TY - THES A1 - Taupp, Marcus T1 - Biotransformation von N-Alkyl- und N,N-Dialkylarylaminen durch Bacillus megaterium T1 - Biotransformation of N-alkyl- and N,N-dialkylarylamines by Bacillus megaterium N2 - In der vorliegenden Arbeit wurden Studien zur bakteriellen Biotransformation von N Alkyl- sowie N,N Dialkylarylaminen mit dem Ziel der arylischen Hydroxy-lierung und N-Dealkylierung durchgeführt. Bodenproben wurden einem Screening-Verfahren unterworfen, um selektiv nach Mikroorganismen zu suchen, die zu den genannten Biotransformationen fähig waren. In einem Screeningverfahren wurden unter Verwendung von N-Ethyl-N methyl-anilin als Standardsubstrat aus Boden-proben Mikroorganismen isoliert und auf ihre Fähigkeit zur Biotransformation überprüft. Einer der isolierten Stämme setzte das zugeführte Substrat effizient und reproduzierbar zu drei Hauptprodukten um. Deren Strukturaufklärung erfolgte mittels Gaschromatographie-Massenspektrometrie (GC-MS) sowie anhand ein-dimensionaler NMR-Experimente (1H-NMR und 13C-NMR). Identifiziert wurden zwei hydroxylierte Produkte, N Ethyl-N-methyl-2-aminophenol und N-Ethyl-N-methyl-4-aminophenol, ferner wurde N-Ethylanilin, das N Demethylierungsprodukt gebildet. Die Identitäten wurden durch synthetisierte Referenzsubstanzen bestätigt. Die phänotypische und genotypische Charakterisierung dieses Bodenisolates als Bacillus megaterium erfolgte mittels mikroskopischer und färbetechnischer Methoden sowie der 16S rDNA-Sequenzierung. Zur eindeutigen Zuordnung wurde eine DNA/DNA-Hybridisierung gegenüber dem Bacillus megaterium Type-strain (DSM 32, ATCC 14581t) durchgeführt. In einem erweiterten Substratscreening wurden die strukturellen Voraussetzungen zur Biotransformation von N-Alkyl- und N,N Dialkylarylaminen durch Bacillus megaterium ermittelt. Ausführlich sind Sub-stituenteneffekte in Bezug auf Hydroxylierung und N-Dealkylierung untersucht worden. Sperrige und räumlich große Substrate wie N,N,N´,N´-Tetramethyl-p,p´ benzidin als auch N,N,N´,N´-Tetramethyl-p-benzidin wurden nicht hydro-xyliert; allerdings fand bei beiden Substrate eine N-Demethylierung statt, wobei das Erstere stärker N demethyliert wurde. Der Effekt des Austausches von Stickstoff gegen Phosphor in einigen Substraten wurde ebenfalls untersucht. So kamen Dimethylphenylphosphin und Diethylphenylphosphin mit Bacillus megaterium zur Anwendung. Phosphor-haltige Substrate wurden von B. megaterium nicht umgesetzt. Durch Versuche mit verschiedenen Induktoren und Repressoren wurde die Cytochrom-P-450-Aktvität des isolierten Bacillus megaterium bei der Bio-transformation von N,N-Diethylanilin untersucht. Hierbei wurde gezeigt, dass durch bestimmte Barbiturate die arylische Hydroxylierung als auch die N Deethylierung gesteigert wurden. Repression der Hydroxylierungs- und N Dealkylierungsaktivität zeigte sich durch Metyrapon, n-Octylamin, Pyridin und Imidazol. Die von Bacillus megaterium durchgeführte N-Demethylierung von N,N Dimethylanilin sowie N-Ethyl-N-methylanilin wurde im Hinblick auf Formaldehydbildung untersucht. Dies erfolgte im Inkubationsmedium direkt in-situ, mittels Cysteamin-Zugabe in das Medium, mit Umsetzung zu Thiazolidin. Anhand von Inkubationsversuchen mit den stabil-isotopenmarkierten Substraten N,N-Di-(trideuteromethyl)-anilin und N-Ethyl-N (trideuteromethyl)-anilin sowie N,N-Di-[methyl-13C]-anilin und N-Ethyl-N [methyl-13C]-anilin wurde anhand der Massenspektren der gebildeten Thiazolidine eindeutig festgestellt, dass die Methylgruppe als Formaldehyd abgespalten wird. Das Potential von Bacillus megaterium zur N-Dealkylierung wurde zur mikrobiellen N Demethylierung von natürlichem N-Methyl-methyl-anthranilat genutzt. Dadurch wurde der natürliche Aromastoff Methylanthranilat gewonnen. Zur Optimierung der bakteriellen Biotransformation von N-Methyl-methyl-anthranilat zu Methylanthranilat wurden in Bezug auf Wachstumsmedium, Inkubationstemperatur, pH-Wert des Inkubationsmediums sowie Substrat-konzentration verschiedene Variationen durchgeführt. Die antimikrobiellen Eigenschaften von N-Methyl-methylanthranilat und Methylanthranilat gegenüber Bacillus megaterium wurden durch Hemmhofbildung sowie der Bestimmung der Inhibierungskonzentration im Flüssigmedium nachgewiesen. Sowohl Substrat als auch Produkt erwiesen sich in den unterschiedlichen Tests als antibakteriell. Im Anschluß an Versuche zur Immobilisierung, die zu geringeren Ausbeuten führten, erfolgten schließlich Umsetzungen im Bioreaktor. Hierbei ließen sich die bei den Schüttelkulturen erhaltenen Ergebnisse direkt proportional auf den Fermenter übertragen. N2 - The goal of this study was to conduct the microbial biotransformation of N-alkyl- and N,N dialkylarylamines. Main objective was the arylic hydroxylation and N-dealkylation of this class of substrates. By this, microorganisms were isolated from topsoil and a selective screening process was started to search for microorganisms capable of con-ducting the biotransformations mentioned above. In a screening process and by the use of N-ethyl-N methylaniline as substrate, microorganisms of soil samples were isolated and proven of their ability to biotransformate N-ethyl-N-methylaniline. One isolate showed three biotransformation products. Structure determination was done by gaschromatography-masspectrometry (GC-MS) and nuclear magnetic resonance experiments (1H-NMR and 13C-NMR). N-ethyl-N-methylaniline was biohydroxylated to N-ethyl-N-methylaniline-2-aminophenol and N ethyl-N-methyl-4-aminophenol, N demethylation of N-ethyl-N-methyl-aniline afforded N-ethylaniline. The soil isolate was characterized and identified phenotypical and genotypical by colour reactions and the standard 16S rDNA method being Bacillus megaterium. To complete the assignment of the isolate to the species Bacillus megaterium, DNA/DNA-hybridization analysis against the Bacillus megaterium type strain (DSM 32, ATCC 14581t) was conducted. In an extended substrate screening, structural properties for a successful bio-transformation of N-alkyl- and N,N-dialkylarylamines by Bacillus megaterium were investigated. Substituent influences were proven in a further substrate screening regarding hydroxylation as well as N-dealkylation. Bulky and large substrates like N,N,N´,N´-tetramethyl-p,p´-benzidine and N,N,N´,N´-tetramethyl-p-benzidine were not hydroxylated by the microorganisms. But, N-demethylation was observed whereas the first one was more accepted. Exchange of nitrogen against phosphorus by using dimethylphenylphosphine and diethylphenylphosphine as substrates finally stopped all biotransformation activity of Bacillus megaterium. Neither arylic hydroxylation nor P dealkylation occurred. Trials to influence the bacterial activity towards the substrate N,N-diethylaniline, elicitors and inhibitors were used to affect cytochrome-P-450. Certain barbiturates clearly increased arylic hydroxylation as well as N dealkylation. Repression of these metabolites was shown by metyrapone, pyridine, n-octylamine and imidazole. N-demethylation reaction of Bacillus megaterium was further investigated for a detection of formaldehyde. Formaldehyde, built after N-demethylation of N,N dimethylaniline or N ethyl-N-methylaniline, was caught by added cysteamine and derivatized to thiazolidine. Incubation of the stable isotope labelled substrates N,N-di-(trideuteromethyl)-aniline and N-ethyl-N-(trideuteromethyl)-aniline as well as N,N-di[methyl 13C]-aniline and N-ethyl-N-[methyl-13C]-aniline and the resulting mass spectral fragmentations of the build labelled thiazolidines clearly stated that formaldehyde comes from methylgroups. Observed N-dealkylation reactions of Bacillus megaterium were used to produce the food flavour methyl anthranilate by microbial N-demethylation of N methyl methyl anthranilate. Several variations of the standard conditions were proven for the optimization of the bacterial biotransformation from N-methyl methyl anthranilate to methyl anthranilate: incubation temperature, pH-value, substrate concentration and media. Antimicrobial activities of N-methyl methyl anthranilate and methyl anthranilate against Bacillus megaterium were tested by using the paper disc diffusion assay and determination of the minimum inhibitory concentration in liquid medium. Substrate as well as product exhibited antimicrobial activity in both tests. To improve the stability of Bacillus megaterium, bacterial cells were immobilized in sodium-alginate-globules resulting in very low yields of methyl anthranilate. Finally, as a summarization of all obtained methyl anthranilate results, an upscaling was done in the bioreactor in a direct proportional way. KW - Bacillus megaterium KW - Arylamine KW - Demethylierung KW - Biokonversion KW - Bacillus megaterium KW - N-Demethylierung KW - Biohydroxylierung KW - Formaldehyd KW - Methylanthranilat KW - Bacillus megaterium KW - N-demethylation KW - biohydroxylation KW - formaldehyde KW - methylanthranilate Y1 - 2005 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-17320 ER - TY - THES A1 - Brandt, Rainer T1 - Sauer katalysierte, unterkritisch getrocknete Resorcin-Formaldehyd-Aerogele und daraus abgeleitete Kohlenstoff-Aerogele T1 - Carbon aerogels derived from acid-catalyzed and subcritcally dried resorcinol-formaldehyde aerogels N2 - Resorcin-Formaldehyd (RF) Aerogele sind feinstporöse organische Stoffe, die über einen katalysierten Sol-Gel-Prozeß und anschließende Trocknung gewonnen werden. In ihrem chemischen Aufbau sind sie den Phenoplasten oder Phenolharzen sehr ähnlich. Durch Erhitzung auf über 900 K unter Schutzgas lassen sich die organischen Aerogele in elektrisch leitfähige Kohlenstoff (C) Aerogele umwandeln. Durch die Menge der wäßrigen Verdünnung, sowie die Art und Konzentration des eingesetzten Katalysators, läßt sich die Poren- und Partikelgröße sowie die Porosität des im Sol-Gel-Prozeß entstehenden Gels beeinflussen. Aufgrund dieser Möglichkeit, die Eigenschaften der RF- und C-Aerogele „maßzuschneidern”, bieten sich Einsatz- und Optimierungsmöglichkeiten bei zahlreichen technischen Anwendungen: z.B. bei Isolationsmaterialien, bei der Gaswäsche und in der Elektrochemie als Elektrodenmaterial für Batterien und Kondensatoren, sowie zur Elektrolyse. Bisherige systematische Untersuchungen unter Variation der Katalysator- und Monomerkonzentration beschränkten sich zumeist auf mit Na2CO3 basisch katalysierte RF- und C-Aerogele. Um metallische Verunreinigungen zu vermeiden, die sich beispielsweise beim Einsatz von C-Aerogelen als Substrat für Halbleiter störend auswirken, wurde in der vorliegenden Arbeit die Wirkung von carbonsauren Katalysatoren, insbesondere Essigsäure und vereinzelt auch Ameisensäure, auf die Strukturen und Eigenschaften der entstehenden Aerogele systematisch untersucht. Da im Hinblick auf spätere Anwendungen stets eine vereinfachte unterkritische Trocknung mit Austausch des Porenwassers durch Aceton durchgeführt wurde, wurde zum Vergleich auch eine entsprechend getrocknete Probenserie Na2CO3-katalysierter RF- und C-Aerogele hergestellt und untersucht. Strukturelle Untersuchungen mittels REM, Röntgenkleinwinkelstreuung (SAXS) und Gassorptionsmessungen ergaben ähnlich wie bei basisch katalysierten Aerogelen eine Abnahme des Primärpartikeldurchmessers mit steigendem Katalysatorgehalt und bestätigten damit die Wirksamkeit der protoneninduzierten Katalyse, welche ab etwa pH = 5 einsetzen sollte. Allerdings zeigte sich, daß der essigsaure Katalysator weniger wirksam ist als Na2CO3, so daß zur Herstellung sehr fein strukturierter Aerogele mit geringen Dichten und Strukturen im nm-Bereich extrem hohe Katalysatorkonzentrationen bis in die Größenordnung der Stoffmenge des wässrigen Lösungsmittels nötig sind. Wie auch bei basischer Katalyse mit geringer Katalysatorkonzentration, ergaben Variationen der Monomerkonzentration bei den essigsauer katalysierten Proben eine Poren- und Partikelverkleinerung mit zunehmendem Monomergehalt, jedoch mit größerer Verteilungsbreite als bei der basischen Katalyse. Bei der Na2CO3-Katalyse mit hohen Katalysatorkonzentrationen und bei unterkritischer Trocknung, kompensierte die mit sinkender Monomerkonzentration stark ansteigende trocknungsbedingte Schrumpfung die zu erwartende Porositätszunahme, so daß sich bei einheitlicher Katalysator- und verschiedenen Monomerkonzentrationen kaum strukturelle und Dichteänderungen einstellten. Die schwach essigsauer katalysierten Proben zeigten im Vergleich zu den basischen eine stark veränderte Morphologie. Während bei letzteren die Kontaktstellen zwischen den Primärpartikeln mit steigendem Partikeldurchmesser immer spärlicher ausfallen, gibt es bei carbonsauer katalysierten RF- und C-Aerogelen auch bei Primärpartikeln im µm-Bereich ein ausgeprägtes Halswachstum. Weiterhin haben die µm-großen Primärpartikel basisch katalysierter RF-Aerogele ein clusterartiges Erscheinungsbild, während man bei essigsauer katalysierten kugelrunde Primärpartikel findet. Zur Untersuchung des Gelierprozesses wurden einige Proben mit veränderten Gelierzeiten und –temperaturen hergestellt. So konnte festgestellt werden, daß die Verweildauer bei Zimmertemperatur im Zusammenhang mit dem Primärpartikelwachstum steht, während bei höheren Temperaturen die Vernetzung der Primärpartikeln untereinander gefördert wird. Zu kurze Gelierzeiten und ein Verzicht auf höhere Temperaturen führt zu einer sehr starken Schrumpfung bei der unterkritischen Trocknung und damit zu nahezu unporösen harzartigen Materialien. N2 - Resorcinol-formaldehyde (RF) aerogels are highly porous materials obtained via an acidic or basic catalyzed sol-gel-process followed by a drying step. Concerning their chemistry, RF-aerogels are similarly constructed as phenolic resins. The organic RF-aerogels allow for conversion into electrically conductive carbon (C) aerogels by heating them up to at least 900K under inert conditions (pyrolysis). The size of the pores and particles as well as the porosity of the developing gel is controlled by the amount of the aqueous dilution as well as the type and the concentration of the used catalyst. The ability to ”tailor” the properties of the RF- and C-Aerogels allows for improvements in numerous technical applications, such as in thermal insulating, filtration and in the field of electrochemistry, where porous carbons act as electrode material in batteries and capacitors, as well as for electrochemical analysis purposes. In contrast to acidic catalysis, the effect of dilution and catalyst concentration on the structural properties of the resulting aerogels are well studied for the commonly used basic catalysis with sodium carbonate. Since metallic impurities are disadvantageous in several technical applications, for example in substrate materials for semiconductor technology, the influence of carbonic acids, especially acetic acid and in some cases formic acid, on the structures and properties of the developing gels was systematically investigated. In view of later applications, a simplified subcritically drying following the exchange of the pore water for acetone was carried out. As a reference a similarly dried series of Na2CO3-catalyzed RF- and C-aerogels was prepared and examined. As for basic catalyzed aerogels, structural investigations via SEM and small angle X-ray scattering (SAXS) show the reduction of the particle diameter with increasing catalyst concentration and confirm the effectiveness of the H3O+-catalysis, which should start at a pH-value of about 5. However, the acidic catalyst is less effective with respect to Na2CO3, so that huge amounts of catalyst are required to obtain acetic acid catalyzed aerogels with a nanometer sized structure and low densities. Alike in basic catalysis with small catalyst concentrations, the pore and particle sizes decrease with increasing monomer concentration. However, the evaluation of the SAXS-measurements suggests a broader pore and particle size distribution for the acidic catalyzed aerogels. In Na2CO3-catalysis with large catalyst concentrations, the expected increase of porosity with decreasing monomer concentration was found to be compensated by an increasing shrinkage due to capillary stresses upon subcritical drying. Consequently, different monomer concentrations led to similar structures and densities if the same catalyst concentration was used. The morphology of the micron structured basic and acidic catalyzed aerogels is different. In case of basic catalysis the transitions between the primary particles become more and more sparse with increasing particle size and the particles have a cluster-like appearance. In contrast, the carbonic acid catalyzed aerogels have thick ”necks” and the particles look like perfect spheres. To investigate the gelation process some gels were prepared at different aging times and temperatures. The results revealed, that the time at room temperature is connected with the growth of the primary particles, whereas the connectivity of the primary particles increases with increasing gelation temperature. A short gelation time and a gelation without higher temperatures leads to a very large shrinkage in the following subcritical drying step. Thus almost non-porous and resin-like samples are derived. KW - Aerogel KW - Resorcin KW - Formaldehyd KW - Pyrolyse KW - Kohlenstoff KW - Aerogele KW - Sol-Gel-Prozess KW - Sorption KW - (U)SAXS KW - Pyrolyse KW - aerogels KW - sol-gel process KW - sorption KW - (U)SAXS KW - pyrolysis Y1 - 2004 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-15795 ER -