TY  - THES
A1  - Maierhofer, Anna
T1  - Altersassoziierte und strahleninduzierte Veränderungen des genomweiten DNA-Methylierungs-Profils
T1  - Age-associated and radiation-induced changes in genome-wide DNA methylation
N2  - Der Prozess des Alterns ist ein komplexer multifaktorieller Vorgang, der durch eine sukzessive Verschlechterung der physiologischen Funktionen charakterisiert ist. Ein hohes Alter ist der Hauptrisikofaktor für die meisten Krankheiten, einschließlich Krebs und Herz-Kreislauf-Erkrankungen. Das Verständnis der epigenetischen Mechanismen, die in den Prozess des Alterns involviert sind, könnte zur Entwicklung pharmakologischer Interventionen beitragen, die nicht nur die Lebenserwartung erhöhen, sondern auch den Beginn des altersassoziierten funktionellen Abbaus verzögern könnten. Durch die Langzeit-Kultivierung primärer humaner Fibroblasten wurde ein in vitro Modell für das Altern etabliert, das die Identifizierung altersassoziierter DNA-Methylierungs-Veränderungen ermöglichte. Die in vitro Alterung konnte mit einer globalen Hypomethylierung und einer erhöhten DNA-Methylierung der ribosomalen DNA assoziiert werden. Darüber hinaus konnten DNA-Methylierungs-Veränderungen in Genen und Signalwegen, die für das Altern relevant sind, und ein erhöhtes epigenetisches Alter nachgewiesen werden.
Das in vitro Modell für das Altern wurde verwendet, um neben den direkten Effekten ionisierender Strahlung auf die DNA-Methylierung auch deren Langzeit-Effekte zu untersuchen. Die Strahlentherapie ist ein entscheidendes Element der Krebstherapie, hat aber auch negative Auswirkungen und kann unter anderem das Risiko für die Entwicklung eines Zweittumors erhöhen. Bei externer Bestrahlung wird neben dem Tumor auch gesundes Gewebe ionisierender Strahlung ausgesetzt. Daher ist es wichtig zu untersuchen, wie Zellen mit intakten DNA-Reparatur-Mechanismen und funktionierenden Zellzyklus-Checkpoints durch diese beeinflusst werden. In der frühen Phase der DNA-Schadensantwort auf Bestrahlung wurden in normalen Zellen keine wesentlichen DNA-Methylierungs-Veränderungen beobachtet. Mehrere Populations-Verdoppelungen nach Strahlenexposition konnten dagegen eine globale Hypomethylierung, eine erhöhte DNA-Methylierung der ribosomalen DNA und ein erhöhtes epigenetisches Alter detektiert werden. Des Weiteren zeigten Gene und Signalwege, die mit Krebs in Verbindung gebracht wurden, Veränderungen in der DNA-Methylierung. Als Langzeit-Effekte ionisierender Strahlung traten somit die mit der in vitro Alterung assoziierten DNA-Methylierungs-Veränderungen verstärkt auf und ein epigenetisches Muster, das stark an das DNA-Methylierungs-Profil von Tumorzellen erinnert, entstand. Man geht davon aus, dass Veränderungen der DNA-Methylierung eine aktive Rolle in der Entwicklung eines Tumors spielen. Die durch ionisierende Strahlung induzierten DNA-Methylierungs-Veränderungen in normalen Zellen könnten demnach in die Krebsentstehung nach Strahlenexposition involviert sein und zu dem sekundären Krebsrisiko nach Strahlentherapie beitragen. Es ist bekannt, dass Patienten unterschiedlich auf therapeutische Bestrahlung reagieren. Die Ergebnisse dieser Arbeit weisen darauf hin, dass die individuelle Sensitivität gegenüber ionisierender Strahlung auch auf epigenetischer Ebene beobachtet werden kann.
In einem zweiten Projekt wurden Gesamtblutproben von Patienten mit Werner-Syndrom, einer segmental progeroiden Erkrankung, und gesunden Kontrollen analysiert, um mit dem vorzeitigen Altern in Verbindung stehende DNA-Methylierungs-Veränderungen zu identifizieren. Werner-Syndrom konnte nicht mit einer globalen Hypomethylierung, jedoch mit einer erhöhten DNA-Methylierung der ribosomalen DNA und einem erhöhten epigenetischen Alter assoziiert werden. Das vorzeitige Altern geht demzufolge mit spezifischen epigenetischen Veränderungen einher, die eine Beschleunigung der mit dem normalen Altern auftretenden DNA-Methylierungs-Veränderungen darstellen.
Im Rahmen dieser Arbeit konnte die Bedeutung epigenetischer Mechanismen im Prozess des Alterns hervorgehoben werden und gezeigt werden, dass sowohl exogene Faktoren, wie ionisierende Strahlung, als auch endogene Faktoren, wie das in Werner-Syndrom-Patienten mutiert vorliegende WRN-Gen, altersassoziierte DNA-Methylierungs-Veränderungen beeinflussen können.
N2  - Aging is a complex, multifactorial process that is characterized by the successive deterioration of normal physiological functions. Age is the main risk factor for most diseases, including cancer. Understanding the epigenetic mechanisms that are involved in the aging process could contribute to the development of pharmacological interventions not only increasing lifespan but also delaying the onset of age-dependent functional decline. An in vitro model for aging was established by long-term culturing of primary human fibroblasts and used to identify age-associated changes in DNA methylation. In vitro aging could be linked to global hypomethylation, elevated DNA methylation of ribosomal DNA, a higher epigenetic age and alterations in DNA methylation of genes and pathways being relevant for aging.
The in vitro model for aging allowed to analyse the long-term effects of ionizing radiation on DNA methylation in addition to their direct effects. Radiotherapy is an important element of cancer treatment but can also have negative effects and increase the risk of second cancers. Although radiotherapy is targeted to the tumour, it also affects the surrounding healthy tissue. Therefore, it is important to analyse the impacts of ionizing radiation on normal cells with intact DNA repair and cell cycle checkpoints. The early phase of DNA damage response to radiation does not seem to include great changes in DNA methylation in normal cells. In contrast, several population doublings after radiation exposure, global hypomethylation and DNA methylation changes of genes and pathways being linked to tumorigenesis were detected. Furthermore, DNA methylation of ribosomal DNA and the epigenetic age were increased. Thus, as long-term effects of ionizing radiation the age-associated changes in DNA methylation were enhanced and an epigenetic pattern strongly resembling the DNA methylation profile of tumour cells was observed. It is assumed that alterations in DNA methylation are not only side effects of carcinogenesis but rather play an active role during this process. Radiation-induced changes in DNA methylation could thus be involved in tumour development and contribute to the secondary cancer risk after radiotherapy. It is well known that patients react differently to therapeutic radiation. The results of this study suggest that individual radiation sensitivity is also reflected on epigenetic level.
In a second project whole blood samples from patients with Werner syndrome, a segmental progeroid syndrome, and healthy controls were analysed to identify changes in DNA methylation associated with premature aging. Werner syndrome could not be linked to global hypomethylation, but to an increased epigenetic age and elevated methylation levels of ribosomal DNA. Hence, premature aging seems to be accompanied by specific alterations in DNA methylation representing an acceleration of the DNA methylation changes associated with normal aging.
This work outlines the importance of epigenetic mechanisms in the aging process and shows that not only exogenous factors like ionizing radiation but also endogenous factors like Werner syndrome causing mutations in the WRN gene can influence age-associated changes in DNA methylation.
KW  - Methylierung
KW  - Ionisierende Strahlung
KW  - Altern
KW  - Progeria adultorum
KW  - Epigenetik
KW  - Epigenetische Uhr
Y1  - 2018
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-174134
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TY  - THES
A1  - Haertle, Larissa
T1  - Gestationsdiabetes und fetale Programmierung: Epigenetische Untersuchungen mit verschiedenen Next Generation Sequencing Techniken
T1  - Gestational Diabetes Mellitus and fetal programming: Epigenetic investigations with different Next Generation Sequencing Techniques
N2  - Eine intrauterine Gestationsdiabetes (GDM) Exposition induziert in den betroffenen Nachkommen eine lebenslang erhöhte Prädisposition für metabolische und komplexe Erkrankungen. Die Krankheitssuszeptibilität wird dabei durch epigenetische Veränderungen vermittelt, die sich über die Regulation der Genaktivität auch auf das Expressionsniveau und den Phänotypen auswirken. Um neue Gene zu finden, die eine Rolle in der fetalen Programmierung spielen, wurden in dieser Arbeit genomweite Methylierungsmuster von Nabelschnurbluten (FCBs) aus GDM-Schwangerschaften und Kontrollen miteinander verglichen. Mit Illumina Infinium HumanMethylation 450K Arrays konnten signifikante Gruppenunterschiede für insgesamt 65 CpG-Stellen (52 davon genassoziiert) festgestellt werden, die multiplem Testen standhielten. Mittels Pyrosequenzierung wurden vier dieser Kandidaten-Loci (ATP5A1, MFAP4, PRKCH, SLC17A4), sowie ein Gen aus der Literatur (HIF3A) genauer untersucht und die Effekte erfolgreich validiert. Für das zugrundeliegende multivariate Regressionsmodell wurden die potenziellen Störfaktoren Gestationsalter, kindliches Geschlecht und mütterlicher BMI berücksichtigt. Der GDM-Effekt zeigte sich stärker in der insulinbehandelten Subgruppe (I-GDM) als in der diätisch behandelten (D GDM) und scheint insgesamt multifaktoriell bedingt zu sein, da viele Gene betroffen waren, jedoch alle mit einer vergleichsweise niedrigen Effekt-Größe. Zusätzlich konnten für den MEG3 Promotor, MEST und PEG3, drei von vier geprägten Genen, die mittels Deep Bisulfite Sequencings (DBS) analysiert wurden, ebenfalls signifikante Methylierungs-unterschiede zwischen der GDM- und Kontroll-Gruppe detektiert werden. Die identifizierten Gene stellen labile Zielregionen für die GDM-induzierte intrauterine Programmierung dar und können zukünftig nützliche Biomarker für Krankheitsdiagnosen und Prognosen sein. Mittels DBS können darüber hinaus Einzelmolekül-Analysen durchgeführt werden, für die in differentiell methylierten Regionen (DMRs) anhand eines informativen SNPs die parentale Allel-Herkunft bestimmt und bei der Berechnung von Epimutationsraten einbezogen werden kann. Epimutationen wurde als solche gewertet, wenn sie ein > 50 % abnormal (de)methyliertes Methylierungsprofil aufwiesen. Die DBS-Daten wurden mit zwei verschiedenen Sequenzierplattformen generiert (Roche GS Junior und Illumina MiSeq). Für Zweitere wurde ein eigenes, unabhängiges Library-Präparations-Protokoll entwickelt. In Nabelschnurblut, adultem Blut und Viszeralfett wurden für die paternal exprimierte MEST Promotor DMR und die maternal exprimierte MEG3 intergenic (IG) DMR hohe Epimutationsraten für das jeweils unmethylierte Allel detektiert. Die geprägten (methylierten) Allele wiesen dagegen nur niedrige Epimutationsraten auf. Da MEST und MEG3 invers geprägte Gene sind, war die Hypermethylierung des nicht geprägten Allels (HNA) demnach unabhängig von der parentalen Allel-Herkunft. Die HNA scheint außerdem erst nach der Fertilisation aufzutreten, da in Spermien nur sehr wenige Epimutationen gefunden wurden. Für die sekundäre MEG3 Promotor DMR (deren Prägung von der primären MEG3 IG-DMR reguliert wird) wurde ein deutlich schwächerer, wenngleich signifikanter HNA-Effekt im FCB gemessen, für die paternal exprimierte PEG3 Promotor DMR konnte dagegen kein signifikanter Unterschied zwischen den beiden parentalen Epimutationsraten festgestellt werden. Der HNA-Effekt für die MEST DMR, MEG3 IG-DMR und MEG3 Promotor DMR war weder mit GDM noch mit Adipositas assoziiert und zeigte allgemein eine große interindividuelle Varianz. Die Aufrechterhaltung differenzieller Methylierungsmuster in Imprinting Kontrollregionen (ICRs) scheint in manchen Entwicklungs-Zeitspannen von großer Bedeutung und damit streng kontrolliert zu sein, später jedoch redundant zu werden, was sich in der Anreicherung von stochastischen sowie umweltinduzierten Fehlern auf dem nicht geprägten Allel äußern kann. HNA-suszeptible geprägte Gene ähneln in mancherlei Hinsicht metastabilen Epiallelen. Diese Studie zeigt, dass sowohl stochastische Faktoren als auch Umweltstimuli während der frühen embryonalen Entwicklung u.a. über HNA-Effekte geprägte Gen-Netzwerke programmieren, die in Wachstumsprozesse involviert sind. Um tiefere Einblicke in allelspezifische Prägungsprofile zu erhalten, wären umfangreiche DBS HNA-Längsschnittstudien aller 50-100 human geprägten Gene in unterschiedlichen Gewebetypen und Differenzierungsstadien wünschenswert.  
N2  - Intrauterine exposure to gestational diabetes mellitus (GDM) induces lifelong increased predisposition for metabolic and complex diseases in the exposed progeny. The elevated disease susceptibility is transmitted via epigenetic alterations that influence gene expression levels and phenotypes through regulation of gene activity. Genome-wide methylation profiles of fetal cord bloods (FCBs) were investigated in GDM and control pregnancies in order to identify new genes susceptible to fetal programming. After multiple testing correction, we found 65 significantly differentially methylated CpG sites between GDM and control groups (52 of which were gene associated) within the Illumina Infinium HumanMethylation 450K array data. Using pyrosequencing, we successfully confirmed the observed results in four of these candidate loci (ATP5A1, MFAP4, PRKCH, SLC17A4) and one gene from the literature (HIF3A). A multivariate regression model was adjusted for the confounding factors gestational age, fetal sex and maternal BMI. The GDM effect was stronger within the insulin treated subgroup (I-GDM) compared to the dietary subgroup (D GDM), suggesting that GDM is a multifactorial disease evidenced by changes of small effect size in multiple genes. Significant mean methylation differences were detected between the GDM group and controls in three out of four imprinted genes (MEG3 promoter, MEST and PEG3) that were analyzed with Deep Bisulfite Sequencing (DBS). The identified genes represent labile target regions for GDM-induced intrauterine programming and could represent future biomarkers for disease diagnosis and prognosis. Furthermore, DBS enables sequencing at a single allele resolution and the calculation of allele specific epimutation rates by differentiating the parental origin of alleles via an informative SNP within differentially methylated regions (DMRs). Epimutations were characterized as alleles showing > 50 % aberrantly (de)methylated CpG sites. DBS data were generated using two different sequencing platforms (Roche GS Junior and Illumina MiSeq). An independent library preparation protocol was established for Illumina MiSeq sequencing. The paternally expressed MEST promoter DMR and the maternally expressed MEG3 intergenic (IG) DMR showed high epimutation rates for the unmethylated alleles in FCB, as well as adult blood and visceral adipose tissue. On the contrary, only minor epimutation rates were displayed by the imprinted (methylated) alleles. Thus, hypermethylation of the non-imprinted allele (HNA) was independent of parental origin, as MEST and MEG3 are opposingly imprinted genes. Very low epimutation rates in sperm indicate that the HNA effect arises after fertilization. A weak but significant HNA was also found for the secondary MEG3 promoter DMR (which is known to be regulated by the MEG3 IG-DMR). The paternally expressed PEG3 promoter DMR showed no HNA and no difference in parental epimutation rates. The observed HNA effect (for the MEST DMR, the MEG3 IG-DMR and the MEG3 promoter DMR) was neither associated with GDM nor obesity and exhibited a large interindividual variance. Maintenance of differential methylation profiles in imprinting control regions (ICRs) seems to be of great importance during some developmental periods and is therefore strictly controlled in germ cells. Later on, it might become redundant manifested in the accumulation of stochastic as well as environmentally-induced errors on the non-imprinted allele. There is evidence that HNA-susceptible imprinted genes resemble metastable epialleles in many aspects. Therefore, we suggest that stochastic as well as environmental stimuli program imprinted gene networks that are important for growth related processes during early development using HNA. Further longitudinal studies of all 50 – 100 imprinted genes would benefit in a deeper insight in allele-specific imprinting patterns of various human tissues.
KW  - Schwangerschaftsdiabetes
KW  - Genetisches Imprinting
KW  - Epigenetik
KW  - Next Generation Sequencing (NGS)
KW  - Fetale Programmierung
Y1  - 2018
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-156465
ER  - 
TY  - THES
A1  - Mattern, Felix
T1  - Alterungsbedingte Effekte auf DNA-Methylierungsprofile entwicklungsrelevanter Gene in Eizellen und Embryonen am Modellorganismus Bos taurus
T1  - Aging-induced effects on DNA methylation profiles of developmental genes in oocytes and embryos on the model organism Bos taurus
N2  - Die postovulatorische Alterung sowie die ovarielle Alterung konnten bei der Anwendung assistierter Reproduktionstechniken (ARTs) als entscheidende Faktoren identifiziert werden, die den Reproduktionserfolg nachhaltig beeinträchtigen. Die postovulatorische Alterung tritt ein, sobald die reife Eizelle nicht mehr innerhalb ihres physiologischen Zeitfensters befruchtet wird. Die ovarielle Alterung beschreibt hingegen die Abnahme des Follikel-Vorrats mit zunehmendem Alter des weiblichen Individuums bzw. des Ovars. Sowohl die postovulatorische Alterung als auch die ovarielle Alterung führen u.a. zu einer reduzierten Oozytenqualität und einer geringeren Blastozystenrate. Die Zielsetzung dieser Arbeit bestand darin, den Einfluss der postovulatorischen Alterung und der ovariellen Alterung im Holstein-Rind (Bos taurus) auf die DNA-Methylierung entwicklungsrelevanter Gene in Eizellen und Embryonen zu untersuchen. Aus Schlachthof-Ovarien wurden Antralfollikeln unterschiedlicher Größe (<2 mm, 3-5 mm und >6 mm) isoliert. Eizellen aus Follikeln der Größe 3-5 mm wurden für 24h (physiologisch) und 48h (gealtert) in vitro gereift (IVM). Die gereiften Oozyten wurden anschließend in vitro fertilisiert und Embryonen im 4-6 Zellstadium generiert. Sowohl in den unreifen Eizellen aus Antralfollikeln unterschiedlicher Größe als auch in den gereiften Oozyten und den Embryonen wurde die Promotormethylierung der Gene bH19, bSNRPN, bZAR1, bDNMT3A, bOCT4, bDNMT3Lo und bDNMT3Ls analysiert. Zur Untersuchung der ovariellen Alterung wurden mittelgroßen Antralfollikel aus Ovarien lebender Rinder (in vivo) unterschiedlichen Alters (9-12 Monate, 3-7 Jahre und 8-11 Jahre) gewonnen. In den daraus isolierten unreifen Eizellen wurde die DNA-Methylierung der Promotorregionen der Gene bTERF2, bREC8, bBCL-XL, bPISD, bBUB1, bDNMT3Lo, bH19 und bSNRPN bestimmt. Als Methode zur Analyse der Promotormethylierung wurde die Limiting Dilution Bisulfit-Sequenzierung angewendet.
In unreifen Eizellen aus Antralfollikeln unterschiedlicher Größe (<2 mm, 3-5 mm und >6 mm) konnte ein erhöhtes Auftreten abnormal methylierter Allele in den geprägten Genen bH19 und bSNRPN von Eizellen kleiner Follikel (<2 mm) identifiziert werden. Dieses Ergebnis könnte eine mögliche Ursache einer bereits bekannten und mehrfach beschriebenen geringeren Entwicklungskompetenz von Eizellen kleiner Follikel (<2 mm) auf epigenetischer Ebene darstellen.
Die verlängerte Reifungsdauer der IVM-Eizellen hatte eine signifikante Hypermethylierung in der Promotorregion des Gens DNMT3Lo von 48h-gereiften Eizellen zur Folge. Beim Übergang von 48h-gereiften Eizellen zum Embryo konnte eine signifikante Hypomethylierung von CpG7 des stammzellspezifischen Transkripts DNMT3Ls beobachtet werden. Diese CpG-Stelle wies ebenfalls einen signifikanten Anstieg von CpGs mit nicht-eindeutigem Methylierungszustand in unreifen Eizellen mit steigender Follikelgröße auf. Da sich die CpG-Position innerhalb eines Sequenz-Motivs einer Bindungsstelle des Transkriptionsfaktors CREB befindet, könnten die Methylierungsdaten auf eine Interaktion zwischen dem Transkriptionsfaktor CREB und der DNA-Methylierung während der Entwicklung und Reifung der Eizelle sowie der Transition von der Eizelle zum Embryo hindeuten.
Die DNA-Methylierungsprofile der untersuchten Gene in unreifen Eizellen aus Kühen unterschiedlichen Alters (9-12 Monate, 3-7 Jahre und 8-11 Jahre) wiesen keine signifikanten Unterschiede zwischen den Altersgruppen auf. Die ovarielle Alterung bei Rindern zwischen 9 Monaten und 11 Jahren zeigte damit keinen Effekt auf die DNA-Methylierung der untersuchten Promotorregionen der Gene bTERF2, bREC8, bBCL-XL, bPISD, bBUB1, bDNMT3Lo, bH19 und bSNRPN.
Nach einer simulierten postovulatorischen Alterung durch eine in vitro Reifung für 48h konnte eine Veränderung der DNA-Methylierung der Oozyten-spezifischen (DNMT3Lo) und Stammzell-spezifischen (DNMT3Ls) Promotoren des katalytisch inaktiven Cofaktors von DNMT3A, DNMT3L, beobachtet werden. Die veränderte DNA-Methylierung von DNMT3Ls tritt dabei erst im frühen Embryo in Erscheinung und interagiert vermutlich mit dem Transkriptionsfaktor CREB. Die Veränderungen von DNMT3Lo in Eizellen und DNMT3Ls in den daraus generierten Embryonen lässt vermuten, dass es sich hierbei um eine dynamische Anpassung des Embryos auf äußere Umweltbedingungen der Eizelle über die Methylierung der DNA handelt.
N2  - Postovulatory  aging  and  ovarian  aging  have  been  identified  as  key  factors  in  assisted
reproductive techniques (ARTs) and have a lasting effect  on  reproductive success. Postovulatory 
aging occurs if the mature egg is not fertilized within its physiological time window. On the other 
hand, ovarian aging describes the decrease in the follicular reserve with increasing age of the 
female or the ovary, respectively. Both post-ovulatory aging and ovarian aging result in reduced 
oocyte quality and lower blastocyst rate. The aim of this thesis was to explore the effects of 
postovulatory aging and ovarian aging in Holstein cattle (Bos taurus) on the DNA methylation of 
developmentally important genes in oocytes and embryos. Antral follicles of different sizes (<2 mm, 
3-5 mm and> 6 mm) were isolated from slaughterhouse ovaries. Female germ cells from middle-sized 
follicles (3-5 mm) were matured for 24h (physiological conditions) and 48h (aged conditions) in 
vitro (IVM). The IVM- oocytes were subsequently fertilized in vitro and embryos at the 4-6 cell 
stage were generated. Promoter methylation of the genes bH19, bSNRPN, bZAR1, bDNMT3A, bOCT4, 
bDNMT3Lo and bDNMT3Ls was analysed in immature oocytes from antral follicles of different sizes as 
well as in matured oocytes and the respective embryos. For studying ovarian aging, middle-sized 
antral follicles were obtained in vivo from animals of different age groups (9-12 months, 3-7 years 
and 8-11 years). In the extracted immature gametes, the DNA methylation of the promoter regions of 
bTERF2, bREC8, bBCL-XL, bPISD, bBUB1, bDNMT3Lo, bH19 and bSNRPN was examined. The limiting dilution 
bisulfite (pyro)sequencing method was applied to determine the promoter methylation of the 
candidate genes at the single allele level.
In immature oocytes from antral follicles of different diameters (<2 mm, 3-5 mm and> 6 mm) an 
increased occurrence of abnormally methylated alleles of the imprinted genes bH19 and bSNRPN was 
identified in small follicles (<2 mm). This failure to establish imprinting could be a possible 
cause of a well-known reduced developmental potential of small follicles (<2 mm) at the epigenetic 
level.
The extended maturation time of the IVM-oocytes resulted in a significant hypermethylation in the 
promoter region of DNMT3Lo in 48h matured oocytes. After transition from 48h matured oocytes to 
embryos, a significant hypomethylation of CpG7 of the stem cell specific transcript DNMT3Ls was 
detected. The same CpG site showed a significant increase of CpGs with unclear methylation state in 
immature female germ cells with increasing follicular size. This CpG position is located within a 
potential binding site of the transcription factor CREB. Thus, the methylation data indicates an 
interaction between the transcription factor CREB and the DNA methylation during development and 
maturation of oocytes as well as during transition from the oocyte to the embryo.
The DNA methylation profiles of the analysed genes in immature oocytes from cows of different age 
(9-12 months, 3-7 years and 8-11 years) showed no significant differences between age groups. 
Hence, the ovarian aging in cattle between 9 months and 11 years caused no effect on the DNA 
methylation of bTERF2, bREC8, bBCL-XL, bPISD, bBUB1, bDNMT3Lo, bH19 and bSNRPN.
After a simulated postovulatory aging by in vitro maturation for 48h, a change in the DNA 
methylation of the oocyte-specific (DNMT3Lo) and stem cell-specific (DNMT3Ls) promoters of the 
catalytically inactive DNA-methyltransferase DNMT3L was observed. The altered DNA methylation of 
DNMT3Ls occurs in the early embryo and probably interacts with the transcription factor CREB. The 
changes of DNMT3Lo in oocytes and DNMT3Ls in the resulting
embryos might represent a dynamic adaptation to external environmental conditions.
KW  - Oozyte
KW  - Epigenetik
KW  - Altern
KW  - DNS-Methyltransferase
KW  - Ovarielle Alterung
KW  - Postovulatorische Alterung
KW  - Antralfollikel
KW  - Holstein <Rind>
Y1  - 2016
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-144562
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TY  - THES
A1  - Kuhtz, Juliane
T1  - Epimutationen humaner Keimzellen und Infertilität
T1  - Epimutations of human germ cells and infertility
N2  - Infertilität stellt in unserer heutigen Gesellschaft ein zunehmendes Problem dar. Bei der Suche nach den der Infertilität zugrunde liegenden Ursachen gerät immer mehr die Epigenetik in den Fokus. Epigenetische Prozesse sind nicht nur in die Embryo-nalentwicklung und Wachstumsprozesse des Kindes involviert, sondern auch in korrekte Funktionsweisen von Gameten. Störungen können die Fertilität beeinträch-tigen. Eine besondere Rolle spielen geprägte Gene, die auf einem ihrer Allele, je nach parentaler Herkunft, ein Imprint in Form von DNA-Methylierung tragen. Fehl-regulationen solcher geprägter Gene können zu Imprinting-Erkrankungen führen.   
Seit Einführung der In-vitro-Fertilisation (IVF) wurden verschiedene assistierte Re-produktionstechniken (ART) entwickelt, um infertilen Paaren zu helfen. Die Sicher-heit dieser Techniken ist nicht abschließend geklärt. Immer wieder wird von nach ART-Behandlung gehäuft auftretenden Imprinting-Erkrankungen berichtet. Diese Erkrankungen stehen jedoch eher in Zusammenhang mit der zugrunde liegenden Infertilität, als mit ART selbst. Dennoch ist es notwendig zu untersuchen inwieweit sich ART eventuell auf den Gesundheitszustand dieser Kinder auswirken könnte. 
In der hier vorgelegten Arbeit wurde der Zusammenhang von Epigenetik, Infertilität und ART von verschiedenen Standpunkten aus beleuchtet. 
In humanen Spermien wurde die DNA-Methylierung verschiedener geprägter Gene hinsichtlich Epimutationen untersucht. ICSI (intracytoplasmatic sperm injection) und IMSI (intracytoplasmic morphologically selected sperm injection) sind verschiedene Techniken zur Selektion von Spermien für eine ART-Behandlung. Hier wurde un-tersucht, ob IMSI epigenetisch bessere Spermien selektiert als die konventionelle ICSI-Methode. Außerdem ist bekannt, dass in Spermienköpfen fertiler und infertiler Männer Vakuolen vorkommen können, deren epigenetische Bedeutung jedoch un-bekannt ist. Ob diese Vakuolen in Zusammenhang mit Epimutationen stehen könn-ten, wurde ebenfalls überprüft. Dazu wurde bisulfitkonvertierte DNA weniger Sper-mien (11 je Probe) mithilfe der Limiting Dilution (LD)–Technik und Pyrosequenzie-rung analysiert. Insgesamt standen 880 Spermien für diese Untersuchung zur Ver-fügung. Es konnte kein Unterschied zwischen IMSI- und ICSI-selektierten Spermien gefunden werden. Vorhandene Vakuolen im Spermienkopf beeinträchtigten nicht die DNA-Methylierung der Gene hGTL2, hLIT1 und hPEG3. 
Ein weiteres Projekt befasste sich mit der Frage, inwieweit die Technik der In-vitro-Maturation (IVM) DNA-Methylierung in humanen Oocyten beeinflussen könnte. Bisulfitkonvertierte DNA einzelner humaner Oocyten wurde mit LD und Pyrose-quenzierung analysiert. Verglichen wurden IVM und in vivo gereifte Oocyten. Hier-für standen 139 Oocyten zur Verfügung, wovon 90 mittels IVM und 49 in vivo gereift waren. Untersucht wurden vier geprägte Gene (hGTL2, hLIT1, hPEG3 und hSNRPN) und drei nicht geprägte Gene (hDNMT3Lo, hNANOG und hOCT4). Es konnten keine IVM-bedingten Epimutationen gefunden werden.  
Im dritten Projekt wurde untersucht, ob sich die DNA-Methylierung normaler Sper-mien von Spermien aus Oligozoospermie-Asthenozoospermie-Teratozoospermie (OAT)–Syndrom-Patienten unterscheidet. Eine weitere Frage war, ob Epimutationen einen Einfluss auf den ART-Ausgang haben. Untersucht wurden 54 Spermienpro-ben von Paaren in ART-Behandlung. Zur Untersuchung der DNA-Methylierungsmuster der geprägten Gene hGTL2 und hPEG3 sowie der beiden nicht geprägten Pluripotenzgene hNANOG und hOCT4 wurde die Methode Deep Bisulfite Sequencing (DBS) verwendet. Dies ist eine Next Generation Sequencing (NGS)–Technik, angewandt an bisulfitkonvertierter DNA. Diese Technik ermöglicht es mehrere Proben sowie Gene gleichzeitig zu analysieren. Es zeigte sich, dass OAT-Spermien, die zu einer Lebendgeburt geführt hatten, sich epigenetisch nicht von normalen Spermien unterschieden. Besonders viele Epimutationen konnten hingegen in OAT-Spermien gefunden werden, die zu keiner Schwangerschaft ge-führt hatten. Zwischen Spermien die zu einer Lebendgeburt oder keiner Schwan-gerschaft geführt hatten, zeigten sich Unterschiede in der Häufigkeit von hGTL2-Epimutationen. Über die Häufigkeit von Epimutationen konnte eine prädiktive Aus-sage zum ART-Ausgang getroffen werden.  
Zusammenfassend konnte in dieser Arbeit festgestellt werden, dass sich eine Häu-fung von Epimutationen darauf auswirkt, ob eine Schwangerschaft erreicht werden kann oder nicht. Diese Epimutationen liegen bereits im parentalen Genom vor. Sie werden nicht durch ART verursacht. Allerdings muss man Techniken finden, mit denen man Gameten mit möglichst wenig Epimutationen selektiert, um eine Über-tragung solcher auf das Kind zu verhindern.
N2  - Infertility is an increasing problem in today’s society. The search for the underlying causes of infertility reveals more and more the role of epigenetics. Epigenetic pro-cesses are involved in embryo development and growth, but also in the proper func-tion of gametes. Disturbances have been shown to impair fertility. Imprinted genes play an important role. They carry a parental-specific DNA methylation imprint on one of their alleles. Deregulation of these genes leads to imprinting diseases. 
Since the introduction of in vitro fertilisation (IVF), different assisted reproductive technologies (ART) have been developed to treat infertile couples. The safety of these techniques is not finally solved. Increased rates of imprinting diseases in ART offspring have been reported, but seem more likely to be linked to the underlying parental infertility problems than to ART itself. Nevertheless it is of importance to in-vestigate how ART could affect the health of those children. 
In the work presented here the relations between epigenetics, infertility and ART have been investigated from different points of view.  
Firstly, the DNA methylation pattern of different imprinted genes has been investi-gated in human sperm with regard to the frequency of epimutations. ICSI (intracyto-plasmatic sperm injection) and IMSI (intracytoplasmic morphologically selected sperm injection) are different techniques to select sperm for ART treatment. It was analysed whether IMSI selects epigenetically superior sperm than the conventional ICSI method. Furthermore it is known that sperm from fertile and infertile men can carry vacuoles in their sperm heads. Their epigenetic relevance is unknown. Whether these vacuoles are linked to epimutations has also been investigated here. Bisulfite converted DNA of a few sperm (11 per sample) was analysed using the Limiting Dilution (LD) technique followed by pyrosequencing. In total 880 sperm were available for analysis. No difference between IMSI and ICSI selected sperm was found. Further, no influence of sperm head vacuoles on the DNA methylation patterns of the genes hGTL2, hLIT1 and hPEG3 could be observed.  
Secondly, it was of interest whether the in vitro maturation (IVM) technique has an influence on DNA methylation in human oocytes. Bisulfite converted DNA of single human oocytes was analysed with LD and pyrosequencing. IVM oocytes were com-pared to in vivo grown oocytes. A total of 139 oocytes were available, of which 90 oocytes were IVM treated while 49 oocytes were grown in vivo. Four imprinted genes (hGTL2, hLIT1, hPEG3 and hSNRPN) and three non-imprinted genes (hDNMT3Lo, hNANOG and hOCT4) were analysed. No IVM-induced epimutations were detected. 
Finally, it was investigated whether DNA methylation patterns of normal sperm would differ from sperm of oligozoospermia-asthenozoospermia-teratozoospermia (OAT) syndrome patients. Furthermore it was of interest whether epimutations would influence the ART outcome. A total of 54 sperm samples from couples undergoing ART treatment were investigated. To analyse DNA methylation of the imprinted genes hGTL2 and hPEG3 as well as the non-imprinted pluripotency genes hNANOG and hOCT4, Deep Bisulfite Sequencing (DBS) was applied. This is a Next Generation Sequencing (NGS) technique applied on bisulfite converted DNA, al-lowing the analysis of several samples and genes at once. The obtained results showed that OAT samples, which had led to a live-birth, did not differ epigenetically from normal sperm. Much more epimutations were found in OAT sperm which had failed to achieve a pregnancy. Sperm not being able to achieve a pregnancy differed from sperm that had led to a live-birth with regard to hGTL2 epimutation frequency. In addition, ART outcome can be predicted using the frequency of epimutations. 
Taken together this work shows that the amount of epimutations influences whether a pregnancy can be achieved or not. Epimutations already exist within the parental genome. They are not caused by ART. Nevertheless, one needs to find techniques with which gametes with as few as possible epimutations are being selected to pre-vent the transmission of these onto the offspring.
KW  - Epigenetik
KW  - Sterilität
KW  - Epimutationen
KW  - geprägte Gene
KW  - humane Keimzellen
KW  - Infertilität
Y1  - 2015
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-108248
ER  -