TY  - THES
A1  - Levchenko, Victor
T1  - Studies of CA 2+ -signaling and CL-conductance changes in response to abscisic acid, voltage changes and cold, in the plasma membrane of guard cells
N2  - Land plants must control the transpiration water stream and balance it with carbon dioxide uptake for optimal photosynthesis. A highly specialized type of plant cell called guard cells have evolutionary appeared which are suited for this complicated purpose. Guard cells are located by pairs on aerated plant surface and form stomata – structural units, which represent highly regulated “watergate” (Roelfsema and Hedrich, 2005). Guard cells sense many environmental and internal plant-derived stimuli and by changing degree of their swelling tightly regulate diffusion of water vapor and other gases. Cell processes taking place in stomata during their movements had been a subject of intensive investigation for more than three decades (Schroeder et al., 2001; Assmann and Shimazaki, 1999). With use of electrophysiological technique the basic processes underlying stomatal movements were described (Thiel et al., 1992; Dietrich et. al., 2001; Roelfsema and Hedrich, 2005). Another set of questions arised between plant biologists is how the signals affecting stomatal aperture are transduced in guard cells starting from perception by receptor structures and ending on the osmodynamic motor components. Introduction of fluorescent microspectroscopy technique allowed to characterize some Ca2+ and H+-based signaling events, taking place in the cytoplasm during stomata function. Most of the processes, taking place in stomata were characterized in guard cell preparations, such as strips of isolated leaf epidermis or guard cell protoplasts, - cells with enzymaticaly digested cell walls. Some experimental observations although point that reactions of guard cells located in their natural environment, leaves of intact plants can differ from those could be registered in preparations. These deviations might be explained by the modulation of guard cell function by apoplastic factors originating from surrounding tissues like mesophyll or leaf epidermis (Roelfsema and Hedrich, 2002). On the other hand registration of physiological responses in prepared tissues may also contain possible artifacts, related to the preparation procedures. The aim of the experimental work presented here was to investigate the cell signaling events, taking place in guard cells upon plant stress hormone abscisic acid (ABA) and some other stimuli action. Abscisic acid is a compound that synthesized in plant roots upon drought and closes stomata in the leaf to prevent the plant organism from excessive water loss. Previous studies on guard cell of isolated epidermis and guard cell protoplasts showed, that ABA induces stomatal closure via activation of plasma membrane anion channels (Grabov et al., 1997; Pei et al, 1997). Anion channels are known to be activated by elevated 2 concentrations of cytoplasmic Ca2+ [Ca2+]cyt (Schroeder and Hagiwara, 1989; Hedrich et al., 1990). Application of Ca2+-sensitive fluorescent probes revealed [Ca2+]cyt increases in guard cells upon ABA action (McAinsh et al., 1990). This observation led to suggestion that [Ca2+]cyt directly participate in the transduction of ABA signal in guard cells. Although no direct evidences for co-occurrence of [Ca2+]cyt rises and following activation of anion channels upon ABA action was not presented until yet. Results of experimental work performed on intact Vicia faba, Commelina communis and Nicotiana plumbagnifolia plants showed that guard cells of intact plant leaves respond with transient activation of plasma membrane anion channels upon perception of ABA. Kinetics of the response is highly reproducible and seemed to be conserved between species. Although despite clear generation of anion current transients, no [Ca2+]cyt increases could be recorded with using fluorescent probe Fura-2 microinjected into the cytoplasm. Together with results of later study on intact Nicotiana tabacum guard cells, reported obligatory [Ca2+]cyt increases which were desynchronized with anion current transients (Marten et al., 2007b) this, may indicate that [Ca2+]cyt increases are not necessary component of ABA signal transduction pathway. Together with absence of the effect of cytoplasm-delivered Ca2+- mobilizing agents IP3, IP6 and NAADP on anion currents these data may suppose that role of [Ca2+]cyt in ABA signaling must be reassessed. Further interest represented characterization of [Ca2+]cyt signaling and homeostasis in intact guard cells comparing with those in prepared cells. Experiments revealed strong deviations in [Ca2+]cyt behavior between different measuring systems. While guard cells of intact plants were able to strictly maintain [Ca2+]cyt level upon experimental shifting of [Ca2+]cyt level in either direction of elevation or decrease, cells of isolated epidermis showed complete absence of such ability. Guard cell protoplasts showed even weaker [Ca2+]cyt regulation ability and were capable of low physiological [Ca2+]cyt levels maintaining only at depolarized membrane potentials. Apart to these differences, prepared guard cells showed also for-time less activation of anion currents by experimentally imposed [Ca2+]cyt increases. These data strongly suggest that registered in guard cell preparations [Ca2+]cyt signals may contain significant part of artifacts and must be carefully used for the building of models of guard cells signaling. Further experimental investigations are strongly required for understanding guard cell functioning, especially with relation of vacuoles participation. The experimental work was done by the author in the period from october 2001 until november 2004 under supervision of Professor Dr. Rainer Hedrich in laboratory of molecular plant physiology and biophysics at Julius-Maximillians University of Würzburg, Würz3 burg, Federal Republic of Germany. Scientific coordinator of the Ph. D. project is Dr. Max Robert Gustaaf Roelfsema, University of Würzburg. Most of experimental results, presented here (chapter III) are also published elsewhere (Roelfsema et al., 2004; Langer et al., 2004; Levchenko et al., 2005, 2008). Chapter I intend to shortly introduce the reader into the field of guard cell research and point out the current level of understanding regarding this branch of plant research. Special attention is given to description of guard cell ion channels, their function and regulation, including the mechanisms of Ca2+-, H+- and phosphorylation-based signaling. This section is preceded by a short history of guard cell research and explains the actuality of presented work. In chapter II experimental techniques, methods and data processing approaches, used in the presented work are described. Technique used for electrophysiological registrations on intact plant leaves were used before and described in more details by Roelfsema et al. (2001). Fluorescent microspectroscopy technique was for the first time applied to intact plant leaves in this work and described in more details including calibration of Fura-2 based measurements. Chapter III presents the major results of the experimental work. In chapter IV the experimental results are discussed and put into context with current knowledge of guard cell function knowledge. Finally, remarks on perspectives of guard cell signaling research are drawn.
N2  - Landpflanzen sind in der Lage ihren Transpirationsfluss durch das Xylem zu regulieren und so den Wasserverlust mit dem Kohlendioxidbedarf der Photosynthese abzugleichen. Zu diesem Zweck haben sich im Laufe der Evolution Schließzellen entwickelt, welche in der Lage sind, diese komplizierte Aufgabe zu erfüllen. Schließzellen befinden sich auf Oberflächen oberirdischer Pflanzenorgane, wo sie als Paar eine Pore, dem sogenannten Stoma bilden. Schließzellen sind in der Lage mehrere Signale aus der Umwelt und von benachbarten Pflanzen wahrzunehmen. Anhand dieser Signale wird die Porenöffnung durch Änderungen des Schwellungsgrads der beiden Schließzellen genau reguliert. Die intrazellulären Prozesse die während der Stomabewegungen in den Schließzellen stattfinden sind bereits seit Jahrhunderten ein intensiv bearbeitetes Forschungsgebiet. Mit Hilfe elektrophysiologischer Techniken konnten bereits einige für die Stomabewegung grundlegende Prozesse beschrieben worden. Trotzdem sind immer noch viele Fragen offen. Dazu zählen vor allem die Mechanismen, die zur Wahrnehmung verschiedener Signale der Regulierung des osmotischen Motors in Schließzellen führt. Die meisten Studien zur Signalweiterleitung wurden mit isolierten Schließzellpräparationen durchgeführt, wie z.B. Epidermisstreifen oder Schließzellprotoplasten. Obwohl einige Schließzell-spezifische Eigenschaften in diesen Präparationen erhalten bleiben, deuteten kürzlich experimentelle Ergebnisse auf Unterschiede zwischen Antworten isolierter Schließzellen und denen intakter Pflanzen hin. Diese Unterschiede könnten durch die von Mesophyll- oder Epidermiszellen freigesetzte apoplastische Faktoren bedingt sein. Das Ziel der experimentellen Arbeiten dieser Dissertation war die Charakterisierung des Schließzellsignalweges ausgehend vom pflanzlichen Stresshormon Abscisinsäure (ABA). ABA wird in der Wurzel bei Trockenstress synthetisiert und bewirkt den Stomaschluss, um übermäßigen Wasserverlust zu unterbinden. Bisherige Studien mit isolierten Schließzellen ergaben, dass ABA die Aktivität der Plasmamembran-ständigen Anionenkanäle erhöht. In diesem Zusammenhang wurde postuliert, dass eine Aktivierung des ABAabhängigen Anionenkanals durch eine Erhöhung der zytosolischen Ca2+ Konzentration ([Ca2+]zyt) ausgelöst wird. Anionkanäle werden durch Ca2+ stimuliert und ABA bewirkt eine Erhöhung der [Ca2+]zyt. Die Resultate dieser Arbeit mit Vicia faba, Commelina communis und Nicotiana plumbagnifolia haben gezeigt, dass Schließzellen in intakten Blättern mit einer transienten Aktivierung der Plasmamembran-ständigen Anionenkanäle auf ABA reagieren. Die sehr typische 5 Aktivierungskinetik dieser ABA-Antwort scheint evolutionär gut konserviert zu sein. Obwohl ABA große Anionenströme in Vicia faba Schließzellen auslösen konnte, wurden keine Änderungen der [Ca2+]zyt mit dem Ca2+-Fluoreszenzindikator Fura-2 aufgezeichnet. Diese Resultate zeigen, dass zumindest in Vicia faba Schließzellen, eine Erhöhung der [Ca2+]zyt keine essentielle Komponente des ABA-Signalweges ist. Dieses Ergebnis zeigt, dass vor allem die Rolle der [Ca2+]zyt im ABA-Signalwege neu bewertet werden muss. Vor allem mit dem Unfähigkeit in Kombination mit den drei tierischen Ca2+-mobilisierenden Signalstoffen, IP3, IP6 and NAADP, die Anionenkanalaktivität zu beeinflussen. In einem weiteren Experiment, wurden Ca2+-abhängige Signalmechanismen und die Ca2+–Homöostase in Schließzellen zwischen isolierten Zellen mit denen in intakten Pflanzen verglichen. Schließzellen in intakten Pflanzen waren in der Lage, die [Ca2+]zyt unabhängig von Änderungen des Plasmamembranpotentials auf ein konstantes Niveau zu halten, während Schließzellen in isolierten Epidermisstreifen diese Fähigkeit verloren hatten. In Präparationen mit Epidermisstreifen löste eine Hyperpolarisierung des Membranpotentials einen dauerhaften Anstieg der [Ca2+]zyt aus. In Schließzellprotoplasten war das Vermögen, die [Ca2+]zyt zu regulieren, noch stärker eingeschränkt. Diese Zellen konnten nur bei depolarisierenden Membranpotentialen eine stabile [Ca2+]zyt halten. Darüber hinaus war auch das Vermögen von ABA, die Anionenkanalaktivität zu erhöhen bei Schließzellen in Epidermisstreifen stark begrenzt. Die in dieser Dissertation präsentierten Ergebnisse legen nahe, dass die bisher gemessenen [Ca2+]zyt-Signale an isolierten Schließzellen mit Fehlern behaftet sind. Die Isolierungsprozedur beeinflusst die Eigenschaften der Schließzellen und Daten aus solchen Präparationen sollten deswegen sorgfältiger bei der Entwicklung von Modellen zu Schließzellsignalwegen betrachtet werden. Einer Neubewertung der Rolle des [Ca2+]cyt wird voraussichtlich auf die Beteiligung neuartiger Komponenten des ABA Signalwegs hinweisen. Eine dieser Komponenten könnte die Vakuole der Schließzellen sein. „Tracer-Flux“ Experimente mit radioaktiven Isotopen und Patch-Clamp Studien an isolierten Vakuolen deuteten bereits auf eine wichtige Rolle der Vakuole bei der Regulierung der Schließzellbewegungen hin. Zukünftige Studien an intakten Schließzellen sind notwendig um diese Funktion in weiteren Details aufzuklären
KW  - Schließzelle
KW  - Abscisinsäure
KW  - Cytoplasma
KW  - Abscisic Acid
KW  - Guard Cell
KW  - Cytoplasmic Ca"+
KW  - Vicia
Y1  - 2009
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-45309
ER  - 
TY  - THES
A1  - Effenberger, Madlen
T1  - Funktionelle Charakterisierung von YB-1 im Zytoplasma des Multiplen Myeloms
T1  - Functional Characterization of YB-1 in the Cytoplasm of Multiple Myeloma
N2  - Das Y-Box-bindende Protein 1 (YB-1) ist ein Vertreter der hochkonservierten Familie eukaryotischer Kälteschockproteine und ein DNA/RNA-bindendes Protein. In Abhängigkeit von seiner Lokalisation übernimmt es Aufgaben bei der DNA-Transkription oder mRNA-Translation. YB-1 ist ein potentielles Onkogen beim Multiplen Myelom (MM), dass in primären MM-Zellen exprimiert ist. Für die funktionellen Untersuchungen von YB-1 in der vorliegenden Arbeit wurden humane Myelomzelllinien (HMZL) verwendet, die als in vitro Modell dieser malignen B Zell-Erkrankung dienen. Aufgrund der potentiellen Expression von YB-1 im Zellkern und/oder Zytoplasma von HMZL, wurde zunächst die Lokalisation des Proteins bestimmt. Es konnte gezeigt werden, dass YB 1 in den HMZL ausschließlich im Zytoplasma lokalisiert ist. Eine Translokation von YB-1 in den Nukleus kann durch die Serin-Phosphorylierung (Aminosäure 102) in der Kälteschockdomäne induziert werden. Die analysierten Myelomzelllinien zeigen jedoch kein nukleäres YB 1 und keine S102-Phosphorylierung. Diese Ergebnisse stützen die These, dass die Regulation der mRNA-Translation im Zytoplasma die vorherrschende Funktion von YB-1 beim MM ist. YB-1 könnte über diesen Mechanismus seine anti-apoptotische Wirkung vermitteln und die MM-Zellen vor genotoxischem Stress schützen. Um YB-1-regulierte mRNAs zu identifizieren wurden YB 1-Immunpräzipitationen mit zwei HMZL, einer Maus-Plasmozytomzelllinie und einem primären Maus-Plasmazelltumor durchgeführt. Zu den YB-1-gebundenen mRNAs gehören Translationsfaktoren und ribosomale Proteine, die eine starke Beteiligung von YB-1 beim RNA-Metabolismus bestätigen. In der vorliegenden Arbeit wurden spezifisch zwei mRNA-Kandidaten untersucht, die für den malignen Phänotyp von MM-Zellen wichtig sein können: das translationell kontrollierte Tumorprotein TCTP und MYC. Sowohl TCTP als auch MYC wurden bereits in Zusammenhang mit der Proliferation und Apoptose-Resistenz von malignen Zellen beschrieben. Die immunhistochemische Untersuchung der Knochenmarkbiopsien von MM-Patienten ergab eine gute Ko-Expression von YB-1 und TCTP in intramedullären MM-Zellen, während MYC erst in extramedullärem MM-Tumormaterial verstärkt mit der hohen YB 1-Expression korreliert. Die funktionellen Analysen der Arbeit haben gezeigt, dass YB 1 für die Translation der TCTP- und MYC-mRNA essentiell ist. Es kontrolliert die Verteilung dieser mRNAs zwischen translationell aktiven und inaktiven messenger Ribonukleoprotein-Partikeln. Die shRNA-vermittelte Reduktion von YB-1 führte zur Hemmung der TCTP- und MYC-Translation in der Phase der Initiation. Um den Einfluss der Kandidaten auf das Überleben der HMZL zu untersuchen, wurden proteinspezifische Knockdown-Experimente durchgeführt. Beim shRNA-vermittelten TCTP-Knockdown konnten keine Auswirkungen auf die Proliferation oder Viabilität von MM-Zellen beobachtet werden. Im Gegensatz dazu ist MYC für das Überleben und Wachstum der HMZL ausschlaggebend, denn der MYC-Knockdown induzierte Apoptose. Wie beim YB 1-Knockdown war ein Anstieg der Caspase-Aktivität und der Zusammenbruch des mitochondrialen Membranpotentials in den HMZL nachweisbar. Da es beim MYC-Knockdown gleichzeitig zur einer Reduktion der YB 1-Protein- und mRNA-Expression kam, wurde der Einfluss von MYC auf die Transkription des YB-1-Gens untersucht. Mit Hilfe von embryonalen Mausfibroblasten, die ein induzierbares MYC als Transgen besitzen, konnte gezeigt werden, dass die Aktivierung von MYC mit einer Zunahme der YB-1-mRNA einher geht. YB-1 ist somit ein direktes Zielgen des Transkriptionsfaktors MYC. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit haben zum ersten Mal ein gegenseitiges regulatorisches Netzwerk aufgezeigt, in dem YB 1 transkriptionell durch MYC reguliert wird und YB-1 für die Translation der MYC-mRNA essentiell ist. Die Ko-Expression beider Proteine trägt zum Wachstum und Überleben von malignen Plasmazellen bei.
N2  - The Y-box binding protein 1 (YB-1) is a member of the highly conserved coldshock-domain protein family and a DNA/RNA-binding protein. Therefore YB-1 can be involved in DNA transcription or mRNA translation depending on its localization in the cell. YB-1 is a potential oncogene in Multiple Myeloma (MM) and is expressed in primary MM cells. Human myeloma cell lines (HMCLs), which serve as the in vitro model for this B-cell malignancy, were used to functionally characterize YB-1 in MM. In this study it was shown that the YB-1 protein is expressed exclusively in the cytoplasm of HMCLs. Its translocation into the nucleus can be induced through the phosphorylation of a serine residue (amino acid 102) in the coldshock-domain of the protein. The analyzed myeloma cell lines are negative for nuclear YB-1 and the S102-phosphorylation. These results support the hypothesis that the regulation of mRNA translation in the cytoplasm is the primary function of YB-1 in MM. Through this mechanism YB-1 could mediate its anti-apoptotic effects and protect MM cells against genotoxic stress. To identify YB-1 regulated mRNAs in the cytoplasm immunoprecipitations of two HMCLs, one mouse plasmacytoma cell line and one primary mouse plasma cell tumor were performed. YB-1 bound mRNAs include translation factors and ribosomal proteins, which confirms the strong participation of YB-1 in the metabolism of RNAs. In the present study two mRNA candidates were specifically investigated which might be important for the malignant phenotype of MM cells: the translationally controlled tumor protein (TCTP) and MYC. Both, TCTP and MYC have been described in conjunction with proliferation and apoptosis-resistance of malignant cells. The immunohistochemical staining of bone marrow biopsies from MM patients revealed a good co-expression of YB-1 and TCTP in intramedullary MM cells, whereas MYC and YB-1 correlate strongly with each other in extramedullary MM tumors. The functional analysis of this study showed, that YB-1 is essential for the translation of TCTP and MYC mRNA. It controls the distribution of these mRNAs between translationally active and inactive messenger ribonucleoprotein particles. The shRNA-mediated reduction of YB-1 expression inhibits TCTP and MYC translation in the initiation phase. To investigate the influence of the candidates for HMCL survival protein-specific knockdown experiments were performed. The TCTP knockdown showed no effect on proliferation or viability of the analyzed MM cells. In contrast, MYC is crucial for MM cell survival and growth, as the knockdown induced apoptosis. Comparable with the performed YB-1 knockdown experiments apoptosis induction was verified here by an increase of activated caspases and disruption of the mitochondrial membrane potential in HMCLs. Interestingly, the knockdown of MYC also reduced YB-1 protein and mRNA expression. To investigate the influence of MYC on YB-1 gene transcription mouse embryonic fibroblasts (MEFs) from MYC transgenic animals were used. The activation of MYC protein in these cells induced YB-1 mRNA expression, showing that YB-1 is a direct target of the transcription factor MYC. The work presented here revealed for the first time a feed-forward loop of YB-1 and MYC expression in MM cells. In this loop YB-1 is transcribed by MYC and YB-1 is essential for MYC mRNA translation. Consequently, both proteins mutually up-regulate each other via combined transcriptional/translational activity to support cell growth and survival of malignant plasma cells.
KW  - Plasmozytom
KW  - Apoptosis
KW  - RNS-Bindungsproteine
KW  - Myc
KW  - Cytoplasma
KW  - YB-1
KW  - mRNA-Translation
KW  - TCTP
KW  - Multiples Myelom
KW  - Transkription
KW  - YB-1
KW  - mRNA translation
KW  - TCTP
KW  - multiple myeloma
KW  - transcription
Y1  - 2012
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-76816
ER  -