TY  - THES
A1  - Bertleff-Zieschang, Nadja Luisa
T1  - Galectin-1: A Synthetic and Biological Study of a Tumor Target
T1  - Galectin-1: Eine Synthetische und Biologische Studie eines Tumortargets
N2  - Galectin-1 (hGal-1) is overexpressed by numerous cancer types and previously conducted studies confirmed that the β-galactoside-binding protein mediates various molecular interactions associated with tumor growth, spread and survival. Upon interaction with carbohydrate-based binding epitopes of glycan structures on human cell surfaces galectin-1 induces proliferative, angiogenetic and migratory signals and modulates negative T cell regulation which essentially helps the tumor to evade the immune response. These findings attributed galectin-1 a pivotal role in tumor physiology and strongly suggest the protein as target for diagnostic and therapeutic applications.
Within the scope of this work a strategy was elaborated for designing tailor-made galectin-1 ligands by functionalizing selected hydroxyl groups of the natural binding partner N-acetyllactosamine (LacNAc) that are not involved in the sophisticated interplay between the disaccharide and the protein. Synthetic modifications intended to introduce chemical groups i) to address a potential binding site adjacent to the carbohydrate recognition domain (CRD) with extended hGal-1-ligand interactions, ii) to implement a tracer isotope for diagnostic detection and iii) to install a linker unit for immobilization on microarrays.
Resulting structures were investigated regarding their targeting ability towards galectin-1 by cocrystallization experiments, SPR and ITC studies. Potent binders were further probed for their diagnostic potential to trace elevated galectin-1 levels in microarray experiments and for an application in positron emission tomography (PET).
N2  - Galectin-1 (hGal-1) wird von zahlreichen Tumoren überexprimiert und frühere Studien bestätigten, dass das β-Galactosid-bindende Protein verschiedene molekulare Wechselwirkungen vermittelt, welche in direktem Zusammenhang mit Tumorwachstum, -ausbreitung und -überleben stehen. Durch die Wechselwirkung mit Kohlenhydrat-basierten Bindungsepitopen von Glykanstrukturen auf Zelloberflächen induziert Galectin-1 proliferative, angiogenetische und migratorische Signale und moduliert die negative Regulierung von T-Zellen, entscheidend für den Tumor, um der Immunantwort zu entkommen. Diese Beobachtungen schreiben Galectin-1 eine zentrale Rolle in der Tumorphysiologie zu, was dieses Protein zu einem attraktiven Target für diagnostische und therapeutische Anwendungen macht.
Im Rahmen dieser Arbeit wurde eine Synthesestrategie für das Design maßgeschneiderter Galectin-1 Liganden entwickelt, wobei ausgewählte Hydroxylgruppen des natürlichen Bindungspartners N-Acetyllactosamin (LacNAc), welche nicht an dem hochkomplexen Zusammenspiel zwischen Protein und Disaccharid beteiligt sind, funktionalisiert wurden. Synthetische Modifikationen wurden mit der Absicht eingeführt i) eine potentielle Bindungstasche in Nachbarschaft der Kohlenhydraterkennungsdomäne (CRD) zu adressieren, ii) einen Isotopenmarker für die diagnostische Detektion zu implementieren und iii) eine Brückeneinheit zu integrieren, welche einer späteren Immobilisierung auf Mikroarrays dient. 
Resultierende Strukturen wurden mittels Kokristallisationsexperimenten, SPR- und ITC-Studien auf ihre Fähigkeit untersucht, Galectin-1 zu adressieren. Erfolgreich entwickelte Liganden wurden zudem auf ihr diagnostisches Potential getestet, erhöhte Galectin-1-Spiegel in Microarray-Experimenten zu detektieren und könnten zukünftig Einsatz in der Positronen-Emissions-Tomographie (PET) finden.
KW  - Organische Synthese
KW  - Galectine
KW  - Kohlenhydrate
KW  - Molekulare Erkennung
KW  - Click-Chemie
KW  - carbohydrate chemistry
KW  - protein crystallography
KW  - galectin-1
KW  - protein-ligand-interaction
KW  - N-acetyllactosamine
Y1  - 2014
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-101529
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TY  - THES
A1  - Fink, Julian
T1  - Synthese von molekularen Werkzeugen zur Visualisierung und Untersuchung des Sphingolipidmetabolismus und weiterer biologischer Prozesse
T1  - Synthesis of molecular tools to visualize and study sphingolipid metabolism and other biological processes
N2  - Die Zelle stellt die kleinste Einheit des Lebens dar und zeichnet sich durch die hoch koordinierte Anordnung von mehreren Millionen (Bio-)Molekülen zu einem mikrometergroßen Objekt aus. Als struktureller Bestandteil der Lipiddoppelschicht eukaryotischer Zellen spielt neben Sterolen und Glycerolipiden die Verbindungsklasse der Sphingolipide eine zentrale Rolle bei der Aufrechterhaltung der Membranintegrität.[472] Darüber hinaus sind bioaktive Sphingolipide bei vielen grundlegenden zellulären Prozessen wie Apoptose, Wachstum, Differenzierung, Migration und Adhäsion entscheidend beteiligt.[87,120] Ein gestörtes Gleichgewicht des Sphingolipidmetabolismus und Defekte der entsprechenden Stoffwechselwege stehen im Zusammenhang mit vielen Krankheiten wie Krebs, Diabetes, Adipositas, Arteriosklerose, chronischen Entzündungen und Autoimmunerkrankungen sowie viraler und bakterieller Pathogenese.[22,143,473,474] 
Die Entwicklung und Anwendung von Sphingolipidanaloga als potenzielle Wirkstoffe rückten in den letzten Jahren immer weiter in den Fokus der interdisziplinären Forschung von Biologen, Chemikern und Medizinern. Als bekanntestes Beispiel ist Fingolimod (FTY720) zu nennen, das als Sphingosin-1-phosphat-Mimetikum heute unter dem Markennamen Gilenya® erfolgreich als Arzneistoff zur Behandlung von Multipler Sklerose eingesetzt wird.[475] Es besteht jedoch die Gefahr, dass Fingolimod zur Schädigung anderer Zellfunktionen und zu gravierenden Nebeneffekten wie Bradykardie führen kann.[476] Da Sphingolipide ebenfalls in der Kontrolle von bakteriellen und viralen Infektionen essentiell beteiligt sind, spielen Sphingolipide und deren synthetisch dargestellte Derivate vermehrt eine Rolle in der Wirkstoffentwicklung im Kampf gegen pathogene Krankheitserreger.[175,477-479] Die Wirkweise von antimikrobiellen Sphingolipiden ist bisher nicht vollständig aufgeklärt. Für eine Weiterentwicklung von bekannten Medikamenten gegen verschiedene Krankheiten oder für die Entwicklung neuartiger Wirkstoffe gegen Erreger ist eine umfassende Untersuchung der zugrundeliegenden zellulären Mechanismen auf molekularer Ebene entscheidend. 
Hierfür finden aufgrund der relativ einfachen Detektion mittels Fluoreszenzmikroskopie häufig fluoreszenzmarkierte Sphingolipidderivate breite Anwendung.[480] Die kovalent gebundene Farbstoffeinheit bringt jedoch wesentliche Nachteile mit sich, da sich die Biomoleküle durch die veränderte Struktur und Polarität in ihren biologischen Eigenschaften von den natürlichen Substraten unterscheiden können. Die Verwendung von bioorthogonal funktionalisierten Biomolekülen umgeht dieses Problem, da die strukturellen Änderungen minimal gehalten werden.  
Nach dem zellulären Einbau dieser Derivate ist eine schnelle und spezifische Konjugation mit einem komplementären Fluorophor zu einem gewünschten Zeitpunkt durch sogenannte Click-Reaktionen wie CuAAC oder SPAAC möglich.[12,46] Das Prinzip der Click-Chemie wurde bereits auf eine Vielzahl an Biomolekülen wie Sphingolipide, Fettsäuren, Aminosäuren, Proteine, Kohlenhydrate, Nukleoside oder Nukleinsäuren (DNA und RNA) übertragen.[47,280] Jedoch bedarf es weiterer spezifisch modifizierter Verbindungen, die vielfältige bioorthogonale Reaktionen für die Untersuchung von Zellprozessen zulassen ‒ sowohl in vitro als auch in vivo.
Um neue Therapieansätze gegen verschiedene Krankheiten zu entwickeln und schwerwiegende Nebenwirkungen zu vermeiden, ist die detaillierte Erforschung hochkomplexer Zellvorgänge auf molekularer Ebene von entscheidender Bedeutung. Das Ziel dieser Arbeit war daher die Synthese und Charakterisierung von molekularen Werkzeugen, die in Kombination mit verschiedenen aktuellen Mikroskopie- und Massenspektrometriemethoden die Visualisierung und Untersuchung des Sphingolipidmetabolismus und weiterer biologischer Prozesse ermöglichen.
Zusammenfassend wurde in dieser Arbeit eine Vielzahl an Sphingolipiden und deren bioorthogonal funktionalisierte Analoga ausgehend von der Aminosäure L-Serin erfolgreich synthetisiert. Die vorgestellten Verbindungen eignen sich in Kombination mit Massenspektrometrie und Fluoreszenz- oder Elektronenmikroskopie als molekulare Werkzeuge zur Untersuchung des komplexen Sphingolipidmetabolismus sowie des Einbaus und der Dynamik von Sphingolipiden in Modell- und Zellmembranen. Sowohl in humanen und tierischen Zellen als auch in Bakterien wurden die azidmodifizierten Sphingolipide durch Click-Reaktionen visualisiert, um ein verbessertes Verständnis von bakteriellen und viralen Infektionsprozessen zu erhalten. Der modulare Ansatz der Click-Chemie ermöglicht die Verwendung verschiedener komplementär funktionalisierter Farbstoffe, die unterschiedliche Eigenschaften bezüglich der Membrandurchgängigkeit oder Absorptions- und Emissionswellenlängen besitzen und somit je nach biologischer Fragestellung gezielt eingesetzt werden können.
Alles in allem tragen die in dieser Arbeit synthetisierten Verbindungen dazu bei, die Rolle von Sphingolipiden bei Infektionsprozessen und Krankheitsverläufen auf subzellulärer Ebene aufzuklären. Dadurch wird ein entscheidender Beitrag für die Entwicklung neuartiger Wirkstoffe gegen bakterielle oder virale Erreger sowie innovativer Therapien gegen verschiedene humane Krankheiten geliefert.
N2  - The cell represents the smallest unit of life and is characterized by the highly coordinated arrangement of several million (bio)molecules to form a micrometer-sized object. As a structural component of the lipid bilayer of eukaryotic cells, in addition to sterols and glycerophospholipids, the compound class of sphingolipids plays a central role in maintaining membrane integrity.[472]  In addition, bioactive sphingolipids are critically involved in many basic cellular processes such as apoptosis, growth, differentiation, migration and adhesion.[87,120] A disturbed balance of the sphingolipid metabolism and defects in the corresponding metabolic pathways are associated with many diseases such as cancer, diabetes, obesity, arteriosclerosis, chronic inflammation and autoimmune diseases as well as viral and bacterial pathogenesis.[22,143,473,474]
The development and application of sphingolipid analogues as potential active ingredients have moved more and more into the focus of interdisciplinary research by biologists, chemists and medical professionals in recent years. The best-known example is fingolimod (FTY720), which is now successfully used as a sphingosine-1-phosphate mimetic under the brand name Gilenya® as a drug for the treatment of multiple sclerosis.[475] However, there is a risk that fingolimod can damage other cell functions and lead to serious side effects such as bradycardia.[476] Since sphingolipids are also essential for the control of bacterial and viral infections, sphingolipids and their synthetically produced derivatives are playing an increasing a role in the development of active ingredients in the fight against pathogenic germs.[175,477-479] The mode of action of antimicrobial sphingolipids has not yet been fully elucidated. A comprehensive investigation of the underlying cellular mechanisms at the molecular level is crucial for further development of known drugs against various diseases or for the development of novel active substances against pathogens. 
Due to the relatively easy detection by fluorescence microscopy, fluorescence-labeled sphingolipid derivatives are widely used for this purpose.[480] However, the covalently bonded dye unit has significant disadvantages since the biological properties of the biomolecules can differ from the natural substrates concerning structure and polarity changes. The usage of bioorthogonally functionalized biomolecules avoids this problem because the structural changes are kept to a minimum. After the cellular incorporation of these derivatives, rapid and specific conjugation with a complementary fluorophore at a desired point of time is possible by so-called click reactions such as CuAAC or SPAAC.[12,46] 
The concept of click chemistry has already been applied to a large number of biomolecules such as sphingolipids, fatty acids, amino acids, proteins, carbohydrates, nucleosides or nucleic acids (DNA and RNA).[47,280] However, further specifically modified compounds are required, allowing diverse bioorthogonal reactions for the investigation of cell processes – both in vitro and in vivo.
In order to develop new therapeutic approaches against numerous diseases and to avoid serious side effects, detailed research into highly complex cell processes at the molecular level is of crucial importance. Therefore, the aim of this work was the synthesis and characterization of molecular tools which, in combination with several current microscopy and mass spectrometry methods, enable the visualization and investigation of the sphingolipid metabolism and other biological processes. 
In summary, a variety of sphingolipids and their bioorthogonally functionalized analogues were successfully synthesized in this work starting from the amino acid L-serine. In combination with mass spectrometry and fluorescence or electron microscopy, the presented compounds are suitable as molecular tools for the investigation of the complex sphingolipid metabolism as well as the incorporation and dynamics of sphingolipids in model and cell membranes. The azide-modified sphingolipids were visualized by click reactions in human and animal cells as well as in bacteria to gain a better understanding of bacterial and viral infection processes. The modular approach of click chemistry enables the use of different complementarily functionalized dyes that have different properties in terms of membrane permeability or absorption and emission wavelengths and can therefore be used in a targeted manner depending on the biological issue.
All in all, the compounds synthesized in this work help to elucidate the role of sphingolipids in infection processes and disease progression at subcellular level. This makes a decisive contribution to the development of novel active substances against bacterial or viral pathogens as well as of innovative therapies against various human diseases.
KW  - Chemische Synthese
KW  - Sphingolipide
KW  - Click-Chemie
KW  - Organische Synthese
KW  - Sphingolipidderivate
KW  - bioorthogonale Markierung
KW  - Wirkstoffentwicklung
KW  - Infektionsprozesse
KW  - Sphingolipidanaloga
KW  - Sphingolipidstoffwechsel
Y1  - 2023
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-286992
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TY  - THES
A1  - Löschberger, Anna
T1  - Biologische Referenzstrukturen und Protokolloptimierung in der hochauflösenden Fluoreszenzmikroskopie mit dSTORM
T1  - Biological model structures and optimization of protocols in super-resolution fluorescence microscopy with dSTORM
N2  - Die Lokalisationsmikroskopie ist eine neue, vielversprechende Methode der hochauflösenden Fluoreszenzmikroskopie. Sie ermöglicht detaillierte Einblicke in die Organisation und den strukturellen Aufbau von Zellen. Da die Vorbereitung der Proben und das Aufnehmen der Bilder im Vergleich zu herkömmlichen Methoden höhere Anforderungen stellt, mussten ihr Potential und ihre Zuverlässigkeit erst noch überzeugend gezeigt werden. Bis vor kurzem wurde das Auflösungsvermögen vor allem an Mikrotubuli gezeigt, deren filamentöse Struktur allerdings schon in konfokalen Bildern zu erkennen ist. Deswegen wurde in dieser Dissertation der Kernporenkomplex (NPC), dessen Struktur in der konventionellen Fluoreszenzmikroskopie nicht auflösbar ist, als Modellstruktur für die hochauflösende Fluoreszenzmikroskopie eingeführt. 

Dazu wurden Kernporenkomplexe aus Kernhüllen von Xenopus laevis Oocyten mit dSTORM (direct stochastic optical reconstruction microscopy), einer Methode der Lokalisationsmikroskopie, hochaufgelöst. Damit konnte nun erstmals die Achtfachsymmetrie dieses Proteinkomplexes lichtmikroskopisch dargestellt werden. Desweiteren konnte der Zentralkanal mit einem Durchmesser von ca. 40 nm aufgelöst werden. Die Daten eigneten sich außerdem für eine automatisierte Bildanalyse nach dem sogenannten "particle averaging" - einer aus der Elektronenmikroskopie bekannten Methode, um eine Durchschnittsstruktur zu ermitteln.

Darüber hinaus wurden Zweifach-Färbungen von NPCs benutzt, um verschiedene Ansätze für Zweifarben-Aufnahmen mit dSTORM zu testen. Neben dem mittlerweile standardmäßig benutzten, sequentiellen Ansatz mit zwei spektral getrennten Farbstoffen, wurde auch ein simultaner Ansatz mit zwei spektral überlappenden Farbstoffen erfolgreich angewandt. Auch für 3D-Messungen mit den Ansätzen Biplane und Astigmatismus eignete sich die Markierung der Kernhülle. Hier wurden jedoch A6-Zellen benutzt und die Krümmung des Zellkerns über die gefärbten Kernporen dargestellt.

dSTORM-Messungen können nicht nur an fixierten, sondern auch in lebenden Zellen durchgeführt werden. Hierzu eignen sich vor allem sehr immobile Proteine, wie H2B oder Lamin C. Anhand von SNAP-Tag- und Halo-Tag-Konstrukten konnte gezeigt werden, dass sich kommerziell erhältliche, organische Farbstoffe auch in endogener zellulärer Umgebung schalten lassen, wodurch Lebendzell-Aufnahmen mit dSTORM möglich sind.

Ein weiterer Teil dieser Arbeit befasst sich mit korrelativen Aufnahmen aus dSTORM und Rasterelektronenmikroskopie (SEM). Hierzu wurden Xenopus laevis Kernhüllen zuerst mit dSTORM hochaufgelöst und danach für die EM präpariert. Anschließend wurden zugehörige Bereiche am Rasterelektronenmikroskop aufgenommen. Mit den erhaltenen korrelativen Bildern konnte gezeigt werden, dass sich dSTORM und SEM bei geeigneten Proben durchaus kombinieren lassen. Proteine können somit spezifisch markiert und im Rahmen ihrer strukturellen Umgebung mit nahezu molekularer Auflösung dargestellt werden.

Da hochwertige Aufnahmen eine ausgereifte Probenpräparation voraussetzen, darf deren Etablierung nicht zu kurz kommen. Unter dieser Prämisse wurde ein optimiertes Markierungsprotokoll mit dem Namen ClickOx entwickelt. Mit ClickOx bleibt bei der kupferkatalysierten Azid-Alkin-Cycloaddition die Feinstruktur von Aktinfilamenten, sowie die Fluoreszenz fluoreszierender Proteine, deutlich sichtbar erhalten. Während bei den klassischen Click-Protokollen auf Grund der Entstehung von reaktiven Sauerstoff-Spezies (ROS) feine zelluläre Strukturen, wie Aktinfilamente, angegriffen oder zerstört werden, schützt das neue Protokoll mit enzymatischem Sauerstoffentzug Proteine und somit Strukturen vor Reaktionen mit ROS. Das unterstreicht, wie wichtig es ist auch sogenannte "etablierte" Protokolle weiterzuentwickeln, denn bestimmte Nebeneffekte in Präparationen werden unter Umständen erstmals in der Hochauflösung sichtbar. 

Ein weiterer Aspekt war die Untersuchung des Einflusses von D1 auf die Chromatinorganisation. Mit verschiedenen mikroskopischen Methoden konnten Hinweise auf eine mögliche DNA-Cross-Linking-Fähigkeit dieses Proteins gesammelt werden. Hier wurde die Einzelmolekülinformation der dSTORM-Filme genutzt, um unterschiedliche Grade von DNA- bzw. Chromatin-Akkumulation zu vergleichen. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass wildtypisches D1 DNA vernetzen kann. Dies erfolgt über die sogenannten AT-Haken-Motive. Sobald diese alle durch Mutation funktionsunfähig gemacht werden - wie bei der verwendeten R10xG-Mutante - lässt sich keine Akkumulation der DNA mehr beobachten. Neben der Chromatinaggregation durch D1-Expression konnte in FRAP-Experimenten gezeigt werden, dass nur die "echten" AT-Haken eine hohe Affinität zum Chromatin aufweisen, die sogenannten "potentiellen" hingegen nicht.
N2  - Localization microscopy is a new and promising imaging technique, which provides detailed insights into cellular organization and structural composition of cells with high spatial resolution. Due to the challenging preparation of samples and demanding imaging procedure, its potential and reliability had to be proven. Until recently the resolution has been shown mainly on microtubules, whose structure is already visible in confocal images. This thesis introduced the nuclear pore complex (NPC) as a more demanding model structure for super-resolution fluorescence microscopy as the structure of NPCs can not be resolved with conventional fluorescence microscopy.

For this purpose nuclear envelopes of Xenopus laevis oocytes were highly resolved with dSTORM (direct stochastic optical reconstruction microscopy). With this localization microscopy method it was further possible to resolve the eightfold symmetry of nuclear pore complexes with light microscopy for the first time. In addition the central channel could be resolved with a diameter of about 40 nm. Furthermore, the localizations were used for single particle averaging, a well known image analysis method from electron microscopy, to calculate an average structure.

Double staining of NPCs was used to check the potential of two-color imaging with dSTORM. 
Beside the common way of sequential imaging with two clearly spectrally separated dyes, a spectral demixing approach with spectrally overlapping dyes was applied. 
Labeling the nuclear envelope was also suitable for 3D measurements using two different approaches, i.e. biplane and astigmatism. In this case, labeled NPCs of Xenopus laevis A6-cells were used to illustrate the bending of the nucleus.

dSTORM can be applied not only in fixed but also in living cells. Immobile proteins such as H2B or lamin C are especially suitable for this approach. Using fusion proteins with SNAP-Tag or Halo-Tag, it was shown that photoswitching of commercially available organic dyes is possible in an endogenous cellular environment and thus enabeling dSTORM in living cells.

Another aspect of this work covers correlative microscopy  using dSTORM and scanning electron microscopy (SEM). Therefor nuclear envelopes of Xenopus laevis were first imaged with dSTORM and then prepared for SEM. After that, corresponding areas were imaged with SEM. The resulting correlative images showed clearly that - assuming one has appropriate samples - dSTORM and SEM can be fairly combined. This way specifically labeled proteins can be imaged with nearly molecular resolution in the context of their structural environment.

Since the quality of localization microscopy strongly depends on sample preparation, ongoing developments of labeling protocols are required. On this premise an optimized labeling protocol called ClickOx was developed. ClickOx clearly preserves the fine structure of actin filaments and the fluorescence of fluorescent proteins when using copper-catalyzed azide-alkine-cycloaddition. Whereas fine cellular structures such as actin filaments are affected by reactive oxygen species (ROS) under standard clicking procedures, the new protocol, which contains an enzymatic oxygen scavenger, protects proteins and thus cellular structures from reactions with ROS. This demonstrates the importance of further developing even so called "well established" protocols, because some side effects may appear only in super-resolution.

Another aspect adressed the influence of D1 on chromatin organization. Hints for a possible DNA cross-linking ability of D1 were collected using different microscopic approaches. The single-molecule information of dSTORM measurements was used to analyse chromatin aggregation induced by D1 expression. The results indicate that wildtype D1 can cross-link DNA with its AT-hooks. Consequently the loss-of-function mutant R10xG is unable to aggregate chromatin. Furthermore FRAP experiments were performed to demonstrate that only "true" AT-hooks in D1 have a strong affinity to chromatin, but not the so called "potential" AT-hooks.
KW  - Fluoreszenzmikroskopie
KW  - Chromatin
KW  - Kernporen-Komplex
KW  - Click-Chemie
KW  - Korrelative Mikroskopie
KW  - Lokalisationsmikroskopie
KW  - dSTORM
KW  - super-resolution
KW  - Hochauflösung
Y1  - 2014
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-102630
ER  - 
TY  - THES
A1  - Meinhardt, Thomas
T1  - Effiziente Oberflächen-Funktionalisierung von Nanodiamant durch die Click-Reaktion von Alkinen und Aziden
T1  - Efficient surface functionalization of nanodiamond via click reaction of alkynes and azides
N2  - In dieser Arbeit wurde die Kupfer(I)-katalysierte Cycloaddition von Alkinen und Aziden ("Click-Chemie") als effiziente, vielseitige und milde Reaktion für die Funktionalisierung von Nanodiamantpartikeln etabliert. Es wurden verschiedene Alkin- oder Azid-funktionalisierte Nanodiamantsysteme hergestellt und deren Reaktivität in Click-Reaktionen anhand vielfältiger Beispiele demonstriert. Hierzu wurden neben einfachen Testverbindungen auch komplexere Substanzen (z. B. ein Mannose-Derivat, Polytriazole, Fluoreszenzfarbstoffe, ein Thiazolium-Organokatalysator) durch Triazolsynthese immobilisiert. Zusätzlich wurde eine Methode entwickelt, die die Herstellung funktionalisierter und vollständig dispergierter Nanodiamant-Primärteilchen ermöglicht, wobei gezeigt wurde, dass dieser Weg auch für die Funktionalisierung durch Click-Chemie geeignet ist. Die Analyse der Nanodiamantpartikel erfolgte u. a. durch FT-IR, TGA, Elementaranalyse, Partikelgrößen- und Zetapotentialbestimmung, NMR, HR-TEM, UV / Vis sowie Fluoreszenzspektroskopie und -mikroskopie.
N2  - In this work, the copper(I)-catalyzed cycloaddition of alkynes and azides ("click chemistry") was established as an efficient, versatile and mild reaction for the functionalization of nanodiamond particles. Different alkyne- or azide-functionalized nanodiamond systems were prepared and their reactivity in click reactions was demonstrated by various examples. For this purpose, simple compounds as well as more complex substances (e. g. a mannose derivative, polytriazoles, fluorescent dyes, a thiazolium organocatalyst) were immobilized via triazole synthesis. In addition, a method was developed that allows for the preparation of functionalized and completely dispersed nanodiamond primary particles. It was shown that this strategy is also suitable for the functionalization via click chemistry. The nanodiamond particles were analyzed by FT-IR, TGA, elemental analysis, particle size and zeta potential measurements, NMR, HR-TEM, UV / Vis, fluorescence spectroscopy and microscopy.
KW  - Funktionalisierung <Chemie>
KW  - Diamant
KW  - Click-Chemie
KW  - Partikel
KW  - Nanodiamant
KW  - nanodiamond
KW  - functionalization
KW  - click chemistry
KW  - particles
Y1  - 2011
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-66410
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TY  - THES
A1  - Nagl, Patrick Alexander
T1  - Chemistry meets Cancer Immunotherapy: Synthesis and Characterization of Hapten-like Compounds for Selective Immunotherapy
T1  - Chemie trifft Krebsimmuntherapie: Synthese und Charakterisierung von hapten-artigen Verbindungen für selektive Immuntherapie
N2  - Chimeric antigen receptors (CARs) are able to specifically direct T cells to tumor antigens and therapy with anti-CD19 CARs has already cured cancer patients with B-cell lymphomas who have undergone long-term therapy non-successful. Despite this impressive result, the therapy is currently only approved as a last treatment option for blood cancers due to its life-threatening deficiencies. For patient safety and to enable additional application such as the treatment of solid tumors, CAR-T cells must be controllable, e. g. by chemically programmable CARs (cpCARs) regulated by hapten-like compounds.
This thesis reports the synthesis and characterization of such hapten-like compounds. In the first step, seven different warheads with two different spacers were bound to biotin in order to find a suitable warhead for programming the cpCAR.
In a second step, synthetic routes for the three pharmacophores folate, c(RGD), and an RGD peptidomimetic were developed. The routes allow the modification of the pharmacophores with one of the warheads from the first step. CuAAC was chosen as a bioorthogonal approach to link pharmacophores and warheads.
In total, three different pharmacophores were modified with the 1,3-diketone motif of compound 21 leading to 112, 113 and 128. Activation of the T-cell signaling cascade was tested after binding of these hapten-like compounds to the cpCAR in the presence of suitable target structures. For 112, only a slight, non-significant, activation of the T-cell signaling cascade was observed, whereas for 113 and 128, a significant activation of the T-cell signaling cascade was observed.
The poor solubility of the folate compounds led to alternative strategies. Folic acid was exchanged by pteroic acid and the bifunctional, linear compounds were enlarged to trifunctional dendrimers.
Besides the reported regioisomer in 112, a second one, which was not reported to date, occurred by the cyclization of the linear RGD pentapeptide leading to 113.
After the reported synthesis of an RGD peptidomimetic analogous to 128 could not be reproduced, a new synthetic route was developed. It also consists of 17 steps, but reduces the number of linear steps from 13 to 10. Moreover, the developed route contains an asymmetric hydrogenation step and is, compared to the published one, more flexible by the use of the copper-catalyzed azide-alkyne cycloaddition (CuAAC). In addition, an unknown reaction was observed. Instead of the formation of a Schiff base in the reductive amination of 129, an insertion of propargylamine occurred forming 131. The reaction is almost quantitative and in high purity. After requiring no purification, it could be predestined for industrial purposes, such as the synthesis of N-functionalized 1,2-dihydroquinolines or as a building block with various orthogonal functional groups.
Besides the sulfonamide 16, the diketone (21, 27, 31) and lactam compounds (39 – 41), experiments on adapter molecules with further warheads were performed. In the synthesis of a proadapter approach, in which the warhead is formed only after the retro-aldol reaction catalyzed by the mAb, 6 of 10 steps were successfully performed. A newly developed synthesis to keto-sulfonyl and keto-sulfoxide compounds could not be completed but was performed on a small scale to the point of keto-sulfonyl and keto-sulfoxide. Furthermore, a universal synthesis route was designed to allow the introduction of the warhead at the end of the synthesis by acylation. Thus, after 5 shared steps, 3 of them in quantitative yield, different warheads may be introduced. Moreover, this also facilitates the purification and the analysis of the compounds by the absence of tautomerism or labile groups. However, the acylation experiments were not successful with either the acid cyanide or the Weinreb amide.
In summary, this thesis has proven that the 1,3-diketone motif is a suitable warhead for programming the cpCAR, which was developed by Hudecek et al. (unpublished data). The hapten-like compounds 112, 113 and 128 simultaneously bind to integrin ${\alpha}_v{\beta}_3$ and the cpCAR activating the T-cell signaling cascade. The modular synthesis strategy and the use of the bioorthogonal CuAAC allow straightforward access to these valuable immunotherapeutics but revealed the need for an additional purification step to remove copper ions.
N2  - Chimäre Antigen-Rezeptoren (CARs) ermöglichen es T-Zellen spezifisch auf Tumorantigene auszurichten. Die Therapie mit anti-CD19 CARs konnte bereits eindrucksvolle Ergebnisse liefern und austherapierte Krebspatienten mit B-Zell-Lymphomen heilen. Durch zum Teil lebensbedrohliche Nebenwirkungen ist sie aktuell jedoch nur als letzte Therapiemöglichkeit zugelassen. Um Patienten zu schützen und ihr Einsatzgebiet zu erweitern, beispielsweise zur Behandlung von soliden Tumoren, müssen CAR-T-Zellen kontrollierbar sein, z. B. durch chemisch programmierbare CARs (cpCARs), die durch hapten-artigen Verbindungen reguliert werden.

Die vorliegende Arbeit beschreibt die Synthese und Charakterisierung von solchen Verbindungen. Dafür wurden im ersten Schritt sieben verschiedene reaktive Gruppen mit zwei unterschiedlichen Spacern an Biotin gebunden, um eine geeignete reaktive Gruppe für die Programmierung des cpCARs zu finden.
Im zweiten Schritt wurden Syntheserouten für die drei Pharmakophore Folat, c(RGD) und ein RGD-Peptidomimetikum entwickelt. Die Routen ermöglichen es das jeweilige Pharmakophor mit einer der reaktiven Gruppe aus dem ersten Schritt zu modifizieren. Zur Verbindung von Pharmakophor und reaktiver Gruppe, wurde die CuAAC als bioorthogonaler Ansatz gewählt.

Insgesamt wurden im Rahmen dieser Arbeit drei verschiedene Pharmakophore mit dem 1,3-Diketon-Motiv von Verbindung 21 modifiziert. Mit den resultierenden Verbindungen 112, 113 und 128 wurde die Aktivierung der T-Zell-Signalkaskade bei Anwesenheit geeigneter Zielstrukturen untersucht. Bei 112 konnte nur eine leichte, nicht signifikante Aktivierung der T-Zell-Signalkaskade beobachtet werden, während bei 113 und 128 eine deutliche Aktivierung der T-Zell-Signalkaskade beobachtet wurde.

Die schlechte Löslichkeit der Folatverbindungen führte zu Versuchen Folsäure gegen Pteroinsäure zu tauschen und die linearen Verbindungen zu trifunktionalen, dendrimeren Verbindungen mit weiteren Triethylenglycol-Ketten zu vergrößern. 
Neben dem publizierten Regioisomer in 112 trat bei der Zyklisierung des linearen RGD-Pentapeptides ein zweites Regioisomer auf, das zu 113 führte.
Nachdem die veröffentlichte Syntheseroute eines RGD-Peptidomimetikums, das analog zu 128 ist, nicht reproduziert werden konnte, wurde eine neue Syntheseroute entwickelt. Sie besteht ebenfalls aus 17 Schritten, die Anzahl der linearen Schritte konnte jedoch von 13 auf 10 reduziert werden. Zusätzlich enthält die entwickelte Route einen asymmetrischen Hydrierungsschritt und ist durch den Einsatz der Kupfer-katalysierten Azid-Alkin-Cycloaddition (CuAAC) flexibler als die bereits publizierte Synthese.
Während der Entwicklung der Syntheseroute wurde eine Reaktion beobachtet, die in der Literatur bisher nicht bekannt ist. Anstatt der Bildung eines Imins bei der reduktiven Aminierung von 129 kam es zu einer Insertion von Propargylamin, was zu 131 führte. Die Reaktion verläuft dabei nahezu quantitativ und in hoher Reinheit, so dass keine Aufreinigung notwendig ist. Sie könnte somit prädestiniert für industrielle Zwecke sein, wie zum Beispiel die Synthese von N-funktionalisieren 1,2-Dihydrochinolinen oder als Baustein mit mehreren funktionellen Gruppen, die orthogonal zu einander sind.

Zusätzlich zum Sulfonamid 16, den Diketon- (21, 27, 31) und Lactamverbindungen (39 – 41), wurden Versuche zu Adaptermolekülen mit weiteren reaktiven Gruppen durchgeführt. Bei der Synthese eines Proadapter-Ansatzes, bei dem die reaktive Gruppe erst nach der vom mAb katalysierten Retroaldolreaktion entsteht, konnten 6 von 10 Schritten erfolgreich durchgeführt werden. Eine neu entwickelte Synthese von Keto-Sulfonyl- und Keto-Sulfoxid-Verbindungen konnte nicht abgeschlossen, aber im kleinen Maßstab bis zum Keto-Sulfonyl bzw. Keto-Sulfoxid durchgeführt werden. Des Weiteren wurde eine universelle Syntheseroute entworfen, um die Einführung der reaktiven Gruppe am Ende der Synthese durch Acylierung zu ermöglichen. So können nach den ersten 5 gemeinsamen Schritten, 3 davon in quantitativer Ausbeute, verschiedene reaktive Gruppen eingeführt werden. Darüber hinaus wird durch die Abwesenheit von Tautomerie oder labilen Gruppen sowohl die Aufreinigung als auch die Analytik der Verbindungen erleichtert. Die Acylierungsversuche waren jedoch weder mit dem Säurecyanid noch mit dem Weinreb-Amid erfolgreich.

Zusammenfassend konnte in dieser Arbeit bewiesen werden, dass das 1,3-Diketon-Motiv eine geeignete reaktive Gruppe zur Programmierung des cpCARs ist, der von Hudecek et al. (bisher unveröffentlicht) entwickelt wurde. Es konnte außerdem gezeigt werden, dass die hapten-artigen Verbindungen gleichzeitig an Integrin ${\alpha}_v{\beta}_3$ und den cpCAR binden und die T-Zell-Signalkaskade aktivieren. Die modulare Synthesestrategie und der Einsatz der bioorthogonalen CuAAC für die Herstellung der Verbindungen ermöglichen einen unkomplizierten Zugang zu diesen wertvollen Immuntherapeutika, offenbarten jedoch die Notwendigkeit für einen zusätzlichen Reinigungsschritt zur Entfernung der Kupferionen.
KW  - Organische Synthese
KW  - Synthetische Biologie
KW  - Click-Chemie
KW  - Peptidsynthese
KW  - NMR-Spektroskopie
KW  - chemically programmable
KW  - chemisch programmierbar
KW  - CAR T cells
KW  - monoclonal antibodies
KW  - CAR T-Zellen
KW  - monoklonale Antikörper
Y1  - 2022
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-211385
ER  - 
TY  - THES
A1  - Peng, Kun
T1  - iClick reactions as a modular access to palladium(II) and platinum(II) triazolato complexes: Trends in kinetics and biological activity
T1  - iClick-Reaktionen als modularer Zugang zu Palladium (II)- und Platin (II)-Triazolato-Komplexen: Trends in der Kinetik und biologischen Aktivität
N2  - In the context of this work, important trends in the influence of the metal center, coligand, and alkyne reaction partner on the iClick reaction of square-planar palladium(II) and platinum(II) complexes with a N^N^N, C^N^N, or S^N^N coordination sphere and a number of internal as well as terminal alkynes were elaborated. Preliminary bioactivity studies on a human cancer cell line gave low micromolar EC50 values, for the most promising compound comparable to cisplatin serving as a reference drug. The further application of the iClick reaction to bioconjugation will be explored in future work.
N2  - Insgesamt konnten im Rahmen dieser Arbeit systematische Einflüsse des Metallzentrums, des Coliganden und des Alkins auf die Geschwindigkeit der iClick-Reaktion von quadratisch-planaren Palladium(II)- und Platin(II)-Azid-Komplexen mit internen und terminalen Alkinen identifiziert werden. So reagiert auch in dieser Serie das 4d-Element schneller als das entsprechend 5d-Metall, interne Alkinen mit elektronenarmen Substituenten führen zu einer höheren Reaktionsgeschwindigkeit als terminale Alkine und Geschwindigkeitskonstante steigt für tridentate Chelatliganden in der Reihenfolge N^N^N < S^N^N < C^N^N an. Erste orientierende biologische Studien an menschlichen Tumorzellen ergaben vielversprechende EC50-Werte im unteren mikromolaren Bereich. Das Potential dieser Verbindungen und der iClick-Reaktion allgemein für die Biokonjugation und tiefgehende Untersuchungen des Mechanismus der Antitumor-Wirkung sollte in zukünftigen Studien noch weiter ausgedehnt werden.
KW  - iClick reactions
KW  - palladium(II) and platinum(II) triazolato complexes
KW  - kinetics
KW  - biological activity
KW  - Click-Chemie
KW  - Palladiumkomplexe
KW  - Platinkomplexe
Y1  - 2020
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-211613
ER  - 
TY  - THES
A1  - Qamar, Riaz-ul
T1  - Synthesis of functionalized molecular probes for bioorthogonal metabolic glycoengineering
T1  - Synthese von funktionalisierten molekularen Strukturen für metabolisch bioorthogonales Glycoengineering
N2  - Biomolecules are difficult to investigate in their native environment. The vast complexity of cellular systems and seldom availability of chemical reactions compatible with the physiological milieu make it a challenging task. Bioorthogonal chemical reactions serve as a key to achieve selective ligation, whose components must react rapidly and selectively with each other under physiological conditions in the presence of the plethora of functionalities necessary to sustain life. In this dissertation, we focused on the synthesis of chemical reporters and probe molecules for bioorthogonal labeling through click reaction. Initially, sialic acid derivatives with a linker containing terminal alkyne functionality were synthesized. After the synthesis of azide derivatives of fluorescent dyes as counter partners, they were conjugated with sialic acids through Cu(I) catalyzed alkyne azide cycloaddition (CuAAC). The successful in vitro conjugation of Sia and fluorescent dyes was followed by metabolic tagging of human larynx carcinoma (HEp-2) and the carcinoma of Chinese hamster ovary (CHO­K1) with alkynated Sia that were subsequently ligated with fluorescein azide. Finally, the stained cells were subjected to fluorescent microscopy to obtain their images. To enable the click reaction compatible to in vivo applications, the reactivity of cyclooctyne was enhanced by two different approaches. In a first approach, following the Bertozzi’s strategy, two fluorine atoms were introduced adjacent to the alkyne to lower the LUMO. In a second strategy the ring strain of cyclooctyne was attempted to be enhanced by the introduction of an amide group. In addition, glutarimide derivatives with free amino and carboxylic acid functional groups were synthesized by domino-Michael addition-cyclization-reaction.
N2  - Biomoleküle sind schwer in ihrer natürlichen Umgebung zu untersuchen. Die enorme Komplexizität zellulärer Systeme und die geringe Verfügbarkeit von chemischen Reaktionen, welche mit physiologischen Bedingungen kompatibel sind, stellen eine große Herausforderung dar. Bioorthogonale Reaktionen dienen hierbei als Schlüssel für eine selektive Ligation, bei der die Komponenten schnell, selektiv und unter genannten Bedingungen miteinander reagieren. Der Fokus dieser Dissertation lag auf der Synthese von chemischen Reportermolekülen, welche für bioorthogonale Markierungsversuche mithilfe einer Klick-Reaktion eingesetzt werden können. Dafür wurden zunächst Derivate der Sialinsäure mit einem Linker, der eine endständige Alkinfunktion trägt, synthetisiert und diese mit ebenfalls in dieser Arbeit dargestellten Azidofluoreszenzfarbstoffen in einer Cu(I)-katalysierten Alkin-Azid-Cycloaddition (CuAAC) konjugiert. Nach erfolgreicher in vitro Durchführung wurden Zellen des menschlichen Larynx Karzinoms (HEp-2) und Zellen des Ovariumkarzinoms des chinesischen Hamsters metabolisch mit alkinfunktionalisierten Sialinsäuren markiert und anschließend mit Fluoresceinazid ligiert. Fluoreszenzmikroskopie an diesen Zellen demonstrierte den erfolgreichen Einbau der Sialinderivate. Um die Klickreaktion verträglicher für in vivo Anwendungen zu gestalten, wurde versucht die Reaktivität des Cyclooctin durch zwei verschiedene Herangehensweisen zu erhöhen. Zum einen wurden nach Strategie von Bertozzi zwei Fluoratome benachbart zur Alkingruppe eingeführt, um die LUMO-Energie zu erniedrigen. Zum anderen wurde versucht die Ringspannung des Cyclooctin durch Einführung einer Amidgruppe zu erhöhen. Neben dem Klickprojekt wurden in dieser Arbeit außerdem Glutarimidderivate mit freien Amino- und Carbonsäuregruppen über eine Domino-Michael-Additions-Zyklisierungsreaktion dargestellt.
KW  - Click-Chemie
KW  - Acetylneuraminsäure <N->
KW  - Cyclooctine
KW  - Ringschlussmetathese
KW  - Michael-Addition
KW  - Bioorthogonal
KW  - Glycoengineering
KW  - Sialinsäuren
KW  - Molecular probes
KW  - Bioorthogonal
KW  - Glycoengineering
KW  - Sialic acids
KW  - Cyclooctyne
KW  - Ring closing metathesis
KW  - Michael addition
Y1  - 2012
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-73378
ER  - 
TY  - THES
A1  - Schlegel, Jan
T1  - Super-Resolution Microscopy of Sphingolipids and Protein Nanodomains
T1  - Hochaufgelöste Mikroskopie von Sphingolipiden und Protein Nanodomänen
N2  - The development of cellular life on earth is coupled to the formation of lipid-based biological membranes. Although many tools to analyze their biophysical properties already exist, their variety and number is still relatively small compared to the field of protein studies. One reason for this, is their small size and complex assembly into an asymmetric tightly packed lipid bilayer showing characteristics of a two-dimensional heterogenous fluid. Since membranes are capable to form dynamic, nanoscopic domains, enriched in sphingolipids and cholesterol, their detailed investigation is limited to techniques which access information below the diffraction limit of light. In this work, I aimed to extend, optimize and compare three different labeling approaches for sphingolipids and their subsequent analysis by the single-molecule localization microscopy (SMLM) technique direct stochastic optical reconstruction microscopy (dSTORM). First, I applied classical immunofluorescence by immunoglobulin G (IgG) antibody labeling to detect and quantify sphingolipid nanodomains in the plasma membrane of eukaryotic cells. I was able to identify and characterize ceramide-rich platforms (CRPs) with a size of ~ 75nm on the basal and apical membrane of different cell lines. Next, I used click-chemistry to characterize sphingolipid analogs in living and fixed cells. By using a combination of fluorescence microscopy and anisotropy experiments, I analyzed their accessibility and configuration in the plasma membrane, respectively. Azide-modified, short fatty acid side chains, were accessible to membrane impermeable dyes and localized outside the hydrophobic membrane core. In contrast, azide moieties at the end of longer fatty acid side chains were less accessible and conjugated dyes localized deeper within the plasma membrane. By introducing photo-crosslinkable diazirine groups or chemically addressable amine groups, I developed methods to improve their immobilization required for dSTORM. Finally, I harnessed the specific binding characteristics of non-toxic shiga toxin B subunits (STxBs) and cholera toxin B subunits (CTxBs) to label and quantify glycosphingolipid nanodomains in the context of Neisseria meningitidis infection. Under pyhsiological conditions, these glycosphingolipids were distributed homogenously in the plasma membrane but upon bacterial infection CTxB detectable gangliosides accumulated around invasive Neisseria meningitidis. I was able to highlight the importance of cell cycle dependent glycosphingolipid expression for the invasion process. Blocking membrane accessible sugar headgroups by pretreatment with CTxB significantly reduced the number of invasive bacteria which confirmed the importance of gangliosides for bacterial uptake into cells. Based on my results, it can be concluded that labeling of sphingolipids should be carefully optimized depending on the research question and applied microscopy technique. In particular, I was able to develop new tools and protocols which enable the characterization of sphingolipid nanodomains by dSTORM for all three labeling approaches.
N2  - Die Entwicklung von zellulären Lebensformen auf der Erde basiert auf der Entstehung biologischer Lipid-Membranen. Obwohl viele Techniken zur Verfügung stehen, welche es erlauben deren biophysikalische Eigenschaften zu untersuchen, sind die Möglichkeiten, verglichen mit der Analyse von Proteinen, eher eingeschränkt. Ein Grund hierfür, ist die geringe Größe von Lipiden und deren komplexe Zusammenlagerung in eine asymmetrische dicht gepackte Lipiddoppelschicht, welche sich wie eine heterogene zweidimensionale Flüssigkeit verhält. Durch die lokale Anreicherung von Sphingolipiden und Cholesterol sind Membranen in der Lage dynamische, nanoskopische Domänen auszubilden, welche lediglich mit Techniken, welche die optische Auflösungsgrenze umgehen, detailliert untersucht werden können.

Ein wesentliches Ziel meiner Arbeit war es, drei Färbeverfahren für Sphingolipide zu vergleichen, erweitern und optimieren, um eine anschliessende Untersuchung mit Hilfe der einzelmolekülsensitiven Technik dSTORM (direct stochastic optical reconstruction microscopy) zu ermöglichen. Zunächst verwendete ich das klassische Färbeverfahren der Immunfluoreszenz, um Sphingolipid-Nanodomänen auf eukaryotischen Zellen mit Hilfe von Farbstoff-gekoppelten Antikörpern zu detektieren und quantifizieren. Dieses Vorgehen ermöglichte es mir, Ceramid-angereicherte Plattformen mit einer Größe von ~ 75nm auf der basalen und apikalen Membran verschiedener Zell-Linien zu identifizieren und charakterisieren.

Als nächstes Verfahren verwendete ich die Klick-Chemie, um Sphingolipid-Analoge in lebenden und fixierten Zellen zu untersuchen. Eine Kombination aus Fluoreszenz-Mikroskopie und Anisotropie-Messungen erlaubte es mir Rückschlüsse über deren Zugänglichkeit und Konfiguration innerhalb der Plasmamembran zu ziehen. Hierbei lokalisierten Azid-Gruppen am Ende kurzkettiger Fettsäurereste außerhalb des hydrophoben Membrankerns, wodurch sie mittels membran-undurchlässige Farbstoffe angeklickt werden konnten. Im Gegensatz dazu, waren Azide an längeren Fettsäureresten weniger zugänglich und konjugierte Farbstoffe tauchten tiefer in die Plasmamembran ein. Durch die Einführung photoreaktiver Diazirin-Gruppen oder chemisch modifzierbarer Amin-Gruppen wurden Wege geschaffen, welche eine Immobilisierung und anschließende Analyse mit Hilfe von dSTORM ermöglichen.

Schließlich nutzte ich das spezifische Bindeverhalten der nicht toxischen B Untereinheiten von Shiga- (STxB) und Cholera-Toxin (CTxB) aus, um Glycosphingolipid Nanodomänen im Kontext einer Neisseria meningitidis Infektion zu untersuchen. Unter physiologischen Bedingungen waren diese homogen in der Plasmamembran verteilt, jedoch reicherten sich CTxB-detektierbare Ganglioside um eindringende Bakterien an. Darüber hinaus konnte ich einen Zusammenhang zwischen der zellzyklusabhängigen Expression von Glycosphingolipiden und dem Eindringen der Bakterien herstellen. Eine Absättigung der Zucker an der äußeren Membran durch CTxB-Vorbehandlung reduzierte die Anzahl von invasiven Bakterien signifikant und bestätigte die Schlüsselrolle von Gangliosiden bei der Aufnahme von Bakterien.

Meine Ergebnisse legen Nahe, dass das Färbeverfahren für Sphingolipide an die jeweilige Fragestellung und Mikroskopietechnik angepasst werden sollte. Im Rahmen dieser Arbeit konnten neue Werkzeuge und Protokolle geschaffen werden, die die Charakterisierung von Sphingolipid-Nanodomänen mittels dSTORM für alle drei Färbeverfahren ermöglichen.
KW  - Sphingolipide
KW  - Lipide
KW  - Einzelmolekülmikroskopie
KW  - Click-Chemie
KW  - Lipid Raft
KW  - super-resolution microscopy
KW  - sphingolipids
KW  - labeling techniques
KW  - dSTORM
KW  - lipid rafts
Y1  - 2021
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-229596
ER  - 
TY  - THES
A1  - Solger, Franziska
T1  - Central role of sphingolipids on the intracellular survival of \(Neisseria\) \(gonorrhoeae\) in epithelial cells
T1  - Die zentrale Rolle von Sphingolipiden auf das intrazelluläre Überleben von \(Neisseria\) \(gonorrhoeae\) in Epithelzellen
N2  - Neisseria gonorrhoeae are Gram-negative bacteria with diplococcal shape. As an obligate human pathogen, it is the causative agent of gonorrhoea, a sexually transmitted disease. Gonococci colonize a variety of mucosal tissues, mainly the urogenital tract in men and women. Occasionally N. gonorrhoeae invades the bloodstream, leading to disseminated gonococcal infection. These bacteria possess a repertoire of virulence factors, which expression patterns can be adapted to the environmental conditions of the host. Through the accumulation of antibiotic resistances and in absence of vaccines, some neisserial strains have the potential to spread globally and represent a major public health threat. Therefore, it is necessary to understand the exact molecular mechanisms underlying the successful infection and progression of gonococci within their host. This deeper understanding of neisserial infection and survival mechanisms is needed for the development of new therapeutic agents. 
In this work, the role of host-cell sphingolipids on the intracellular survival of N. gonorrhoeae was investigated. It was shown that different classes of sphingolipids strongly interact with invasive gonococci in epithelial cells. Therefore, novel and highly specific clickable sphingolipid analogues were applied to study these interactions with this pathogen. The formation of intra- and extracellular sphingosine vesicles, which were able to target gonococci, was observed. This direct interaction led to the uptake and incorporation of sphingosine into the neisserial membrane. Together with in vitro results, sphingosine was identified as a potential bactericidal reagent as part of the host cell defence. By using different classes of sphingolipids and their clickable analogues, essential structural features, which seem to trigger the bacterial uptake, were detected. Furthermore, effects of key enzymes of the sphingolipid signalling pathway were tested in a neutrophil infection model.
In conclusion, the combination of click chemistry and infection biology made it possible to shed some light on the dynamic interplay between cellular sphingosine and N. gonorrhoeae. Thereby, a possible “catch-and-kill” mechanism could have been observed.
N2  - Neisseria gonorrhoeae ist ein Gram-negatives Bakterium, welches als Diplokokke vorkommt. Als ein ausschließliches Humanpathogen sind Neisserien der Erreger für die sexuell übertragbare Infektionskrankheit Gonorrhö. Gonokokken besiedeln eine Vielzahl von Schleimhäuten, jedoch hauptsächlich den Urogenitaltrakt bei Männern und Frauen. Gelegentlich kann N. gonorrhoeae in die Blutbahn invadieren, was zu einer disseminierten Infektion führen kann. Diese Bakterien verfügen über ein Repertoire an Virulenzfaktoren, deren Expressionskombination den Umgebungsbedingungen des Wirts angepasst werden können. Durch die Anhäufung von Antibiotikaresistenzen und durch das Fehlen eines Impfstoffes, besteht die Gefahr, dass spezielle Neisserienstämme sich weltweit verbreiten und daher eine ernstzunehmende Bedrohung des Menschen sind. Daher ist es notwendig die zugrundeliegenden molekularen Mechanismen der erfolgreichen Infektion und Ausbreitung der Gonokokken im Wirt genauestens zu verstehen. Das detaillierte Wissen über die Neisserieninfektion und Überlebensmechanismen ist nötig für die Entwicklung neuer Therapieansätze. 
In dieser Arbeit wurde der Effekt von Sphingolipiden der Wirtszelle auf das intrazelluläre Überleben von N. gonorrhoeae untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass unterschiedliche Klassen von Sphingolipiden stark mit invasiven Gonokokken in Epithelzellen interagieren. Um dies zu tun, wurden neue und hochspezifische clickbare Sphingolipidanaloge eingesetzt, um deren Interaktionen mit diesem Pathogen zu studieren. Die Formation von intra- als auch extrazellulären Sphingosinvesikeln, welche Gonokokken gezielt erreichten, konnte beobachtet werden. Diese direkte Interaktion führte zu einer Aufnahme und Einbau des Sphingosins in die Neisserienmembran. Zusammen mit in vitro Ergebnissen, konnte Sphingosin als potenzieller und antibakterieller Bestandteil des zellulären Abwehrsystems identifiziert werden. Weiterhin wurde durch die Verwendung unterschiedlicher Sphingolipidklassen und deren clickbaren Analoge wichtige Strukturen erkannt, die die bakterielle Aufnahme auslösen. Des Weiteren wurden die Auswirkungen von Schlüsselenzymen des Sphingolipidsignalwegs in einem Infektionsmodell mit Neutrophilen getestet. 
Abschließend ist zu sagen, dass die Kombination aus Click Chemie und Infektionsbiologie es ermöglicht hat, die dynamischen Wechselwirkungen zwischen zellulären Sphingosin und N. gonorrhoeae zu beleuchten. Dadurch konnte ein möglicher „catch-and-kill”-Mechanismus entdeckt werden.
KW  - Neisseria gonorrhoeae
KW  - Sphingosinkinase
KW  - Sphingosinanaloga
KW  - Click-Chemie
KW  - sphingosine
KW  - sphingolipids
KW  - Neisseria
KW  - intracellular
KW  - vesicles
Y1  - 2021
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-247534
ER  - 
TY  - THES
A1  - Walter, Tim
T1  - Bioorthogonal funktionalisierte Sphingolipide zur Evaluierung von Lipiddynamiken \(in\) \(vivo\)
T1  - Bioorthogonal functionalized sphingolipids for evaluation of lipid dynamics \(in\) \(vivo\)
N2  - In der Kontrolle von viralen oder bakteriellen Infektionen spielen Sphingolipide eine essentielle Rolle[335-336], weshalb sich inzwischen die Forschung vermehrt an Sphingolipiden und -analoga als Wirkstoffen gegen die verschiedensten Erreger beschäftigt.[9] Dabei finden in der Synthese und Identifikation potentieller Wirkstoffe auch clickchemiebasierte Ansätze Anwendung.[224] Allerdings ist die Wirkweise von sphingolipidbasierten Pharmaka auch in viraler und mikrobieller Pathogenese bisher ungeklärt. 
Mit der Entdeckung der CuAAC[112-113] sowie deren modernen Varianten und Alternativen, die gemeinsam unter dem Begriff Clickchemie zusammengefasst werden, ist es möglich, die strukturellen Änderungen von Biomolekülen klein zu halten und durch spätere Konjugation mit Farbstoffen Fluoreszenspektroskopie zu ermöglichen.[339-340] Während in den letzten Jahren die Clickchemie breite Anwendung zur Modifikation von Proteinen[130], Kohlenhydraten[341] und DNA[340] gefunden hat blieben Lipide lange unbeachtet[342], was vor allem auch für Sphingolipide gilt.
In dieser Arbeit werden bioorthogonal funktionalisierte Sphingolipide und -analoga vorgestellt, um die Vielseitigkeit der Clickchemie auf das Feld der Sphingolipide zu übertragen. Die clickfähigen Lipidanaloga ermöglichen detaillierte Einblicke in die dynamische Organisation von Sphingolipiden bei Infektionsprozessen und ihr Einsatz als therapeutische Wirkstoffe oder zur Generierung von antibakteriellen Oberflächenbeschichtungen wurden untersucht.
Die dargestellten azidmodifizierten Sphingolipide und –analoga konnten in Zusammenarbeit mit Kooperationspartnern, bezüglich ihrer Verwendung in Visualisierungsexperimenten und antibakteriellen Eigenschaften untersucht werden.
Die Ceramidderivate konnten genutzt werden, um den Einfluss von Kettenlänge und Position des Azides der acylierten Säure auf die in vivo-Konjugation mit dem Fluoreszenzfarbstoff DBCO-Sulfo-Cy5 in Jurkatzellen genauer zu untersuchen.[211]
Auch konnten azidfunktionalisierte Ceramide auf ihre Eignung zur Visualisierung von Ceramiddynamiken während T-Stimulation untersucht werden.[205] In diesem Zusammenhang sind visualisierbare Ceramide von besonderer Bedeutung, da die T-Zellstimulation die ASM-Aktivierung zur Folge hat, die wiederum Ceramide freisetzt.
Mit dem azidmodifizierten Phytosphingosinderivat gelang es erstmals ein azidmodifiziertes Sphingolipid nach Inkubation von Arabidopsis thaliana Setzlingen mittels CuAAC mit einem Fluoreszenzfarbstoff zu konjugieren.[258] 
Des Weiteren konnten die azidfunktionalisierten N-Oleoylserinole in verschiedenen Zelltypten erfolgreich eingebaut und selektiv mit Fluoreszenzfarbstoff visualisiert werden. Kofärbungen mit GFP-PKCζ und Antikörpermarkierungen von Ceramid sowie PKCζ zeigten, dass es sich bei den Enantiomeren um ceramidimitierende Lipidanaloga handelt. Somit eignen sich diese N-Oleoylserinolanaloga, um die Interaktion von Ceramiden mit der Proteinkinase Cζ zu untersuchen.
Da viele natürliche Sphingolipide antibakterielle Eigenschaften aufweisen, konnte in Kooperation mit Jérôme Becam der Einsatz azidmodifizierter Ceramide als Wirkstoff gegen Neisseria meningitidis, Neisseria gonorrhoeae sowie Escherichia coli und Staphylococcus aureus untersucht werden. ωN3-C6-Cer zeigt gute bakterizide Eigenschaften gegen Neisseria meningitidis und Neisseria gonorrhoeae, ohne dabei toxisch gegenüber den Wirtszellen zu sein. Die Ceramidanaloga αN3-C6-Cer, αN3-C16-Cer und ωN3-C16-Cer weisen keine antibakteriellen Eigenschaften auf, aber sie wurden effizient in die Membran der Neisseriae eingebaut und konnten ebenfalls erfolgreich bioorthogonal markiert werden. Des Weiteren zeigten hochauflösende dSTORM-Aufnahmen der Bakterien, im Gegensatz zu Humanzellen, eine homologe Verteilung der konjugierten Ceramide. Da Ceramide eine wichtige Rolle in der Infektionsbekämpfung spielen, sind die in dieser Arbeit synthetisierten azidmodifizierten Ceramide wertvolle Werkzeuge, um die Interaktion von Bakterien mit Humanzellen zu untersuchen.
Außerdem konnte im Rahmen dieser Arbeit erfolgreich eine innovative Methode entwickelt werden, um alkinpräsentierende Linker auf die Oberfläche von Nunc Covalink 96 Microtiterplatten kovalent zu binden und die Alkine konnten anschließend mittels CuAAC mit den in dieser Arbeit synthetisierten azidfunktionalisierten Lipiden zu konjugiert werden. Ziel der Methode war es potentielle Moleküle für bakterizide Oberflächenmodifikationen zu identifizieren. Mittels solcher Oberflächenmodifikationen soll die Biofilmbildung in Endotrachealtuben verhindert, und damit die Entstehung von beatmungsassozierten Pneumonien unterbunden werden. Die lipidmodifizierten Microtiterplatten sollen zukünftig auch genutzt werden, um sphingolpidaffine Proteine aus Zelllysaten zu identifizieren.
N2  - Sphingolipids play an essential role in the control of viral and bacterial infections[335-336], therefore sphingolipids and analogues shift into the focus of pharmaceutical research as active ingredients against various pathogens.[9] Also click chemistry is used for synthesis and screening of potential drugs.[224] The mode of action of sphingolipid based pharmaceuticals in viral and microbial pathogenesis is not yet fully understood.
By using CuAAC[112-113] and their modern variants and alternatives – summarized in the term click chemistry – it is possible to minimise the structural alterations of biomolecules and still use them in fluorescence spectroscopy after labeling. [339-340] While modification of proteins[130], carbohydrates[341] and DNA[340] via click chemistry has been widely used in recent years, lipids have remained unaffected for a long time, especially sphingolipids.[342]
In this Work biorthogonal functionalised sphingolipids and analogues are presented, that transfer the versatility of the click chemistry to the field of sphingolipids. Furthermore, the clickable lipid analogues allow a detailed view into the dynamic organisation of sphingolipids in infection processes and in addition their use as therapeutic agents or for the generation of antibacterial surface coatings were investigated. 
The synthesized azide modified sphingolipids and analogues were evaluated for the use in visualisation experiments and their antibacterial properties were evaluated within several cooperation projects.
The ceramide derivatives were used to evaluate the influence of acylated chain length and azide position in regard to in vivo labeling with the fluorescence dye DBCO-Sulfo-Cy5 in jurkat cells.[211]
Furthermore, ceramide dynamics during T-cell stimulation were investigated by labeling azide functionalised ceramides.[205] In this context visualisable ceramides are of particular interest due T-cell stimulation results in ASM-activation, which again releases ceramides.
With the azide modified phytosphingosine derivative, an azide modified sphingolipid was labelled via CuAAC after incubation of arabidoopsis thailana seedlings for the first time[258] 
Furthermore, azide functionalised N-Oleoyl serinols were successfully incorporated within different cell types and selectively visualised by labelling. Colocalization studies with GFP-PKCζ and anti body labeling of ceramide as well as PKCζ proved to be ceramide mimicking lipid analogues
Many natural sphingolipids show antibacterial behaviour, therefore the use of azide modified ceramides as active ingredients against Neisseria meningitidis, Neisseria gonorrhoeae sowie Escherichia coli und Staphylococcus aureus were investigated in cooperation with Jérôme Becam ωN3-C6-Cer shows good bactericidal properties against Neisseria meningitidis and Neisseria gonorrhoeae without being toxic against host cells. The ceramide analogues αN3-C6-Cer, αN3-C16-Cer and ωN3-C16-Cer show no antibacterial properties, but they were also efficiently incorporated into the membrane of Neisseriae and can be used biorthogonal labelling. Furthermore, in contrast to human cells high resolution dSTORM-images show an evenly distribution of labelled ceramides in bacteria cells. Since ceramides play an important role in the fight against infections the ceramides synthesised in this work are valuable tools to investigate the interaction of bacteria with human cells. 
Also an innovative method was established within this thesis to modify the surface of Nunc Covalink 96 Wellplates with alkyne presenting linkers followed by the conjugation of the azide modified lipids presented in this work via CuAAC. This method is intended to be used for screening of potential molecules for antibacterial surface modifications. In the future this kind of surface modifications are expected to prevent the biofilm formation in endotracheal tubes and prohibit the formation of ventilator-associated pneumonia. In Addition the lipid modified microtiter plates are also intended to be used to identify sphingolipid affine proteins from cell lysate.
KW  - Click-Chemie
KW  - Sphingolipide
KW  - Lipidmembran
KW  - Sphingolipid
KW  - bioorthogonal
Y1  - 2018
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-168091
ER  - 
TY  - THES
A1  - Wolf, Natalia
T1  - Synthese multifunktionaler Farbstoffe und Linker zur Visualisierung biologischer Strukturen
T1  - Synthesis of multifunctional dyes and linkers for visualization of biological structures
N2  - Durch stetige Entwicklung der Mikroskopiemethoden in den letzten Jahrzehnten ist es nun möglich Strukturen und Abläufe in biologischen Systemen detaillierter darzustellen als mit der von Abbe entdeckten maximalen Auflösungsgrenze. Oft werden dabei Fluoreszenzmarker benutzt, welche die unsichtbare Welt der Mikrobiologie und deren biochemische Prozesse illuminieren. Diese werden entweder durch Expression, wie z.B. das grün fluoreszierende Protein (GFP), in das zu untersuchende Objekt eingebracht oder durch klassische Markierungsmethoden mithilfe von fluoreszierenden Immunkonjugaten installiert. Jedoch gewinnt eine alternative Strategie, die von der interdisziplinären Zusammenarbeit zwischen Chemikern, Physikern und Biologen profitiert, immer mehr an Bedeutung – die bioorthogonale Click-Chemie. Sie ermöglicht eine effiziente Fluoreszenzmarkierung der biologischen Strukturen unter minimalem Eingriff in die Abläufe der Zelle. Dazu müssen allerdings sowohl Farbstoffe als auch die biologisch aktiven Substanzen chemisch modifiziert werden, da nur dadurch die Bioorthogonalität gewährleistet werden kann. 
Mittlerweile existiert eine breite Palette an fluoreszierenden Farbstoffen, die das komplette sichtbare Spektrum abdecken und sich für diverse Mikroskopiemethoden eignen. Allerdings gibt es zwei Farbstoffklassen, die sich aus der gesamten Fülle abheben und sich für hochauflösende bildgebende Experimente auf Einzelmolekülebene eignen. Zum einen ist es die Farbstofffamilie der Cyanine und insbesondere der wasserlöslichen Pentamethincyanine, die reversibel und kontrolliert zum Photoschalten animiert werden können und in der stochastisch optischen Rekonstruktionsmikroskopie Anwendung finden. Zum anderen ist es die Gruppe, der Rhodamine und Fluoresceine, die zu Xanthenfarbstoffen gehören und sich durch gute photophysikalische Eigenschaften auszeichnen. 
Trotz der Beliebtheit stellt ihre Darstellung immer noch eine Herausforderung dar und limitiert deren Einsatz. Deshalb war es notwendig im Rahmen der vorliegenden Arbeit Möglichkeiten zur Syntheseoptimierung beider Farbstoffklassen zu finden, damit diese im Folgenden weiterentwickelt und an die biologische Fragestellung angepasst werden können. Die Arbeit unterteilt sich deshalb in Relation an die oben genannten Farbstoffklassen in zwei Bereiche. Im ersten Teil wurden Projekte basierend auf den wasserlöslichen Pentamethincyaninen behandelt. Im zweiten Teil beschäftigte sich die Arbeit mit Projekten, die auf Xanthen-Farbstoffen aufbauen.
N2  - Due to steady development in microscopy methods during the last decades its now possible to visualize biological structures in more detail than Abbes low would allow. Frequently fluorescence labeling is used to illuminate the world of microbiology and its processes. There are two classical methods to introduce fluorescent markers to the target of interest. The first way is to use the expression of fluorescent proteins like GFP (green fluorescent protein). The second one is the application of fluorescent immunoconjugates. However, an alternative strategy that benefits from the interdisciplinary cooperation between chemists, physicists and biologists is becoming increasingly important – bioorthogonal click chemistry. It enables efficient fluorescent labelling of biological structures with minimal influence in cell processes. But this requires chemical modification of both dyes and the biologically active substances, as this is the only way to guarantee bioorthogonal click reactions. 
In the meantime, a wide range of fluorescent dyes is available that cover the entire visible spectrum and are suitable for various microscopy methods. However, there are two classes of dyes that stand out from the rest and are suitable for high-resolution imaging experiments at the single molecule level. On the one hand, there is the dye family of cyanines and in particular the water-soluble pentamethine cyanines, which can be reversibly and in a controlled manner animated to photoswitch. Therefore, they are used in stochastic optical reconstruction microscopy like dStorm. On the other hand, there is the group of rhodamines and fluoresceins, which belong to xanthene dyes and are characterized by good photophysical properties.
Despite their popularity, their synthesis still poses a challenge and limits their use. Therefore, it was necessary to find ways to optimize the synthesis of both dye classes within the scope of the present work, so that they can be further developed and adapted to the biological question. This thesis is therefore divided into two parts in relation to the two above mentioned dye classes. In the first part three projects based on the water-soluble pentamethine cyanines were addressed. In the second part the work dealt with projects based on the HMSiR-dyes.
KW  - Farbstoff
KW  - Cyanin
KW  - Rhodaminderivate
KW  - Click-Chemie
KW  - Farbstoffsynthese
KW  - Pentamethincyanine
KW  - Siliziumrhodaminderivate
KW  - bioorthogonale Click-Chemie
KW  - Synthese
Y1  - 2021
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-205312
ER  -