TY - THES A1 - Schneider, Nicole T1 - Untersuchung der Expression von SET7 und anderer epigenetischer Enzyme in vitro und vivo im Modell der Atherosklerose T1 - Analysis of the expression of SET7 and other epigenetic enzymes in vitro and vivo in a model of atherosclerosis N2 - Bei der Atherosklerose handelt es sich um eine chronische inflammatorische Erkrankung, die sich an der arteriellen Gefäßinnenwand abspielt. Ihre Haupt-Manifestationsformen Schlaganfall und Herzinfarkt zählen zu den häufigsten Todesursachen weltweit. Eine chronische Endothelbelastung und -funktionsstörung, beeinflusst durch Risikofaktoren wie Diabetes, arterieller Bluthochdruck, Rauchen und Entzündungszustände, führen zur Permeabilitätserhöhung des Endothels, zur Zelleinwanderung, subendothelialen Lipidanreicherung, Migration glatter Muskelzellen und der Ausbildung atherosklerotischer Läsionen. Es kommt zu Aktivierung des Immunsystems und fortschreitender Entzündungsreaktion, schließlich zur Ausbildung eines nekrotischen Kerns und zunehmender Vulnerabilität des Plaques. Epigenetische Veränderungen betreffen klassischerweise das Chromatingerüst. Durch DNA-Methylierung und -Demethylierung sowie verschiedene Modifikationen der Histon-Proteine kann die DNA in ihrer Zugänglichkeit verändert werden. So kann die Transkription eines bestimmten Genes direkt und potenziell längerfristig beeinflusst werden, ohne dass Alterationen der DNA-Basenfolge selbst stattfinden. Das Enzym SET7 nimmt hierbei eine Sonderrolle ein, da es neben einer Methylierung von Histon 3 auch verschiedene zelluläre Zielstrukturen posttranslational direkt methylieren kann. Epigenetische Veränderungen im Kontext der Atherosklerose sind bereits vereinzelt beschrieben. Auch sind sie relevant in der Reaktion auf Umwelteinflüsse und bei inflammatorischen Vorgängen. Der Frage, ob epigenetische Mechanismen im atherosklerotischen Geschehen eine Rolle spielen, sollte in dieser Arbeit nachgegangen werden. Dazu wurde in Zellkulturversuchen für Makrophagen und glatte Muskelzellen geprüft, ob die einzelnen pro-atherosklerotischen Stimuli oxLDL, IL-1β, TNFα und LPS bereits zu relevanten Veränderungen epigenetischer Enzyme führen. Dies erfolgte über Vergleich der entsprechenden mRNA mittels qPCR. Zur Untersuchung der genaueren Dynamik wurde für die Enzyme SET7 und DNMT1 der zeitliche Ablauf dieser Reaktion auf TNFα-Stimulation in Makrophagen genauer betrachtet. Unter gleichen Versuchsbedingungen wurde außerdem die Änderung der mRNA-Expression einiger Matrixmetalloproteasen, TIMP-Enzyme, Zytokine und Transkriptionsfaktoren analysiert,um zukünftig kausale Zusammenhänge weiter aufdecken zu können. Auch die Frage nach Veränderungen epigenetischer Enzyme in der Ldlr-/--Maus nach fettreicher Diät im Vergleich zu Ldlr-/--Mäusen ohne Diät sollte hier beantwortet werden. Dazu wurde die mRNA der Zellsuspensionen aus Milz, Aortenwurzel und gesamter Aorta der Tiere mithilfe der qPCR verglichen. Schließlich sollte ein effizienter Weg für einen individuellen und flexiblen SET7 knock-out etabliert werden, um weitere Studien dieses Enzyms zu ermöglichen. Hierzu wurde die Methode des CRISPR/Cas9 Systems gewählt und abschließend die Funktionalität des Systems überprüft. N2 - Atherosclerosis is a chronic inflammatory disease which occurs at the inner layer of the artery wall. Its two main manifestations are stroke and myocardial infarction, which are two of the most common causes of death worldwide. Chronical endothelial stress and endothelial dysfunction, affected by different risk factors such as hypertension, diabetes mellitus, smoking, and an inflammatory state, lead to an increased permeability, cell accumulation, subendothelial lipid accumulation and migration of smooth muscle cells, causing immune system activation, a subsequent inflammatory reaction, and the formation of atherosclerotic lesions. Finally, the development of a necrotic core occurs, accompanied by a progressive plaque vulnerability. Epigenetic mechanisms affect the chromatin structure. Therefore, the accessibility of the DNA can be altered by DNA methylation, -demethylation and different modifications of histone proteins. This can directly affect the transcription of a certain gene in a potentially long-lasting way without altering the DNA base sequence itself. The enzyme SET7 is noteworthy because of its ability of direct methylation of different cellular targets in addition to its function as a histone 3 methyltransferase. Some epigenetic alterations in the context of atherosclerosis have already been described. Epigenetic changes also play a role in the reaction to environmental signals and in processes caused by inflammation. The aim of this study was to clarify whether epigenetic mechanisms play a role in atherosclerosis. Therefore, epigenetic alterations in macrophages and smooth muscle cells after pro-atherosclerotic stimulation with oxLDL, IL-1β, TNFα and LPS were tested in cell culture experiments and their mRNA expression was compared via qPCR. Regarding the dynamics, the temporal SET7 and DNMT1 expression after stimulation was investigated for macrophages in detail. Furthermore, changes of mRNA expression for certain matrix-metalloproteases, TIMP-enzymes, cytokines, and transcription factors could be detected under constant experimental conditions. By this, the detection of causal dependencies between individual changes could be facilitated in the future. To answer the question of relevant changes in epigenetic enzyme expression in Ldlr-/--mice after high-fat diet compared to mice without any diet, mRNA expression of cell suspension gained from the mice spleen, aortic sinus and total aorta were compared by using qPCR. Finally, an efficient way of knocking down SET7 was established by the usage of the CRISPR/Cas9 method, and functionality of this approach was demonstrated in this study. KW - Arteriosklerose KW - Epigenetik KW - Atherogenese KW - Atherosklerose KW - Atherosclerosis KW - epigenetics KW - SET7 Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-328952 ER - TY - THES A1 - Knochenhauer, Tim T1 - Die Rolle von HIF-1α in T-Zellen bei kardiovaskulären Erkrankungen T1 - Role of HIF-1α in T cells in cardiovascular diseases N2 - Die Atherosklerose ist als Ursache kardiovaskulärer Erkrankungen, welche die häufigste Todesursache weltweit darstellen, von großer klinischer und wissenschaftlicher Relevanz. Atherosklerose ist charakterisiert durch Einlagerungen von Lipiden in die Gefäßwand, welche zur Ausbildung von Plaques führen. Als Folge wird eine chronische Entzündungsreaktion eingeleitet, die durch spezifische Immunzellen, unter anderem T-Lymphozyten, und komplexe molekulare Prozesse aufrechterhalten wird. Durch eine verminderte Sauerstoffdiffusionskapazität und eine hohe Zelldichte ist das Milieu in den Plaques hypoxisch. Zur zellulären Anpassung an ein solches hypoxisches Milieu werden Hypoxie-induzierbare Faktoren (HIF) in den Immunzellen stabilisiert. Der Transkriptionsfaktor HIF-1 ist ein heterodimeres Protein, welches die Transkription bestimmter Zielgene initiiert, die den Zellen notwendige Adaptationen des Zellstoffwechsels an ein vermindertes Sauerstoffangebot ermöglichen. Das Ziel der vorliegenden Arbeit bestand darin zu untersuchen, inwiefern sich ein Ausschalten des Transkriptionsfaktor HIF-1α selektiv in T-Lymphozyten auf Atherosklerose und Myokardinfarkt auswirkt. Die funktionelle Bedeutung von HIF-1α in T-Zellen in der Pathogenese dieser Erkrankungen wurde an zwei Mausmodellen untersucht. Im Atherosklerose Modell wurde Biomaterial von LDLR-/- Mäusen mit T-Zell spezifischem Knockout von HIF-1α nach achtwöchiger fettreicher Western-Typ Diät untersucht. Histologisch zeigte sich eine vermehrte Plaqueausprägung und ein verminderter Makrophagenanteil in den Plaques. Durchflusszytometrisch und mittels qPCR konnten keine Unterschiede in der Lymphozytendifferenzierung in Milz und Lymphknoten dieser Mäuse nachgewiesen werden. Im Myokardinfarkt-Modell mit T-Zell spezifischem HIF-1α Knockout konnte in früheren Untersuchungen der Arbeitsgruppe eine vergrößerte Infarktzone mit eingeschränkter kardialer Funktion nachgewiesen werden. Histologisch konnte im Rahmen dieser Arbeit hierfür kein zellmorphologisches Korrelat in Kardiomyozytengröße oder der Vaskularisation des Myokards gefunden werden. In Zukunft könnte HIF-1α in T-Lymphozyten ein möglicher Angriffspunkt zur medikamentösen Prävention oder Therapie kardiovaskulärer Erkrankungen sein. N2 - Atherosclerosis is of great clinical and scientific relevance as a cause of cardiovascular disease, which is the most common cause of death worldwide. Atherosclerosis is characterized by deposition of lipids in the vessel wall, which leads to the formation of plaques. As a consequence, a chronic inflammatory response is initiated, which is maintained by specific immune cells, including T lymphocytes, and complex molecular processes. Due to a reduced oxygen diffusion capacity and a high cell density, the environment in the plaques is hypoxic. For cellular adaptation to such a hypoxic milieu, hypoxia-inducible factors (HIF) are stabilized in immune cells. The transcription factor HIF-1 is a heterodimeric protein that initiates the transcription of specific target genes that enable cells to make necessary adaptations of cellular metabolism to a reduced oxygen supply. The aim of the present work was to investigate the extent to which silencing of the transcription factor HIF-1α selectively in T lymphocytes affects atherosclerosis and myocardial infarction. The functional significance of HIF-1α in T cells in the pathogenesis of these diseases was investigated in two mouse models. In the atherosclerosis model, biomaterial from LDLR-/- mice with T-cell specific knockout of HIF-1α was examined after an eight-week high-fat Western-type diet. Histologically, there was increased plaque expression and decreased macrophage content in plaques. Flow cytometry and qPCR did not detect differences in lymphocyte differentiation in the spleen and lymph nodes of these mice. In the myocardial infarction model with T-cell specific HIF-1α knockout, an enlarged infarct zone with impaired cardiac function could be detected in previous studies of the research group. Histologically, no cell morphological correlate for this in cardiomyocyte size or myocardial vascularization could be found in this work. In the future, HIF-1α in T lymphocytes could be a potential target for drug prevention or therapy of cardiovascular diseases. KW - Hypoxie-induzierbarer Faktor KW - Arteriosklerose KW - T-Lymphozyt KW - Herzinfarkt KW - HIF-1α KW - HIF-1α KW - T-Lymphozyten KW - T cell KW - Atherosklerose KW - Atherosclerosis KW - CVD KW - Kardiovaskuläre Erkrankungen Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-322758 ER - TY - THES A1 - Westhofen, Thilo Chou-Jong T1 - Die Entwicklung und Charakterisierung Dendritischer Zell-Subsets in der gesunden und arteriosklerotischen Aorta T1 - The development and characterization of dendritic cell subsets in healthy and atherosclerotic aorta N2 - Arteriosklerose ist eine chronisch inflammatorische Erkrankung der Gefäßwand. Nach aktuellem Wissensstand sind Dendritische Zellen (DCs) maßgeblich an der Entstehung und dem Fortschreiten von Arteriosklerose beteiligt. In der Vergangenheit konnten für DCs unterschiedliche Subsets beschreiben werden, die sowohl proinflammatorische als auch immunregulatorische Funktionen übernehmen können. Die systematische Charakterisierung von DCs in der gesunden Aorta, sowie während der Entstehung von Arteriosklerose ist jedoch noch ausstehend. In der vorliegenden Arbeit wurde zunächst die systematische Einteilung von DCs in vitro mit Hilfe von DCs aus Flt3L-Knochenmarkskulturen durchgeführt. Aufbauend darauf erfolgte die systematische Analyse aortaler DCs durch tierexperimentelle Untersuchungen an gesunden C57BL/6J Mäusen, sowie Apolipoprotein E-defizienten (ApoE-/-) Mäusen und low-density-lipoprotein-receptor-defizienten (Ldlr-/-) Mäusen während der Atherogenese. Mittels immunhistochemischer Untersuchungen von CD11cYFPreporter Mäusen konnten zudem korrelierend DCs in der Gefäßwand der murinen Aorta lokalisiert werden. Zusammenfassend gibt die vorliegende Arbeit erstmalig einen systematischen Überblick über die einzelnen DC-Subsets in der gesunden Aorta und während der Atherogenese. Dies trägt zu einem besseren Verständnis der Rolle der einzelnen DC Subsets während der Entstehung der Arteriosklerose bei und bietet eine mögliche Grundlage für zukünftige Behandlungsstrategien. Die Ergebnisse dieser Arbeit wurden im Februar 2014 als Originalarbeit in geteilter Erstautorenschaft von Martin Busch, Thilo Westhofen und Miriam Koch unter dem Titel Dendritic Cell Subset Distributions in the Aorta in Healthy and Atherosclerotic Mice im Plos One publiziert (1). Die Originalpublikation findet sich im Folgenden unter Absatz 11. Die Ergebnisse dieser Publikation wurden modifiziert unter 6.1-6.5 dargelegt und unter 7.1-7.5 im Kontext der aktuellen Literatur diskutiert. Sofern nicht anders angegeben, wurden alle Experimente von Thilo Westhofen geplant, durchgeführt und ausgewertet. N2 - Atherosclerosis is a chronic inflammatory disease of the vessel wall. According to current knowledge, dendritic cells (DCs) are significantly involved in the development and progression of atherosclerosis. In the past, different subsets could be described for DCs, with both proinflammatory and immunoregulatory functions. However, the systematic characterization of DCs in the healthy aorta, as well as during the development of atherosclerosis, is still pending. In the present work, the systematic classification of DCs in vitro was first performed using DCs from Flt3L bone marrow cultures. Based on this, the systematic analysis of aortic DCs was performed by animal studies in healthy C57BL/6J mice, as well as apolipoprotein E-deficient (ApoE-/-) mice and low-density lipoprotein receptor-deficient (Ldlr-/-) mice during atherogenesis. In addition, applying immunohistochemical studies of CD11cYFPreporter mice, correlating DCs were localized in the vessel wall of the murine aorta. In the aorta of healthy C57BL/6 mice and Ldlr-/- mice on a normal diet, CD11c+MHCII+ DCs could be identified and subdivided into 4 distinct subsets CD103-CD11b+F4/80+, CD103-CD11b+F4/80-, CD103-CD11b-F4/80- DCs and CD103+CD11b-F4/80- DCs. After 6 or 12 weeks of proatherogenic high-fat diet, all subsets except the CD103-CD11b-F4/80- DCs showed relevant growth. More detailed characterization of the subsets showed Sirpα expression for the CD103-CD11b+F4/80+subset, the CD103-CD11b+F4/80- subset and partially for the CD103-CD11b-F4/80- subset, but not for CD103+DCs. For all subsets, there were no relevant dynamics during atherogenesis. For CD64, however, no expression in the healthy aorta could be shown for any of the DC subsets. After 12 weeks of proatherogenic high-fat diet, the CD103-CD11b+F4/80- and the CD11b+F4/80+ subset showed a proportional CD64 expression. Conversely, mice with FMS-like tyrosine kinase 3 ligand deficiency (Flt3L-/-) showed loss of CD103-CD11b+F4/80- DCs and CD103+DCs, but not the other subsets. Furthermore, the CD103-CD11b+F4/80- subset and the CD103-CD11b+F4/80+ subset showed an increase in CX3CR1 expression during atherogenesis. In the healthy aorta, no subset showed relevant proportions of CX3CR1-expressing DCs. This suggests an increase of these subsets by possible migrated monocytes. Immunohistochemically, CX3CR1GFPreporter mice were able to locate corresponding CX3CR1+ cells luminal in plaque areas of the aorta. In summary, the present work provides for the first time a systematic overview of the individual DC subsets in the healthy aorta and during atherogenesis. This contributes to a better understanding of the role of the individual DC subsets during the development of atherosclerosis and provides a possible basis for future treatment strategies. The results of this work were published in February 2014 as an original paper with shared first authorship by Martin Busch, Thilo Westhofen and Miriam Koch under the title Dendritic Cell Subset Distributions in the Aorta in Healthy and Atherosclerotic Mice in Plos One (1). KW - Dendritische Zelle KW - Arteriosklerose Y1 - 2022 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-296210 ER -