TY - THES A1 - Leistner, Adrian Dieter T1 - Improving the quality analysis of monographed drugs - dapsone, baclofen, acarbose and other selected APIs T1 - Verbesserung der Qualitätsanalyse von monographierten Arzneistoffen - Dapson, Baclofen, Acarbose und andere ausgewählte Wirkstoffe N2 - All presented studies aimed on the improvement of the quality analysis of already monographed drugs. Thereby different LC methods were applied and coupled to i.e., the UV/VIS detector, the CAD or a hyphenation of these detectors, respectively. The choice of the chromatographic system including the detector was largely dependent on the physicochemical properties of the respective analytes. With the risk-assessment report on the API cetirizine we presented an exemplary tool, that can help to minimize the risk of the occurrence of unexpected impurities. An in- deep analysis of each step within synthesis pathway by means of reaction matrices of all compounds was performed. It is essential to understand the complete impurity profile of all reactants, solvents, and catalysts and to include them in the matrix. Finally, the API of this synthesis was checked if all impurities are identified by this tool. Of note, a shortcoming of such a targeted approach is that impurities can still occur, but they are not captured. This disadvantage can be partially compensated by non-targeted approaches if they are performed in parallel with the other studies that represent most of the impurities. However, this work also shows that even in a supposedly simple synthesis, potentially hundreds of by-products can be formed. For each of them, it must be decided individually whether their formation is probable or how their quantity can be minimized in order to obtain APIs, that are as pure as possible. In the dapsone project it was aimed to replace the existing old Ph. Eur. TLC method with a modern RP-HPLC method. This was successful and since Ph. Eur. 10.6, the method developed in this work, became a valid monograph. Within the revision process of the monograph, the individual limits for impurities were tightened. However, this new method needs HPLC instrumentation, suitable to perform gradients. As this is not always available in all control laboratories, we also developed an alternative, more simple method using two different isocratic runs for the impurity analysis. The obtained batch results of both, the new pharmacopoeial method and the more simple one, were in a comparable order of magnitude. Furthermore, within the method development stage of the Ph. Eur. method, we could identify one unknown impurity of the impurity reference by high-resolution MS/MS analysis. Also, in the baclofen project it was aimed to replace the existing Ph. Eur. method with the introduction of an additional impurity to be quantified. A corresponding method was developed and validated. However, due to the harmonization process of the pharmacopoeias, it is currently not used. In addition, we tried to find further, non- 116 SUMMARY chromophoric impurities by means of the CAD. However, except for one counterion of an impurity, no further impurities were found. Also, the aforementioned new impurity could not be detected above the reporting threshold in the batches analyzed. As the only individually specified impurity A is also present at a low level, it can be concluded that the examined batches of baclofen are very pure. The use of universal detectors, such as the CAD can be particularly interesting for compounds with no chromophore or those with only a weak chromophore. Therefore, we decided to take a closer look at the impurity profile of acarbose. Currently, acarbose and its impurities are being studied by low wavelength UV detection at 210 nm. Therefore, the question arose whether there are no other impurities in the API that do not show absorption at this wavelength. CAD, which offers consistent detection properties for all non-volatile compounds, is ideally suited for this purpose. However, it was not so easy to use the CAD together with the UV detector, for example, as a hyphenated detection technique, because the Ph. Eur. method uses phosphate buffers. However, this is non-volatile and therefore inappropriate for the CAD. Therefore, an attempt was made to replace the buffer with a volatile one. However, since this did not lead to satisfactory results and rather the self-degradation process of the stationary phase used could be observed by means of the CAD, it was decided to switch to alternative stationary phases. A column screening also revealed further difficulties with acarbose and its impurities: they show an epimerization reaction at the end of the sugar chain. However, since one wanted to have uniform peaks in the corresponding chromatograms, one had to accelerate this reaction significantly to obtain only one peak for each component. This was best achieved by using two stationary phases: PGC and Amide-HILIC. Impurity-profiling methods could be developed on each of the two phases. In addition, as expected, new impurities could be detected, albeit at a low level. Two of them could even be identified by spiking experiments as the sugar fragments maltose and maltotriose. Taken together, it can be concluded, that this work has contributed significantly to the improvement of the quality analysis of monographed drugs. In addition to the presented general tool for the identification of potential impurities, one of the methods developed, had already been implemented to the Ph. Eur. In an effort to improve the CAD's universal detection capabilities, additional methods have also been developed. Further, new improved methods for the impurity profiling are ready to use. N2 - Alle vorgestellten Arbeiten zielten auf die Verbesserung der Qualitätsanalyse von im Europäischen Arzneibuch monographierten Wirkstoffen ab. Dabei wurden verschiedene flüssig-chromatographische Methoden angewandt und z.B. mit dem UV/VIS-Detektor, dem CAD oder einer Kombination dieser Detektoren gekoppelt. Die Wahl des chromatographischen Systems einschließlich des Detektors war weitgehend von den physikochemischen Eigenschaften der jeweiligen Analyten abhängig. Mit dem Bericht zur Risikoanalyse des Wirkstoffs Cetirizin haben wir ein beispielhaftes Instrument vorgestellt, das helfen kann, das Risiko des Auftretens unerwarteter Verunreinigungen zu minimieren. Es wurde eine eingehende Analyse der einzelnen Syntheseschritte anhand der Reaktionsmatrizen aller Verbindungen durchgeführt. Dabei ist wichtig, das vollständige Verunreinigungsprofil aller Reaktanten, Lösungsmittel und Katalysatoren zu verstehen und in die Matrix mit aufzunehmen. Schließlich wurde produzierte Arzneistoff-Chargen überprüft, ob alle Verunreinigungen mit diesem Werkzeug identifiziert werden konnten. Es soll aber nicht unerwähnt bleiben, dass ein Nachteil eines solch gezielten Ansatzes darin besteht, dass Verunreinigungen im Wirkstoff dennoch vorkommen können, sie aber nicht durch das Tool erfasst werden. Dieser Nachteil kann z.B. durch nicht-zielgerichtete Ansätze kompensiert werden, wenn sie parallel zu den anderen Untersuchungen durchgeführt werden, die bereits den Großteil der Verunreinigungen abbilden können. Diese Arbeit zeigt aber auch, dass selbst bei einer vermeintlich einfachen Synthese potenziell Hunderte von Nebenprodukten gebildet werden können. Für jedes von ihnen muss individuell entschieden werden, ob ihre Bildung wahrscheinlich ist und wie ihre Menge im Endprodukt minimiert werden kann, um möglichst reine Wirkstoffe zu erhalten. Im Dapsonprojekt wurde versucht, die bestehende dünnschichtchromatographische Ph.Eur.-Methode durch eine moderne HPLC-Methode zu ersetzen. Dies war erfolgreich und seit Ph. Eur. 10.6 wurde die in dieser Arbeit entwickelte Methode zu einer gültigen Monographie. Im Rahmen der Überarbeitung der Monographie sind auch die einzelnen Grenzwerte für Verunreinigungen verschärft worden. Die neue Methode erfordert jedoch ein HPLC-Gerät, mit dem man eine Gradientenelution durchführen kann. Da dies aber nicht immer in allen Kontrolllabors verfügbar ist, haben wir ein alternatives, einfacheres Prozedere entwickelt, bei dem zwei verschiedene isokratische Methoden für die Verunreinigungsanalyse verwendet werden. Die Batch- Ergebnisse der neuen und der einfacheren Methode lagen dabei in einer 118 ZUSAMMENFASSUNG vergleichbaren Größenordnung wie die Ph. Eur.-Methode. Darüber hinaus konnten wir eine unbekannte Verunreinigung der Verunreinigungsreferenz durch hochauflösende Massenspektrometrie identifizieren. Im Rahmen des Baclofen-Projekts sollte die bestehende Ph. Eur.-Methode ersetzt werden und die Monographie durch eine zusätzlich zu quantifizierende Verunreinigung ergänzt werden. Eine entsprechende Methode wurde entwickelt und validiert. Aufgrund des Harmonisierungsprozesses der Pharmakopöen wird sie jedoch derzeit nicht verwendet. Darüber hinaus haben wir versucht, mit Hilfe des CAD weitere, nicht- chromophore Verunreinigungen zu finden. Bis auf ein Gegenion einer Verunreinigung wurden jedoch keine weiteren Verunreinigungen gefunden. Auch die oben erwähnte neue Verunreinigung konnte in den untersuchten Chargen nicht oberhalb des Berichtsgrenzwert nachgewiesen werden. Da auch die sonst einzig individuell zu spezifizierende Verunreinigung A nur in geringem Maße vorhanden ist, kann der Schluss gezogen werden, dass die untersuchten Baclofen-Chargen sehr rein sind. Der Einsatz von universellen Detektoren wie dem CAD kann besonders für Verbindungen ohne Chromophor oder solche mit nur schwachem Chromophor interessant sein. Daher wurde das Verunreinigungsprofil von Acarbose genauer untersucht. Derzeit werden Acarbose und ihre Verunreinigungen mit Hilfe der UV- Detektion bei 210 nm untersucht. Daher stellte sich die Frage, ob es nicht noch anderen Verunreinigungen im Wirkstoff gibt, die keine Absorption bei dieser Wellenlänge zeigen. Die Detektion mittels CAD, der für alle nichtflüchtigen Verbindungen gleichbleibende Werte liefert, ist für diesen Zweck gut geeignet. Allerdings war es nicht so einfach, den CAD zusammen mit dem UV-Detektor z. B. als gekoppeltes Detektionsverfahren zu verwenden, da die Ph.Eur.-Methode Phosphatpuffer verwendet. Dieser ist jedoch nicht flüchtig und daher für CAD ungeeignet. Es wurde daher versucht, den Puffer durch einen flüchtigen Puffer zu ersetzen. Da dies jedoch nicht zu befriedigenden Ergebnissen führte und vielmehr die Selbstzersetzung der verwendeten stationären Phase mit Hilfe der CAD beobachtet werden konnte, wurde auf alternative stationäre Phasen ausgewichen. Eine Auswahl von verschiedenen Säulen zeigte zudem weitere analytische Schwierigkeiten mit Acarbose und ihren Verunreinigungen: Sie zeigen die Epimerisierungsreaktion am Ende der Zuckeralkohole. Da man für jede Komponente einen Peak in den entsprechenden Chromatogrammen haben wollte, wurde die beschriebene Reaktion durch Temperaturerhöhung beschleunigt. Dies wurde am besten durch die 119 ZUSAMMENFASSUNG Verwendung mit folgenden stationären Phasen erreicht: PGC und Amid-HILIC. Auf jeder der beiden Phasen konnten Methoden zur Erfassung der Verunreinigungsprofile entwickelt werden. Darüber hinaus konnten erwartungsgemäß neue Verunreinigungen nachgewiesen werden, wenn auch auf niedrigem Niveau. Zwei von ihnen konnten durch „Spiking“-Experimente als die Zuckerfragmente Maltose und Maltotriose identifiziert werden. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass diese Arbeit einen wesentlichen Beitrag zur Verbesserung der Qualitätsanalyse von monographierten Arzneimitteln geleistet hat. Zusätzlich zu dem vorgestellten allgemeinen Werkzeug zur Identifizierung potenzieller Verunreinigungen wurde eine der entwickelten Methoden bereits in die Ph. Eur. aufgenommen. In dem Versuch, die universellen Detektionsmöglichkeiten des CAD zu verbessern, wurden auch ergänzende Methoden entwickelt. Außerdem sind neue verbesserte Methoden für die Analyse von Verunreinigungsprofilen einsatzbereit. KW - Instrumentelle Analytik KW - HPLC KW - Chemische Reinheit KW - Charged Aerosol Detection KW - Impurity Profiling KW - Pharmaceutical Analysis Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-303318 ER - TY - THES A1 - Becht, Alexander Ulrich T1 - New applications for spectroscopic and chemometric studies of drugs T1 - Neue Anwendungen für spektroskopische und chemometrische Untersuchungen von Arzneimitteln N2 - Spectroscopic methods were established decades ago in a wide variety of fields. This also applies to the pharmaceutical field, although they initially were mostly used for identity testing or structure elucidation only. Technical developments, such as miniaturization (NMR benchtop devices), Fourier transformations (for NMR, MIR spectroscopy) or the combination with chemometric evaluation (e.g., in Process Analytical Technology, PAT), have further increased their importance and opened up new applications. The aim of this work was to investigate further new approaches and to find new applications for already established methods and to show their benefits. By means of MIR, NIR and NMR data and their chemometric evaluation (principal component analysis, PCA; hierarchical cluster analysis, HCA; linear discriminant analysis, LDA), possibilities were presented to successfully determine the manufacturer or the pharmaceutical company of various paracetamol preparations. In the course of this, various similarities and correlations between the preparations of individual companies could also be identified. For this purpose, a suitable sample preparation was developed for each spectroscopic method, and suitable measurement parameters in order to obtain reproducible spectra for the chemometric evaluation were determined. Furthermore, the results of the two unsupervised methods (HCA, PCA) were compared with each other. The HCA was able to confirm those of the PCA for the very most part. Additionally, through these methods it was possible to characterize many of the preparations based on clusters formed by comparable tablet compositions. In order to be able to measure unmortared, whole tablets using the NIR spectrometer, an attachment was developed and manufactured using 3D printing. Its functionality was demonstrated by measuring and analyzing the tablets of two different batches of nine paracetamol preparations. The batches were clearly distinguished on the basis of a PCA and a significant difference was also demonstrated by means of statistical tests. For NMR spectroscopy, a method was developed to obtain optimized "fingerprint" spectra of drug formulations. For this purpose, a 1D DOSY measurement was elaborated, in which the signals of the active ingredient could be filtered out by the appropriate choice of measurement parameters. The chemometric evaluation can thus focus on the remaining signals of the excipients, on the basis of which the preparations of the same API can be distinguished. Especially in the case of formulations that consist largely of active ingredient, data pre processing of the spectra can thus be simplified and greater importance can be assigned to the originally very small excipient signals. A quantitative 1H NMR method was developed for the comparison of a high field spectrometer (400 MHz) with a benchtop spectrometer (80 MHz) for two finished drugs. It was shown that it is possible to obtain comparable results with both instruments, but that the influence of the excipients on the signals and the lower resolution of the benchtop instrument must be taken into account. Therefore, it was not possible to obtain comparable results without further optimization of the method for one of the active ingredients. In the investigation of various reactions between APIs and excipients using DOSY, its usefulness as a screening method in stability testing was demonstrated. For this purpose, three different APIs and excipients were stressed together and the reaction mixtures were subsequently measured using DOSY. Based on the translational diffusion coefficient, the reaction products could be identified and distinguished from the active ingredients and the excipients used. The importance of thoughtful processing could also be demonstrated. If all peak heights are selected when evaluating signals split by direct spin spin coupling, this allows the detection of hidden signals as long as not all signals have the same diffusion coefficient. The selective selection of individual peak heights in the case of split signals also enables the evaluation of signals that overlap slightly. However, the limitations of this method were also shown when two signals overlap too much and differ too little in their diffusion coefficients. Hence, it has been successfully demonstrated in the various projects that the new chemometric approaches, as well as the new applications of already established methods, enable in depth findings and thus have a clear added value. N2 - Spektroskopische Methoden haben sich schon vor Jahrzehnten in den verschiedensten Bereichen etabliert. Dies betrifft auch den pharmazeutischen Bereich, auch wenn sie hier zunächst meist nur zur Identitätsprüfung oder Strukturaufklärung verwendet wurden. Durch technische Weiterentwicklungen, wie Miniaturisierungen (NMR benchtop Geräte), Fourier Transformationen (NMR, MIR) oder die Kombination mit einer chemometrischen Auswertung (z. B. bei Process Analytical Technology, PAT), haben sie weiter an Bedeutung gewonnen, und es wurden neue Einsatzbereiche erschlossen. Das Ziel der vorliegenden Arbeit war es, weitere neue Ansätze zu untersuchen und neue Anwendungen für bereits etablierte Methoden zu finden und deren Mehrwert aufzuzeigen. Es wurden Möglichkeiten aufgezeigt mittels MIR , NIR und NMR Daten und deren chemometrischen Auswertungen (Hauptkomponentenanalyse, PCA; hierarchische Clusteranalyse, HCA; lineare Diskriminanzanalyse, LDA) erfolgreich den Hersteller bzw. das pharmazeutische Unternehmen verschiedener Paracetamol Präparate zu bestimmen. In diesem Zuge konnten Ähnlichkeiten zwischen Präparaten unterschiedlicher Firmen identifiziert werden. Um dies zu erreichen, wurde für jede spektroskopische Methode eine geeignete Probenvorbereitung entwickelt sowie geeignete Messparameter festgelegt, um reproduzierbare Spektren für die chemometrische Auswertung zu erhalten. Weiterhin wurden die Ergebnisse der zwei unüberwachten Methoden (HCA, PCA) miteinander verglichen, wobei die HCA die der PCA zum allergrößten Teil bestätigen konnte. Zudem war es möglich durch diese Methoden viele der Präparate anhand von Clustern zu charakterisieren, die durch vergleichbare Tablettenzusammensetzungen gebildet wurden. Um mit Hilfe des NIR Spektrometers intakte Tabletten vermessen zu können, wurde ein Aufsatz entwickelt und mittels 3D Druck hergestellt. Dessen Funktionalität wurde überprüft, indem Tabletten aus je zwei unterschiedlichen Chargen von neun Paracetamol Präparaten vermessen und analysiert wurden. Dabei konnten die Batches anhand einer PCA eindeutig unterschieden und zudem mittels statistischer Tests ein signifikanter Unterschied nachgewiesen werden. Für die NMR Spektroskopie wurde eine Methode entwickelt, um optimierte „Fingerprint“ Spektren von Arzneimittelformulierungen zu erhalten. Dazu wurde eine 1D DOSY Messmethode erarbeitet, bei der durch die passende Wahl der Messparameter die Signale des Wirkstoffes herausgefiltert werden konnten. Die chemometrische Auswertung konnte sich somit auf die Signale der Hilfsstoffe beschränken, anhand derer die Präparate unterschieden werden können. Vor allem bei Formulierungen, die zum größten Teil aus Wirkstoff bestehen, kann so eine Datenvorverarbeitung der Spektren vereinfacht und den ursprünglich sehr kleinen Hilfsstoffsignalen eine größere Bedeutung beigemessen werden. Für den Vergleich eines Hochfeld Spektrometers (400 MHz) mit einem „benchtop“ Spektrometer (80 MHz) wurde für zwei Fertigarzneimittel eine quantitative 1H NMR Methode entwickelt. Es konnte gezeigt werden, dass es möglich ist, mit beiden Geräten vergleichbare Ergebnisse zu erzielen. Dabei ist jedoch der Einfluss der Hilfsstoffe auf die Signale sowie die geringere Auflösung des „benchtop“ Gerätes zu berücksichtigen. Aus diesen Gründen war es ohne eine weitere Optimierung der Methode für einen der Wirkstoffe nicht möglich vergleichbare Ergebnisse mit beiden Geräten zu erzielen. Bei der Untersuchung verschiedener Reaktionen zwischen Wirk- und Hilfsstoffen mittels DOSY konnte dessen Nutzen als Screening Methode bei Stabilitätstests gezeigt werden. Für diesen Zweck wurden drei verschiedene Wirk- und Hilfsstoffe gemeinsam gestresst und die Reaktionsgemische anschließend mittels DOSY vermessen. Anhand des translationalen Diffusionskoeffizienten konnten die Reaktionsprodukte identifiziert und von den eingesetzten Wirk- und Hilfsstoffen unterschieden werden. Ebenso konnte die Bedeutung einer sorgfältigen Prozessierung demonstriert werden. Werden bei der Auswertung von Signalen, die durch direkte Spin Spin Kopplung aufgespalten wurden, alle Peakhöhen ausgewählt, erlaubt dies die Detektion von versteckten Signalen, falls nicht alle Signale den gleichen Diffusionskoeffizienten besitzen. Die selektive Auswahl einzelner Peakhöhen bei aufgespaltenen Signalen ermöglicht zudem die Auswertung von leicht überlappenden Signalen. Es wurden jedoch auch die Grenzen dieser Methode aufgezeigt: wenn zwei Signale zu stark überlappen und sich dabei in ihrem Diffusionskoeffizienten zu wenig unterscheiden. Somit konnte in den verschiedenen Projekten erfolgreich gezeigt werden, dass die neuen chemometrischen Ansätze, sowie die neuen Anwendungen bereits etablierter Methoden vertiefte Erkenntnisse ermöglichen und somit einen deutlichen Mehrwert besitzen. KW - Instrumentelle Analytik KW - NMR-Spektroskopie KW - MIR-Spektroskopie KW - NIR-Spektroskopie KW - Chemometrie KW - Paracetamol KW - Acetaminophen Y1 - 2022 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-275342 ER - TY - THES A1 - Pawellek, Ruben T1 - Charged Aerosol Detector Performance Evaluation and Development of Optimization Strategies for the Analysis of Amino Acids T1 - Leistungsbeurteilung des Charged Aerosol Detektors und Entwicklung von Optimierungsstrategien für die Analyse von Aminosäuren N2 - The charged aerosol detector (CAD) is an aerosol-based detector employed in liquid chromatography which has become established in the field of pharmaceutical analysis due to its outstanding performance characteristics, e.g. the almost uniform response for nonvolatile analytes. Owing to its principle of detection, the response of the CAD depends on the volatility of a compound and is inherently nonlinear. However, the newly implemented instrumental settings evaporation temperature and power function value (PFV) are valuable tools to overcome some of these drawbacks and can even enhance the detector’s capabilities when adjusted properly. This thesis aimed to evaluate the impact of the new instrumental settings on the CAD performance. Additionally, the influence of modern separation techniques for small polar compounds on the CAD was assessed and the applicability of hyphenated UV-CAD techniques explored. The optimization strategies derived from the evaluation procedures and the conjunction of the instrumental and chromatographic techniques investigated were utilized for the challenging impurity profiling of amino acids and amino acid-like drugs. The results of the method validation procedures confirmed the broad applicability of the CAD in the pharmaceutical analysis of nonvolatile compounds, supported by satisfactory sensitivity and reproducibility for meeting the regulatory requirements with respect to the ICH guidelines Q2(R1) and Q3A(R2). The limits of applicability include the analysis of semivolatile compounds, and the method transfer between current and legacy CAD models. Further advances in the definition and standardization of allowed ranges for the instrumental settings and the establishment of general optimization procedures in the method development could lead to a more widespread use of the detection technique in compendial methods. N2 - Der “charged aerosol detectorˮ (CAD) ist ein aerosol-basierter Detektor in der Flüssigchromatographie, der sich im Bereich der pharmazeutischen Analytik etabliert hat, da er über herausragende Leistungsmerkmale verfügt, wie das annährend einheitliche Signal für nichtflüchtige Analyte. Aufgrund des Detektionsprinzips ist das Signal des Detektors abhängig von der Flüchtigkeit einer Verbindung und zudem nichtlinear. Die neu eingeführten Geräteparameter Verdampfungstemperatur und „power function value” (PFV) stellen hierbei wertvolle Werkzeuge dar, um einige der mit dem Detektionsprinzip verbundenen Nachteile auszugleichen und können darüber hinaus die Detektionsmöglichkeiten erweitern, sofern sie auf geeignete Weise eingestellt wurden. Die vorliegende Arbeit hatte zum Ziel, die Auswirkungen der neuen Geräteparameter auf die Leistungsfähigkeit des Detektors zu untersuchen. Zusätzlich wurde der Einfluss moderner Trenntechniken auf den CAD beurteilt und die Anwendbarkeit gekoppelter UV-CAD Techniken erforscht. Die sich aus den Evaluierungsprozeduren ergebenden Optimierungsstrategien und die Verknüpfung der untersuchten instrumentellen und chromatographischen Techniken wurden anschließend verwendet, um Methoden für die herausfordernde Verunreinigungsanalyse von Aminosäuren und Arzneistoffen mit Aminosäurestruktur zu entwickeln. Die Ergebnisse der Validierungsverfahren bestätigten die weitgehende Anwendbarkeit des CAD in der pharmazeutischen Analyse nichtflüchtiger Verbindungen, unterstützt durch zufriedenstellende Empfindlichkeit und Reproduzierbarkeit, wodurch die Vorgaben der ICH-Leitfäden Q2(R1) und Q3A(R2) erfüllt werden konnten. Einschränkungen der Anwendbarkeit bestehen in der Analyse halbflüchtiger Verbindungen, sowie im Methodentransfer zwischen gegenwärtigen und alten CAD-Modellen. Weitere Fortschritte in der Definition und Standardisierung erlaubter Bereiche für die Einstellung der Geräteparameter und die Etablierung allgemeiner Optimierungsverfahren in der Methodenentwicklung könnten zu einer umfassenderen Nutzung der Detektionstechnik für Arzneibuchmethoden führen. KW - Instrumentelle Analytik KW - HPLC KW - Chemische Reinheit KW - Chromatographischer Detektor KW - Pharmaceutical Analysis KW - Charged Aerosol Detection KW - Impurity Profiling KW - Amino Acids KW - Aminosäuren Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-243197 ER - TY - THES A1 - Slopianka, Markus T1 - Evaluation von Gallensäuren als Biomarker für Lebertoxizität in der präklinischen Arzneimittelentwicklung T1 - Evaluation of Bile acids as Biomarkers for Liver Toxicity in Preclinical Drug Development N2 - Die Detektion Arzneimittel-induzierter Leberschädigung (engl. DILI – Drug induced liver injury) stellt eine Herausforderung in der präklinischen Entwicklung von Arzneistoffen dar. Die zur Verfügung stehenden konventionellen klinisch-chemischen Marker, wie Alanin-Aminotransferase (ALAT), Aspartat-Aminotransferase (ASAT) und Alkalische Phosphatase (APh), zeigen z. B. bei minimaler bis leichter Leberpathologie keine Veränderungen im Serum an und besitzen somit nur eine geringe Sensitivität für den frühzeitigen Nachweis einer Lebertoxizität. Des Weiteren besitzen klinisch-chemische Serummarker gleichzeitig eine geringe Spezifität und sind somit für die Differenzierung unterschiedlicher Lebertoxizitäten nur limitiert geeignet. Neben den beschriebenen diagnostischen Herausforderungen können u. a. auch histopathologische Befunde in der Leber, ohne eine Veränderung der klinisch-chemischen Serummarker auftreten und umgekehrt. Die Histopathologie ist als Goldstandard zwar spezifisch, als invasive Technik für eine Verlaufskontrolle in toxikologischen und klinischen Studien aber ungeeignet. In den vergangenen Jahren lieferten Studien zum Gallensäure-Profiling mittels Flüssigkeitschromatographie-Tandem-Massenspektrometrie (LC-MS/MS) mit Modellsubstanzen, die unterschiedliche Formen einer Lebertoxizität in Ratten induzierten Hinweise, dass individuelle Gallensäuren ein diagnostisches Potential für die Bewertung einer Leberschädigung besitzen. Ziel dieser Arbeit ist es, dass Gallensäure-Profiling in die vorgeschriebene Diagnostik der Lebertoxizität in der präklinischen Arzneimittelentwicklung zu implementieren und zu bewerten, ob diese Marker einen wertvollen Beitrag zur Charakterisierung einer Lebertoxizität leisten können. Hierzu wurde eine quantitative LC-MS/MS-Methode etabliert und validiert, die es ermöglicht, 20 verschiedene endogene Gallensäuren in Ratten zu analysieren. Die quantitative Analytik ermöglichte eine selektive Bestimmung von primären, konjugierten und sekundären Gallensäuren. Für die Quantifizierung der individuellen Gallensäuren wurden 2 MRM-Übergänge bestimmt. Zur Bestimmung des Arbeitsbereiches wurden 20 Referenzstandards von Gallensäuren verwendet. Eine Kalibrierung mit sieben Kalibrierpunkten in aufsteigender Konzentration wurde für die Bestimmung der endogenen Konzentrationen genutzt. Zur Kompensation des Matrixeffektes wurden 10 isotopenmarkierte interne Standards in die Analytik eingefügt. Die Reproduzierbarkeit laufender Messungen wurde durch eingefügte Qualitätskontrollen (QCs) in drei verschiedenen Konzentrationsbereichen überwacht. Es wurde ein Gallensäure-Profiling mittels LC-MS/MS im Plasma und Lebergewebe von Ratten, die mit verschiedenen Arzneimitteln behandelt wurden, durchgeführt. Histopathologische Zusammenfassung Untersuchungen konnten aufzeigen, dass sich in den Lebern von männlichen Ratten, die mit dem Arzneimittel Amitriptylin über 14 Tage behandelt wurden, eine makrovesikuläre Steatose in der Leber manifestierte. Die klassischen Serummarker, wie ALAT, ASAT und Gamma-Glutamyltransferase (γGT), konnten diese Art des Leberschadens nicht detektieren. Dagegen erhöhten sich die Konzentrationen Glycin-konjugierter Gallensäuren mit parallel absinkenden Konzentrationen von Taurin-konjugierten Gallensäuren im Lebergewebe behandelter Ratten. Gleichzeitig ergaben sich signifikant erhöhte Konzentrationen der primären Gallensäuren CA und CDCA im Plasma behandelter Ratten. Andere Gallensäure-Profile konnten nach einer Methapyrilen-induzierten Leberzellnekrose mit hepatobiliärer Schädigung beobachtet werden. Nach einer 14-tägigen Behandlungsphase mit 80 mg/kg KG Methapyrilen, erhöhten sich die Konzentrationen von 11 Gallensäuren im Lebergewebe behandelter Tiere. Gleichzeitig stiegen die Konzentrationen von allen 20 individuellen Gallensäuren im Plasma behandelter Ratten an. Zusätzlich zur quantitativen Analyse von Gallensäuren mittels LC-MS/MS wurde die Expression von Genen der Gallensäure-Biosynthese, des Gallensäure-Transports und die Regulation der Gallensäure-Homöostase mittels Multiplex-Analyse untersucht. Die erhöhte Expression von Genen für Efflux-Transporter der Multidrug Resistance-Related Protein (MRP)-Familie deutet auf einen gesteigerten Abtransport von Gallensäuren ins Blut hin und korrespondierte mit erhöhten Gallensäure-Konzentrationen im Plasma der behandelten Ratten. Des Weiteren wurden die Erkenntnisse der Gallensäure-Profile aus den tierexperimentellen Studien als Grundlage genutzt, um Arzneimittel-induzierte Lebertoxizität auf ein zellbiologisches In-vitro-System zu übertragen. Es wurden In-vitro-Experimente mit primären Rattenhepatozyten zwischen zwei Kollagenmatrices (Sandwich-Kultivierung) durchgeführt. Dieses etablierte System wird u. a. für Untersuchungen an hepatobiliären Transportsystemen (z. B. Bile Salt Export Pump, BSEP) genutzt. Das Gallensäure-Profiling in den Zellkulturüberständen belegt, dass die primären Hepatozyten konjugierte Gallensäuren bilden, dass sie bei einer Inkubation mit primären Gallensäuren diese verstoffwechseln und dadurch, neben den bereits vorhandenen Gallensäuren, weitere konjugierte Gallensäuren produzieren. Eine Exposition mit den Hepatotoxinen Troglitazon und Methapyrilen führte zu Veränderungen in der Gallensäure-Homöostase der Hepatozyten. In den In-vivo-Experimenten wurde eine Methapyrilen-induzierte Nekrose mit hepatobiliärer Schädigung in den behandelten Ratten festgestellt. Bei der Behandlung mit Methapyrilen ergaben sich starke Konzentrationsanstiege der Gallensäuren im Plasma (u. a. von GCA und TCA), die mit den histopathologischen Befunden korrelierten. Anhand dieser Daten und der Zusammenfassung pharmakokinetischen Eigenschaften von Methapyrilen wurde ein Studiendesign für Rattenhepatozyten in Sandwich-Kulturen entwickelt, um eine initiale Abschätzung der Konzentrationsveränderungen von Gallensäuren im In-vitro-Testsystem durchzuführen. Ab Tag 8 der Behandlung kam es zu einem erhöhten Anstieg der GCA- und TCA-Konzentrationen im Zellkulturmedium. Daher besitzt das In-vitro-Testsystem möglicherweise das Potential, tierexperimentelle Studien bei der Bewertung einer Hepatotoxizität zu unterstützen oder sogar zu reduzieren. Insgesamt zeigen diese Ergebnisse aus dieser Arbeit, dass Gallensäure-Profiling in männlichen und weiblichen Ratten eine geeignete Methode zur Detektion und Differenzierung von Leberschäden ist. Die Technologie ist flexibel einsetzbar und kann bereits etablierte Testverfahren, wie die Bestimmung von Serummarkern in der Klinischen Chemie und die Histopathologie unterstützen. Damit besitzt das Gallensäure-Profiling das Potential, die Bewertung beim Nachweis und bei der Charakterisierung einer Lebertoxizität im Rahmen der Evaluierung von präklinischen Arzneimittelkandidaten zu verbessern. N2 - Drug-induced liver injury (DILI) remains a significant challenge in preclinical drug development. Nonclinical studies provide an opportunity to correlate the biochemical and morphological findings; however, liver injury is often complex and heterogeneous, confounding the ability to relate biochemical changes to specific, histopathological patterns of liver injury. The diagnostic performance of the available hepatobiliary markers, such as alanine aminotransferase (ALAT), aspartate aminotransferase (ASAT) or alkaline phosphatase (APh), for specific manifestations of liver injury, is often limited and insensitive, e.g. minimal to slight liver pathology might not result in changes to the serum marker. Furthermore, histopathological findings in the liver can occur without there being significant changes in the serum markers and vice versa. Although histopathology is the gold standard, its invasive nature makes it unsuitable for monitoring liver injury in toxicological and non-clinical studies. In recent years, study results of bile acid profiling, using liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS/MS), indicated diagnostic potential regarding the detection of hepatotoxicity. This work aims to establish bile acid profiling in preclinical drug development and to demonstrate that bile acids can provide a valuable contribution to characterizing liver injury in preclinical safety diagnostics. For this purpose, a quantitative LC-MS/MS method was established and validated, in order to analyze 20 different endogenous bile acids in rats. The quantitative analysis enabled the selective determination of primary, conjugated and secondary bile acids. 2 MRM-transitions for qualitative and quantitative analysis were used for the quantification of the individual bile acids. Twenty bile acid reference standards were used for the calibration range. A seven-point calibration, in ascending concentration, was performed to quantify the absolute endogenous bile acid concentrations. Ten isotopically labeled internal standards were employed in the analyses to compensate for matrix effects. The reproducibility of the current measurements was monitored by quality controls (QCs) inserted into three different concentration ranges. Bile acid profiling was performed by LC-MS/MS of plasma and liver tissue of rats that had been treated with different hepatotoxins. The results of the bile acid profiling and histopathological evaluation revealed correlation between bile acid profiles and histopathological graded liver toxicity, e.g., the quantitative analysis and histopathological examination showed that macrovesicular steatosis was induced in the livers of male rats which had been treated with amitriptyline for 14 days. Classic serum markers, such as ALAT, ASAT, and gamma-glutamyltransferase (γGT), were unable to detect this specific manifestation of liver injury. In contrast, the concentrations of glycine-conjugated bile acids Summary increased while there was a parallel decrease in the levels of taurine-conjugated bile acids in the treated rats’ liver tissue. At the same time, there was a significant increase in the concentration of primary bile acids, CA and CDCA, in plasma of treated rats. Different bile acid profiles were observed following methapyrilene-induced liver cell necrosis with hepatobiliary damage. After a 14-day treatment phase with 80 mg/kg body weight methapyrilene, the concentrations of 11 bile acids increased in liver tissue of treated animals. At the same time, the levels of all 20 individual bile acids increased in plasma of treated rats. In addition to the quantitative analysis of bile acids with LC-MS/MS, the expression of specific genes associated with bile acid biosynthesis, and the transport and regulation of bile acid homeostasis, was analyzed using multiplex analysis of targeted mRNA. The increased expression of efflux transporter genes belonging to the multidrug resistance-related protein (MRP) family, indicated an increase in the efflux transport of bile acids into blood, and corresponded to increased bile acid concentrations in the plasma of treated rats. Furthermore, bile acid profiles originated from the animal studies, were used as reference to evaluate bile acid profiles regarding liver toxicity on a liver cell-based biological system. In vitro experiments were performed using primary rat hepatocytes between two collagen matrices (sandwich cultivation). This traditional in vitro model is used to study of hepatobiliary transport alterations (e.g., Bile Salt Export Pump, BSEP). Bile acid profiling of the cell culture supernatants demonstrated that the primary hepatocytes produced conjugated bile acids. Incubation with primary bile acids resulted in an improvement of the in vitro system by producing conjugated bile acids, in addition to those already existed. Exposure to troglitazone and methapyrilene resulted in changes in the hepatocytes’ bile acid homeostasis. In the in vivo experiments, methapyrilene treatment induced necrosis and hepatobiliary damage in the treated rats. There was a substantial increase in the concentration of plasma bile acids in the methapyrilene treatment group (including GCA and TCA), which correlated with the histopathological findings. Based on these data and the pharmacokinetic properties of methapyrilene, a study design was developed that used rat hepatocytes in sandwich cultures to provide an initial estimate of bile acid concentration changes in the in vitro test system. There was an increase in GCA and TCA concentrations in the cell culture medium from day 8 of the methapyrilene treatment. Therefore, the in vitro test system may have the potential to support or even reduce animal studies for evaluating hepatotoxicity. Bile acid profiling in male and female rats is a suitable method for detecting and differentiating liver injury. The technology can be used flexibly and can support already established test procedures, such as the determination of serum markers in clinical chemistry and histopathology. Summary Thus, bile acid profiling has the potential to fill the gap in the detection and characterization of hepatotoxicity, as part of the evaluation of preclinical drug candidates. KW - Hepatotoxizität KW - Biomarker KW - Gallensäuren KW - UHPLC-ESI-MS/MS KW - Biomarker KW - Gallensäuren KW - UHPLC KW - Lebertoxizität KW - Instrumentelle Analytik Y1 - 2020 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-204627 ER - TY - THES A1 - Schilling, Klaus Jussi T1 - Liquid chromatographic analysis of weakly- and non-chromophore compounds focusing on Charged Aerosol Detection T1 - Flüssigchromatographische Analyse von schwach- und nicht-chromophoren Substanzen mit Schwerpunkt auf Charged Aerosol Detektion N2 - Liquid chromatography has become the gold standard for modern quality control and purity analytics since its establishment in the 1930s. However, some analytical questions remain very challenging even today. Several molecules and impurities do not possess a suitable chromophore for the application of UV detection or cannot be retained well on regular RP columns. Possible solutions are found in derivatization procedures, but they are time consuming and can be prone to errors. In order to detect non chromophore molecules underivatized, the concept of aerosol based universal detection was established with the introduction of the evaporative light scattering detector (ELSD) in the 1970s and the charged aerosol detector (CAD) followed in 2002. These two challenging fields – polar and non chromophore molecules – are tackled in this thesis. An overview of applications of the CAD in the literature and a comparison to its aerosol based competitors and MS is presented, emphasizing on its high sensitivity and robustness. Parameters and techniques to overcome the drawbacks of CAD, such as the use of gradient compensation or adjusted evaporation temperatures are discussed. A consideration of aspects and drawbacks of data transformation such as the integrated power function value (PFV) in the GMP environment is performed. A method for the fatty acid analysis in polysorbate 80 that was developed on HPLC CAD was transferred to UHPLC CAD. Time and eluent savings of over 75% and 40%, respectively, as well as ways to determine the optimal CAD parameters resulted from this investigation. The evaporation temperature was determined as the most crucial setting, which has to be adjusted with care. Optimal signal to noise ratios are found at a compromise between maintaining analyte signal and reducing background noise. The incorporation of semi volatile short chain fatty acids enabled the observation of differences based on volatility of the analyte. E.g. for semi volatiles, an improved linearity by means of adjusting the PFV is achieved at values below 1.0 instead of at elevated PFVs. Using sugars and sugar related antibiotics, a proof-of-concept was given that artificial neural networks can describe correlations between the structure and physicochemical properties of molecules and their response in CAD. Quantitative structure property relationships obtained by design of experiment approaches were able to predict the response of unseen substances and yielded insights on the response generation of the detector, which heavily relies on the formed surface area of the dried particle. Further work can substantiate upon these findings, eventually building a library of diverse eluent compositions, analytes and settings. In order to cope with a chromatographically challenging substances, the application of ion pairing reversed phase chromatography coupled to low wavelength UV detection has been shown as a possible approach for the amino acid L asparagine. A method capable of compendial purity analysis in one single HPLC approach, thus making the utilization of the semi quantitative TLC-ninhydrin analysis obsolete, resulted from this. One cyclic dipeptide impurity (diketoasparagine) that was formerly not assessed, could be identified in several batches and added to the monograph of the Ph.Eur. Studying ibandronate sodium with CAD and ELSD, it was found that randomly occurring spike peaks represent a major flaw of the ELSD when high sample load is present. The research with this non chromophore bisphosphonate drug furthermore shed light on possible drawbacks of mixed mode chromatography methods and ways to overcome these issues. Due to strong adsorption of the analyte onto the column, over ten injections of the highly concentrated test solution were found to be necessary to ensure reproducible peak areas. Preconditioning steps should thus be evaluated for mixed mode approaches during method development and validation. Last, using a ternary mixed mode stationary phase coupled to CAD, a method for the impurity profiling of pamidronate disodium, also applicable to the assessment of phosphate and phosphite in four other bisphosphonate drugs, has been developed. This represents a major advantage over the Ph.Eur. impurity profiling of pamidronate, which requires two different methods, one of which is only a semi quantitative TLC approach. N2 - Flüssigchromatographische Untersuchungen sind seit deren Einführung in den 1930er Jahren zum Goldstandard für die moderne Qualitätskontrolle und Reinheitsanalytik geworden. Allerdings sind auch noch heutzutage einige Fragestellungen sehr herausfordernd. Viele Moleküle und Verunreinigungen besitzen keinen geeigneten Chromophor, das die Anwendung klassischer UV Detektion ermöglicht, oder erfahren auf gewöhnlichen Umkehrphasen keine ausreichende Retention. Lösungsansätze in Form von Derivatisierungsverfahren sind zeitaufwändig und fehleranfällig. Um underivatisierte Moleküle ohne geeignetes Chromophor zu analysieren, wurde das Prinzip der auf Aerosolen basierenden universellen Detektion mit dem „Evaporative Light Scattering Detector (ELSD)“ in den 1970er Jahren entwickelt und 2002 folgte der „Charged Aerosol Detector (CAD)“. Diese zwei Felder - polare und nicht chromophore Analyte - werden in der vorliegenden Dissertation bearbeitet. Eine Literaturübersicht und analyse von Applikationen des CAD, sowie ein Vergleich zu seinen auf Aerosoltechnik basierenden Konkurrenten und der Massenspektroskopie wird dargestellt; besonders die hohe Sensitivität und Robustheit werden ersichtlich. Geräteeinstellungen und Techniken, mit denen sich Nachteile des CAD ausgleichen lassen, werden erläutert und diskutiert. Hierbei werden beispielsweise die Gradientenkompensation oder die Veränderung der Verdampfungstemperatur diskutiert. Ein Überblick über Möglichkeiten und Nachteile der Datentransformation des CAD Signals mittels des eingebauten „Power Function Values (PFV)“ im GMP Umfeld wird gegeben. Ein Methodentransfer der Analytik von Fettsäuren in Polysorbat 80 von HPLC CAD zu UHPLC CAD wurde durchgeführt. Chemikalien und Zeitersparnisse jenseits von 40 bzw. 75%, sowie Herangehensweisen für die Optimierung der CAD Einstellungen resultierten hieraus. Die Verdampfungstemperatur ist der wichtigste Parameter des Detektors und sollte stets feinjustiert werden. Die höchste Sensitivität findet sich für einen Kompromiss aus verringertem Rauschen und auch erhaltenem Analytsignal. Durch die Analyse von semi flüchtigen Fettsäuren konnten Unterschiede, die auf der Flüchtigkeit von Substanzen basieren, erarbeitet werden. Für semi flüchtige Stoffe ist die Linearisierung mittels PFV bespielsweise bei Werten unter 1.0 erfolgreich, wohingegen für nicht flüchtige Analyte Werte jenseits von 1.0 optimal sind. Für Zucker und zuckerverwandte Antibiotika konnte ein konzeptioneller Beweis erbracht werden, dass künstliche neuronale Netzwerke Korrelationen zwischen den physikochemischen Eigenschaften der Moleküle und deren Signal im CAD herstellen können. Ein solches Netzwerk wurde mittels Methoden des experimentellen Designs erstellt. Die CAD Detektorantwort, die stark von der Oberfläche der Partikel abhängt, konnte auf diese Weise für Substanzen innerhalb des Experimentalraumes vorhergesagt werden. Hierauf aufbauend kann eine Bibliothek aus Analyten, Fließmitteln und Detektorparametern erarbeitet werden, um weiteres Detailwissen über den CAD zu erhalten. Die Aminosäure L Asparagin stellt eine chromatographische Herausforderung dar. Es wurde eine Ionenpaar Umkehrphasen Methode mit UV Detektion bei 210 nm als erfolgreicher Ansatz gezeigt. Die arzneibuchkonforme Bestimmung des Verunreinigungsprofils ist mit dieser Methode in einem Lauf möglich, wodurch die Nutzung der halbquantitativen Dünnschichtchromatographie obsolet wird. Weiterhin konnte ein cyclisches Dipeptid (Diketoasparagin), welches zuvor nicht im Verunreinigungsprofil gelistet war, in einigen Batches gefunden und so der Monographie des Ph.Eur. hinzugefügt werden. Bei der Untersuchung von Natrium-Ibandronat mit dem CAD und dem ELSD konnte gezeigt werden, dass zufällig auftretende „spike peaks“ bei hohen Probenkonzentrationen ein enormes analytisches Problem des ELSD darstellen. Weiterhin wurde mit der Analyse der nicht chromophoren Bisphosphonaten ein Problem von „mixed mode“ Chromatographie aufgedeckt. Durch die starke Adsorption des Analyten auf der Säule waren über zehn Injektionen der konzentrierten Testlösung notwendig, um reproduzierbare Peakflächen zu erhalten. Derartige Sättigungs- und Vorkonditionierungsprozesse sollten für „mixed mode“ Chromatographie während der Entwicklung und Validierung untersucht werden. Zuletzt wurde eine ternäre „mixed mode“ stationäre Phase gekoppelt mit CAD verwendet, um das Verunreinigungsprofil von Pamidronat Dinatrium zu analysieren. Diese entwickelte Methode konnte auch für die Bestimmung von Phosphat und Phosphit in vier anderen Bisphosphonaten genutzt werden. Erneut ergibt sich ein Vorteil gegenüber der Arzneibuchmethode für Pamidronat, welche zwei verschiedene Methoden - eine davon nur eine halbquantitative Dünnschichtchromatographie - nutzt. KW - HPLC KW - Flüssigkeitschromatographie KW - Instrumentelle Analytik KW - Chemische Reinheit KW - Charged Aerosol Detection KW - mixed-mode chromatography KW - ion-pair chromatography KW - non-chromophore analytes Y1 - 2020 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-202114 ER - TY - THES A1 - Hebron Mwalwisi, Yonah T1 - Assessment of Counterfeit and Substandard Antimalarial Medicines using High Performance Thin Layer Chromatography and High Performance Liquid Chromatography T1 - Untersuchung der Qualität gefälschter Antimalaria-Medikamente mittels Hochleistungs-Dünnschichtchromatographie und Hochleistungs-Flüssigchromatographie N2 - Although the prevalence of substandard and counterfeit pharmaceutical products is a global problem, it is more critical in resource-constrained countries. The national medicines regulatory authorities (MNRA) in these countries have limited resources to cater for regular quality surveillance programmes aimed at ensuring that medicines in circulation are of acceptable quality. Among the reasons explained to hinder the implementation of these strategies is that compendial monographs are too complicated and require expensive infrastructures in terms of environment, equipment and consumables. In this study it was therefore aimed at developing simple, precise, and robust HPLC and HPTLC methods utilizing inexpensive, readily available chemicals (methanol and simple buffers) that can determine the APIs, other API than declared one, and which are capable of impurity profiling. As an outcome of this study, three isocratic and robust HPLC and two HPTLC methods for sulfadoxine, sulfalene, pyrimethamine, primaquine, artesunate, as well as amodiaquine have been developed and validated. All HPLC methods are operated using an isocratic elution mode which means they can be implemented even with a single pump HPLC system and standard C18 columns. The densitometric sulfadoxine/sulfalene and pyrimethamine method utilizes standard TLC plates as well as inexpensive, readily available and safe chemicals (toluene, methanol, and ethyl acetate), while that for artesunate and amodiaquine requires HPTLC plates as well as triethylamine and acetonitrile due to challenges associated with the analysis of amodiaquine and poorly the detectable artesunate. These HPTLC methods can be implemented as alternative to those requiring HPLC equipment e.g. in countries that already have acquired densitometer equipment. It is understood that HPTLC methods are less sensitive, precise and accurate when compared to HPLC methods, but this hindrance can easily be addressed by sending representative samples to third party quality control laboratories where the analytical results are verified using compendial HPLC methods on a regular basis. It is therefore anticipated that the implementation of these methods will not only address the problem of limited resources required for medicines quality control but also increase the number of monitored targeted antimalarial products as well as the number of resource- constrained countries participating in quality monitoring campaigns. Moreover, the experiences and skills acquired within this work will be applied to other API groups, e. g. antibiotics, afterwards. N2 - Trotz der weltweiten Verbreitung gefälschter Arzneimittel und solcher, die nicht die deklarierte Menge an Wirkstoff enthalten, sind vor allem Entwicklungs- und Schwellenländer von dieser Problematik betroffen. Die Arzneimittelüberwachungs- bzw. Zulassungsbehörden dieser Länder verfügen nur über eingeschränkte Möglichkeiten, die Arzneimittelqualität regelmäßig zu überwachen und somit sicherzustellen, dass die im Markt befindlichen Medikamente eine gute Qualität aufweisen. Einer der Gründe hierfür ist unter anderem, dass die in Arzneibüchern beschriebenen Methoden oftmals sehr komplex sind und eine umfassende Laborausstattung, spezielle Geräte oder teure Chemikalien benötigen. In dieser Arbeit wurden einfache, genaue und robuste flüssigchromatographische Methoden entwickelt, die lediglich günstige, überall verfügbare Chemikalien (z. B. Methanol oder einfache Puffersalze) benötigen und mit denen der Gehalt des deklarierten Arzneistoffes, Arzneistoffverwechslungen sowie das Verunreinigungsprofil bestimmt werden kann. Es konnten drei isokratische, robuste flüssigchromatographische sowie zwei dünnschichtchromatographische Methoden zur Bestimmung von Sulfadoxin, Sulfalen, Pyrimethamin, Primaquin, Artesunat sowie Amodiaquin entwickelt und validiert werden. Alle flüssigchromatographischen Methoden arbeiten isokratisch, folglich können sie auch mit sehr einfachen HPLC-Geräten mit beispielsweise nur einem Pumpenkopf genutzt werden. Zudem werden nur einfache, kommerziell erhältliche C18-Säulen benötigt. Die densitometrischen Methoden für Sulfadoxin/Sulfalen sowie Pyrimethamin benötigen standardisierte Dünnschichtchromatographie-Platten sowie günstige, überall verfügbare und wenig toxische Chemikalien wie beispielsweise Toluol, Methanol oder Ethylacetat. Für die Methode zur Bestimmung von Artesunat und Amodiaquin werden Hochleistungsdünnschichtchromatographie-Platten und Triethylamin sowie Acetonitril benötigt. Dieser Umstand ist der Tatsache geschuldet, dass Amodiaquin und Artesunat sich anderweitig nur ungenügend trennen ließen. Die dünnschichtchromatographischen Protokolle können als Alternative zur HPLC eingesetzt werden, beispielsweise überall dort, wo bereits die entsprechenden Gerätschaften vorhanden sind. Natürlich weisen dünnschichtchromatographische Methoden im Vergleich zur Flüssigchromatographie eine geringere Sensitivität, Präzision und Richtigkeit auf, dies kann jedoch dadurch umgangen werden, die entsprechenden Methoden nur zum Screening zu verwenden und die zu analysierenden Proben anderweitig, z. B. in externen Laboratorien, detailliert zu untersuchen. Dort können beispielsweise Methoden aus gängigen Arzneibüchern verwendet werden. Durch die Implementierung der neu entwickelten Methoden kann zum einen das Problem schlecht verfügbarer Chemikalien umgangen werden und gleichzeitig die Anzahl an untersuchten Arzneimitteln erhöht werden. Dies ist ein wichtiger Beitrag zur Qualitätskontrolle in Ländern mit eingeschränkten Infrastrukturen. KW - Instrumentelle Analytik KW - Arzneimittel KW - Fälschung KW - Malaria KW - HPLC KW - Counterfeit Medicines KW - HPLC KW - Pharmaceutical Analysis KW - Impurity Profiling Y1 - 2018 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-145821 ER - TY - THES A1 - Scherf-Clavel, Maike T1 - Anwendung der Trockenblutanalytik zur vereinfachten Überwachung der Nierenfunktion und zur Blutspiegelbestimmung von Metformin und Sitagliptin T1 - Application of dried-blood analytic for the simplified monitoring of the renal function and for the blood level determination of metformin and sitagliptin N2 - Die oralen Antidiabetika Metformin und Sitagliptin werden überwiegend renal eliminiert, weshalb während der Therapie regelmäßig die Nierenfunktion abgeschätzt werden sollte. Dies geschieht mithilfe von Serumkreatinin-basierten Formeln, zum Beispiel der Gleichung nach Cockcroft-Gault. Mit dem Ziel, zukünftig eine Möglichkeit für eine vereinfachte Kontrolle der Therapie mit Metformin und/oder Sitagliptin in Kapillarblutproben zu haben, wurde eine Methode zur Bestimmung der Konzentration von Kreatinin, Metformin und Sitagliptin aus Trockenblutproben (Dried Blood Spots, DBS) entwickelt. Als Träger zeigte Blotting Papier die besten Ergebnisse in Bezug auf die Handhabung und die Extraktionseffizienz. Aus einem einzelnen DBS gelang es, Metformin und Kreatinin mittels HPLC-UV und Sitagliptin mittels LC-MS/MS zu quantifizieren. Die flüssigchromatographischen Methoden wurden entsprechend der EMA- und FDA-Kriterien erfolgreich vollvalidiert. Die unteren Nachweisgrenzen (LLOQ) lagen bei 0,2 µg/mL für Metformin, 1,5 µg/mL für Kreatinin und 3 ng/mL für Sitagliptin. Da Referenzbereiche für Arzneistoffkonzentrationen in der Regel für Serum/Plasma angegeben werden, wurde das Verteilungsverhalten der beiden Antidiabetika zwischen Plasma (cP) und Blutzellen (cBZ) mittels in-vitro Inkubationsversuchen ermittelt. Für Metformin betrug der Verteilungskoeffizient cP/cBZ 4,65 ± 0,73, für Sitagliptin 5,58 ± 0,98. Damit lagen beide Arzneistoffe mehr als 4-fach höher im Plasma als in den Blutzellen vor. Erythrozyten waren zuvor schon als tiefes Kompartiment für Metformin beschrieben worden, für Sitagliptin waren dieses die ersten Daten die zeigten, dass der Arzneistoff ebenfalls eine relevante Verteilung in die Blutzellen zeigt. In Kooperation mit einer diabetologischen Schwerpunktpraxis wurde eine erste klinische Studie (Basisstudie) durchgeführt, die zum Ziel hatte, aus den DBS die Nierenfunktion abzuschätzen. In DBS von 70 Patienten wurden Metformin, und/oder Sitagliptin sowie Kreatinin quantifiziert. Mit Hilfe der von der Praxis übermittelten Serumkreatinin-konzentration konnte durch den Vergleich mit der Konzentration im Kapillarbut erstmalig ein Korrelationsfaktor bestimmt und verifiziert werden, um die Kapillarblut- in die Serumkonzentration des Kreatinins umzurechnen (F = cKapillarblut/cPlasma = 0,916 ± 0,088). So war es möglich, die Nierenfunktion über die Formel nach Cockcroft und Gault abzuschätzen. In der Basisstudie fiel auf, dass die Konzentration des Sitagliptins im Blut der Patienten signifikant mit steigendem Hämatokrit korrelierte (Pearson R = 0,396; p < 0,05). Die nähere Untersuchung dieser Beobachtung mittels in-vitro Verteilungsversuchen zeigte eine sehr stark inter-individuell schwankende Verteilung des Sitagliptins zwischen Plasma und den Blutzellen und eine vom Hämatokrit (Hct) linear abhängige Verteilung. In Blut mit einem höheren Hct fand sich mehr Arzneistoff in den Blutzellen als in Blut mit niedrigerem Hct, was die höheren Gesamtkonzentrationen an Sitagliptin im DBS erklärte. Dialyseversuche in-vitro bestätigten, dass die Eliminationszeit mit steigendem Hämatokrit des Blutes anstieg. Damit konnte zum ersten Mal gezeigt werden, dass die Blutzellen ein tiefes Kompartiment für Sitagliptin darstellen. Eine zweite klinische Studie (Feldstudie) wurde in Kooperation mit 14 öffentlichen Apotheken mit dem Ziel, repräsentative Konzentrationen für die Kapillarblutspiegel der beiden Medikamente unter Alltagsbedingungen zu ermitteln, durchgeführt. In DBS von 84 Patienten wurden wiederum Metformin, Sitagliptin und Kreatinin quantifiziert. Aus den Daten der beiden Studienpopulationen (n = 134) wurde für Metformin eine mittlere Konzentration von 2,22 ± 1,16 µg/mL und für Sitagliptin von 432,20 ± 268,79 ng/mL bestimmt. Mittels populationspharmakokinetischer Methoden konnten für beide Arzneistoffe zum ersten Mal Eliminationshalbwertszeiten (t1/2) aus Kapillarblut für Patienten mit einer Kreatininclearance größer und kleiner als 60 mL/min bestimmt werden. Erwartungsgemäß waren die t1/2 bei besserer Nierenfunktion kürzer, sowohl für Metformin (11,9 h versus 18,5 h) als auch für Sitagliptin (8,4 h versus 13,0 h). Für Sitagliptin waren dies erstmalige klinische Belege für eine ansteigende Eliminationszeit mit sinkender Nierenfunktion. Die gewonnenen Daten boten zudem Gelegenheit, den literaturbekannten ungünstigen Effekt einer kombinierten Einnahme von Diuretika, NSAIDs, ACE-Inhibitoren und/oder Angiotensinrezeptorantagonisten („target drugs“) auf die Nierenfunktion („triple whammy“) zu betrachten. Tatsächlich korrelierten die Anzahl der eingenommenen „target drugs“ und auch die Dosis der Diuretika mit einer sinkenden Kreatininclearance der Patienten. Mit vorliegender Arbeit wurden zum einen neue Erkenntnisse über die Pharmakokinetik des Sitagliptins gewonnen, zum anderen wurde die Grundlage geschaffen, um aus einem DBS die Blutspiegel von Metformin und Sitagliptin im Zusammenhang mit der Nierenfunktion zu betrachten. In Zukunft könnte diese Methode für ein Therapeutisches Drug Monitoring der beiden Arzneistoffe eingesetzt werden um dieses für Patienten aufgrund der minimalinvasiven Blutabnahme wesentlich angenehmer zu gestalten. N2 - Patients´ kidney function should frequently be monitored under therapy with the oral antidiabetics metformin and sitagliptin due to their renal elimination. The creatinine clearance or the glomerular filtration rate can be estimated using serum creatinine-based equations such as the Cockcroft-Gault equation. Aiming at simplifying drug monitoring a method was developed to quantify creatinine, metformin and sitagliptin in dried blood spots (DBS). For sample collection blotting paper showed the best results regarding handling and extraction efficiency. A single DBS was used to quantify creatinine and metformin with HPLC-UV and sitagliptin with LC-MS/MS. Both chromatographic methods were subjected to a full validation following the current FDA and EMA guidelines. The lower limits of quantification (LLOQ) were 0.2 µg/mL for metformin, 1.5 µg/mL for creatinine and 3 ng/mL for sitagliptin. Since reference intervals for drug concentrations are typically reported for plasma/serum, in-vitro experiments were performed to investigate the distribution of the drugs between plasma (cP) and blood cells (cBC). For metformin the mean ratio of plasma to blood cell concentration cP/cBC was 4.65 ± 0.73, for sitagliptin 5.58 ± 0.98. Thus, both drugs were present at more than four times higher concentrations in plasma compared to blood cells. The erythrocytes had been identified as deep compartment of metformin before, but for sitagliptin these were the first data showing a drug distributing into blood cells. In collaboration with a physician specialized in diabetology a first clinical study (basic study) was performed to estimate the kidney function using DBS. In blood spots of 70 patients metformin, creatinine and sitagliptin were quantified. For the first time a correlation factor (F = ccapillary blood/cplasma = 0.916 ± 0.088) was determined and verified to translate capillary blood concentrations of creatinine into plasma concentrations. Thereby, the Cockcroft-Gault equation could be used to estimate the kidney function. In capillary blood samples of patients participating in the basic study the concentration of sitagliptin statistically significantly correlated with increasing hematocrit values (Pearson R = 0.396; p < 0,05). In-vitro experiments revealed a strong inter-individual variability of sitagliptin distribution between blood cells and plasma and also a distribution depending on the hematocrit (hct). With a higher hematocrit a bigger amount of the drug resided within the cells compared to blood with a lower hematocrit. In in-vitro dialysis experiments an increasing elimination time from venous blood was demonstrated with rising hct. Based on these results blood cells were identified as deep compartment for sitagliptin. A second clinical study (field study) was performed in cooperation with 14 community pharmacies to determine representative capillary blood concentrations under real-life conditions. In DBS of 84 patients metformin and/or sitagliptin and creatinine were quantified. In the cohort of both studies (n = 134) mean concentrations of 2.22 ± 1.16 µg/mL for metformin and 432.20 ± 268.79 ng/mL for sitagliptin were detected. Population pharmacokinetic methods were applied to calculate elimination half-lives (t1/2) from capillary blood for patients with creatinine clearances higher and lower than 60 mL/min. As expected, t1/2 were shorter in patients with a better renal function, both for metformin (11.9 h vs. 18.5 h) and for sitagliptin (8.4 h vs. 13. 0 h). For the first time an increasing elimination time with decreasing renal function was demonstrated for sitagliptin. The collected data provided the opportunity to examine the influence of drugs with known unfavorable impact on kidney function. The effect of the combined therapy with diuretics, NSAIDs, ACE-inhibitors and angiotensin receptor antagonists (“target drugs”) on the renal function has been termed “triple whammy”. Indeed, in the present study both the number of the target drugs as well as the dose of the diuretics correlated with a decreasing creatinine clearance. With the herein presented work new insights into the pharmacokinetics of sitagliptin were gained. Additionally, a basis was created to use a single dried-blood-spot for appraisal of the blood levels of metformin and sitagliptin in relation to the kidney function. This method might facilitate an easier and more pleasant future therapeutic drug monitoring of the compounds due to minimal invasive blood collection. KW - Pharmakotherapie KW - Diabetes mellitus KW - Metformin KW - Sitagliptin KW - Trockenblutanalytik KW - Kreatinin KW - Orale Antidiabetika KW - Nierenfunktion KW - Blutspiegel KW - Instrumentelle Analytik KW - Pharmakokinetik Y1 - 2017 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-146930 ER - TY - THES A1 - Diwischek, Florian T1 - Development of synthesis pathways and characterization of cerulenin analogues as inhibitors of the fatty acid biosynthesis of Mycobacterium tuberculosis and of efflux pump resistant Candida albicans T1 - Entwicklung von Synthesewegen und Charakterisierung von Ceruleninanaloga als Inhibitoren der Fettsäuresynthese von Mycobacterium tuberculosis und Effluxpumpen-resistentem Candida albicans N2 - The work deals with the synthesis and characterization of cerulenin analogues as inhibitors of efflux pump mediated resistance of Candida albicans isolates and as inhibitors of the fatty acid synthesis enzyme KasA of Mycobacterium tuberculosis. Cerulenin was chosen as the lead structure, being a substrate of the efflux pumps in Candida albicans on one hand and therefore variations on the structure could lead to a blocking of the efflux pumps as in the case of tetracycline and inhibitor 13-CPTC of the TetB efflux pump. On the other hand, cerulenin is a known inhibitor of the FAS system but inhibition is unselective in type I and II FAS. Therefore, analogues could result in increased selectivity towards the type II FAS system in M. tuberculosis. The first cerulenin derivatives were prepared by coupling 2,3-dihydrofuran to the before synthesized 1-octaniodide, followed by ring opening and oxidation in one step by chromic acid and transfer of the resulting 4-keto acid to amides to give analogues 4a-d, 4e was prepared in analogy. To include the epoxide function especially with regard to the mechanism of action of cerulenin in the FAS system (considering known crystal structures of cerulenin and the KasA analogue of E. coli) tetrahydro- and dihydrocerulenin analogues were synthesized. Starting from the corresponding aldehyde, lactone 5 (tetrahydrocerulenin analogues) was obtained via two different routes A and B. Route A included the coupling of the aldehyde 1-nonanal to propiolic acid via a Grignard reaction with subsequent hydrogenation with the Lindlar catalyst under hydrogen pressure to give 5. Via Route B 1-nonanal was coupled to methyl propiolate by n-BuLi with subsequent hydrogenation under reflux with the catalytic system Lindlar cat./NH4HCO2 to yield 5. These hydrogenations were also executed in a microwave oven resulting in better yields and/or reaction times. The lactone 5 was then epoxidized, the ring opened by amidation and the remaining alcohol was oxidized via Collins oxidation to result in tetrahydrocerulenin analogues 8a-e. The same procedure was used for dihydrocerulenin analogues 10a-c except that to obtain the corresponding lactone 9a only route A was used and a further step had to be executed for ring closure. To obtain analogues with all structural features of cerulenin including two double bonds and the epoxide function, a third pathway was chosen. To obtain the future side chain, aldehyde 12 was synthesized by coupling protected 4-pentyn-1-ol to either crotyl bromide or crotyl chloride, which then was deprotected, hydrogenated with Lindlar catalyst under hydrogen pressure and oxidized via a Swern oxidation. The following synthesis sequence starting from 12 was executed similar to that of dihydrocerulenins via the corresponding lactone (51) with the major exception of the oxidation procedure in the last step via TPAP/NMO to result in (4Z,7E)-cerulenin analogues 15a-b. A fourth class of cerulenin analogues was synthesized with the aromatic analogues 17a-e. This synthesis pathway started with the formation of the benzoyl acrylamides 16a-e from benzoylacrylic acid via a mixed anhydride which was prepared with isobutylchloroformate followed by the addition of the corresponding amine. Subsequent epoxidation with H2O2 in basic EtOH gave the aromatic cerulenin analogues 17a-e. Pharmacological testings for the synthesized substances were executed on efflux pump-resistant and -sensitive Candida albicans isolates, on the fatty acid synthesis enzyme KasA of Mycobacterium tuberculosis and on other organisms such as Leishmania major, Trypanosoma brucei brucei, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Escherichia coli and Pseudomonas aeruginosa within the Sonderforschungsbereich 630. N2 - Die Arbeit befasst sich mit der Synthese und Charakterisierung von Ceruleninanaloga als Inhibitoren effluxpumpenresistenter Candida-albicans-Isolate und als Inhibitoren des Fettsäuresyntheseenzyms KasA von Mycobacterium tuberculosis. Der Naturstoff Cerulenin wurde als Leitstruktur gewählt, da er einerseits ein Substrat der bekannten Effluxpumpen von Candida albicans ist und deshalb Strukturvariationen zu einer Blockierung der Effluxpumpen, wie im Fall von Tetrazyklin und dem Inhibitor 13-CPTC der TetB Effluxpumpe, führen können. Andererseits ist Cerulenin ein bekannter Inhibitor der Fettsäuresynthese, allerdings unselektiv für Typ I und II. Ceruleninanaloga als Fettsäureinhibitoren könnten daher eine erhöhte Selektivität bezüglich des Typ II Fettsäuresystems in M. tuberculosis aufweisen. Die in dieser Arbeit zuerst synthetisierten Ceruleninderivate wurden durch Kupplung von 2,3-Dihydrofuran und dem zuvor dargestellten 1-Octaniodid gefolgt von Ringöffnung und Oxidation mittels Chromsäure zur 4-Ketosäure, und Umsetzung zum entsprechenden Amid und somit den Ceruleninanaloga 4a-d hergestellt. Substanz 4e wurde entsprechend synthetisiert. Um die Epoxidfunktion der Leitstruktur zu integrieren, die besonders hinsichtlich des Wirkmechanismus von Cerulenin im FAS-System wichtig zu sein scheint (wenn man die bekannten Kristallstrukturen von Cerulenin und dem KasA-Analogon in E. coli berücksichtigt), wurden Tetrahydro- und Dihydroceruleninanaloga synthetisiert. Ausgehend von dem entsprechendem Aldehyd wurde (im Fall der Tetrahydrocerulenine) Lacton 5 auf zwei verschiedene Arten dargestellt: mittels Route A und B. Route A beinhaltete die Kupplung des Aldehyds 1-Nonanal mit Propiolsäure durch eine entsprechende Grignardreaktion mit anschließender Hydrierung über Lindlar-Katalysator unter Wasserstoffdruck. Bei Route B wurden 1-Nonanal und Methylpropiolat mittels n-BuLi gekuppelt und anschließend hydriert durch Refluxieren mit Lindlar-Katalysator und NH4HCO2. Die Hydrierungen von Route A und B wurden auch in der Mikrowelle durchgeführt, wodurch bessere Ausbeuten und/oder Reaktionszeiten erzielt werden konnten. Das so dargestellte Lacton 5 wurde dann epoxidiert, der Lactonring durch den Angriff eines Amins geöffnet und der so entstandene Alkohol mittels Collins Oxidierung zu den Tetrahydroceruleninanaloga 8a-e oxidiert. Dihydroceruleninanaloga 10a-c wurden auf analogem Syntheseweg hergestellt mit dem Unterschied, dass die entsprechende Lactonzwischenstufe 9a nur durch Route A synthetisiert und ein weiterer Zwischenschritt zum Ringschluss benötigt wurde. Um Ceruleninanaloga mit allen strukturellen Komponenten des Cerulenins inklusive zweier Doppelbindungen und Epoxidfunktion zu erhalten, wurde ein dritter Syntheseweg gewählt. Zur Integration der späteren Seitenkette wurde zuerst Aldehyd 12 durch Kupplung von geschütztem 4-Pentyn-1-ol mit entweder Crotylbromid oder Crotylchlorid, anschließendem Entschützen und Hydrierung über Lindlar-Katalysator und unter Wasserstoffdruck und nachfolgender Swern Oxidation synthetisiert. Die anschließende Synthesesequenz startete von Substanz 12 und wurde in Anlehnung der Synthese an die Dihydroceruleninderivate über Lacton 51 durchgeführt. Die größte Abweichung stellte dabei die Oxidation im letzten Schritt dar, die mittels TPAP/NMO durchgeführt wurde und in den (4Z,7E)-Ceruleninanaloga 15a-b resultierte. Eine vierte Klasse von Ceruleninanaloga wurde mit den aromatischen Derivaten 17a-e synthetisiert. Diese Route startete mit der Synthese der Benzoylacrylamide 16a-e aus Benzoylacrylsäure über das gemischte Anhydrid, das mit Isobutylchloroformiat hergestellt wurde, gefolgt von der Zugabe des entsprechenden Amins. Die nachfolgende Epoxidierung mit H2O2 in basischem EtOH ergab die aromatischen Ceruleninanaloga 17a-e. Pharmakologische Testungen der synthetisierten Substanzen wurden an Efflux-pumpen-resistenten und -sensitiven Candida albicans Isolaten, am Fettsäuresyntheseenzym KasA von Mycobacterium tuberculosis und an anderen Mikroorganismen wie Leishmania major, Trypanosoma brucei brucei, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Escherichia coli und Pseudomonas aeruginosa im Sonderforschungsbereich 630 durchgeführt. KW - Organische Synthese KW - Candida albicans KW - Tuberkelbakterium KW - Instrumentelle Analytik KW - Naturstoff KW - Cerulenin KW - KasA KW - Effluxpumpen KW - Fettsäurebiosynthese KW - fatty acid biosynthesis KW - efflux pumps KW - kasA KW - cerulenin KW - tuberculosis KW - Candida albicans Y1 - 2008 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-27532 ER - TY - THES A1 - Weckerle, Bernhard T1 - Instrumentell-analytische Techniken zur Charakterisierung von Naturstoffen aus Rucola (Eruca sativa Mill.) und Rohkaffee (Coffea arabica) T1 - Instrumental-analytical tools to characterize natural constituents from rocket salad (Eruca sativa Mill.) and green coffee (Coffea arabica) N2 - Unsere Lebensmittel haben eine zweifache, auch vom Gesetz vorgegebene Zweckbestimmung, d.h. sie dienen einerseits dem Genuss und andererseits der Ernährung. Aktuelle For-schungsstrategien in der Lebensmittelchemie auf diesen Gebieten lassen sich dahingehend zusammenfassen, dass im ersten Bereich die Suche nach wirksamen Aromastoffen und deren Vorläufern sowie auch zunehmend Probleme der Herkunftsanalytik im Vordergrund stehen. Auf dem Gebiet der Ernährung spiegeln die Schlagworte „Funktionalität“ und „Bioaktivität“ die derzeitigen Entwicklungen wider. Für alle Bereiche bilden instrumentell-analytische Techniken die Grundlage für Bewertungen. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit haben wir daher das uns zur Verfügung stehende analytische Potential genutzt, in den oben genannten Gebieten einschlägige Beiträge zu leisten, d.h. die Suche nach wertgebenden Aromastoffen fortzuführen, Zuckerkonjugate zu untersuchen, die sowohl als Aromavorläufer als auch im Hinblick auf Bioaktivitätsstudien von Bedeutung sein können, und schließlich Methoden zur Herkunftsanalytik zu forcieren. Zu diesen Studien sind als attraktive und wirtschaftlich be-deutsame Rohwaren Rucola (Eruca sativa Mill.) und Kaffee (Coffea arabica) eingesetzt worden. Mit Hilfe der Kopplung aus S-selektiver Detektion und strukturselektiver massen-spektro-metrischer Analytik sind in Extrakten von Rucolablättern 22 schwefelhaltige Verbindungen strukturell charakterisiert worden. Darunter befanden sich neben Minorkomponenten wie 3-Sulfanyl-1-hexanol, Glucosinolatabbauprodukte wie 4-Methylthiobutylnitril, 4-Methylthiobutylthiocyanat und 4-Methylthiobutylisothiocyanat. Mit [1,3]-Thiazepan-2-thion ist eine bislang nicht bekannte Komponente erstmals beschrieben wor-den. Das Vorkommen von 3-Sulfanyl-1-hexanol, welches im Übrigen anhand von MDGC-MS-Analytik in nahezu racemischer Form (44:56 Prozent, R:S) in Rucola gefunden wurde, forderte dazu heraus, in einer Modellstudie eine allgemeine Methode zur Bestimmung der Absolutkonfiguration azyklischer 2- und 3-Sulfanyl-1-alkanole mittels der ECCD-Methode zu entwickeln. Dabei wurden in einer Ein-Schritt-Synthese die funktionellen Grup-pen der 2- und 3-Sulfanyl-1-alkanole (in der Studie handelte es sich um enantiomerenreine 2- und 3-Sulfanyl-1-hexanole) jeweils mit dem Chromophor 9-Anthroylflourid derivatisiert. Die ent-sprechenden CD-Splitkurven erlaubten eine eindeutige Zuordnung der Konfiguration. Die entwickelte Mikro-Maßstab-Methode wurde ebenfalls er-folgreich zur Bestimmung der Absolutkonfiguration von in der Studie als zusätzliche Modellverbindungen eingesetzten 1,2- und 1,3-Diolen angewendet. 3-Sulfanyl-1-hexanol wurde abschließend in einer Zwei-Schritt-Synthese mit 9- und 2-Anthroylflourid derivatisiert, auch diese Variation erlaubte eine eindeutige Zuordnung der Absolutkonfiguration. Mittels präparativer HPLC-Techniken wurden drei neue Flavonoidglykoside aus Rucolablättern isoliert. Deren Charakterisierung erfolgte mittels Tandemmassenspektrometrie sowie ein- und zweidimensionalen NMR-Messungen. Die Verbindungen sind als Quercetin-3,3’,4’-tri-O-beta-D-glucopyranosid, Quercetin-3’-(6-sinapoyl-O-beta-D-gluco-py-ra-nosyl)-3,4’-di-O-beta-D-gluco-pyranosid und Quercetin-3-(2-sinapoyl-O-beta-D-gluco-pyranosyl)-3’-(6-sina-poyl-O-beta-D-glucopyranosyl)-4’-O-beta-D-gluco-py-rano-sid identifiziert worden. Diese Quercetin-Derivate zeigten sowohl hinsichtlich der Glucosilierung des Aglykons (an den Positionen 3, 3’ und 4’) als auch bezüglich der Acylierung ungewöhnliche Strukturen. Bei Rohkaffee hat man bislang keine Studien über das Vorkommen von Zuckerkonjugaten als Aromastoffvorläufer durchgeführt. Wir konnten diese Lücke anhand der Strukturaufklärung der nachfolgend aufgeführten Verbindungen schließen. Durch Kombination verschiedener präparativer Techniken (CCC, LC und HPLC) mit verschiedenen Methoden der Strukturaufklärung (HRGC-MS, HPLC-MS/MS, ein- und zweidimensionale NMR) sind aus Rohkaffee fünf Aromastoffprekursoren isoliert und identifiziert worden. Für die beiden aus Rohkaffee isolierten Linalyldisaccharide wurden als Strukturen 3(S)-Linalyl-3-O-beta-D-glucopyranosyl-(1-6)-alpha-L-arabinofuranosid (AK1) und 3(S)-Linalyl-3-O-beta-D-gluco-pyranosyl-(1-6)-beta-D-apiofuranosid ermittelt. Weiterhin sind erstmals drei neue Aromastoffprekursoren in Form von Zuckerestern, d.h. (3-Methylbutanoyl)-1-O-beta-D-glucopyranosyl-beta-D-apiofuranosid, (3-Methylbuta-noyl)-6-O-alpha-D-gluco-pyranosyl-(1-2)-beta-D-fructofuranosid und (3-Methyl-2-butenoyl)-O-beta-D-gluco-pyranosyl-beta-D-apio-furanosid in Rohkaffee charakterisiert worden. Die Kenntnis der Herkunft bestimmter Lebensmittel bzw. einzelner In-haltstoffe spielt für die Lebensmittelindustrie eine wichtige Rolle. Für die Zuordnung der geographischen Herkunft von Rohkaffee wurden in dieser Arbeit die 13C/12C-, 2H-/1H- und 18O/16O-Verhältnisse von extrahiertem Coffein mittels Elementaranalysator-Isotopen-massen-spektro-metrie (EA-IRMS) bestimmt. Zur Bewertung der Multielement-Messwerte wurden diese statistischen Berechnungen unterzogen. Zur Anwendung kamen die Lineare Diskrimi-nanzanalyse (LDA) und die Auswertung mittels sog. „Classification and Regression Trees“ (CART). In der Anpassung wurde dabei eine Probe aus der Klasse 1 (Provenienz Afrika) der Klasse 2 (Provenienz Amerika) zugeordnet und eine Probe der Klasse 2 der Klasse 1 zugeordnet (Fehlerrate von 5,1 Prozent). Bei Kreuzvalidierung wurden drei der 39 Proben falsch zugeordnet (jeweils zwei der Klasse 1 und eine der Klasse 2), die Fehlerrate betrug hier somit 7,7 Prozent. Die Proben der Klasse 3 (synthetisches Coffein) ließen sich zu 100 Prozent von denjenigen natürlichen Ursprungs unterscheiden. N2 - Our foods exhibit two functions defined by legislation, too, i.e. to provide pleasure and nutri-tive effects. Current research strategies in food chemistry in these areas can be summarized as follows, i.e. that in the first-mentioned area the search for effective aroma substances and their precursors as well as, increasingly, also problems of authenticity assessments predominate. In the area of nutrition, the highlights “functionality” and “bioactivity” reflect the actual research trends. In all areas instrumental-analytical techniques form the fundament of evaluations. Thus, we used our analytical potential to provide new informations in the above-mentioned areas, i.e. to continue the search for valuable aroma compounds, to study sugar conjugates being important as flavour precursors and for bioactivity studies, as well as, finally, to strengthen methods for authenticity assessment. For these studies rocket salad (Eruca sativa Mill.) and green coffee (Arabica coffea), both known as attractive industrially important raw materials, were used. In flavour extracts of rocket salad leaves we characterized 22 sulphur-containing constituents by means of HRGC-MS/SCD analysis. This analytical tool allows parallel detection of com-pounds eluting from the GC column by mass spectrometry (to get structural information) and by chemiluminescence (to get selectively signals of sulphur-containing substances). Among the identified constituents we detected minor compounds such as 3-sulfanyl-1-hexanol, by-products of myrosinase hydrolysis such as 4-methylthiobutyl nitrile, 4-methylthio-butyl thiocyanate and 4-methylthiobutyl isothiocyanate as well as [1,3]-thiazepan-2-thion, the latter described for the first time. By means of multidimensional GC-MS (MDGC-MS) the enantiomeric ratio of 3-sulfanyl hexanol was determined as 44 per cent (R) to 56 per cent (S). In addition, a method for the determination of the absolute configuration of chiral 2- and 3-sulfanyl-1-alkanols (and 1,2 diols and 1,3 diols as model compounds) was developed. We demonstrated for the first time that the CD exciton chirality method can be extended to acyclic 2- and 3-sulfanyl-1-alkanols. The simple one-step derivatization using the 9-anthroate chromophore provided a general microscale method for the determination of the absolute configuration. Exciton coupling between the two 9-anthroate chromophores led to intense positive split CD curves for the (R)-configured 2-sulfanyl-1-alkanols and the (S)-configured 3-sulfanyl-1-alkanols as well as vice versa. The developed method was also useful for the stereochemical assignment of 1,2- and 1,3-diols. Furthermore, the application of the two step-derivatization using two different chromophores for both functional groups (2- and 9-anthroate) also resulted in mirror image split CD curves for both enantiomers, allowing the stereochemical assignment of 3-sulfanyl-1-alkanols. Three novel flavonoid glycosides were isolated of leaves of rocket salad by means of preparative techniques. Structural elucidation was performed using LC-MS/MS as well as one and two dimensional NMR experiments. The compounds were identified as quercetin 3’,4’-tri-O-beta-D-gluco-py-ra-no-side, quercetin 3’-(6-sinapoyl-O-beta-D-gluco-pyra-no-syl)-3,4’-di-O-beta-D-gluco-py-ra-no-side and quercetin 3-(2-sinapoyl-O-beta-D-glucopyranosyl)-3’-(6-sinapoyl-O-beta-D-gluco-pyra-no-syl)-4’-O-beta-D-gluco-py-rano-side. These quercetin derivatives exhibited unusual structures as to the glucosylation of the aglycones (at positions 3, 3’ and 4’) and the type of acylation. Studies of bound flavour precursors in green coffee beans (Coffea arabica) have not been carried out to date. We were able to fill out this gap by means of structural analysis of the following compounds. By combination of different preparative analytical steps (CCC, LC and HPLC) with several analytical methods of structural elucidation (HRGC-MS, HPLC-MS/MS, one and two dimensional NMR experiments) five flavour precursors were isolated and identi-fied in green coffee beans. The two isolated linalool disaccharides were identified as 3(S)-linalyl-3-O-beta-D-gluco-py-ra-nosyl-(1-6)-alpha-L-arabinofuranoside and 3(S)-linalyl-3-O-beta-D-gluco-pyra-no-syl-(1-6)-beta-D-apiofuranoside. In addition, three novel flavour precursors were identified as sugar esters, i.e. (3-methyl-butanoyl)-1-O-beta-D-glucopyranosyl-beta-D-apiofuranoside, (3-methylbutanoyl)-6-O-alpha-D-gluco-pyranosyl-(1-2)-beta-D-fructo-furano-side and (3-Methyl-2-buteno-yl)-O-beta-D-gluco-pyranosyl-beta-D-apio-furanoside. The knowledge of the origin of food and its ingredients is actually one of the major topics for the food industry. For the assignment of the geographic origin of green coffee we determined the ratios of 13C/12C, 2H/1H and 18O/16O of extracted caffeine by means of elemental analysator/isotopic mass spectrometry (EA-IRMS). To check the suitability of the analytical data obtained by EA-IRMS we used statistical calculations, i.e. (i) linear discrimination analysis (LDA) and (ii) validation via classification and regression trees (CART). In the course of adap-tion one sample of class 1 (origin Africa) was assigned to class 2 (origin middle and south America) and vice versa, resulting in an error rate of 5.1 per cent. Using cross validation three of the 39 analyzed samples were assigned incorrectly resulting in an error rate of 7.7 per cent. Samples of class 3 (synthetic caffeine) were discriminated from that of natural origin at a rate of 100 per cent. KW - Gartenrauke KW - Aromastoff KW - Flavonglykoside KW - Schwefelorganische Verbindungen KW - Lebensmittelanalyse KW - Instrumentelle Analytik KW - Rohkaffee KW - Arabischer Kaffee KW - Aromastoff KW - Herkunft KW - Coffein KW - Rucola KW - Eruca sativa Mill. KW - GC-MS-SCD KW - schwefelhaltige Aromastoffe KW - Acylierte Quercetin-Tri-Glukoside KW - Grüner Kaffee KW - Coffea arabica KW - rocket salad KW - Eruca sativa Mill. KW - GC-MS-SCD KW - sulfur containing flavour compounds KW - acylated quercetin-tri-glucosides KW - green coffee beans Y1 - 2001 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-1180944 ER -