TY - THES A1 - Lauber, Paloma T1 - Die Rolle individueller NFAT-Faktoren in Lymphozyten und Keratinozyten T1 - The role of individual NFAT factors in lymphocytes and keratinocytes N2 - In der vorliegenden Arbeit wurde die Rolle der Transkriptionsfaktoren NFATc1/αA bzw. NFATc1/ßC und NFATc2 in NK-Zellen und die Rolle der Faktoren NFATc1-4 und NFAT5 in Keratinozyten analysiert. Die Familie der Nuclear Factor of Activated T-cell (NFAT) Transkriptionsfaktoren besteht aus fünf Mitgliedern, welche entscheidend die Gentranskription bei Immunantworten beeinflussen. Nach Antigenaktivierung wird in Lymphozyten die Expression des Nfatc1-Gens stark induziert. Die Akkumulation der dabei gebildeten kurzen Isoform NFATc1/αA ist für die Zytokinproduktion als Effektorfunktion sowie für die Proliferation und das Überleben aktivierter Zellen verantwortlich. Das kurze NFATc1-Protein unterscheidet sich nicht nur strukturell, sondern auch funktionell von fast allen anderen NFAT-Proteinen. Um neue Erkenntnisse über die Funktion der Isoform NFATc1/αA in Lymphozyten zu gewinnen, wurden KT12 NK-Zellen mit NFATc1/αA bzw. NFATc1/ßC und NFATc2- exprimierenden Vektoren transfiziert, geklont, stimuliert und anschließend auf ihre jeweilige Apoptoserate und die Zytokinsynthese bzw. -expression hin untersucht. Die gewählten KT12-Hybridoma-Zellen erwiesen sich allerdings in ihrer intendierten Funktion als Testzellen für die Über-Expression von NFATc-Proteinen in NK-Zellen als ungeeignet. Fehlregulationen von NFAT-Signalwegen werden mit einer fehlerhaften Entwicklung des Immunsystems, mit der Entstehung von Autoimmunerkrankungen und mit Krebs in Verbindung gebracht. Um die Rolle von NFAT-Faktoren in Keratinozyten besser zu verstehen, wurden HaCaT-Zellen und primäre humane Keratinozyten mit Differenzierungssignalen bzw. UVB-Licht stimuliert. Änderungen der Transkription von NFAT-Faktoren, Keratinozyten-spezifischen Proteinen und Chemokinen wurden mittels qRT-PCR-Assays detektiert und analysiert. Insgesamt konnte die Beteiligung von NFAT-Faktoren am Differenzierungsprozess und an der UV-Antwort von Keratinozyten gezeigt werden. Es zeigte sich tendenziell eine stärkere Induktion der kurzen NFATc1-Isoform im Vergleich zu langen NFATc1-Isoformen, was die Frage nach einer besonderen Funktion der kurzen NFATc1-Isoform in Keratinozyten aufwirft. Generell ließen sich besonders hohe Expressionslevel des Transkriptionsfaktors NFAT5 - verglichen mit anderen NFAT-Faktoren - messen. Für die Entwicklung von Therapien, welche die Ursachen und Folgen einer dysregulierten Hautbarrierenbildung behandeln, könnten sich weitere Studien zu einzelnen NFAT-Faktoren bzw. NFATc1-Isoformen als zielführend erweisen. N2 - In the present work the role of the transcription factors NFATc1/αA or NFATc1/ßC and NFATc2 in NK cells and the role of the factors NFATc1-4 and NFAT5 in keratinocytes were investigated. The nuclear factor of activated T-cell (NFAT) transcription factor family consists of five members that critically influence gene transcription in immune responses. Following antigen activation, expression of the Nfatc1 gene is strongly induced in lymphocytes. Accumulation of the short NFATc1/αA isoform - formed in this process - is responsible for cytokine production as an effector function and for proliferation along with the survival of activated cells. The short NFATc1 protein differs not only structurally but also functionally from almost all other NFAT proteins. To gain new insights into the function of the NFATc1/αA isoform in lymphocytes, KT12 NK cells were transfected with NFATc1/αA, NFATc1/ßC or NFATc2- expressing vectors. The KT12 cells were cloned, stimulated and subsequently analyzed for their respective apoptosis rates together with cytokine synthesis or expression. However, the selected KT12 hybridoma cells proved to be unsuitable in their function as test cells for the overexpression of NFATc proteins in NK cells. Misregulation of NFAT signaling pathways has been associated with defective development of the immune system and autoimmune diseases and cancer. To better understand the role of NFAT factors in keratinocytes, HaCaT cells and primary human keratinocytes were stimulated with differentiation signals and UVB light, respectively. Changes in transcription of NFAT factors, keratinocyte-specific proteins and chemokines were detected and analyzed by qRT-PCR assays. Overall, the involvement of NFAT factors in the differentiation process and UV response of keratinocytes was demonstrated. The short NFATc1 isoform tended to be more strongly induced compared with long NFATc1 isoforms, raising the question of a special function of the short NFATc1 isoform in keratinocytes. Particularly high expression levels of the transcription factor NFAT5 - compared to other NFAT factors - could be measured. For the development of therapies that treat the causes and consequences of dysregulated skin barrier formation further studies on individual NFAT factors or NFATc1 isoforms will prove useful. KW - Keratinozyt KW - Natürliche Killerzelle KW - Transkriptionsfaktor KW - Chemokin CXCL10 KW - Chemokine KW - NFAT KW - Differenzierung KW - UV-Strahlung KW - Keratine Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-240119 ER - TY - THES A1 - Gehringer, Rebekka T1 - Periphere Mechanismen von Elektroakupunktur bei Entzündungsschmerz T1 - Peripheral mechanisms of electroacupuncture in inflammatory pain N2 - Die Grundlage für diese Arbeit bildete ein Modell mit CFA-(komplettes Freundsches Adjuvant) induziertem Entzündungsschmerz in Ratten, bei denen eine zweimalige Behandlung mit Elektroakupunktur zu einer langanhaltenden Antinozizeption führte, welche abhängig von peripheren Opioiden war. In einem nächsten Schritt sollten nun die durch Akupunktur vermittelten Zytokin- und Chemokinveränderungen untersucht und deren Beitrag zu den antinozizeptiven und anttiinflammatorischen Mechanismen geklärt werden. Mittels ELISA und PCR wurden die Protein- und mRNA-Level der klassischen Zytokine und des Chemokins CXCL10 bestimmt. CXCL10, welches durch Elektroakupunktur sowohl auf Transkriptions- als auch auf Translationsebene hochreguliert wurde, ist notwendig für die Rekrutierung β-Endorphin haltiger Makrophagen in das entzündete Gewebe und für die antinozizeptive Wirkung der Akupunkturbehandlung. Ein antiinflammatorischer Effekt der Akupunkturbehandlung äußerte sich durch die Reduktion von TNF-α und IL-1β und ein erhöhtes IL-13. Das einzige hochregulierte proinflammatorische Zytokin war IFN-γ. Ein Teil der entzündungshemmenden Wirkung, die Reduktion der proinflammatorischen Zytokine TNF-α und IL-1β, wird durch Adenosin-2B-Rezeptoren vermittelt, welche bekannt sind für ihre Rolle in der „Deaktivierung“ IFN-γ-stimulierter Makrophagen. Diese Ergebnisse verweisen auf die bisher unbekannte Verbindung zwischen chemokinvermittelter peripherer, opioidabhängiger Antinozizeption durch Elektroakupunktur. Sie erweitern das Verständnis für das Zusammenspiel von Immunzellen, Adenosin und Akupunktur. Weitere Untersuchungen sind notwendig, um neuroimmunologische Verbindungen zu klären und die Wirkungen durch die Nadelinsertion mit Effekten in der entfernten Rattenpfote besser zu verstehen. N2 - This work is based on a rat model with complete Freund's adjuvant (CFA)-induced hind paw inflammation. Animals were treated twice with electroacupuncture eliciting long-term antinociception, which depended on peripheral opioids. In a next step we wanted to study acupuncture mediated changes in cytokine and chemokine profiles and their contribution to antinociceptive and anti-inflammatory mechanisms. For the measurement of protein and mRNA levels of classical cytokines and the chemokine CXCL10 ELISA and real-time PCR were used. CXCL10, which was upregulated on transcriptional and translational level, increased infiltrating β-endorphin containing macrophages within the inflamed tissue and was necessary for the antinociceptive effect of acupuncture treatment. Anti-inflammatory effects were seen in changed cytokine profiles with decreased TNF-α and IL-1β and increased IL-13. The only pro-inflammatory cytokine which was upregulated was IFN-γ. The anti-inflammatory effect caused by the changed cytokines may partly be mediated by Adenosine-2B Receptors, known for their deactivation of IFN-γ stimulated macrophages. In summary these results show a novel connection of chemokine-mediated, peripheral, opoid-dependent antinociception in electroacupuncture. They expand our understanding of the interaction of immune cells, adenosine and acupuncture. More research is needed to examine neuroimmunological mechanisms and the connection between needle insertion and detected effects in the rat paw. KW - Elektroakupunktur KW - Chemokin CXCL10 KW - Entzündung KW - Schmerz KW - Antinozizeption KW - Opioide Y1 - 2017 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-153261 ER - TY - THES A1 - Wang, Ying T1 - Immune and peripheral endogenous opioid mechanisms of electroacupuncture analgesia T1 - Immunologische und periphere endogene Opioidmechanismen bei Analgesie durch Elektroakupunktur N2 - A precious treasure in traditional Chinese medicine (TCM), acupuncture played a vital and irreplaceable role in contributing to people’s health in the thousands of years of Chinese history, and in 2010 was officially added to the “Representative List of the Intangible Cultural Heritage of Humanity” by the United Nations. Because of the side-effects of long-term drug therapy for pain, and the risks of dependency, acupuncture has been widely accepted as one of the most important alternative choice therapies for treating varieties of acute and chronic pain-related disorders. The clinical application and scientific mechanism research of acupuncture have therefore increased intensively in the last few decades. Besides hand acupuncture, other treatment approaches e.g. electroacupuncture (EA) have been widely accepted and applied as an important acupuncture-related technique for acupuncture analgesia (AA) research. The involvement of opioid peptides and receptors in acute AA has been shown via pre-EA application of opioid receptor/peptide antagonists. However, existing publications still cannot illuminate the answer to the following question: how does sustained antinociception happen by EA treatment? The hypothesis of opioid peptide-mediated tonic AA might be able to answer the question. In the first part of this thesis, the institution of a reproducible acupuncture treatment model as well as the endogenous opioid-related mechanisms was demonstrated. An anatomically-based three-dimensional (3D) rat model was established to exhibit a digital true-to-life organism, accurate acupoint position and EA treatment protocol on bilateral acupoint GB-30 Huantiao. The optimal EA treatment protocol (100 Hz, 2-3 mA, 0.1 ms, 20 min) at 0 and 24 h after induction of inflammatory pain by complete Freund’s adjuvant (CFA) on conscious free-moving rats was then established. EA elicited significant sustained mechanical and thermal antinociception up to 144 h. Post-EA application of opioid receptors (mu opioid receptor, MOR; delta opioid receptor, DOR) antagonists naloxone (NLX) and naltrindole (NTI), or opioid peptide antibodies anti-beta-endorphin (anti-END), met-enkephalin (anti-ENK) or -dynorphin A (anti-DYN) could also block this effect at a late phase (96 h) of CFA post-EA, which suggested opioid-dependent tonic analgesia was produced by EA. Meanwhile, EA also reduced paw temperature and volume at 72-144 h post CFA indicating anti-inflammatory effects. Nociceptive thresholds were assessed by paw pressure threshold (Randall-Sellito) or paw withdrawal latency (Hargreaves) and an anti-inflammatory effect was evaluated by measurement of plantar temperature and volume of inflamed paw. The second part of the thesis further suggests the correlation between the chemokine CXCL10 (= interferon-gamma inducible protein 10, IP-10) and opioid peptides in EA-induced antinociception. Based on a comprehensive Cytokine Array of 29 cytokines, targeted cytokines interleukin (IL)-1alpha, interleukin (IL)-1beta, tumor necrosis factor (TNF)-alpha, interleukin (IL)-4, interleukin (IL)-13, interferon (IFN)-gamma as well as CXCL10 were selected and quantified by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), and real time reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR) quantification confirmed upregulation of CXCL10 mRNA at both 72 and 96 h. The following hyperalgesic assessment suggested the antinociceptive effect of CXCL10. The double immunostaining localizing opioid peptides with macrophages expressed the evident upregulation of CXCR3-receptor of CXCL10 in EA treated samples as well as the significant upregulation or downregulation of opioid peptides by repeated treatment of CXCL10 or antibody of CXCL10 via behavioral tests and immune staining. Subsequent immunoblotting measurements showed non-alteration of opioid receptor level by EA, indicating that the opioid receptors did not apparently contribute to AA in the present studies. In vitro, CXCL10 did not directly trigger opioid peptide END release from freshly isolated rat macrophages. This might implicate an indirect property of CXCL10 in vitro stimulating the opioid peptide-containing macrophages by requiring additional mediators in inflammatory tissue. In summary, this project intended to explore the peripheral opioid-dependent analgesic mechanisms of acupuncture with a novel 3D treatment rat model and put forward new information to support the pivot role of chemokine CXCL10 in mediating EA-induced tonic antinociception via peripheral opioid peptides. N2 - Als wertvoller Schatz in der traditionellen chinesischen Medizin (TCM) spielt die Akupunktur eine wichtige und unersetzliche Rolle für die Gesundheit der Menschen in der über tausendjährigen Geschichte von China und wurde im Jahr 2010 offiziell in das "Weltkulturerbe" der Vereinten Nationen aufgenommen. Aufgrund der Nebenwirkungen von Langzeittherapien zur Schmerzbehandlung und dem Risiko der Abhängigkeit wird Akupunktur weithin als eine wichtigste Alternative für die Behandlung von akuten und chronischen Schmerzen eingesetzt. Die klinische Anwendung und Forschung in der Akupunktur wurden in den letzten Jahrzehnten intensiv vorangetrieben. Neben Handakupunktur gibt es noch andere Behandlungsmöglichkeiten, wie z.B. die Elektroakupunktur (EA). EA ist vor allem eine allgemein akzeptierte und wichtige akupunkturbezogene Technik für die Akupunkturanalgesie (AA) in der Forschung. Die Beteiligung von Opioidpeptiden und Opioidrezeptoren in der akuten AA wurde mittels Anwendung von Opioidrezeptorantagonisten/Opioidpeptidantikörpern appliziert vor EA gezeigt. Nach dem aktuellen Forschungsstand kann man jedoch nicht die Frage beantworten, wie die längerfristige (tonische) Antinozizeption nach EA-Behandlung funktioniert. Mit einer Hypothese zur Opioidpeptid vermittelten tonischen AA könnte man die Frage hierzu beantworten. In der vorliegenden Arbeit wurden in einem Modell der Akupunktur zum ersten Mal endogene Opioid-vermittelte Mechanismen reproduzierbar nachgewiesen. Es wurde ein dreidimensionales (3D) anatomisch-basiertes Rattenmodell entworfen, um am wachen Tier ein genaue Akupunkturbehandlung (EA) an den Akupunkten GB-30 Huantiao beidseitig durchzuführen. Darüber hinaus wurde ein optimiertes Behandlungsprotokoll von EA (100 Hz, 2-3 mA, 0.1 ms, 20 min) bei Ratten 0 und 24 h nach intraplantarer Injektion von komplettem Freunds Adjuvans (CFA) etabliert. Nozizeptive Schwellen wurden mittels Pfotendruckschwelle (Randall-Sellito) oder Pfotenrückzugslatenzzeit (Hargreaves) gemessen und die entzündungshemmende Wirkung durch Messung der Pfotentemperatur und Volumen der entzündeten Pfote ausgewertet. EA bewirkte eine signifikante mechanische und thermische Antinozizeption, welche bis zu 144 h anhielt. Die antinozizeptive Wirkung durch EA war nach Injektion von Opioidrezeptorantagonisten (mu opioid receptor, MOR; delta opioid receptor, DOR) Naloxon (NLX) und Naltrindol (NTI) oder Antikörpern gegen die Opioidpeptide beta-Endorphin (anti-END), Met-Enkephalin (anti-ENK) oder Dynorphin A (anti-DYN) während der späten Entzündungsphase (96 h) mit CFA blockierbar. Dies lässt auf eine durch EA induzierte tonische Analgesie schließen. Darüber hinaus reduzierte EA auch die erhöhte Pfotentemperatur und das erhöhte Pfotenvolumen, welche sehr typisch ist für eine 96-144 h Entzündung mit CFA. Dies spricht für eine entzündungshemmende Wirkung von EA. Nachfolgend wurde die Beteiligung von Opioidpeptiden und dem Chemokin CXCL10 (= Interferon-gamma induziertes Protein 10, IP-10) sowie die Korrelationen zwischen beiden geklärt. Basierend auf umfangreichenden Zytokinarrays mit 29 Zytokinen, wurden die Zytokine Interleukin (IL)-1alpha, Interleukin (IL)-1beta, Tumornekrosefaktor (TNF)-alpha, Interleukin (IL)-4, Interleukin (IL)-13, Interferon (IFN)-gamma und CXCL10 gezielt ausgewählt und im Enzym Immunoassay (ELISA) sowie durch eine Echtzeit Reverse Transkription-Polymerase Kettenreaktion (RT-PCR) quantifiziert. Die Quantifizierung auf mRNA-Ebene zeigte eine Hochregulation von CXCL10 bei 96 h und zum früheren Zeitpunkt von 72 h. Nachfolgende Schmerzschwellenmessungen wiesen auf eine antinozizeptive Wirkung von CXCL10 hin. Eine Doppelimmunfärbung zeigte die Lokalisation von Opioidpeptiden in Makrophagen. Nachweislich wurde die Expression des CXCR3-Rezeptor von CXCL10 in EA behandelten Pfoten erhöht. Ebenso kam es zu einer signifikanten Hochregulation von Opioidpeptiden durch wiederholte Behandlung mit CXCL10 bzw. Herunterregulation der Opioidpeptide nach wiederholter Behandlung mit anti-CXCL10 Antikörper. Dies wurde sowohl in Verhaltenstests als auch in der Immunfärbung zu beobachtet. Immunoblotting zeigte keine Veränderung der Expression von Opioidrezeptoren nach EA, was schließen lässt, dass die Menge an Opioidrezeptoren in den vorliegenden Untersuchungen keine Rolle spielen. Da CXCL10 in vitro keine direkten Effekt auf die Freisetzung des Opioidpeptides beta-END aus frisch isolierten Rattenmakrophagen hat, liegt die Vermutung nahe, dass CXCL10 in vitro eine indirekte Rolle als Mediator zukommt und indirekt die Opioidpeptidfreisetzung aus Makrophagen in entzündlichen Gewebe stimuliert wird. Zusammenfassend wurden in dem hier vorgestellten Projekt die Opioidpeptid-abhängigen analgetischen und peripheren Mechanismen der Akupunktur mit einem neuartigem 3D-Behandlungsmodell der Ratte untersucht und eine Schlüsselrolle des Chemokins CXCL10 bei der Vermittlung der EA-induzierten tonischen Antinozizeption in Abhändigkeit von peripheren Opioidpeptiden. (Translated by Dr. Dagmar Hackel and revised by Priv.-Doz. Dr. Heike Rittner) KW - Elektroakupunktur KW - electroacupuncture KW - peripheral analgesia KW - Chemokin CXCL10 KW - Analgesie KW - Cytokine KW - Ratte KW - opioid peptide KW - cytokines KW - Periphere Analgesie KW - Opioidpeptide Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-98326 ER -