TY - THES A1 - Boldt, Julian T1 - Design-Evaluation und –Optimierung eines neuartigen Stiftaufbau-Konzeptes mittels FE-Simulationen und Bruchtests T1 - Evaluation and optimziation of a new post-and-core design using FEM and force loaded destructive testing N2 - Der konventionelle Stift-Stumpfaufbau ist seit Jahrzehnten eine prothetische Standardtherapie bei der Restauration von Zähnen, deren klinische Krone einen erheblichen Substanzverlust erlitten haben. Bei dieser Art der Restauration sind klinisch jedoch wiederkehrende Versagensmechanismen zu beobachten, die negativen Einfluss auf Überlebensraten der restaurierten Zähne haben. Die vorliegende Untersuchung beschäftigt sich mit der Frage, ob diesen Versagensarten durch eine neuartige Verankerung, die sich anstelle einer kraftschlüssigen eine formschlüssige Verbindung zunutze macht, eliminiert werden können und wie ein geeignetes Verankerungselement beschaffen sein muss. Dazu wurde zunächst aus theoretischen Überlegungen heraus ein mechanisches Ersatzmodell erstellt, das die Wirkung der angreifenden Kräfte auf die Einheit aus restaurierter Zahnwurzel und Stift-Stumpfaufbau vereinfacht darstellt. Anschließend wurden die aus dem klinischen Alltag bekannten Versagensarten als Grundlage für die Designänderungen am Verankerungselement verwendet. An die Stelle eines langen und dünnen Wurzelstiftes tritt damit ein kurzer, dicker Stift, an dessen Ende ein invers konisches Verbindungselement angebracht ist. Dieses greift in eine ebenfalls invers konische Kavität, die durch besondere Werkzeuge in die Zahnwurzel präpariert wird. Über eine Einfassung, die den klassischen Fassreifen ersetzt, werden mechanische Kräfte auf das Dentin übertragen. Dieses Design wurde in In-Vitro-Versuchen getestet und optimiert, während die so gewonnenen Ergebnisse (Lastniveaus und Bruchmechanik) als Grundlage für Finite-Elemente-Simulationen dienten, mit deren Hilfe die Spannungsverteilung in der Zahnwurzel unter mechanischer Belastung sichtbar gemacht wurde. Der Zyklus aus FEM und Bruchversuchen erlaubte es, innerhalb weniger Iterationen einen Anker zu entwickeln, der mittlerweile als CE-zertifiziertes Medizinprodukt im klinischen Alltag Anwendung findet. Aus dem geometrischen Ersatzmodell konnte weiterhin die klinische Indikation für einen Stift-Stumpfaufbau verfeinert werden – es liefert auch eine mögliche Erklärung für die Ursache der teilweise großen Diskrepanzen zwischen verschiedenen Ergebnissen in der Literatur. N2 - Conventional post-and-core restorations have been a long time standard procedure of teeth which have suffered loss of hard tissue. Such restorations exhibit recurring methods of failure which have a negative impact on survival rates of the respective teeth. This study is aimed at evaluating a new approach using postive locking rather than conventional luting and bonding for post-and-cores. To this purpose a geometrical model is constructed which demonstrates the forces that act on teeth which have been restored with a post-and-core. Failure methods which can be clinically observed are then eliminated by changes in the post's design. Rather than making use of long and thin cylindrical post, a short and thin version is used which can be spread to an inversely tapered shape. This post is inserted into a matching cavity which is machined into the root with custom tools. Mechanical forces are chanelled into the dentine by means of an annular groove and a corresponding structure replacing the classic ferrule. This design is tested and optimized though force loading and destructive testing as well as finite element simulations, allowing for short development time with few prototype iterations which lead to a design that is commercially available and in clinical use. Furthermore, the devised mechanical model serves to explain the large discrepancies in various studies' results found in the literature. KW - Zahnprothetik KW - Prothetik KW - Stift-Stumpfaufbau KW - Formschluss KW - Würzburger Stift KW - Prosthodontics KW - Post-and-Core KW - positive locking KW - Würzburg Post Y1 - 2012 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-72562 ER - TY - JOUR T1 - einBlick - Ausgabe 31 - 04. September 2012 N2 - Nachrichten aus der Julius-Maximilians-Universität Würzburg KW - Würzburg KW - Universität KW - University KW - Wuerzburg KW - Wurzburg Y1 - 2012 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-72621 VL - 31/2012 ER - TY - THES A1 - Wirth, Clemens T1 - Klinische Wertigkeit der funktionellen Magnetresonanzurographie bei Kindern T1 - Value of semi-automated functional MR-Urography in clincal routine N2 - Die vorliegende retrospektive Arbeit zeigt die Einsatzmöglichkeiten der funktionellen Magnetresonanzurographie bei Kindern auf. Mit Hilfe der verwendeten Software lassen sich die funktionellen Aspekte der Untersuchung wenig zeitintensiv bearbeiten und die Ergebnisse anschaulich und verständlich darstellen. Die Beurteilung der funktionellen Ergebnisse erlaubt aus der Zusammenschau von errechneten definierten metrischen Daten der Untersuchung und der Kurvenanalyse eine Aussage zur seitengetrennten Nierenfunktion. Diese korreliert gut mit dem klinischen Ergebnis und der MAG 3 Szintigraphie als Standardverfahren. Als Funktionsparameter zur Unterscheidung zwischen normal funktionierender und dekompensierter obstruierter Nierenuretereinheit dient in erster Linie die renale Transitzeit des Kontrastmittels RTT. Durch Einführung einer Pseudonativsequenz konnten im Patientenkollektiv Untersuchungen der Auswertung zugeführt werden, die primär nicht auszuwerten waren. Eine Korrelation der errechneten Patlakzahl mit der geschätzten glomulären Filtrationsrate ließ sich in unserem Kollektiv nicht nachweisen. Insgesamt ist das Verfahren im klinischen Alltag weiter zu evaluieren, Prospektive Studien sollten eine eventuelle Überlegenheit dieser strahlenfreien Methode gegenüber der Szintigraphie als zentrale Fragestellung überprüfen. N2 - Retrospective functional assessment of MRU examinations between 2004 and 2011. Calculated functional parameters and curves were interpreted as normal (group 1), equivocal (group 2) or obstructed (group 3), followed by comparison with clinical outcome (SOR) and, if available, MAG 3 scintigraphy. CHOP-fMRU is a valuable tool to assess functional parameters in fMRU. CTT and RTT can help to differenciate between obstructed and normal KUU. Further prospective studies should evaluate the performance of fMRU compared to scintigraphy in children, in order to appraise the additional functional value of fMRU beyond morphological information. KW - Funktionelle NMR-Tomographie KW - Kinderradiologie KW - MR-Urography Pediatric Y1 - 2012 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-72593 ER - TY - THES A1 - Eujen, Ulrike T1 - Maximierung der Oszillationsfrequenzen unter Hochfrequenz-Oszillations-Ventilation: Auswirkungen auf den Gasaustausch und die beatmungsinduzierte Lungenschädigung in einem Langzeit-Großtiermodell des akuten Lungenversagens T1 - Maximization of oscillatory frequencies during high-frequency oscillatory ventilation: Impact on gas exchange and ventilator induced lung injury in a long term animal model of acute respiratory distress syndrome N2 - Beim akuten Lungenversagen (ARDS) handelt es sich um eine akute, schwere pulmonale Insuffizienz mit Gasaustauschstörung als typische Reaktion der Lunge auf unterschiedliche Noxen und Traumata. Durch die Einführung einer lungenprotektiven Beatmungsstrategie mit reduziertem Tidalvolumen konnte sowohl die Mortalität als auch die systemische und pulmonale Entzündungsreaktion bei ARDS-Patienten gesenkt werden. Neuere Untersuchungen zeigen jedoch, dass selbst bei Anwendung niedriger Tidalvolumina die lokale Überblähung gesunder Lungenareale eine weitere Lungenschädigung zur Folge hat. Eine weitere Reduktion des Vt im Sinne einer erhöhten Lungenprotektion wäre daher wünschenswert. Die Hochfrequenz-Oszillations-Ventilation ist durch die Applikation kleiner Tidalvolumina und durch die Verwendung hoher mittlerer Atemwegsdrücke gekennzeichnet. Diese Charakteristika zeichnen die HFOV als ideale lungenprotektive Beatmungsform beim ARDS aus, da der hohe mPaw die zyklische Derekrutierung der Lunge (Atelektrauma) vermindert und die kleinen Tidalvolumina eine alveoläre Überdehnung (Volutrauma) limitieren. In der vorliegenden ARDS-Großtier-Studie wurden zwei lungenprotektive Hochfrequenz-Oszillations-Beatmungsformen einander gegenübergestellt, indem eine HFOV mit einer konventionellen Beatmungsfrequenz von 6 Hz mit einer HFOV mit 12-15 Hz verglichen wurde. Die Anwendung solch hoher Oszillationsfrequenzen von 12-15 Hz bedeutet eine erhebliche Verminderung des Tidalvolumens. Das Ziel dieser Studie war es, zu untersuchen, ob mit dieser Beatmungsform eine suffiziente Oxygenierung und Ventilation zu erreichen ist und ob diese Strategie die Lungenschädigung in der Histopathologie zu reduzieren vermag. Hierzu wurde bei jeweils 8 Pietrain-Schweinen pro Untersuchungsgruppe mittels repetitiven salinen Lavagen ein akutes Lungenversagen induziert. Danach wurde eine Druck-Volumen-Kurve erstellt und der mPaw für den gesamten weiteren Versuchszeitraum auf 3 cmH2O über dem unteren Inflektionspunkt festgesetzt. Es folgte ein Rekrutierungsmanöver, wonach die Tiere, randomisiert den beiden Gruppen zugeordnet, über einen Zeitraum von 24 Stunden mit der jeweiligen HFOV-Strategie beatmet wurden. Während des Experiments wurden regelmäßig verschiedene Parameter betreffend Beatmung, Gasaustausch und Hämodynamik dokumentiert. Nach Versuchsende wurde das Ausmaß der Lungenschädigung bei den Tieren histopathologisch beurteilt. Die Daten zeigen, dass beide Formen der HFOV, besonders durch die Kombination mit der Anwendung von Rekrutierungsmanövern und durch die Applikation eines suffizient hohen mPaw, eine anhaltende Verbesserung des pulmonalen Gasaustauschs bewirken. Dies ließ sich unter anderem an einem signifikant verminderten Oxygenierungsindex, einem erhöhten PaO2/FiO2-Verhältnis und einer reduzierten Shunt-Fraktion erkennen. Mit unseren histopathologischen Ergebnissen wurde außerdem demonstriert, dass eine HFOV mit 12-15 Hz das Ausmaß der Inflammation und damit die Lungenschädigung im Unterlappen im Vergleich mit einer HFOV mit 6 Hz signifikant vermindert, was darauf schließen lässt, dass eine Beatmung mit hohen Oszillationsfrequenzen eine größere Lungenprotektion bewirkt. N2 - The acute respiratory distress syndrome (ARDS) is characterized by severe pulmonary insufficiency. The introduction of a lung protective ventilation strategy with reduced tidal volume was able to reduce both mortality rate and systemic and pulmonary inflammation. However, recent studies show that even when using low tidal volumes local hyperinflation can occur. A further reduction of Vt would therefore be desirable. High-frequency oscillatory ventilation is characterized by application of small tidal volumes and use of high mean airway pressures. These characteristics make HFOV an ideal form of lung protective ventilation in ARDS because high mPaw reduces atelectrauma and small tidal volumes limit volutrauma. In this ARDS large animal study two lung-protective high-frequency oscillatory ventilation modes were compared (HFOV with a conventional frequency of 6 Hz vs. HFOV at 12-15 Hz). The use of high frequencies results in a considerable reduction of tidal volume. The aim of this study was to investigate whether this type of ventilation can ensure oxygenation and ventilation and whether it is able to reduce lung injury in histopathology. In 16 pigs acute lung injury was induced by repetitive saline lavage. Thereafter, a pressure volume curve was created and mPaw was set 3 cmH2O above the lower inflection point. A recruitment maneuver was performed, after which the animals were randomly assigned to the two groups and ventilated for a period of 24 hours. During the experiment several parameters regarding ventilation, gas exchange and hemodynamics were documented. Finally the degree of lung injury was assessed histopathologically. The data show that both forms of HFOV, especially when combined with the use of recruitment maneuvers and by the application of sufficient mPaw, lead to improvement in pulmonary gas exchange. This could be shown in a significantly decreased oxygenation index, an increased PaO2/FiO2-index and a reduced shunt fraction. Our histopathological results demonstrate that HFOV at 12-15 Hz significantly reduces the degree of inflammation in the lower lobe in comparison with a HFOV at 6 Hz, which suggests that higher frequencies cause better lung protection. KW - ARDS KW - HFOV KW - Hochfrequenz-Oszillations-Ventilation KW - Beatmung KW - ARDS KW - Acute Respiratory Distress Syndrome KW - High-frequency oscillatory ventilation Y1 - 2012 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-72542 ER - TY - THES A1 - Topuzoglu, Tengü Gülsüm T1 - Charakterisierung von IL-4 Knockout-Mäusen und ihrer Zytokin- und Opioidrezeptor-Expression im peripheren und zentralen Nervensystem T1 - Characterization of IL-4 knockout-mice and their cytokine- and opioidreceptor gene expression in the peripheral and central nervous system N2 - In der vorliegenden Arbeit wurde der Einfluss eines Mangels des antiinflammatorischen Zytokins Interleukin(IL)-4 am Tiermodell einer experimentellen Mononeuropathie (engl. chronic constriction injury, CCI) untersucht. Zentrale Fragestellung der Studie war, ob IL-4 knockout(ko)-Mäuse im Vergleich zu Wildtyp(wt)-Mäusen mit einem gesteigerten Schmerzverhalten sowie einer veränderten Zytokinantwort und Opioidrezeptor-Expression nach Anwendung eines neuropathischen Schmerzmodells (CCI) reagieren. In mehreren Tierstudien war zuvor eine antiinflammatorische und analgetische Wirkung von IL-4 belegt worden (Vale et al. 2003; Hao et al. 2006) und in klinischen Studien war ein verminderter IL-4-Spiegel bei Patienten mit verschiedenen neuropathischen Schmerzsyndromen mit einer gesteigerten Schmerzempfindung verbunden (Üçeyler et al. 2006; Üçeyler et al. 2007b). Da IL-4 die Transkription von Opioidrezeptoren induziert (Kraus et al. 2001; Börner et al. 2004), wurde zudem das Ansprechen von IL-4 ko-Mäusen auf Morphin und die Genexpression zentraler Opioidrezeptoren untersucht. Vor sowie bis vier Wochen nach Durchführung einer CCI wurden IL-4 ko- sowie wt- Mäuse hinsichtlich ihrer Empfindlichkeit auf mechanische und thermische Stimuli analysiert. Zum Zeitpunkt des Schmerzmaximums nach CCI (Tag 7 bis 9) wurde zudem das Ansprechen beider Genotypen auf Morphin untersucht. Die Genexpression pro- (IL-1 beta, TNF) und antiinflammatorischer Zytokine (IL-10, IL- 13) im peripheren (N. ischiadicus) und zentralen Nervensystem (lumbales und zervikales Rückenmark, Pons, Thalamus, Hypothalamus, Striatum, Kortex) sowie die Genexpression zentraler Opioidrezeptoren (mü-OR, delta-OR, kappa-OR) wurde bei beiden Genotypen vor sowie vier Wochen nach CCI mittels Real-Time-PCR bestimmt. Unbehandelte IL-4 ko-Mäuse zeigten im Vergleich zu wt-Mäusen bereits vor Durchführung einer CCI eine mechanische Überempfindlichkeit (Hyperalgesie), was möglicherweise durch die bei IL-4-Mangel fehlenden zentralen inhibitorischen Mechanismen bedingt ist. Nach CCI entwickelten sowohl IL-4 ko- als auch wt-Mäuse eine gleich ausgeprägte mechanische und thermische Hyperalgesie. Die Tatsache, dass die mechanische Überempfindlichkeit bei IL-4 ko-Mäusen nach Nervenläsion nicht überproportional steigt, kann Ausdruck der nachgewiesenen kompensatorisch stärker ausgeprägten Genexpression proinflammatorischer, aber insbesondere auch antiinflammatorischer Zytokine in diesem Genotyp sein. Nur bei IL-4 ko-Mäusen war vier Wochen nach CCI die Genexpression der anti- inflammatorischen Zytokine im N. ischiadicus (IL-10) und ipsilateralen Rückenmark (IL-10, IL-13), jedoch auch die der proinflammatorischen Zytokine im ipsilateralen Rückenmark (TNF, IL-1 beta) erhöht. Nach CCI sprachen IL-4 ko-Mäuse schneller auf Morphingabe an als wt-Mäuse, was durch den bei diesem Genotyp stärker ausgeprägten Anstieg der Genexpression der Opioidrezeptortypen delta-OR und kappa-OR im kontralateralen Thalamus bedingt sein kann. N2 - In this study the pain behavior of IL-4 knockout (ko) mice was characterized before and after chronic constriction injury (CCI) of the sciatic nerve as an established model for neuropathic pain. The opioid responsivity of IL-4 ko-mice was tested and four weeks after CCI the cytokine and opioid receptor gene expression in the peripheral and central nervous system of IL-4 ko mice was measured compared to wildtype (wt) mice. Before CCI IL-4 ko mice showed tactile allodynia, while responses to heat did not differ in comparison to wt-mice. No compensatory changes in the gene expression of the measured cytokines (tumor necrosis factor-alpha (TNF), IL-1b, IL-10, and IL-13) were found in the PNS and CNS of na ̈ıve IL-4 ko mice. Four weeks after CCI IL-1b gene expression was stronger in the sciatic nerve of IL-4 ko mice (p,0.001) and only IL-4 ko mice had elevated IL-10 gene expression in the sciatic nerve. Only in IL-4 ko-mice there was an upregulated gene expression four weeks after CCI of TNF (p,0.01), IL-1b (p,0.05), IL-10 (p,0.05), and IL-13 (p,0.001) in the ipsilateral spinal cord. The compensatory overexpression of the anti-inflammatory cytokines IL-10 and IL-13 in the spinal cord of IL-4 ko mice may explain the lack of genotype differences for pain behavior after CCI. CCI upregulated gene expression of k, and d opioid receptors in the contralateral thalamus of IL-4 ko mice, in accordance with an observed fast onset of morphine analgesia compared to wt mice. KW - Neuralgie KW - Interleukin-4 KW - Zytokin KW - Opioidrezeptor KW - Genexpression KW - Neuropathischer Schmerz KW - Interleukin-4 KW - cytokine KW - opioidreceptor KW - mRNA expression KW - mice Y1 - 2012 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-72372 ER - TY - THES A1 - Buback, Verena Simone [geb. Schulz] T1 - Synthese neuer Cystein-Protease-Inhibitoren sowie deren theoretische und experimentelle Untersuchung hinsichtlich der Struktur-Wirkungs-Beziehung T1 - Synthesis of new Cystein protease inhibitors and their theoretical and experimental investigation regarding the structure activity relationship N2 - Derivate von Vinylsulfonen (VS), die zur Klasse der Michael-Akzeptoren gehören, haben sich in den letzten Jahren als potente irreversible Inhibitoren von Cystein-Proteasen etabliert. Durch einen nucleophilen Angriff des Cys-Restes im aktiven Zentrum der Protease auf das beta-Kohlenstoffatom der C-C-Doppelbindung wird die Protease irreversibel alkyliert. Ziel dieser Arbeit war es, einfache theoretische und experimentelle Methoden zu entwickeln, um erste Schlussfolgerungen hinsichtlich der Reaktivität unterschiedlicher Vinylsulfone ziehen zu können, die zur vollständigen Aufklärung der Struktur-Wirkungsbeziehung von Vinylsulfonen mit diversen Cystein-Proteasen dienen. Im ersten Teil der Arbeit wurden quantenmechanische Rechnungen an kleinen Vinylsulfon-Bausteinen angestellt, um den Einfluss unterschiedlicher Substitutionsmuster an der Sulfoneinheit auf die Reaktionskinetik von Vinylsulfonen zu untersuchen. Anhand der jeweiligen Potentialflächen ließen sich die charakteristischen Punkte der Reaktion, wie der Reaktionskomplex, der Übergangszustand (transition state, TS) sowie das Produkt mitsamt ihren Energien und Geometrien bestimmen. Die Höhe der Energiebarriere, die zum Erreichen des TS überwunden werden muss, die sogenannte Aktiverungsenergie, hängt über die Arrhenius-Gleichung mit den kinetischen Parametern der Reaktion zusammen. Es lässt sich also durch die Kenntnis der Aktivierungsenergien die Reaktivitätsreihenfolge unterschiedlich substituierter Vinylsulfone VS vorhersagen. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurden Vinylsulfonbausteine synthetisiert und an separat hergestellte Peptide gekuppelt, sodass potentielle Inhibitoren erhalten wurden. So konnten u.a. die peptidischen Inhibitoren Mu-D-Phe-L-HomoPhe-VS-Me und MP-D-Phe-L-HomoPhe-VS-Me hergestellt werden. Ein zweites Syntheseprojekt beschäftigte sich mit der Kupplung von Peptiden an neue Derivate der trans-Aziridin-2,3-dicarbonsäure. Die synthetisierten Inhibitoren waren Z-Phe-Ala-Azi, Boc-Leu-Pro-Azi und Z-Pro-Leu-Azi. Hierfür wurden die Peptide des Vinylsulfonsprojekts in umgekehrter Aminosäure-Reihenfolge synthetisiert, um sie an die Aziridinbausteine kuppeln zu können. Der dritte Teil der Doktorarbeit befasste sich mit der experimentellen Untersuchung der synthetisierten Vinylsulfonbausteine sowie den erhaltenen peptidischen VS- und Aziridin-basierten Inhibitoren. Es wurden einerseits Enzym-Assays durchgeführt, um die prozentuale Hemmung verschiedener Cystein-Proteasen durch die synthetisierten Moleküle zu messen. Keine der Verbindungen wies jedoch eine signifikannte Hemmung der Proteasen Rhodesain, Falcipain 2 und Cathepsin B auf. Andererseits wurden Modellsysteme entwickelt, um die Kinetik der Reaktionen der Vinylsulfon- und Aziridinbausteine mit einem geeigneten Thiol als Enzym-Imitat zu verfolgen. Ein zielführendes Modell konnte mit Phenylethanthiol in deuteriertem Methanol realisiert werden. Durch Zusatz von NaOH, KOH oder KOtBu konnte zusätzlich die Reaktion mit dem Thiolat untersucht werden. Die Reaktionen wurden sowohl mit IR- als auch NMR-Spektroskopie verfolgt und es wurden die Geschwindigkeitskonstanten 2. Ordnung bestimmt. Auf den ersten Blick konnte mit dem theoretischen Modell der experimentell gefundene Trend nicht vorhergesagt werden. Die Reihenfolge der Sulfonderivate aber, die an der Sulfongruppe ein weiteres Heteroatom tragen, Sulfonester und Sulfonamid, wurde richtig abgeschätzt. Der Unterschied in der Aktivierungsenergie zwischen den Sulfonestern beläuft sich auf 0.7 kcal pro mol. Über die Arrheniusgleichung, ergibt sich bei Annahme desselben Arrhenius-Faktors bei einer Temperatur von 25°C, dass OPhVS um einen Faktor 3 schneller als OMeVS reagieren sollte. Tatsächlich wurde im Experiment ein Faktor von 2.6 gefunden. Aufgrund der unterschiedlichen Substituenten am Stickstoffatom, ist das Amid nicht vollständig mit seinem H-substituierten theoretischen Pendant vergleichbar. Dass das Sulfonamid langsamer als die Sulfonester reagieren, wurde vom theoretischen Modell ebenfalls richtig vorhergesagt. N2 - Derivatives of vinyl sulfones (VS), which belong to the class of Michael acceptors, have been established as potent, irreversible inhibitors of cysteine proteases during the past years. The protease is irreversibly alkylated by the nucleophilic attack of the Cys-residue of the protease's active site at the beta-carbon atom of the C-C-double bond. The objective of this work was the development of simple, theoretical and experimental methods to draw first conclusions concerning the reactivity of diverse vinyl sulfones, which are needed for further investigations to fully understand the complex structure-activity relationship of vinyl sulfones as inhibitors of various cysteine proteases. In the first part of this work, quantum mechanical calculations of small vinyl sulfone entities were conducted in order to investigate the impact of different substitution patterns at the sulfone moiety on the reaction kinetics of vinyl sulfones. By means of the PES characteristic reaction points, such as the reaction complex, the transition state (TS) or the product, including energies and structural parameters, could be determined. The height of the energy barrier to pass the TS, the so-called activation energy, is related to the kinetic parameters of a reaction through the Arrhenius equation. In the second part of this work, the discussed vinyl sulfone building blocks were synthesized and coupled to separately synthesized peptides, yielding potential inhibitors such as Mu-D-Phe-L-HomoPhe-VS-Me and MP-D-Phe-L-HomoPhe-VS-Me. A second synthesis project dealt with the coupling of peptides to new derivatives of trans-aziridine-2,3-dicarbonylic acid. The synthesized inhibitors are Z-Phe-Ala-Azi, Boc-Leu-Pro-Azi, and Z-Pro-Leu-Azi. Additionally, the stated peptides were synthesized with reverse amino acid sequence in order to couple them to the aziridine building blocks. The third part of this phD thesis dealt with the experimental investigation of the synthesized vinyl sulfone building blocks as well as the obtained peptidic VS- and aziridine-based inhibitors. On the one hand, enzymatic assays were carried out, to measure the percentage inhibition of various cysteine proteases caused by the synthesized molecules. Unfortunately, none of the compounds showed significant inhibition of the proteases rhodesaine, falcipain 2 or cathepsine B. On the other hand, model systems were developed to track the reaction kintics of the addition reactions of the vinyl sulfone and aziridine building blocks with a suitable thiol as the enzyme "dummy". A target-aimed model could be realized with phenyl ethane thiol in deuterated methanol. Moreover, by addition of NaOH, KOH or KOtBu, the raction with the respective thiolate could be studied. The reactions were followed by IR- and NMR-spectroscopy and the second order rate constants were determined. The series of the investigated vinyl sulfones with respect to the reactivity towards phenyl ethane thiolate was established. At first glance, the theoretical model was not able to predict the experimentally disclosed reactivity trend. Nevertheless, the order of the sulfone derivatives carrying a hetero atom at the sulfone moiety, sulfone esters and sulfone amide, was estimated correctly. The calculated difference in activation energy between the sulfone esters is 0.7 kcal per mol. Applying the Arrhenius equation under the assumption of identical Arrhenius factors at a temperature of 25°C, OPhVS should react faster than OMeVS by a factor of 3. Indeed, experiments showed a factor of 2.6. Because of the different substituents at the nitrogen atom, the amide is not thouroughly comparable to its H-substituted theoretical pendant. The even slower reaction of the sulfone amide compared to the sulfone esters was still correctly predicted with the theoretical model. KW - Cysteinproteasen KW - Enzyminhibitor KW - Struktur-Aktivitäts-Beziehung KW - cystein protease inhibitor QSAR Y1 - 2012 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-72306 ER - TY - RPRT A1 - Reinders, Heinz A1 - Seemann, Franziska T1 - Das DLRG-Programm "Cool & Sicher" bei Vorschulkindern: Abschlussbericht über die wissenschaftliche Begleitung des "Eisregel"-Trainings N2 - Der vorliegende Bericht gibt Auskunft über die Ergebnisse der wissenschaftlichen Begleitung des Eisregel-Trainings der DLRG-Jugend Bayern bei Kindern im Vorschulalter. Das Eisregel-Training ist Bestandteil des Programms "Cool & Sicher", bei dem Heranwachsende mit den Gefahren im und am Wasser bzw. Eisflächen vertraut gemacht werden. Das Ziel des Programms ist es, durch das Training die Wahrscheinlichkeit eines Tods durch Ertrinken bei Kindern deutlich zu reduzieren, in dem die Kinder selbst, aber auch die Eltern über Präventionsmaßnahmen aufgeklärt werden. T3 - Schriftenreihe Empirische Bildungsforschung - 24 KW - Vorschulkind KW - Eis KW - Gefahr KW - Eisregel KW - Training Y1 - 2012 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-72288 SN - 978-3-923959-82-2 ER - TY - RPRT A1 - Christoph, Gabriela A1 - Reinders, Heinz T1 - Jugend. Engagement. Politische Sozialisation : Skalendokumentation des Längsschnitts 2010 - 2011 N2 - Die dargestellten Ergebnisse stammen aus dem Projekt "Jugend. Engagement. Politische Sozialisation" ("Persönlichkeitsentwicklung und politische Beteiligungsbereitschaft durch gemeinnützige Tätigkeit im Jugendalter") der Universität Würzburg. Hauptaugenmerk dieser repräsentativen Umfrage liegt auf der Erfassung des ehrenamtlichen Engagements bei Jugendlichen und erfolgt in mehreren Erhebungswellen. Ziel ist die differenzierte Darstellung des aktuellen Engagements sowie die Begleitung potentieller Veränderungen über die Zeit hinweg. Die vorgestellten Ergebnisse beziehen sich auf die Daten der von Oktober 2010 bis Mitte Januar 2011 durchgeführten ersten Erhebungswelle (t1). Es werden sowohl Design, als auch die Form der Erfassung des ehrenamtlichen Engagements sowie die Stichprobe beschrieben und anschließend ausgewählte Ergebnisse dargestellt. Die Auswahl der Befunde bezieht sich auf folgende Punkte: zeitlicher Aufwand und Beurteilung des Engagements, Tätigkeitsbereiche, "Wer die ehrenamtlich Engagierten sind", Motive, die Jugendliche dazu bewegen, ein Ehrenamt auszuüben sowie mögliche Auswirkungen. T3 - Schriftenreihe Empirische Bildungsforschung - 23 KW - Jugend KW - Engagement KW - Ehrenamtliche Tätigkeit KW - Studie KW - adolescent KW - voluntary service KW - engagement Y1 - 2012 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-71789 SN - 978-3-923959-81-5 ER - TY - RPRT A1 - Reinders, Heinz A1 - Christoph, Gabriela T1 - Jugend. Engagement. Politische Sozialisation : Abschlussbericht über die erste Projektphase 2010 - 2011 N2 - Die dargestellten Ergebnisse stammen aus dem Projekt "Jugend. Engagement. Politische Sozialisation" ("Persönlichkeitsentwicklung und politische Beteiligungsbereitschaft durch gemeinnützige Tätigkeit im Jugendalter") der Universität Würzburg. Hauptaugenmerk dieser repräsentativen Umfrage liegt auf der Erfassung des ehrenamtlichen Engagements bei Jugendlichen und erfolgt in mehreren Erhebungswellen. Ziel ist die differenzierte Darstellung des aktuellen Engagements sowie die Begleitung potentieller Veränderungen über die Zeit hinweg. Die vorgestellten Ergebnisse beziehen sich auf die Daten der von Oktober 2010 bis Mitte Januar 2011 durchgeführten ersten Erhebungswelle (t1). Es werden sowohl Design, als auch die Form der Erfassung des ehrenamtlichen Engagements sowie die Stichprobe beschrieben und anschließend ausgewählte Ergebnisse dargestellt. Die Auswahl der Befunde bezieht sich auf folgende Punkte: zeitlicher Aufwand und Beurteilung des Engagements, Tätigkeitsbereiche, "Wer die ehrenamtlich Engagierten sind", Motive, die Jugendliche dazu bewegen, ein Ehrenamt auszuüben sowie mögliche Auswirkungen. T3 - Schriftenreihe Empirische Bildungsforschung - 22 KW - Jugend KW - Engagement KW - Ehrenamtliche Tätigkeit KW - Studie KW - adolescent KW - voluntary service KW - engagement Y1 - 2012 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-71770 SN - 978-3-923959-79-2 ER - TY - JOUR T1 - einBlick - Ausgabe 30 - 31. Juli 2012 N2 - Nachrichten aus der Julius-Maximilians-Universität Würzburg KW - Würzburg KW - Universität KW - University KW - Wuerzburg KW - Wurzburg Y1 - 2012 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-72317 VL - 30/2012 ER - TY - THES A1 - Nocker, Monika T1 - Molekulardynamische Untersuchungen zur Charakterisierung von Flexibilität, Bindemechanismen und Bindungsaffinitäten von Aldose Reduktase und Nukleären Rezeptoren T1 - Molecular Dynamics Simulations to investigate flexibility, binding mechanism and binding affinity of Aldose Reductase and Nuclear Receptors N2 - Aldose Reduktase ALR2 katalysiert den ersten Schritt des Sorbitol-Stoffwechselweges. In diesem wird mit Hilfe des Kofaktors NADPH Glukose zu Sorbitol reduziert. Bei erhöhtem Blutzuckerspiegel, wie dies bei Diabetes-Patienten der Fall ist, ist dieser metabolische Weg von Bedeutung. Bis zu einem Drittel der Blutglukose wird zu Sorbitol reduziert. Die Folge der Sorbitolakkumulation in den Zellen und der Verminderung der NADPH-Konzentration sind „osmotischer“ sowie „oxidativer“ Stress. Diese stehen in Zusammenhang mit den vielfach diskutierten Spätschäden des Diabetes, wie diabetischer Katarakt, Neuro- und Nephropathie. Das Enzym ist experimentell sehr gut untersucht und eignet sich daher als Modellsystem zur Untersuchung der intrinsischen Proteinflexibilität und thermodynamischer Daten mit Hilfe von Computermethoden. Unter diesen Voraussetzungen steht der Gewinn eines besseren Verständnisses von molekularer Erkennung und Proteinbeweglichkeit der ALR2 unter Verwendung von Molekulardynamik-Simulationen MD als primäres Ziel im Zentrum dieser Arbeit. Dabei wurden MD-Studien zu zwei kristallographisch erhaltenen Protein-Ligand-Komplexen durchgeführt. Die Liganden unterscheiden sich nur geringfügig in der Länge einer Seitenkette, ihre Bindung führt allerdings zu gänzlich unterschiedlichen Bindemodi. Einer davon ist bislang einzigartig für die ALR2. Mit Hilfe von MD-Simulationen wurde versucht, eine Erklärung für diese neue Konformation der Bindetasche im Vergleich zu jener eines strukturell sehr ähnlichen Liganden zu finden. Außerdem waren über diese Studien Aussagen über besonders flexible Bereiche der ALR2-Bindetasche möglich, die mit bereits existierenden Erkenntnissen über die Bindetaschenflexibilität verglichen werden konnten. Darüber hinaus gelang es, durch die Methode der gesteuerten Molekulardynamik SMD einen Übergang zwischen einer röntgenkristallografisch ermittelten kofaktorgebundenen Holo-Konformation und kofaktorfreien Apo-Konformation zu simulieren. Computergestützte Methoden ermöglichen es also, weitläufige Bewegungen von einer Proteinkonformation in die andere nachzuvollziehen bzw. die experimentell erhaltenen Strukturen zu bestätigen. Eine mechanistische Deutung des Kofaktorassoziations- und Kofaktordissoziationsprozesses wurde ebenfalls versucht. Dafür war es notwendig, strukturelle Veränderungen im Protein zeitlich zu verfolgen und entscheidende Vorgänge zu identifizieren. Die Methode der SMD wurde in dieser Arbeit auch auf ein weiteres, pharmakologisch interessantes System übertragen. Dabei wurde versucht auch an zwei Vertretern der Klasse der Nukleären Rezeptoren NRs, dem Androgenrezeptor AR und dem Estrogenrezeptor ER, eine solche weitreichende Bewegung nachzuvollziehen. Auch bei diesen Rezeptoren sind zwei in der Position einer alpha-Helix unterschiedliche Formen bekannt. Auch hier wurden mit Hilfe der genannten Methode, relevante Ereignisse hinsichtlich der Helixmobilität identifiziert. Abschließend wurde auf den thermodynamischen Aspekt der Protein-Ligand-Komplexe eingegangen. Durch Berechnungen anhand der Methode der thermodynamischen Integration TI wurden relative Bindungsaffinitäten am Modellsystem ALR2 gewonnen. Durch den Vergleich mit experimentell vorhandenen Daten konnte die Methode validiert werden. Das Verfahren der TI sollte in Zukunft eine Voraussage von Affinitäten beliebiger, sich geringfügig unterscheidender Inhibitoren, die aber denselben Bindemodus aufweisen, ermöglichen und damit den Prozess des Wirkstoffdesigns erleichtern. Zusammenfassend ergab sich eine gute Übereinstimmung der experimentell ermittelten Strukturen bzw. Daten mit den durch Computersimulationen erhaltenen. N2 - Aldose Reductase ALR2 catalyzes the first step of the sorbitol pathway leading to a reduction of glucose into sorbitol. NADPH acts as cofactor. People suffering from diabetes mellitus blood show a raised glucose level and up to one third of the available glucose is processed in this way. As a consequence sorbitol accumulates in cells with insulin-independent glucose uptake and the NADPH concentration decreases. This leads to “osmotic” as well as “oxidative” stress, which are correlated to the late-onset diabetic complications like diabetic cataract, neuro- and nephropathy. The enzyme is experimentally very well examined. Therefore, it can be taken as model system for the investigation of the intrinsic protein flexibility and formerly gained thermodynamic data by application of computer methods. It is in that context that Aldose Reductase is regarded as an important target for this work with the aim of getting a broader insight into molecular recognition and protein mobility by use of molecular dynamics simulations MD. MD simulations were carried out for two crystallographically obtained protein-ligand-complexes. Both ligands lead to different binding modes although they differ only by the length of one sidechain. The binding mode for one of these inhibitors is unique for ALR2. MD simulations should shed light upon this novel binding site conformation and investigate enzyme’s inherent flexibility in comparison with former studies. Beyond that it was possible to reconstruct the transition between the cofactor bound "holo" comformation to a cofactor unbound "apo" one by the application of Steered Molecular Dynamics SMD. Therefore computer simulations offer the possibility to simulate large movements from one protein conformation to the other one and affirm the experimentally obtainable stuctures. A mechanistical explanation of the cofactor association and dissociation process was also tried. For this purpose an observation of the structural rearrengements in time was necessary to elucidate crucial events. The method of SMD was additionally used to investigate the large movements in two members of the class of the pharmacollogically very interesting Nuclear Receptors NR, the Androgen Receptor AR and the Estrogen Receptor ER. For both this receptors two different conformations are known, differing from each other by the position of an alpha-helix. Here relevant events in helix mobility were identified. To conclude the thermodynamic aspect of protein-ligand-complexes was examined. By the method of thermodynamic integration TI relative binding affinities of ALR2 inhibitors were gained. Comparison with experimental data allowed a validation. In the future the prediction of binding affinities of slightly different inhibitors showing an identical binding mode should be possible by the use of TI to ease the process of drug design. In summary, an good agreement between experimental structures respectively data and computational results is obtained. KW - Molekulardynamik KW - Aldehydreductase KW - Kernrezeptor KW - Aldose Reduktase KW - Nukleäre Rezeptoren KW - Flexibilität KW - Bindemechanismus KW - Bindungsaffinität KW - Statistische Thermodynamik KW - Ligand KW - Aldose Reductase KW - Nuclear Receptor KW - flexibility KW - binding mechanism KW - binding affinity Y1 - 2012 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-72110 ER - TY - THES A1 - Bobinger, Tobias T1 - Einfluss von Monozyten auf Heilungsvorgänge und kardiale Thromboembolien nach einem Myokardinfarkt T1 - Role of monocytes in wound healing and thromboembolism after myocardial infarction N2 - Beim Myokardinfarkt führt die Unterbrechung der Blutversorgung zur Nekrose von Myozyten. Hierauf werden im Rahmen der Entzündungsreaktion verschiedene Reaktionen angestoßen, die dazu dienen sollen, die Integrität und Funktion des Herzens zu erhalten. Einen wichtigen Anteil an der Inflammationsreaktion haben die Monozyten, deren Funktion in diesem Rahmen bis jetzt nur wenig erforscht ist. In dieser Studie wurde die Rolle von Monozyten auf die Heilungsvorgänge nach einem Infarkt untersucht. Durch die Gabe von Clodronat-Liposom wurden in der Behandlungsgruppe die Monozyten ausgeschaltet. Es zeigte sich, dass die Mortalität in der Behandlungsgruppe aufgrund der Bildung eines linksventrikulären Thrombus deutlich erhöht ist. Dieser war bereits innerhalb der ersten 24h in den echokardiographischen Untersuchungen sichtbar. Veränderungen im Gerinnungssystem konnten als Ursache ausgeschlossen werden. Durch eine CD-31-Färbung wurde deutlich, dass in den infarzierten Herzen der Behandlungsgruppe ein Defekt im Endokard entstanden war, der als Ursache für die Entstehung der Thromben gewertet werden kann. Zudem wurde in der Behandlungsgruppe neben einem verschlechterten Abräumvorgang eine signifikant erniedrigte Kollagen-1-Produktion, ein erhöhtes MMP-9, ein leicht erniedrigtes TGF sowie erhöhtes VEGF gemessen. In dieser Studie wurde somit gezeigt, dass Monozyten ein essentieller Bestandteil der Heilungsvorgänge nach einem Infarkt sind. Durch eine eingeschränkte Monozytenfunktion wird zudem aufgrund von Defekten im Endothel die Bildung eines linksventrikulären Thrombus und folgender thromboembolischer Ereignisse begünstigt. N2 - Myocardial infarction leads to necrosis of cardiac myocytes. To obtain tissue integrity and function inflammatory cells are activated. The role of monocytes after myocardial infarction is poorly defined. We examined the role of monocytes after experimental myocardial infarction by monocyte depletion through injections of clodronate-containing liposomes. Thus, monocyte infiltration was reduced in the myocardium of the mice in the treatment group. Mortality was increased due to thromboembolic events in the treatment group. Left ventricular thrombi were seen as early as 24 hours after myocardial infarction. CD31-Staining showed endocardial defects before the onset of thrombus formation and in older thrombi. Changes in the blood coagulation or an increased infarct expansion were not observed. In summary, early healing defects are most likely caused by the monocyte depletion. Depletion of the monocytes also led to less clearance of cell debris, increased matrixmetalloproteinase-9 and vascular endothelial growth factor, less collagen-1 production and an unchanged tumor-growth-factor. Impaired monocyte function seems to be a major factor for the development of a left ventricular thrombus after myocardial infarction. KW - Monozyt KW - Monozyten-Makrophagen-System KW - Clodronsäure KW - Herzinfarkt KW - Embolie KW - Monocytes KW - myocardial infarction KW - clodronat-liposome KW - thromboembolism Y1 - 2012 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-72195 ER - TY - THES A1 - Uhlenhut, Klaus T1 - Effekte eines standardisierten Kiefernrindenextraktes und dessen Metabolit auf NO und NO-Synthasen T1 - Effects of a standardized pine bark extract and its metabolite on NO and NO-synthases N2 - Um die Grundlagen für die in klinischen Studien beim Einsatz des standardisierten Kiefernrindenextraktes (Pycnogenol®) gefundenen Effekte auf einer mechanistischen zellulären Ebene aufzuklären, wurde in der hier vorliegenden Arbeit der Einfluss der Komponenten des Extraktes und dessen Metabolit M1 (chemisch benannt δ-(3,4-Dihydroxyphenyl)-γ-valerolacton bzw. 5 (3,4 Dihydroxybenzyl)dihydrofuran 2(3H) on) hinsichtlich der Wirkung auf Stickstoffmonoxid(= NO)-produzierende Systeme untersucht. NO ist an einer Vielzahl von physiologischen und pathophysiologischen Prozessen in lebenden Organismen beteiligt. Im Menschen sind bislang drei NO-Synthasen bekannt: die induzierbare (iNOS), die hinsichtlich der Pathologie vor allem mit entzündlichen Vorgängen assoziiert wird, die endotheliale (eNOS), die bei Gefäß- und Herzkreislauferkrankungen eine Rolle spielt, und die neuronale (nNOS), die mit der Gedächtnisbildung, aber auch mit zytotoxischen Prozessen im Gehirn etwa bei Morbus Alzheimer oder der Parkinson-Krankheit in Verbindung gebracht wird. Der nach peroraler Einnahme des Extraktes im Darm durch metabolisierende Kolonbakterien entstehende und darauf im Plasma erscheinende Metabolit M1, dem bei allen durchgeführten Untersuchungen besonderes Augenmerk zuteil wurde, zeigte eine starke konzentrationsabhängige Inhibierung der NO-Freisetzung der iNOS aus einer durch einen Entzündungsreiz stimulierten murinen Makrophagenzellkultur (IC50= 1,28 µg/mL). Im Vergleich mit Fraktion I des Kiefernrindenextraktes, die vor allem monomere Extraktbestandteile enthält, und Hydrocortison zeigte M1 zusätzlich einen stärkeren Hemmeffekt auf die NO-Freisetzung nach dem Entzündungsreiz. Die Zytotoxizität von M1 im Testsystem war dabei als gering einzustufen. Interessanterweise wurde neben den NO-Radikalfängereigenschaften von M1 auch ein deutlich hemmender konzentrationsabhängiger Effekt auf die iNOS-Proteinexpression gefunden (IC50= 3,78 µg/mL). Da die bislang im Plasma bestimmten M1-Konzentrationen deutlich geringer als die in Zellkulturversuchen wirksamen waren, wurde eine mögliche Anreicherung von M1 in Gegenwart von Serumproteinen in humanen Endothelzellen, primären Monozyten und murinen Makrophagen untersucht. Dabei wurde eine starke Bindung von M1 an die Zellen gezeigt und Hinweise für eine potentiell erleichterte Aufnahme von M1 durch membranständige Transporter unter Einsatz eines Influx-Hemmers (Phloretin) gefunden. Zur Untersuchung der eNOS, die sehr geringe Mengen NO produziert, wurden neue methodische Ansätze entwickelt. In diesem Zusammenhang wurden zuvor unbekannte Fallstricke bei der Verwendung der Fluoreszenzsonde DAF-2 (4,5-Diaminofluorescein) zur NO-Detektion und dem Einsatz unterschiedlicher Detektionssysteme entdeckt. DAF-2 zeigte unter verschiedenen Bedingungen auch ohne extern zugegebene NO-Quelle und besonders beim Einfrieren/Auftauen unerwarteterweise eine Konversion zum korrespondierenden NO-Addukt (DAF-2T). Die eingesetzten monomeren Testsubstanzen ((+)-Catechin, (-)-Epicatechin, Resveratrol, M1) waren über die Testzeiträume deutlich instabil mit dynamischer Eigenfluoreszenz. Sowohl über kurze (≤ 45 min) als auch über längere Zeiträume (14-20 h) wurde entsprechend der Redoxaktivität der eingesetzten Polyphenole eine konzentrationsabhängige scheinbar hemmende Wirkung auf die extrazelluläre NO-Freisetzung der eNOS gezeigt. Die eNOS-Proteinexpression blieb durch die verwendeten Monomere weitestgehend unbeeinflusst. Durch eine hohe Konzentration der Fraktion I des Kiefernrindenextraktes wurde eine Steigerung der eNOS-Proteinkonzentration in Endothelzellen gefunden, wobei zytotoxische Artefakte dabei nicht auszuschließen waren. Als kompetitive endogene Inhibitoren der NOS wurden in vivo in jüngster Zeit methylierte Arginine (ADMA= asymmetrisches, SDMA= symmetrisches Dimethylarginin) entdeckt. In einer randomisierten, kontrollierten, doppelt-blinden klinischen Studie mit einem Cross-over Design am Universitätsklinikum Zürich mit 28 Patienten, die an einer koronaren Herzerkrankung litten, wurden die Plasmaspiegel methylierter Arginine vor und nach 8 wöchiger Einnahme des Kiefernrindenextraktes bestimmt. Es zeigte sich dabei trotz einer Verbesserung der flussinduzierten Gefäßerweiterungskapazität (Flow-mediated dilation) und Verringerung der 15-F2t-Isoprostan-Plasmaspiegel keine signifikante Veränderung der Plasmakonzentrationen von ADMA, SDMA und ET-1 (Endothelin-1) durch die Einnahme des Extraktes. Die nNOS kommt vor allem im Gehirn, aber auch in Muskelzellen vor. Der Einsatz des Metaboliten M1 führte zu keinen deutlichen Effekten auf die konstitutive nNOS-Expression in einem Rhabdomyosarkom(A-673)-Zellkulturmodell. Zur Beantwortung der Frage, wie wahrscheinlich es ist, dass zur möglichen Beeinflussung von (patho)-physiologischen zerebralen Prozessen Polyphenole in vivo das Gehirn erreichen, wurde erstmals ein in silico-Modell zur Vorhersage der Verteilung von ausgewählten polyphenolischen Substanzen zwischen Blut und Gehirn entwickelt. Damit wurde anschließend eine Reihenfolge mit logBB-Werten (logarithmierter Quotient aus Konzentration im Blut und im Gehirngewebe) geordnet nach einer entsprechend dem Modell wahrscheinlich höheren Verteilung ins Gehirn für die untersuchten Substanzen berechnet: Protocatechusäure < Quercetin < Cyanidin < (+) Catechin < (-)-Epicatechin < Phloretin < M1. Insgesamt schienen die untersuchten polyphenolischen Substanzen eher schwach bluthirnschrankengängig zu sein. Der Metabolit M1 zeigte den höchsten logBB-Wert und somit die höchste Wahrscheinlichkeit der untersuchten Polyphenole, die Blut-Hirnschranke in vivo zu überwinden. Im Kontext einer möglichen Anwendung bei chronisch-entzündlichen Erkrankungen wurde zusätzlich ein Extrakt aus der Frucht von Morinda citrifolia L. in einem primären Monozyten-Zellkulturmodell auf seine Eigenschaften hin die Sekretion der Matrix-Metalloprotease-9 (MMP-9) aus Immunzellen nach einem Entzündungsreiz zu beeinflussen untersucht. Dabei zeigten die Extraktverdünnungen deutliche konzentrationsabhängige Hemmeffekte um bis zu ~50 % der maximalen MMP-9 Sekretion, die mit dem Einsatz von Hydrocortison vergleichbar waren. Somit konnten in der vorliegenden Arbeit neue Beiträge zur Wirkungsweise der untersuchten Pflanzenextrakte und vor allem zum Verständnis der möglichen Effekte von Polyphenolen auf physiologisch relevante NO-Systeme sowie zur methodischen Wissenserweiterung der komplexen NO-Analytik geleistet werden. N2 - Many clinical trials with the administration of a standardized maritime pine bark extract (Pycnogenol®) have shown benefical effects. In order to study the basic mechanistic principles of how the extract might work on a cellular level the impact of the extract components and especially of the metabolite M1 (chemically named δ-(3,4-Dihydroxyphenyl)-γ-valerolactone or 5 (3,4 Dihydroxybenzyl)dihydrofuran 2(3H) one) on nitric oxide (NO) producing systems was tested and evaluated. NO is involved in many physiological and pathophysiological processes in living organisms. There are three different isoforms of NO-synthases (NOS) known in humans so far: the inducible NOS (iNOS) is pathologically associated with inflammatory processes, the endothelial NOS (eNOS) is linked to (cardio-)vascular diseases, and the neuronal NOS (nNOS) plays a role in memory formation, but is also put in context to neuronal cytotoxicity within the course of Alzheimer’s and Parkinson’s disease. The metabolite M1 is generated by microbiota in the human colon after per os ingestion of the pine bark extract and thereafter enters the circulation. M1 showed a strong concentration dependent inhibition of NO-release by iNOS from murine macrophages after an inflammatory stimulus (IC50= 1.28 µg/mL). M1 was even more potent at inhibiting NO-release from macrophages than fraction I of the pine bark extract, which predominantly contains monomeric extract compounds, and slightly more potent than hydrocortisone. Cytotoxicity of M1 was found to be modest in the test system. In addition to the NO-radical scavenging activities of M1 there were also profound concentration dependent inhibitory effects on iNOS protein expression (IC50= 3.78 µg/mL). As there is a gap between determined plasma concentrations of M1 after pine bark extract ingestion and required bioactive concentrations in cell culture test systems the binding of M1 to human endothelial cells, human monocytes and murine macrophages in the presence of serum proteins was determined in order to test for cellular M1 accumulation. There was a strong binding of M1 to these cells and a possible facilitated uptake via distinct membrane transporters was shown with using an influx-inhibitor (phloretin). In order to analyze the very small amounts of NO produced by eNOS new methodic approaches were established. Formerly unkown pitfalls and limitations with using the fluorescence dye DAF-2 (4,5-diaminofluorescein) and with applying different detection systems for NO were revealed. DAF-2 was subject to conversion to the NO adduct triazolofluorescein (DAF-2T) even without an externally added NO source under certain assay and storage conditions, especially after freezing and thawing sample solutions. Thus control of spontaneous reagent conversion is advisable. The monomers (+)-catechin, (-)-epicatechin, resveratrol, and M1 were not stable over time and displayed highly dynamic auto-fluorescence. In accordance with their radical scavenging activity the polyphenols seemingly showed a concentration dependent inhibitory effect on NO-release from endothelial cells over short (≤ 45 min) and longer incubation periods (14-20 h). After incubation with the monomers eNOS-protein expression was not markedly affected. When applying very high concentrations of fraction I of the extract an increase of cellular eNOS protein content was observed, but cytotoxic artefacts could not be ruled out though. Recently, competitive endogenous in vivo inhibitors of NOS were identified as methylated arginines (ADMA= asymmetric-, SDMA= symmetric dimethylarginine). In the course of a randomized, double-blind, placebo-controlled and cross-over designed clinical trial, which was conducted at the University of Zurich and enrolled 28 coronary heart disease patients, plasma concentrations of methylated arginines before and after the 8-week intake of pine bark extract were determined. Despite of improvements in flow-mediated dilation parameters and decrease of 15-F2t-Isoprostane plasma concentrations there was no significant alteration of plasma concentrations of ADMA, SDMA and ET-1 (endothelin-1) after the pine bark extrakt intake. The nNOS is found in neuronal cells but is also expressed in other cell types like muscle cells. In a rhabdomyosarcoma (A-673) cell culture model the metabolite M1 had no meaningful effect on nNOS expression. In order to contribute answering the question whether polyphenols are likely to cross the blood brain barrier an in silico model for predicting polyphenol distribution between blood and brain tissue (logBB) was developed. logBB values for selected polyphenols were calculated and resulted in the following rank order with increasing probability of an uptake into the brain: protocatechuic acid< quercetin < cyanidin < (+) catechin < (-)-epicatechin < phloretin < M1. The metabolite M1 showed the highest logBB value of the tested polyphenols and thus had the highest predicted feasibility for crossing the blood brain barrier as described with the newly established computer based model. The extract of the fruits from Morinda citrifolia L. is traditionally utilized for the treatment of inflammatory diseases. Applying a primary human monocyte cell culture model the extract was tested for its ability to inhibit the secretion of matrix-metalloprotease-9 after an inflammatory stimulus. Dilutions of the extract in cell culture media showed profound concentration dependent inhibitory effects with up to a ~50 % decrease of metalloprotease secretion that were comparable to hydrocortisone. Thus, new and substantial contributions were made in this work allowing a better understanding of the mode of action of the tested plant extracts, especially of the effects of polyphenols on physiological relevant nitric oxide systems, and gaining a deeper methodical knowledge in the challenging field of NO-analysis. KW - Stickstoffmonoxid KW - Strandkiefer KW - Rinde KW - Extrakt KW - Stickstoffmonoxid-Synthase KW - Metabolit KW - EA.hy 926 KW - DAF-2 KW - Radikal KW - HPLC KW - Monozyten KW - free radicals KW - DAF-2 KW - (+)-Catechin KW - nitric oxide KW - metabolite KW - hplc KW - EA.hy 926 KW - monocyte KW - macrophage Y1 - 2012 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-72102 ER - TY - JOUR T1 - einBlick - Ausgabe 29 - 24. Juli 2012 N2 - Nachrichten aus der Julius-Maximilians-Universität Würzburg KW - Würzburg KW - Universität KW - University KW - Wuerzburg KW - Wurzburg Y1 - 2012 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-72213 VL - 29/2012 ER - TY - THES A1 - Mögele, Stefanie T1 - Retrospektive klinische Studie zur Überlebenswahrscheinlichkeit von Stift-Stumpfaufbauten T1 - Retrospective clinical study on the survival probability of cast post and cores N2 - Ziel der retrospektiven Studie war es, den Einfluss der prothetischen Restauration, beziehungsweise der Position des Pfeilers im Zahnbogen sowie der Art des restaurierten Zahnes auf das Überleben von mit Stift-Stumpfaufbauten rekonstruierten Zähnen zu untersuchen. Die verschiedenen Parameter, die zu Erfolg oder Misserfolg geführt haben, sollten analysiert werden, um gegebenenfalls deren Einfluss auf die Verweildauer der Stift-Stumpfaufbauten beziehungsweise der damit versorgten Zähne in Form einer Überlebenszeitanalyse zu untersuchen Seit 1999 wurden Patienten, die in der Klinik mit einem Stift-Stumpfaufbau versorgt worden waren, protokollarisch erfasst. Die koronal stark zerstörten Zähne wurden durch ein weitgehend standardisiertes Behandlungsverfahren rekonstruiert und mit diversen prothetischen Restaurationen versehen. Das Patientenkollektiv umfasste 195 Patienten mit 320 Stift-Stumpfaufbauten. Zur Überlebenszeitanalyse kam die Methode nach Kaplan-Meier zum Einsatz. Die gruppenbezogenen Überlebenskurven wurden mittels Log-Rang-Test auf statistische Signifikanz getestet. Die häufigsten Misserfolgsgründe stellten Dezementierungen der Stift-Stumpfauf- bauten und Entzündungszeichen mit apikalen Läsionen dar. Die Ergebnisse dieser Studie zeigten, dass der Erfolg einer postendodontischen Stiftverankerung je nach Zahntyp und Art der prothetischen Versorgung variierte. Festsitzende prothetische Restaurationen auf der Basis eines Stift-Stumpfaufbaus im Frontzahn- und Prämolarenbereich hatten eine relativ hohe Überlebeswahrscheinlichkeit, vor allem wenn sie Brückenpfeiler waren. War der mit einem Stift-Stumpfaufbau rekonstruierte Zahn aber endständig in der Zahnreihe, überdurchschnittlichen Belastungen ausgesezt - wie der Eckzahn - oder diente als endständiger Pfeiler einer herausnehmbaren teleskopierenden Prothese, waren frühzeitige Komplikationen wahrscheinlich. Die Ergebnisse zeigten, dass eine primäre Verblockung die Überlebenswahrscheinlichkeit von Innenteleskopkronen positiv beeinflussen konnte. N2 - The aim of the retrospective study was to examine the influence of the prosthetic restauration, the location of the tooth in the dental arc and the type of tooth restored on the survival time of teeth restored with cast post and cores. The different factors, leading to sucess or failure should be analysed to identfiy the influence on durability of post and cores and restored teeth. Since 1999 files of patiens who received cast post and cores were colleted. The teeth with coronal hard-tissue defects were restored using standardised techniques and were prepared for fitting permanent prosthetic restauration. 195 patients with 320 cast post and cores were collected. The survival probability was assesed using Kaplan-Meier analysis; Log-Rank-test was used to asses statistically significant risk of failure between sub-assembly groups. The most common causes of failure were loss of retention and inflammation with apical lesion. The results of the study represent that success did depend on type of tooth restored and type of restauration fitted. High survival probability was reached for cast post and cores fitted in the anterior and premolar region especially when they were bridge abutments. For teeth restored with cast post and cores at the end of the dental arc, exposed to superior stress - like canins or terminal abutments of a telescopic crown retainted removable partial denture, early failures were supposable. With regard to the results of the study the survival probability of telescopic crowns seemed to be enhanced by primary locking. KW - Überlebenszeit KW - Klinisches Experiment KW - survival probability Y1 - 2012 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-72075 ER - TY - THES A1 - Wehner, Nora T1 - Etablierung und Anwendung molekularer Methoden zur Analyse des Arabidopsis thaliana Transkriptionsfaktor-ORFeoms T1 - Establishment and application of molecular tools to analyse the Arabidopsis thaliana transcription factor ORFeome N2 - Transkriptionsfaktoren (TF) sind wichtige Regulatoren der Genexpression. In Arabidopsis kodieren ca. 1500-2000 Gene für TF, von denen die Mehrheit bis heute nicht funktionell charakterisiert ist. Um die Aufklärung der TF-Funktionen weiter voranzutreiben, werden daher Analyse-Plattformen für Hochdurchsatzverfahren immer wichtiger. In den letzten Jahren sind umfangreiche Gateway® -kompatible ORF (open-reading-frame)-Kollektionen für Arabidopsis aufgebaut worden, die nun als nützliche Ressourcen für genetische Analysen zur Verfügung stehen. Auf Grundlage dieser Kollektionen wurde in dieser Arbeit eine neue Screening-Plattform etabliert, mit der trans-regulatorische Eigenschaften von TF in einem Hochdurchsatzverfahren untersucht werden können. Ein Mikrotiterplatten-System für Protoplastentransformationen erlaubt die transiente Koexpression von 96 verschiedenen TF-Expressionsvektoren mit einem Promotor:Luciferase-Reporter der Wahl. Das Transaktivierungspotential jedes einzelnen TF kann über die Luciferaseaktivität bestimmt werden, indem emittierte Lumineszenz in einem Luminometer detektiert wird. Die Funktionalität des PTA (Protoplast Trans Activation)-Systems wurde anhand einer Transaktivierungsstudie der bereits gut charakterisierten Promotoren von RD29A und PDF1.2 und der ERF (Ethylene Response Factor)-TF-Familie überprüft, wobei bekannte Bindungsspezifitäten der TF bestätigt werden konnten. Für das System wurde eine umfassende Arabidopsis TF-Kollektion aufgebaut. Ca. 950 verschiedene Gateway® -kompatible TF-Expressionsvektoren stehen für Screening-Ansätze zur Verfügung. Für das PTA-System wurden verschiedene Anwendungen etabliert. Neben transaktivierenden, konnten beispielsweise auch repressive Eigenschaften von TF bestimmt werden. Darüber hinaus wurde gezeigt, dass es möglich ist, (I) die Expression von Promotoren gezielt durch verschiedene Stimuli, wie Salz oder Pflanzenhormone zu modulieren, (II) Protein-Protein-Interaktionen zu bestimmen, sowie (III) den Einfluss von Signalmolekülen (wie z. B. Kinasen) auf ihre Aktivierungseigenschaften zu untersuchen. Das PTA-System wurde in verschiedenen Screening-Ansätzen zur Identifizierung transkriptioneller Regulatoren pflanzlicher Stressantworten eingesetzt. In einer Analyse des Auxin-induzierbaren GH3.3-Promotors wurde dabei gezeigt, dass weit mehr bZIP-TF Einfluss auf die Auxin-vermittelte GH3.3-Expression haben, als bisher angenommen. Beispielsweise zeigten bZIP16 und bZIP68 ein höheres Transaktivierungspotential, als die bisher beschriebenen bZIP-Regulatoren der GH3.3-Expression. In einem zweiten Ansatz wurde die koordinierte Regulation der Biosynthese von Tryptophan-abgeleiteten antimikrobiellen Sekundärmetaboliten (Indol-Glukosinolate, Camalexin) untersucht. Dabei konnten ERF-TF der phylogenetischen Gruppen VIII und IX als potentielle Regulatoren mehrerer wichtiger Gene der Biosynthesewege identifiziert werden. Mit einem zusätzlichen Screening-Ansatz der gesamten TF-Expressionsvektor-Kollektion und einem Markerpromotor des Camalexin-Biosynthesewegs wurden weitere potentielle Regulatoren identifiziert, von denen einige bereits in der Pathogenantwort beschrieben sind. In einem weiteren Schwerpunkt dieser Arbeit wurde die von Weiste et al. (2007) etablierte Arabidopsis thaliana TF-ORF-Überexpressions-Kollektion (AtTORF-EX) erweitert. Mit Hilfe des dafür entwickelten Hochdurchsatzverfahrens zur Generierung stabil transformierter Pflanzenlinien wurden neue Überexpressionssamen-Kollektionen hergestellt und anschließend in einem Screening-Ansatz auf erhöhte Toleranz gegenüber oxidativem Stress getestet, wobei die Chemikalie Paraquat als oxidativer Stress-Geber eingesetzt wurde. Die TF bZIP1 und OBP1 konnten dabei als Resistenz-vermittelnd identifiziert werden. Zusammenfassend wurden in dieser Arbeit mit Hilfe beider Systeme neue potentielle Regulatoren pflanzlicher Stressantworten identifiziert. N2 - Transcription factors (TFs) are important cellular regulators of gene expression. In Arabidopsis approximately 1500-2000 genes encode for TFs. Until now, the majority of these genes has not been functionally characterized. To further promote the evaluation of TF function, high-throughput tools are required. In recent years, comprehensive Arabidopsis open reading frame (ORF) collections have been established, which are valuable resources for functional genomics. Based on these collections a high-throughput microtiter plate based Protoplast Trans Activation (PTA) system has been established to screen for TFs which regulate a given promoter:Luciferase construct in planta. 96 protoplast transfection experiments can be performed simultaneously in a standard microtiter plate. Transactivation of a promoter:Luciferase reporter is measured via luciferase imaging. A screening collection of roughly 950 TFs expression vectors has been assembled using Gateway® technology and can be tested in various screening approaches. In this respect, it is possible to analyze transactivating as well as repressive properties. Moreover (I) stimulus induced transcription, (II) studies of protein-protein interaction and (III) the impact of signaling molecules (e.g. kinases) on the promoters activation potential can be measured. To demonstrate the feasibility of the high-throughput system, the transactivating properties of the Ethylene Response Factor (ERF) TF family were studied in combination with the well-characterized RD29A and PDF1.2 promoters. By this means, known binding specificities of the TF family were confirmed. Furthermore, the PTA-System was applied to identify transcriptional regulators involved in plant stress responses. In one approach the influence of bZIP TFs on the auxin-inducibility of the GH3.3-promoter was studied. In particular, bZIP16 and bZIP68 showed a stronger transactivation potential than those bZIPs which were previously described to regulate this auxin-responsive promoter. In an independent approach the transcriptional regulation of tryptophan-derived antifungal compounds (indol-glycosinolates, camalexin) biosynthesis has been studied. ERF TFs of the groups VIII and IX were identified as potential regulators of several biosynthetic genes. A subsequent screening approach of a key promoter of the camalexin biosynthetic pathway disclosed further potential regulators. Among these TFs, many have been described previously in plant pathogen responses. As a second approach to examine TF function the Arabidopsis thaliana TF ORF-EXpression-library (AtTORF-EX) established by Weiste et al. (2007) was extended. The developed high-throughput transformation procedure was used to generate new TF overexpression seed collections. Afterwards the library was applied in a screening approach to identify regulators which mediate enhanced tolerance towards the oxidative stress inducing chemical Paraquat. Thus, the TFs bZIP1 and OBP1 were found to promote resistance against Paraquat when overexpressed in Arabidopsis. In summary, using both approaches novel putative regulators of plant stress response signaling were identfied. KW - Ackerschmalwand KW - Transkriptionsfaktor KW - Protoplast KW - High throughput screening KW - Genaktivierung KW - Arabidopsis thaliana KW - transcription factor KW - protoplast KW - high throughput screening KW - gene activation Y1 - 2012 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-72057 ER - TY - RPRT A1 - Ratz, Christoph A1 - Dworschak, Wolfgang A1 - Gross, Peter T1 - Hilfebedarf im Ambulant Betreuten Wohnen. Ein Vergleich von H.M.B.-W. und ICF-BEST. Abschlussbericht des Forschungsprojektes HAWO N2 - Hilfebedarfserhebung und -bemessung im Bereich Ambulant betreutes Wohnen für Menschen mit geistiger und körperlicher Behinderung - Vergleich eines ICF basierten Verfahrens mit dem HMB-W KW - Eingliederungshilfe KW - ICF KW - Behinderung KW - Geistige Behinderung KW - Geistigbehindertenpädagogik KW - Körperbehinderung KW - Körperbehindertenpädagogik KW - Wohnen KW - ambulant betreutes Wohnen Y1 - 2012 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-71919 ER - TY - JOUR T1 - einBlick - Ausgabe 28 - 17. Juli 2012 N2 - Nachrichten aus der Julius-Maximilians-Universität Würzburg KW - Würzburg KW - Universität KW - University KW - Wuerzburg KW - Wurzburg Y1 - 2012 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-72069 VL - 28/2011 ER - TY - THES A1 - Hubertus, Katharina T1 - Regulation des cAMP Spiegel und der Signaltransduktion in humanen Thrombozyten durch Prostanoid-Rezeptoren T1 - Regulation of cAMP level and signaltransduction in human platelets by prostanoid-receptors N2 - Prostanoide wirken über Prostanoid-Rezeptoren auf die Aktivierung oder Hemmung der Thrombozyten. In dieser Arbeit wurde die Existenz und Funktionsweise der Prostanoid-Rezeptoren anhand synthetischer Agonisten und Antagonisten in humanen Thrombozyten nachgewiesen. Weiter wurde untersucht, über welche Prostanoid-Rezeptoren die Signaltransduktion der natürlichen Agonisten wie PGE2, PGE1 und PGA1 vermittelt wird, sowie das Zusammenspiel der Prostanoid-Rezeptoren auf die Aktivierung oder Hemmung der Thrombozyten gezeigt. Das Vorhandensein der Prostaglandin E2 Synthase 3 wurde nachgewiesen sowie erste Anhaltspunkte für die Existenz eines Komplexes aus Prostaglandin E2 Synthase 3, Hitzeschockprotein-90 sowie Casein Kinase 2 gezeigt. N2 - Prostanoids act to platelet activation or inhibition via prostanoid-receptors. In this work, the existence and function of prostanoid receptors in human platelets was shown by using sythetic agonists and antagonists. Further, the prostanoid receptors taking part at the signaltransduction induced by endogen prostanoids like PGE2, PGE1 and PGA1 were examinated. The interactions of the prostanoid receptors in platelet activation and inhibition were shown. The existence of prostaglandin E2 synthase 3 in human platelets was shown and first evidence for a complexe of prostaglandin E2 synthase 3, heat shock protein 90 and casein kinase 2 was given. KW - Prostaglandine KW - Rezeptor KW - Cyclo-AMP KW - Prostanoid-Rezeptor KW - cAMP KW - Prostanoide KW - Thrombozyt KW - prostanoid receptor KW - platelets KW - cAMP KW - prostanoids Y1 - 2012 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-71996 ER - TY - THES A1 - Stingl, Lavinia T1 - Die Bedeutung des Hitzeschockproteins HSP90 für die Strahlenempfindlichkeit von Tumorzellen unterschiedlicher Entitäten T1 - The Role of the heat shock protein HSP90 for the radiation response of tumor cells of different entities N2 - Krebs ist die zweithäufigste Todesursache in Deutschland. Für die Behandlung von Tumorerkrankungen wird unter anderen die Strahlentherapie angewendet. Allerdings ist die Wirkung der Bestrahlung durch die Radiotoxizität auf normalem Gewebe sowie durch die Radioresistenz vieler Tumoren bei klinisch relevanten Dosen limitiert. Ein vielversprechendes Target für die Radiosensibilisierung von Tumorzellen scheint das Hitzeschockprotein HSP90 zu sein, ein wichtiges molekulares Chaperon, das für die Faltung, Aktivierung, Translokation und Degradation der so genannten Klientenproteine zuständig ist. Durch die pharmakologische Blockierung seiner Funktion wird die simultane Degradation multipler HSP90 Klientenproteine eingeleitet, darunter Radioresistenz-assoziierte Proteine wie RAF-1, AKT, EGFR, Survivin, DNA-Reparaturproteine. Verschiedene Studien belegen das Potential der HSP90 Inhibitoren Geldanamycin und seiner Derivaten als Radiosensibilisatoren. Im Gegensatz zu diesen Substanzen sind die neuartigen HSP90 Inhibitoren NVP-AUY922 und NVP-BEP800 wasserlöslich und nicht hepatotoxisch. Im ersten Teil der Arbeit wurde die Wirkung von NVP-AUY922 und NVP-BEP800 (200 nM, 24 h vor der Bestrahlung) auf die Strahlenempfindlichkeit humaner Tumorzelllinien unterschiedlicher Entitäten, darunter eine Lungenkarzinomzellinie A549, eine Fibrosarkomzelllinie HT1080, sowie zwei Glioblastomzelllinien GaMG und SNB19, untersucht. Die neuartigen HSP90 Inhibitoren zeigten in Kolonietest eine strahlensensibilisierende Wirkung in allen getesteten Tumorzelllinien. Weiterhin wurde mit diversen Methoden den Mechanismus der Radiosensibilisierung untersucht. Die HSP90 Inhibition erhöhte den Anteil der Zellen mit hypodiploiden DNA-Gehalt in den meisten untersuchten Tumorzelllinien. Außerdem induzierte die HSP90 Inhibition die Depletion der anti-apoptotischen Proteine AKT, pAKT und RAF-1 in allen Tumorzelllinien. Wie die erhöhte Expression von beiden Apoptosemarkern, aktivierte Caspase-3 und inaktiviertes PARP, nahe legt, wurde verstärkt die Caspase-abhängige Apoptose in den meisten untersuchten Tumorzelllinien nach HSP90 Inhibition eingeleitet. Laut Comet Assay induzierte die HSP90 Inhibition eine geringere DNA-Fragmentierung in bestrahlten Tumorzellen, gleichzeitig konnte aber eine langsamere Restitution der chromosomalen DNA festgestellt werden. Über die Messungen der γH2AX-Expression als Marker für DNA-Doppelstrangbrüche konnte eine erhöhte Induktion von DNA-Schäden nach HSP90 Inhibition und Bestrahlung sowie eine verlangsamte Reparatur der induzierten DNA-Schäden gemessen werden. Diese korrelierte mit der Depletion der DNA-Reparaturproteine KU70/KU80. Die HSP90 Inhibition führte zusätzlich zu einem ausgeprägten G2/M-Arrest, der durch die Bestrahlung verstärkt werden konnte. NVP-AUY922 induzierte außerdem eine Depletion der S-Phase. Die Depletion der Zellzyklus-regulierenden Proteine CDK1 und CDK4 sowie pRB korrelierte mit den beobachteten Zellzyklusstörungen. Die hier gewonnenen Ergebnisse verdeutlichen, dass der komplexe Mechanismus der Radiosensibilisierung nach HSP90 Inhibition die simultane Degradation diverser HSP90 Klientenproteine involviert, was verschiedene zelluläre Auswirkungen hat: verlangsamte Zellteilung durch anhaltende Zellzyklusstörungen, erhöhte DNA-Schäden und Verlangsamung der Reparatur der DNA-Schäden nach Bestrahlung sowie Apoptoseinduktion. Die HSP90 Inhibition induzierte gleichzeitig die Expression der Hitzeschockproteine HSP90 und HSP70, deren anti-apoptotischen Funktionen die radiosensibilisierenden Effekte der HSP90 Inhibitoren vermindern können. In dieser Arbeit wurden zwei Strategien getestet, um die Hochregulation von HSP90/HSP70 nach HSP90 Inhibition in den Tumorzelllinien A549 und GaMG zu unterdrücken. Zum einen wurden siRNAs gegen die stressinduzierbare α-Isoform von HSP90 angewendet, zum anderen wurde KNK437, eine Substanz die die Expression der HSP auf Transkriptionsebene unterdrückt, eingesetzt. Im zweiten Teil der Arbeit konnte gezeigt werden, dass die Transfektion mit siRNA gegen HSP90α gefolgt von NVP-AUY922 die Hochregulation von HSP90α um circa 50% unterdrückte. Allerdings wurde dadurch keine Erhöhung der NVP-AUY922-vermittelten Radiosensibilisierung erreicht. Es wurden außerdem keine signifikanten Veränderungen betreffend der Induktion und Reparatur der DNA-Schäden, Zellzyklusverteilung, Apoptoseinduktion sowie Expression der getesteten HSP90 Klientenproteine im Vergleich zu alleiniger HSP90 Inhibition festgestellt. Im dritten Teil der Arbeit konnte gezeigt werden, dass die simultane Behandlung mit NVP-AUY922 und KNK437 die NVP-AUY922-vermittelte Hochregulation von HSP90 und HSP70 in beiden Tumorzelllinien temporär unterdrückt. Obwohl die alleinige Behandlung mit KNK437 in der A549-Tumorzelllinie laut Kolonietest radiosensibilisierend wirkte, konnte die simultane Behandlung mit beiden Inhibitoren die NVP-AUY922-vermittelte Radiosensibilisierung nicht erhöhen. Obwohl die Unterdrückung der Stressantwort nach HSP90 Inhibition mittels KNK437 in beiden Tumorzelllinien einen anhaltenden G2/M-Arrest induzierte, blieb die Expression der anti-apoptotischen HSP90-Klientenproteine AKT und RAF-1 unverändert im Vergleich zu NVP-AUY922. Außerdem wurde die inhibierende Wirkung von NVP-AUY922 auf die Reparatur der strahleninduzierten DNA-Schäden nicht erhöht. Die hier gezeigten in vitro Ergebnisse unterstützen die Anwendung von NVP-AUY922 und NVP-BEP800 für in vivo Studien sowie in klinischen Studien alleine oder in Kombination mit der Bestrahlung. Unsere Arbeit ist von besonderem Interesse für die Strahlentherapie, da NVP-AUY922 bereits in klinischen Studien getestet wird. N2 - Besides important improvement of tumor therapy, which increased the chance of survival for the patients, cancer remains the second cause of death in Germany. Among others, radiotherapy is one of the treatment options for tumor diseases. However, radiotherapy has some limitations due to the radiotoxicity on normal tissue and to the radioresistance of several tumors at therapeutic doses. One of the promising radiosensitizers of tumor cells seems to be the heat shock protein HSP90 – an essential molecular chaperone involved in folding, activation, translocation and degradation of its so called client proteins. The pharmacological inhibition of its chaperone function leads to simultaneous degradation of several HSP90 client proteins such as RAF-1, AKT, EGFR, survivin, DNA repair proteins and consequent disruption of several radioresistance-associated pathways. Several studies proved the radiosensitizing ability of geldanamycin and its derivates. In contrast to these drugs, the synthetic HSP90 inhibitors NVP-AUY922 and NVP-BEP800 are more water soluble and not hepatotoxic. In the first part of this work, we tested the effect of NVP-AUY922 and NVP-BEP800 (200 nM, 24 h prior irradiation) on the radiation response of tumor cell lines of different entities: the lung carcinoma A549, the fibrosarcoma HT1080 and the glioblastoma cell lines GaMG and SNB19. The colony forming assay revealed that pre-treatment with the novel HSP90 inhibitors increased the radiosensitivity of all tested tumor cell lines. Furthermore we investigated the mechanism of radiosensitization after HSP90 inhibition. HSP90 inhibition led to an increased percentage of tumor cells with hypodiploid DNA content (subG1 fraction) in most tested cell lines. Moreover, it led to the depletion of the anti-apoptotic HSP90 client proteins AKT, pAKT and RAF-1. In addition, it increased the pro-apoptotic caspase-3 and PARP cleavage in most of the tested cell lines. Our comet assay revealed a lower DNA fragmentation in drug-treated and irradiated tumor cells, but a slower restoration of DNA damage. Measurements of γH2AX expression as a sensitive marker for DNA-DSB showed an increased induction of DNA damage as well as DNA repair protraction in drug-treated and irradiated tumor cells. Inhibition of DNA repair after HSP90 inhibition was supported by the depletion of the DNA repair proteins KU70/KU80. Moreover the novel HSP90 inhibitors led to an increased G2/M-arrest, which could be enhanced by irradiation. In addition, NVP-AUY922 induced S-Phase depletion. The cell cycle disturbances correlated with the drug-mediated degradation of cell cycle regulating proteins CDK4, CDK1 and pRB. In conclusion, our results made clear that the complex mechanism of radiosensitization involves simultaneous degradation of several HSP90 client proteins, thus causing slower proliferation of the tumor cells due to dramatic cell cycle disturbances, increased DNA damage and protraction of DNA repair after irradiation as well as apoptosis induction. However, the radiosensitizing effect of the novel HSP90 inhibitors might be limited by the simultaneous drug-mediated induction of the expression of the anti-apoptotic heat shock proteins HSP90 and HSP70. In this study, we tested two strategies to suppress the drug-mediated up-regulation of HSP90 and HSP70 in the tumor cell lines A549 and GaMG. The first strategy was the siRNA-mediated down-regulation of the stress-inducible isoform HSP90α, combined with drug treatment and irradiation. The second strategy was the inhibition of the stress response by simultaneous treatment with the HSF-1 inhibitor KNK437. In the second part of this work we could show that pre-silencing of HSP90α followed by treatment with NVP-AUY922 indeed reduced the drug-mediated up-regulation of HSP90α to about 50%. However, it did not enhance the radiosensitizing effect of NVP-AUY922. In addition, it did not show any significant changes concerning the induction and the repair of DNA damage, the cell cycle distribution or the expression of the tested HSP90 client proteins AKT, RAF-1, CDK1 and CDK4 compared with drug-only treatment. In the third part of this work we could show that simultaneous treatment with NVP-AUY922 and KNK437 temporary suppressed the NVP-AUY922-mediated up-regulation of HSP90 and HSP70. Although treatment with KNK437 alone increased the radiosensitivity of A549 tumor cells as shown by colony forming assays, simultaneous treatment with both inhibitors did not increase NVP-AUY922-mediated radiosensitization in both tumor cell lines. Our cell cycle analyses revealed that the suppression of stress response after HSP90 inhibition by KNK437 led to a sustained G2/M-arrest in both tumor cell lines. However, the expression of the anti-apoptotic proteins AKT and RAF-1 remained unchanged compared with HSP90 inhibition alone. The evaluation of γH2AX expression showed that simultaneous treatment did not enhance NVP-AUY922-mediated inhibition of DNA repair after irradiation. Our in vitro results support the use of the novel HSP90 inhibitors in in vivo studies as well as in clinical studies alone or in combination with irradiation. This work is of particular interest for the radiation therapy of cancer, because the novel HSP90 inhibitor NVP-AUY922 is currently in clinical trials. KW - Hitzeschockprotein KW - HSP90 KW - HSP90 Inhibitor KW - Radiosensibilisatoren KW - heat shock protein KW - HSP90 KW - HSP90 inhibitor KW - radiosensitizers Y1 - 2012 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-71984 ER -