TY  - THES
A1  - Kastner, Carolin
T1  - LASP1 – ein neuer, phosphorylierungs-abhängiger Bindungspartner von CrkL in CML
T1  - LASP1 – a new, phosphorylation-dependent binding partner of CrkL in CML
N2  - Das Verständnis der molekularen Mechanismen, die einer malignen Erkrankung zugrunde liegen, ist der Schlüssel zur Entwicklung zielgerichteter und effektiver therapeutischer Möglichkeiten. Für das LIM und SH3 Domänen Protein 1, LASP1, konnte im Kontext zahl-reicher Tumorerkrankungen wie dem Mamma-Karzinom, dem Prostata-Karzinom oder dem Ovarial-Karzinom eine Überexpression ebenso wie eine Korrelation mit Aggressivität und Prognose der Tumorerkrankung gezeigt werden. Bisher war eine Relevanz von LASP1 jedoch nur für solide Tumorerkrankungen nachgewiesen worden. Kürzlich allerdings wurde lasp1 als eines von 6 Genen identifiziert, die eine exaktere Vorhersage von Krankheitsprogress und -rezidiv bei Patienten mit einer chronischen myeloischen Leukämie (CML) zulassen sollen. Zudem konnte, wie bereits bei zahlreichen anderen, soliden Tumorerkrankungen, eine signifikante Überexpression des lasp1-Gens in CML-Zellen nachgewiesen werden.Basierend auf diesen neuen Erkenntnissen beschäftigte ich mich im Rahmen dieser Arbeit mit der Frage, welche Funktion LASP1 im Netz der einer CML zugrunde liegenden, molekularen Mechanismen übernimmt. Mittels verschiedener Interaktionsassays konnte LASP1 als ein neuer, phosphorylierungs-abhängiger Bindungspartner von CrkL, dem wohl prominentesten Substrat der BCR-ABL-Kinase, identifiziert werden. Dabei impliziert das Attribut „phosphorylierungs-abhängig“ sowohl den Phosphorylierungsstatus von LASP1 als auch des Interaktionspartners CrkL. Wie in Vorarbeiten gezeigt, stellt das Tyrosin 171 in der Aminosäurensequenz von LASP1 eine Phosphorylierungsstelle für die BCR-ABL-Kinase dar; mit LASP1 wurde somit auch ein neues Substrat dieser konstitutiv aktiven Tyrosinkinase entdeckt. Phosphoryliert an Tyrosin 171 kann LASP1 an die SH2-Domäne von CrkL, genauer an das FLVR-Motif innerhalb dieser, binden. Jedoch selbst an Tyrosin 207 durch die BCR-ABL-Kinase phosphoryliert, blockiert CrkL die eigene SH2-Domäne durch intramolekulare Wechselwirkungen für andere Protein-Protein-Interaktionen in gewissem Umfang. Diese neu gewonnenen Erkenntnisse liefern ein weiteres Puzzlestück zum Verständnis des molekularen Netzwerks, das einer CML-Erkrankung zugrunde liegt und tragen so dazu bei, die Therapieoptionen dieser stetig zu verbessern.
N2  - Understanding the molecular mechanisms underlying a malignant disease makes it possible to develop targeted and effective therapeutic options. For numerous malignant disease such as breast cancer, prostata cancer or ovarial cancer it has been shown that the LIM and SH3 domain protein 1, LASP1, is overexpresssed and that there is a correlation with regard to aggressive growth and outcome of the tumour. So far relevance of LASP1 has only been proven for solid tumours. However recently lasp1 was identified as a component of six genes that may allow to predict more reliably disease´s progress and relapse in CML patients. In addition to that a significant overexpression of lasp1 in CML cells has been discov-ered, a phenomenon already known from a lot of solid malignant tumours. Based on these new findings, i dealt with the issue of the function of LASP1 in the network of molecular mechanisms underlying CML. Using different kinds of interaction assays, LASP1 was identified as a new, phosphorylation-dependent ligand of CrkL, the most prominent substrate of the BCR-ABL-kinase. In this case the attribute "phosphorylation-dependent“ refers to the phosphorylation status of LASP1 as well as of its binding-partner CrkL. As shown in preliminary studies, tyrosine 171 is a phosphorylation site for BCR-ABL-kinase within the AS sequence of LASP1; therefore, with LASP1, a new substrate of this constitutive active tyrosine kinase has been discovered. When phosphorylated on tyrosine 171, LASP1 is able to bind to the SH2-domain of CrkL, more exactly to the FLVR-motive within this domain. But when CrkL is phos-phorylated on tyrosine 207 by BCR-ABL-kinase, there are intramolecular interactions that block the SH2-domain of CrkL for other protein-protein-interactions. These new findings help to understand the molecular network under-lying a CML disease and may contribute to continuous improvement of therapeutic options.
KW  - Chronisch-myeloische Leukämie
KW  - Proteinsynthese
KW  - Domäne <Biochemie>
KW  - Proteininteraktion
Y1  - 2019
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-187539
ER  - 
TY  - THES
A1  - Offner, Kristin
T1  - SH3-mediated protein interactions of Mena and VASP
T1  - SH3 vermittelte Proteininteraktionen von Mena und VASP
N2  - Regulation of actin cytoskeletal turnover is necessary to coordinate cell movement and cell adhesion. Proteins of the Enabled/vasodilator-stimulated phosphoprotein (Ena/VASP) family are important mediators in cytoskeleton control, linking cyclic nucleotide signaling pathways to actin assembly. In mammals, the Ena/VASP family consists of mammalian Enabled (Mena), VASP, and Ena-VASP-like (EVL). The family members share a tripartite domain organization, consisting of an N-terminal Ena/VASP homology 1 (EVH1) domain, a central proline-rich region (PRR), and a C-terminal EVH2 domain. The EVH1 domain mediates binding to the focal adhesion proteins vinculin and zyxin, the PRR interacts with the actin-binding protein profilin and with Src homology 3 (SH3) domains, and the EVH2 domain mediates tetramerization and actin binding.
Endothelial cells line vessel walls and form a semipermeable barrier between blood and the underlying tissue. Endothelial barrier function depends on the integrity of cell-cell junctions and defective sealing of cell-cell contacts results in vascular leakage and edema formation. In a previous study, we could identify a novel interaction of the PRR of VASP with αII-spectrin. VASP-targeting to endothelial cell-cell contacts by interaction with the αII-spectrin SH3 domain is sufficient to initiate perijunctional actin filament assembly, which in turn stabilizes cell-cell contacts and decreases endothelial permeability. Conversely, barrier function of VASP-deficient endothelial cells and microvessels of VASP- null mice is defective, demonstrating that αII-spectrin/VASP complexes regulate endothelial barrier function in vivo.
The aim of the present study was to characterize the structural aspects of the binding of Ena/VASP proteins to αII-spectrin in more detail. These data are highly relevant to understand the cardiovascular function of VASP and its subcellular targeting. In the present study, the following points were experimentally addressed:
 1. Comparison of the interaction between αII-spectrin and Mena, VASP, or EVL
In contrast to the highly conserved EVH1/EVH2 domains, the PRR is the most divergent part within the Ena/VASP proteins and may differ in binding modes and mechanisms of regulation. More specifically, VASP contains a triple GP5 motif, whereas EVL and Mena contain one or more GP6 motifs or even longer proline stretches. In the present study, we used peptide scans and competitive αII-spectrin SH3 pull-down assays with the recombinant Mena, VASP, and VASP mutants to investigate the relative binding efficiency. Our results indicate that binding of the αII-spectrin SH3 domain to GP6 motifs is superior to GP5 motifs, giving a rationale for a stronger interaction of αII-spectrin with EVL and Mena than with VASP.
2. Interaction of SH3i with Ena/VASP proteins
In the mammalian heart, an αII-spectrin splice variant exists (SH3i), which contains a 20 amino acid insertion C-terminal to the SH3 domain. We used GST-fusion proteins of αII-spectrin, comprising the SH3 domain with or without the alternatively spliced amino acids, to pull-down recombinant Mena, VASP or VASP mutants. The results demonstrate a substantially increased binding of the C-terminal extended SH3 domain as compared to the general αII-spectrin isoform without the 20 amino acid insertion. These findings were also confirmed in pull-down experiments with heart lysates and purified Mena from heart muscle. The increased binding was not due to an alternative, SH3-independent binding interface because a pointmutation of the SH3 domain (W1004R) in the alternatively spliced αII-spectrin isoform completely abrogated the interaction. To analyze the interaction of SH3i and Ena/VASP proteins in living cells, we expressed the extended SH3 domain as GFP fusion proteins in endothelial cells. Here, we observed an extensive co-localization with Mena and VASP at the leading edge of lamellipodia confirming the in vivo relevance of the interaction with potential impact on cell migration and angiogenesis.
3. Binding affinity and influence of the Ena/VASP tetramerization domain
We also determined the binding affinity of the general and the alternatively spliced αII-spectrin SH3 with Ena/VASP proteins by isothermal titration calorimetry (ITC) using a peptide from the PRR of Mena (collaboration with Dr. Stephan Feller, University of Oxford). Surprisingly, the binding affinity of the general SH3 domain was low (~900 μM) as compared to other SH3 domain- mediated interactions, which commonly display binding constants in the low micromolar range. Furthermore and in contrast to the pull-down assays, we could not detect an increased binding affinity of the C-terminally extended SH3 domain. This could be either explained by the existence of a third protein, which “bridges” the Mena/αII-spectrin complex in the pull-down assays, or, more likely, by the small size of the Mena peptide, which lacks major parts of the Mena protein, including the tetramerization domain. Indeed, it has been previously shown that the tetramerization of Ena is crucial for the interaction with the Abl- SH3 domain, although no SH3 binding sites are found in the tetramerization domain. To address this point experimentally, we used a VASP mutant that lacks the tetramerization domain in pull-down assays. Neither the general nor the alternatively spliced SH3 domain bound to the monomeric VASP, demonstrating the crucial (indirect) impact of Ena/VASP tetramerization on the interaction with αII-spectrin.
In summary, we conclude that the αII-spectrin SH3 domain binds to the proline- rich region of all Ena/VASP proteins. However, binding to EVL and Mena, which both possess one or more GP6 motifs, is substantially more efficient than VASP, which only contains GP5 motifs. The C-terminally extended SH3 domain, which is present in the αII-spectrin splice variant SH3i, binds stronger to the Ena/VASP proteins than the general isoform and expression of the isolated domain is sufficient for co-localization with Ena/VASP in living endothelial cells. Finally, the tetramerization of the Ena/VASP proteins is indispensable for the interaction with either isoform of αII-spectrin.
N2  - Die Regulation des Umbaus des Aktinzytoskeletts ist für die Fortbewegung sowie die Adhäsion von Zellen essentiell. Proteine der Enabled/vasodilator- stimulated phosphoprotein (Ena/VASP) Familie sind wichtige Mediatoren bei diesem Prozess, indem sie zyklische Nukleotidprotein-Signalwege mit dem Aktinzytoskelett-Aufbau verknüpfen. In Säugern besteht die Ena/VASP-Protein Familie aus mammalian Enabled (Mena), VASP und Ena-VASP-like (EVL). Diese Proteine teilen sich einen gemeinsamen strukturellen Aufbau: N-terminal befindet sich die Ena/VASP homology 1 (EVH1) Domäne, zentral liegt eine prolinreiche Region (PRR) und C-terminal befindet sich eine EVH2 Domäne. Die EVH1 Domäne vermittelt eine Interaktion mit den fokalen Adhäsionsproteinen Vinculin und Zyxin, die PRR interagiert mit dem aktinbindenden Protein Profilin sowie mit Src homology 3 (SH3) Domänen und die EVH2 Domäne vermittelt die Tetramerisierung der Proteine sowie die Interaktion mit Aktin.
Endothelzellen kleiden die Gefäßwand aus und bilden eine semipermeable Barriere zwischen Blut und dem umgebenden Gewebe. Die Funktion des Endothels hängt dabei von der Integrität der Zell-Zell-Kontakte ab. Die Zerstörung dieser Kontakte führt zu vaskulärer Leckage sowie zur Ausbildung von Ödemen. In einer vorausgehenden Arbeit konnten wir eine neue Interaktion zwischen der PRR von VASP und αII-Spektrin zeigen. Durch die Interaktion mit der SH3 Domäne von αII-Spektrin gelangt VASP an Zell-Zell-Kontakte von Endothelzellen und ist dort in der Lage die Aktinverknüpfung in der Umgebung der Zell-Zell-Kontakte zu initiieren, was wiederum die Zell-Zell-Kontakte stabilisiert und die vaskuläre Permeabilität reduziert. Umgekehrt konnten wir beobachten, dass die Barrierefunktion von Endothelzellen und Mikrogefäßen von VASP-defizienten Mäusen gestört ist, was darauf hindeutet, dass VASP/αII- Spektrin-Komplexe an der Regulation der endothelialen Barrierefunktion in vivo beteiligt sind.
Das Ziel dieser Arbeit war die detaillierte Charakterisierung der Strukturen von Ena/VASP Proteinen und αII-Spektrin, die an der Interaktion zwischen diesen Proteinen beteiligt sind. Diese Daten sind äußerst wichtig um die genaue Funktion von VASP im kardiovaskulären System zu verstehen. In dieser Arbeit wurden die folgenden Punkte genauer analysiert:
1. Vergleich der Interaktion zwischen αII-Spektrin und Mena, VASP oder EVL
Verglichen mit den hochkonservierten EVH1/2 Domänen besitzt die zentrale PRR der Ena/VASP Proteinfamilie die größte Diversität und könnte sich bezüglich der Binde- und Regulationsmechanismen zwischen den einzelnen Proteinen unterscheiden. Im Detail besitzt VASP ein sich dreifach wiederholendes GP5 Motiv wohingegen Mena und EVL ein sich ein- oder mehrfach wiederholendes GP6 Motiv oder noch längere Prolinsequenzen aufweisen. In dieser Arbeit nutzten wir peptide scan arrays und kompetitive αII- Spektrin SH3 pull-down Versuche mit rekombinantem Mena, VASP und VASP Mutanten um die relative Bindungsstärke der Interaktion zu untersuchen. Die Ergebnisse zeigten, dass die Bindung der αII-Spektrin SH3 Domäne an GP6 Motive der Bindung an GP5 Motive überlegen ist, was darauf hindeutet, dass die Interaktion zwischen αII-Spektrin und EVL und Mena stärker ist als die Interaktion mit VASP.
2. Interaktion von SH3i mit Ena/VASP Proteinen
Im Säugerherzen kommt eine αII-Spektrin Splicevariante (SH3i) vor, die eine Insertion aus 20 Aminosäuren C-terminal der SH3 Domäne enthält. Wir nutzten GST-αII-Spektrin Fusionsproteine, die die SH3 Domäne mit oder ohne Aminosäuren-Insertion beinhalteten, im pull-down Versuch mit rekombinantem Mena, VASP oder mit VASP Mutanten. Die Ergebnisse zeigten eine deutlich ansteigende Bindungsrate bei der C-terminal verlängerten SH3 Domäne verglichen zu der üblichen αII-Spektrin Isoform ohne Aminosäureninsertion. Diese Ergebnisse konnten auch durch pull-down Versuche mit Herzlysat und aufgereinigtem Mena aus Herzmuskulatur bestätigt werden. Dieser Effekt auf die Bindung war dabei nicht bedingt durch ein alternatives, SH3-unabhängiges Bindungsmuster, da eine Punktmutation (W1004R) in der Sequenz der SH3 Domäne der alternativ gespleißten αII-Spektrin Isoform die Interaktion komplett aufhob. Um die Interaktion von SH3i und Ena/VASP Proteinen in lebenden Zellen zu untersuchen, exprimierten wir die verlängerte SH3 Domäne als GFP- Fusionsprotein in Endothelzellen. Hierbei konnten wir eine ausgeprägte Kolokalisation mit Mena und VASP an Lamellipodien beobachten, was die Relevanz der Interaktion im lebenden Organismus bestätigt und auf einen potentiellen Effekt auf Zellmigration und Angiogenese schließen lässt.
3. Bindungsaffinität und Einfluss der Ena/VASP Tetramerisierungsdomäne
Zusätzlich wurde die Bindungsaffinität der üblichen sowie der alternativ gespleißten αII-Spektrin SH3 Domäne mit den Ena/VASP Proteinen mittels isothermal titration calorimetry (ITC) bestimmt, wobei ein Peptid bestehend aus der PRR von Mena genutzt wurde (Kollaboration mit Dr. Stephan Feller, Universität von Oxford). Überraschenderweise war die Bindungsaffinität der üblichen SH3 Domäne verglichen mit anderen SH3 Interaktionen, die normalerweise Bindungskonstanten im unteren mikromolaren Bereich aufweisen, niedrig (~900 μM). Außerdem und im Kontrast zu den Ergebnissen der pull-down Versuche konnten wir keine gesteigerte Bindungsaffinität der C- terminal verlängerten SH3 Domäne feststellen. Dies könnte entweder durch die Beteiligung eines dritten Proteins erklärt werden, das den Mena/αII-Spektrin- Komplex in den pull-down Versuchen überbrückt, oder aber, was wahrscheinlicher ist, durch die geringe Größe des Mena Peptids, dem wichtige Bestandteile des Mena Proteins inklusive der Tetramerisierungsdomäne fehlen. Tatsächlich wurde erst kürzlich gezeigt, dass die Tetramerisierung von Ena essentiell für eine Interaktion mit der Abl SH3 Domäne ist, obwohl keine SH3 Bindestellen in der Tetramerisierungsdomäne gefunden wurden. Um dieser Beobachtung nachzugehen, nutzten wir eine VASP Mutante in pull-down Versuchen, der die Tetramerisierungsdomäne fehlt. Weder die übliche noch die alternativ gespleißte SH3 Domäne interagierte mit dem monomeren VASP, was einen essentiellen (indirekten) Einfluss der Tetramerisierung von Ena/VASP Proteinen auf die Interaktion mit αII-Spektrin nahelegt.
Zusammengefasst können wir sagen, dass die αII-Spektrin SH3 Domäne an die prolinreiche Region aller Ena/VASP Proteine bindet. Jedoch ist festzuhalten, dass die Bindung an EVL und Mena, die beide ein oder mehrere GP6 Motive enthalten, deutlich effizienter ist als die Bindung an VASP, das ausschließlich GP5 Motive beinhaltet. Die C-terminal verlängerte SH3 Domäne, die in der alternativ gespleißten αII-Spektrin Variante SH3i vorkommt, bindet stärker an Ena/VASP Proteine als die übliche αII-Spektrin Isoform und bereits die Expression der isolierten Domäne alleine ist für eine Kolokalisation mit Ena/VASP Proteinen in lebenden Endothelzellen ausreichend. Letztlich konnten wir zeigen, dass die Tetramerisierung der Ena/VASP Proteine unentbehrlich für die Interaktion mit allen untersuchten αII-Spektrin Isoformen ist.
KW  - SH3
KW  - proteininteraction
KW  - Mena
KW  - VASP
KW  - Proteininteraktion
Y1  - 2017
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-154481
ER  - 
TY  - THES
A1  - Schaafhausen, Anne
T1  - Proteininteraktionen der Vitamin K Epoxid Reduktase Proteine VKORC1 und VKORC1L1
T1  - Protein interactions of the vitamin K epoxide reductase proteins VKORC1 and VKORC1L1
N2  - Seit der Entdeckung des ersten Gens für den Vitamin K Epoxid-Reduktase-Komplex (VKORC1), dem Schlüssel-Enzym für die Regenerierung von Vitamin K, sind keine zusätzlichen Komponenten des Komplexes beschrieben worden. Die einzige bekannte Funktion von VKORC1 ist bislang die Reduktion von Vitamin K-2,3-Epoxid, welches bei der post-translationalen Carboxylierung von Proteinen als oxidierter Kofaktor anfällt, und im sogenannten Vitamin K-Zyklus regeneriert wird. VKORC1 ist zugleich das Zielprotein antikoagulativer Medikamente der Coumarin-Gruppe, wie Warfarin oder Marcumar. Mutationen im VKORC1-Gen führen zu einem signifikanten Effekt auf die benötigte Coumarin-Dosis und die Stabilität der Hämostase in der Thrombosebehandlung mit Antikoagulanzien. Gleichzeitig mit VKORC1 wurde ein stark sequenz-homologes Protein identifiziert, das „VKORC1-like1“ (VKORC1L1) genannt wurde und dessen physiologische Funktion zu Beginn dieser Arbeit völlig unbekannt war. Die vorliegende Arbeit beschäftigte sich mit zwei Aspekten des Vitamin K-Stoffwechsels: A. Den enzym-kinetischen Eigenschaften und der subzellulären Lokalisation des VKORC1L1-Proteins sowie B. der Identifizierung und Charakterisierung von Proteinen, die Interaktionspartner der beiden VKOR-Proteine sein können. Die Ergebnisse können wie folgt zusammengefasst werden: A.1. Die enzym-kinetischen Untersuchungen zeigen starke Ähnlichkeiten zwischen VKORC1 und VKORC1L1: Beide Enzyme haben eine Vitamin K-Epoxidase- und -Reduktase-Aktivität, wobei die Affinitäten zu Vitamin K2-Epoxid deutlich höher sind als die zu Vitamin K1-Epoxid. Beide Enzyme sind durch Warfarin hemmbar und der Austausch der vermutlich am Elektronentransfer beteiligten Cysteine an homologen Positionen führt in beiden Proteinen zu einem fast vollständigen Verlust der Aktivität. A.2. Mittels Ko-Lokalisation konnte VKORC1L1 – wie VKORC1 – in der ER-Membran lokalisiert werden. Folglich schließen wir, dass VKORC1L1 eine ähnliche Struktur, die gleiche zelluläre Lokalisation und zumindest in vitro auch eine VKOR-Aktivität hat und daher eventuell eine weitere Komponente des VKOR-Komplexes darstellen könnte. Allerdings sprechen gewichtige Argumente dagegen, dass beide Proteine funktionell austauschbar sind: Sowohl bei Patienten mit Mutationen in VKORC1 (VKCDF2-Erkrankung), als auch bei VKORC1-Knock-out Mäusen kann das intaktes VKORC1L1-Protein die inaktivierende Mutation im C1-Gen nicht kompensieren. B.1. Mit einem für Membranproteine adaptierten, modifizierten Yeast-Two-Hybrid Screen (Split-Ubiquitin-System) konnten mit VKORC1 und VKORC1L1 als Köder 114 Proteine aus einer Leber-cDNA-Bank als potentielle Interaktionspartner identifiziert werden. Davon wurden 6 Proteine aufgrund ihrer Trefferhäufigkeit und funktioneller Überlegungen mit Hilfe von Ko-Immunpräzipitationsexperimenten und Ko-Immunlokalisation näher untersucht. Interessanterweise zeigen die beiden Trefferlisten starke Überschneidungen. B.2. Es konnte eine in vitro- Interaktion von VKORC1 mit sich selbst und mit VKORC1L1 nachgewiesen werden, die bisher nicht bekannt war. Dies könnte auf der hohen Sequenz- und Struktur-Homologie der beiden Proteine beruhen, führt aber auch zu neuen Hypothesen bezüglich des Vitamin K-Stoffwechsels. B.3. Die Interaktion von VKORC1 und dem „stress-associated endoplasmic reticulum protein 1“ (SERP1) bringt Vitamin K in Zusammenhang mit oxidativem Stress. Dazu passen auch die neuesten Ergebnisse aus der Arbeitsgruppe von Johannes Oldenburg (vormals Würzburg, jetzt Bonn) zur Funktion von VKORC1L1, die eine protektive Rolle von Vitamin K beim Schutz der Zelle vor reaktiven Sauerstoffverbindungen nahe legen. Ob und wie Vitamin K und VKORC1L1 einen neuen Schutzmechanismus gegen Sauerstoffradikale bilden bedarf weiterer Untersuchungen. B.4. Ferner wurde eine Interaktion zwischen VKORC1 und dem „Emopamil-binding-protein“ (EBP) nachgewiesen. Mutationen in EBP führen zu der seltenen genetischen Krankheit Chondrodysplasia punctata. Die Ähnlichkeit der Symptomatik zwischen Chondrodysplasia punctata und der sogenannten Warfarin-Embryopathie, die durch überhöhte Dosierung von Coumarinen während der Schwangerschaft verursacht wird, legt einen Zusammenhang zwischen Vitamin K- und dem Kalziumstoffwechsel nahe. B5. In den Ko-Immunpräzipitationsexperimenten nicht bestätigt haben sich die initial positiven Proteine Protein-Disulfid-Isomerase (PDIA6), CD63, und Fibrinogen-Gamma (FGG). Die Ergebnisse geben Hinweise auf neue Funktionen der VKOR-Proteine beim Schutz vor oxidativem Stress und in der Verbindung zum Kalzium-Stoffwechsel. Beide Aspekte bedürfen weiterführender Untersuchungen. Im Hinblick auf diese neuen Funktionen wäre auch eine kritische Betrachtung der übrigen 85 primären Treffer des Split-Ubiquitin-Screens sinnvoll.
N2  - Since the first gene of the vitamin K epoxide reductase complex (VKORC1) - the key enzyme for the regeneration of vitamin KH2 - has been discovered, no more components of the complex have been described. To date, the only known function of VKORC1 is the reduction of vitamin K-2,3-epoxide (VKO) in the vitamin K cycle. VKO plays a role as an oxidative cofactor during post-translation carboxylation. VKORC1 is also the target protein of anticoagulant drugs of the coumarin type (e.g. warfarin or marcumar). Genetic variants in VKORC1 have recently been shown to significantly affect the coumarin dose and the stability of hamostasis (measured as INR level) during thrombosis treatment. Simultaneously with VKORC1, a homologues protein called VKORC1-like1 (VKORC1L1) was identified. The physiological function of VKORC1L1 was unknown at the beginning of this thesis. The present thesis focuses on two aspects: A. Kinetic properties and subcellular localization of VKORC1L1-protein as well as B. identification and characterization of potential interaction partners of VKORC1 and VKORC1L1, respectively. The results could be summarised as follows: A.1. Kinetic studies revealed a high similarity of VKORC1 and VKORC1L1: Both VKOR-proteins have shown a VKR-activity in our assay and a higher affinity for Vitamin K2-epoxid than for Vitamin K1-epoxid. Both enzymes could be inhibited by warfarin and the exchange of homologous Cysteins leads to an almost complete loss of function for both proteins. A.2. Localisation studies identified VKORC1L1 in the ER when co-expressed in HeLa cells with VKORC1. Accordingly, we suggest that VKORC1L1 has a similar function, localisation and structure as VKORC1 and therefore becomes a potential component of the VKOR-complex. Nevertheless, important arguments lead to the fact that both proteins are not interchangeable as neither patients with VKCDF2 nor VKORC1-knock out mice could be counterbalanced by VKORC1L1. B. Using the split-ubiquitin-system, a method based on yeast two-hybrid system which is capable to investigate membrane-proteins, 114 potential interactions candidates for VKORC1 and VKORC1L1 were found in a human adult liver cDNA library screen. 5 of them were further investigated using co-immunprecipitation and co-localisation studies. Interestingly, various similar hits could be detected for both proteins. B.1. For the first time we were able to show an in vitro-interaction of VKORC1 with itself and the homologues protein VKORC1L1. This might be due to the high level of homology between the two proteins but also leads to a new hypothesis in respect to the vitamin K metabolism. B.2. The interaction of VKORC1 and “stress-associated endoplasmatic reticulum protein 1” (SERP1) connects vitamin K with oxidative stress. This is in accordance with new results from the group of J. Oldenburg (formerly Würzburg, now Bonn). They postulate an antioxidant role of VKORC1L1. Whether VKORC1L1 and vitamin K have an antioxidative effect needs to be solved in further studies. B.2. Furthermore, we showed an interaction between VKORC1 and the “emopamil binding protein” (EBP). Genetic variants in EBP lead to a rare genetic disease chondrodysplasia punctata which can be considered a phenocopy of warfarin embryopathy, which is caused by medication of woman with coumarin derivatives during the first trimester of pregnancy. This interaction and the similar phenotypes suggest a connection between the vitamin K- and calcium metabolism. B.3. The following proteins, which were found using split-ubiquitin-system, could not be confirmed via co-immunoprecipitaion: protein-disulfide-isomerase A6 (PDIA6), CD63, a member of the tetraspanin-family, and fibrinogen-gamma-chain (FGG). A PDI-form was proposed to provide electrons for reduction of the thioredoxin-like CXXC center in VKORC1. Tetraspanins are a large family of cell-surface proteins, which interact with proteins in a molecular network that is known as the tetraspanin web. FGG is the gamma component of fibrinogen, the only identified protein which is known to play a role in blood coagulation. These results suggest new functions of VKOR-proteins related to protection against oxidative stress and a connection to the calcium-metabolism. Both aspects need to be analysed further. Therefore, it would make sense to analyse the remaining candidates found via split-ubiquitin-system with regard to these new functions.
KW  - Vitamin-K-Gruppe
KW  - Regeneration
KW  - Proteine
KW  - Molekulargenetik
KW  - Vitamin K
KW  - VKORC1
KW  - VKORC1L1
KW  - Proteininteraktion
KW  - vitamin K
KW  - VKORC1
KW  - VKORC1L1
KW  - protein interaction
Y1  - 2011
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-55442
ER  - 
TY  - THES
A1  - Fischer, Andreas
T1  - The Role of Protein-Protein Interactions in the Activation Cycle of RAF Kinases
T1  - Die Rolle von Protein-Protein Interaktionen im Aktivierungszyklus der RAF Kinasen
N2  - Members of the RAF protein kinase family are key regulators of diverse cellular processes. The need for isoform-specific regulation is reflected by the fact that all RAFs not only display a different degree of activity but also perform isoform-specific functions at diverse cellular compartments. Protein-protein-interactions and phosphorylation events are essential for the signal propagation along the Ras-RAF-MEK-ERK cascade. More than 40 interaction partners of RAF kinases have been described so far. Two of the most important regulators of RAF activity, namely Ras and 14-3-3 proteins, are subject of this work. So far, coupling of RAF with its upstream modulator protein Ras has only been investigated using truncated versions of RAF and regardless of the lipidation status of Ras. We quantitatively analyzed the binding properties of full-length B- and C-RAF to farnesylated H-Ras in presence and absence of membrane lipids. While the isolated Ras-binding domain of RAF exhibit a high binding affinity to both, farnesylated and nonfarnesylated H-Ras, the full-length RAF kinases demonstrate crucial differences in their affinity to Ras. In contrast to C-RAF that requires carboxyterminal farnesylated H-Ras for interaction at the plasma membrane, B-RAF also binds to nonfarnesylated H-Ras in the cytosol. For identification of the potential farnesyl binding site we used several fragments of the regulatory domain of C-RAF and found that the binding of farnesylated H-Ras is considerably increased in the presence of the cysteine-rich domain of RAF. In B-RAF a sequence of 98 amino acids at the extreme N terminus enables binding of Ras independent of its farnesylation status. The deletion of this region altered Ras binding as well as kinase properties of B-RAF to resemble C-RAF. Immunofluorescence studies in mammalian cells revealed essential differences between B- and C-RAF regarding the colocalization with Ras. In conclusion, our data suggest that that B-RAF, in contrast to C-RAF, is also accessible for nonfarnesylated Ras in the cytosolic environment due to its prolonged N terminus. Therefore, the activation of B-RAF may take place both at the plasma membrane and in the cytosolic environment. Furthermore, the interaction of RAF isoforms with Ras at different subcellular sites may also be governed by the complex formation with 14-3-3 proteins. 14-3-3 adapter proteins play a crucial role in the activation of RAF kinases, but so far no information about the selectivity of the seven mammalian isoforms concerning RAF association and activation is available. We analyzed the composition of in vivo RAF/14-3-3 complexes isolated from mammalian cells with mass spectrometry and found that B-RAF associates with a greater variety of 14-3-3 proteins than C- and A-RAF. In vitro binding assays with purified proteins supported this observation since B-RAF showed highest affinity to all seven 14-3-3 isoforms, whereas C-RAF exhibited reduced affinity to some and A-RAF did not bind to the 14-3-3 isoforms epsilon, sigma, and tau. To further examine this isoform specificity we addressed the question of whether both homo- and heterodimeric forms of 14-3-3 proteins participate in RAF signaling. By deleting one of the two 14-3-3 isoforms in Saccharomyces cerevisiae we were able to show that homodimeric 14-3-3 proteins are sufficient for functional activation of B- and C-RAF. In this context, the diverging effect of the internal, inhibiting and the activating C-terminal 14-3-3 binding domain in RAF could be demonstrated. Furthermore, we unveil that prohibitin stimulates C-RAF activity by interfering with 14-3-3 at the internal binding site. This region of C-RAF is also target of phosphorylation as part of a negative feedback loop. Using tandem MS we were able to identify so far unknown phosphorylation sites at serines 296 and 301. Phosphorylation of these sites in vivo, mediated by activated ERK, leads to inhibition of C-RAF kinase activity. The relationship of prohibitin interference with 14-3-3 binding and phosphorylation of adjacent sites has to be further elucidated. Taken together, our results provide important new information on the isoform-specific regulation of RAF kinases by differential interaction with Ras and 14-3-3 proteins and shed more light on the complex mechanism of RAF kinase activation.
N2  - RAF Protein Kinasen sind essentielle Regulatoren verschiedener zellulärer Prozesse. Unterschiedlich starke Aktivitäten und Lokalisation der drei RAF Isoformen erfordern eine isoform-spezifische Regulation. Der Einfluss von Protein-Protein Interaktionen und Phosphorylierungen ist dabei mitentscheidend für die Signalweiterleitung entlang der Ras-RAF-MEK-ERK Kaskade. Mehr als 40 Interaktionspartner der RAF Kinasen wurden bereits beschrieben von denen zwei der wichtigsten, Ras und 14-3-3 Proteine, Gegenstand der vorliegenden Arbeit sind. Die Interaktion von RAF mit seinem vorgeschaltetem Modulatorprotein Ras wurde bislang nur mit verkürzten RAF-Proteinen und ohne Rücksicht auf den Lipidierungsgrad von Ras untersucht. Wir haben die Bindeeigenschaften von B- und C-RAF in voller, nativer Länge zu farnesyliertem H-Ras in Gegenwart und Abwesenheit von Membranlipiden quantifiziert. Während die isolierte Ras-Bindungsdomäne eine hohe Affinität sowohl zu farnesyliertem als auch nicht-farnesyliertem H-Ras aufweist, zeigen die RAF Proteine in voller Länge entscheidende Unterschiede in ihrem Bindeverhalten zu Ras. C-RAF benötigt für eine effiziente Interaktion mit H-Ras dessen C-terminale Farnesylgruppe, wobei B-RAF auch an nicht-farnesyliertes H-Ras im Cytosol bindet. Um die verantwortliche Farnesylbinderegion zu identifizieren haben wir verschiedene Fragmente der regulatorischen Domäne von C-RAF eingesetzt. Dadurch konnten wir zeigen, dass die Affinität zu farnesyliertem Ras in Gegenwart der sogenannten Cystein-reichen Domäne von RAF beträchtlich erhöht war. In B-RAF ist eine Sequenz von 98 Aminosäuren am N-Terminus verantwortlich für die Ras-Bindung unabhängig von dessen Farnesylierungszustand. Die Deletion dieser Sequenz von B-RAF veränderte die Ras-Bindungseigenschaften sowie die Kinaseaktivität vergleichbar mit C-RAF. Durch Immunfluoreszenzversuche in Säugerzellen konnten darüber hinaus Unterschiede in der Kolokalisation von B- und C-RAF mit Ras beobachtet werden. Zusammenfassend deuten unsere Ergebnisse darauf hin, dass B-RAF, im Gegensatz zu C-RAF, aufgrund seines verlängerten N-Terminus in der Lage ist bereits im Cytosol auch mit unfarnesyliertem Ras zu interagieren, wodurch die Aktivierung von B-RAF sowohl im Cytosol als auch an der Plasmamenbran erfolgen kann. Die Interaktion der RAF-Isoformen mit Ras in unterschiedlichen zellulären Kompartimenten kann aber auch durch die Komplexbildung mit 14-3-3 Proteinen beeinflusst werden. Die 14-3-3 Adapter Proteine spielen eine entscheidende Rolle im Aktivierungszyklus der RAF Proteine. Bislang waren jedoch keine Details bezüglich der Selektivität der sieben 14-3-3 Isoformen aus Säugerzellen hinsichtlich der Assoziation mit und Aktivierung der RAF Kinasen bekannt. Wir haben RAF/14-3-3 Komplexe aus Säugerzellen isoliert und durch Massenspektrometrie analysiert. Dadurch konnten wir zeigen, dass B-RAF mit einer größeren Vielfalt an 14-3-3 Isoformen bindet als C- und A-RAF. In vitro Bindungsversuche mit gereinigten Proteinen bestätigten die höhere Affinität von B-RAF zu allen sieben Säuger-14-3-3 Proteinen. C-RAF dagegen zeigte eine deutlich reduzierte Affinität, während für A-RAF keine Bindung zu den 14-3-3 Isoformen epsilon, sigma, und tau festgestellt wurde. Um diese Isoformspezifität weiter aufzuklären haben wir untersucht, ob sowohl Homo- als auch Heterodimere von 14-3-3 in der Lage sind die RAF-Signaltransduktion zu beeinflussen. Durch die Deletion einer der beiden 14-3-3 Isoformen aus Saccharomyces cerevisiae konnten wir zeigen, dass bereits ein 14-3-3 Homodimer für die korrekte Aktivierung von B- und C-RAF ausreichend ist. In diesem Zusammenhang konnte auch die Rolle der internen, inhibierenden 14-3-3 Bindestelle in RAF gegenüber der C-terminalen, aktivierenden Stelle dargelegt werden. Zusätzlich zeigen wir, dass Prohibitin seinen aktivierenden Einfluss gegenüber C-RAF durch die Beeinträchtigung der 14-3-3 Bindung an der internen Stelle in RAF ausübt. Diese Region in C-RAF ist das Ziel von Phosphorylierungen im Zuge eines negativen Rückkopplungsmechanismus. Durch den Einsatz von Tandem-Massenspektrometrie konnten wir bislang unbekannte Phosphorylierungsstellen an den Serinen 296 und 301 identifizieren deren ERK-vermittelte Phosphorylierung in vivo eine Inaktivierung der C-RAF bewirkt. Der Zusammenhang zwischen der Behinderung der 14-3-3 Anlagerung durch Prohibitin und die Phosphorylierung in unmittelbarer Nachbarschaft bedarf weiterer Untersuchungen. Zusammengefasst liefern unsere Ergebnisse wichtige Informationen bezüglich der isoform-spezifischen Regulation der RAF Kinasen durch die Interaktion mit Ras und 14-3-3 Proteinen und helfen die komplexen Mechanismen der RAF Aktivierung weiter aufzuklären.
KW  - Signaltransduktion
KW  - Raf <Biochemie>
KW  - Biochemie
KW  - Ras
KW  - H-ras
KW  - Proteininteraktion
KW  - signal transduction
KW  - biochemistry
KW  - Ras
KW  - Raf
Y1  - 2010
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-48139
N1  - Aus rechtlichen Gründen sind die in der Dissertation abgedruckten, bereits in Zeitschriften veröffentlichten Artikel (Seiten 34 - 80) nicht in der elektronischen Version enthalten.
ER  -