TY - THES A1 - Bachmann, Julia T1 - Role of Adipose-Derived Stromal/Stem Cells in Cell-Assisted Lipotransfer – Characterization of their Secretory Capacity under Ischemia-Like Stress Conditions and Establishment of a 3D Adipose Tissue-ASC Co-Culture T1 - Bedeutung von mesenchymalen Stammzellen aus dem Fettgewebe für den zellassistierten Lipotransfer – Charakterisierung der Sekretionskapazität unter Ischämie-artigen Stressbedingungen und Etablierung einer 3D Fettgewebe-ASC-Kokultur N2 - The use of human adipose-derived mesenchymal stem cells (ASCs) for cell-based therapeutic approaches, in terms of repair and regeneration of various tissues and organs, offers an alternative therapeutic tool in the field of regenerative medicine. The ability of ASCs to differentiate along mesenchymal lineages is not the only property that makes these cells particularly attractive for therapeutic purposes. Their promising functions in promoting angiogenesis, reducing inflammation as well as in functional tissue restoration are largely related to the trophic effects of a broad panel of secreted cytokines and growth factors. However, in cell-based approaches, the cell-loaded construct often is exposed to an ischemic microenvironment characterized by severe oxidative and nutritional stress after transplantation due to the initial lack of vascular connection, resulting in reduced cell viability and altered cell behaviour. Therefore, the effective use of ASCs in regenerative medicine first requires a comprehensive characterization of the cells in terms of their viability, differentiation capacity and especially their secretory capabilities under ischemia-mimicking conditions in order to better understand their beneficial role. Accordingly, in the first part of this work, ASCs were investigated under different ischemic conditions, in which cells were exposed to both glucose and oxygen deprivation, with respect to viability and secretory function. Using mRNA gene expression analysis, significantly higher expression of selected angiogenic, anti-apoptotic and immunomodulatory factors (IL-6, VEGF, STC-1) could be demonstrated under harsh ischemic conditions. These results were reflected at the protein expression level by a significantly increased secretion of these factors. For stanniocalcin-1 (STC-1), a factor not yet described in ASCs, a particularly high expression with significant secreted amounts of the protein could be demonstrated under harsh ischemic conditions. Thus, the first part of this work, in addition to the characterization of the viability, provided first insights into the secretory response of ASCs under ischemic conditions. The response of ASCs to glucose deficiency in combination with severe hypoxia has been little explored to date. Thus, the focus of the second part of this work was on a more detailed investigation of the secretory response of ASCs under glucose and oxygen deprivation. For a more comprehensive analysis of the secretion profile, a cytokine antibody array was performed, which allowed the detection of a broad panel of secreted angiogenic factors (IL-8, ANG), matrix-regulating proteins (TIMP-1, TIMP-2), chemokines (MCP-1/CCL2, IP-10/CXCL 10) and other factors under ischemic conditions. To verify these results, selected factors were examined using ELISA. The analysis revealed that the secretion of individual factors (e.g., STC-1, VEGF) was significantly upregulated by the combination of glucose and oxygen deprivation compared to oxygen deprivation alone. In order to investigate the impact of the secretome of ischemic ASCs on cell types involved in tissue regeneration, the effect of conditioned medium of ischemia-challenged ASCs on both endothelial cells and fibroblasts was investigated in subsequent experiments. Significantly increased viability and tube formation of endothelial cells as well as activated migration of fibroblasts by the secreted factors of ischemic ASCs could be demonstrated. A direct correlation of these effects to STC-1, which was significantly upregulated under ischemic conditions and has been described as a regulator of key cellular functions, could not be verified. The particular secretory capacity of ASCs provides a valuable tool for cell-based therapies, such as cell-assisted lipotransfer (CAL), where by enriching fat grafts with isolated ASCs, a significantly improved survival rate of the transplanted construct is achieved with less resorption of the fat tissue as well as a reduction in adverse implications, such as fibrosis and cyst formation. In order to better understand the function of ASCs in CAL, an autologous transwell-based lipograft-ASC co-culture was established in the last part of this work, in which first investigations showed a markedly increased secretion of VEGF compared to lipografts without added ASCs. As the stability rate of the fat tissue and thus the success of CAL is presumably also dependent on the preparation of the tissue before transplantation, the conventional preparation method of fat tissue for vocal fold augmentation in laryngoplasty was additionally evaluated in vitro in a pilot experiment. By analyzing the viability and tissue structure of the clinically prepared injection material, a large number of dead cells and a clearly damaged tissue structure with necrotic areas could be demonstrated. In comparison, the preparation method of the fat tissue established in this work as small tissue fragments was able to provide a clearly intact, vital, and vascularized tissue structure. This type of adipose tissue preparation represents a promising alternative for clinical vocal fold augmentation. In conclusion, the results of this work contribute to a comprehensive characterization of ASCs under ischemic conditions, such as those prevalent at the transplantation site or in tissue regeneration. The results obtained, especially on the secretory capacity of ASCs, provide new insights into how ASCs mediate regenerative effects in an ischemic milieu and why their use for therapeutic purposes is highly attractive and promising. N2 - Der Einsatz von humanen mesenchymalen Stammzellen aus dem Fettgewebe (ASCs) für zell-basierte Therapieansätze zur Reparatur und Regeneration von verschiedenen Geweben und Organen bietet eine alternative therapeutische Lösung im Bereich der regenerativen Medizin. Die Fähigkeit der ASCs zur Differenzierung in verschiedene mesenchymale Zelltypen ist jedoch nicht die einzige Eigenschaft, die diese Zellen für therapeutische Zwecke besonders attraktiv macht. ASCs sezernieren vielmehr ein breites Spektrum an Zytokinen und Wachstumsfaktoren, die z.B. durch Förderung der Angiogenese oder der Reduktion von Entzündungsprozessen eine wichtige Rolle bei regenerativen Therapien spielen können. Allerdings ist in zellbasierten Ansätzen, das zellbeladene Konstrukt nach der Transplantation – durch den anfänglich fehlenden Gefäßanschluss und die damit einhergehende mangelnde Versorgung des implantierten Gewebes – starkem oxidativem und ernährungsbedingtem Stress, einem ischämischen Milieu, ausgesetzt, was zu einer reduzierten Zellviabilität und einem veränderten Zellverhalten führt. Der effektive Einsatz der ASCs in der regenerativen Medizin erfordert demnach zunächst eine umfassende Charakterisierung der Zellen in Bezug auf deren Lebensfähigkeit, Differenzierungsfähigkeit und insbesondere die sekretorischen Fähigkeiten unter simulierten ischämischen Bedingungen, um ihren therapeutischen Effekt besser verstehen und optimieren zu können. Dazu wurden im ersten Teil dieser Arbeit die ASCs unter verschiedenen ischämischen Bedingungen, bei denen die Zellen sowohl einem Glukose- als auch Sauerstoffmangel ausgesetzt waren, hinsichtlich der Viabilität und der sekretorischen Funktion in vitro untersucht. Durch mRNA Genexpressionsanalysen konnte für ausgewählte angiogene, anti-apoptotische und immunmodulatorische Faktoren (IL-6, VEGF, STC-1) eine signifikant höhere Expression unter stark ischämischen Bedingungen gezeigt werden. Diese Ergebnisse spiegelten sich gleichermaßen auf Proteinebene durch eine signifikant erhöhte Sekretion der Faktoren wider. Für Stanniocalcin-1 (STC-1), einen Faktor, dessen Rolle bislang im Zusammenhang mit ASCs noch nicht beschrieben ist, konnte eine besonders hohe Expression mit signifikanten sezernierten Mengen des Proteins bei hoher ischämischer Belastung der Zellen gezeigt werden. Somit konnten im ersten Abschnitt der Arbeit neben einer ersten Charakterisierung der ASCs auch erste Erkenntnisse über das sekretorische Verhalten der Zellen in einem ischämischen Milieu gewonnen werden. Die Reaktion von ASCs auf Glukosemangel in Kombination mit Hypoxie ist bislang wenig untersucht. Somit lag der Fokus im zweiten Teil dieser Arbeit auf der detaillierteren Untersuchung des Sekretionsverhaltens von ASCs unter Glucose- und Sauerstoffdeprivation. Für eine umfassende Analyse des Sekretionsprofils wurde ein Zytokin-Antikörper-Array durchgeführt, mit welchem die Sekretion eines breiten Panels von angiogenen Faktoren (IL-8, ANG), matrixregulierenden Proteinen (TIMP-1, TIMP-2), Chemokinen (MCP-1/CCL2, IP-10/CXCL 10) sowie weiterer Faktoren unter ischämischen Bedingungen nachgewiesen werden konnte. Zur Verifizierung dieser Ergebnisse wurden ausgewählte Faktoren mittels ELISA untersucht. Durch diese Analyse konnte gezeigt werden, dass die Sekretion einzelner Faktoren (z.B. STC-1, VEGF) durch die Kombination von Glukose- und Sauerstoffentzug deutlich hochreguliert wird, z.B. gegenüber nur dem Entzug von Sauerstoff. Um die Wirkung des Sekretoms von ischämischen ASCs auf Zelltypen, die in der Regeneration von Geweben eine Rolle spielen, zu untersuchen, wurde in nachfolgenden Experimenten die Wirkung von konditioniertem Medium ischämischer ASCs sowohl auf Endothelzellen als auch auf Fibroblasten untersucht. Dabei konnte sowohl eine deutlich gesteigerte Röhrenbildung („tube formation“) von Endothelzellen als auch eine aktivierte Migration von Fibroblasten durch die sezernierten Faktoren der ischämischen ASCs nachgewiesen werden. Ein direkter Zusammenhang dieser Effekte mit dem unter ischämischen Bedingungen signifikant hochregulierten Faktor STC-1, welcher als Regulator zellulärer Schlüsselfunktionen beschrieben wird, konnte hingegen nicht nachgewiesen werden. Die besondere Sekretionsfähigkeit von ASCs stellt ein wertvolles Werkzeug für zellbasierte Therapien dar, wie z.B. den zellassistierten Lipotransfer (CAL), bei dem durch die Anreicherung von Fetttransplantaten mit isolierten ASCs eine deutliche Verbesserung der Überlebensrate des transplantierten Konstrukts mit einer geringeren Resorption des Fettgewebes sowie einer Verringerung von unerwünschten Folgen, wie Fibrosen und Zystenbildung, erzielt wird. Um die Funktion der ASCs im CAL besser charakterisieren zu können, wurde im letzten Teil dieser Arbeit eine autologe Transwell-basierte Lipograft-ASC-Kokultur etabliert, in welcher durch erste Untersuchungen eine signifikant erhöhte Sekretion von VEGF im Vergleich zu den Lipografts ohne Zusatz von isolierten ASCs gezeigt werden konnte. Da die Stabilitätsrate des Fettgewebes und damit der Erfolg des CAL mutmaßlich auch von der Aufbereitung des Gewebes vor der Transplantation abhängig ist, wurde in einem Pilot-Experiment die konventionelle Präparationsmethode von Fettgewebe für die Stimmlippenaugmentation in der Laryngoplastik in vitro evaluiert. Durch Analysen zur Viabilität und Gewebestruktur konnte bei dem klinisch aufbereiteten Injektionsmaterial eine große Anzahl abgestorbener Zellen sowie eine deutlich geschädigte Gewebestruktur mit nekrotischen Arealen nachgewiesen werden. Im Vergleich dazu konnte mit der in dieser Arbeit etablierten Präparationsmethode des Fettgewebes als kleine Gewebsfragmente eine deutlich intakte, vitale und vaskularisierte Gewebestruktur erhalten werden. Damit bietet diese Art der Aufbereitung von Fettgewebe eine vielversprechende Alternative für die klinische Stimmlippenaugmentation.  Zusammengefasst tragen die Ergebnisse dieser Arbeit zu einer umfassenden Charakterisierung von ASCs unter ischämischen Bedingungen bei, wie sie beispielsweise am Transplantationsort oder in der Geweberegeneration vorliegen können. Die gewonnenen Ergebnisse, insbesondere zu den sekretorischen Fähigkeiten der ASCs, liefern neue Erkenntnisse darüber, wie ASCs regenerative Effekte in einem ischämischen Milieu vermitteln und weshalb deren Verwendung für therapeutische Zwecke besonders attraktiv und vielversprechend ist. KW - Adipose KW - Secretion KW - Regenerative Medicine KW - Ischemia KW - Hypoxia KW - Adipose-Derived Stromal/Stem Cells KW - Trophic Factors KW - Glucose Starvation KW - Cell-Assisted Lipotransfer Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-251786 ER - TY - THES A1 - Mietrach, Nicole Aline T1 - Structural and functional elucidation of the Type VIIb secretion system from Staphylococcus aureus T1 - Strukturelle und funktionelle Analyse des Typ VIIb Sekretionssystems aus Staphylococcus aureus N2 - The Type VII secretion system (T7SS) is linked to virulence and long-term pathogenesis in a broad range of Gram-positive bacteria, including the human commensal and pathogen Staphylococcus aureus. The Type VIIb secretion system (T7SSb) is responsible for the export of small toxic proteins, which induce antibacterial immune responses and mediate bacterial persistence in the host. In addition, it is also involved in bacterial competition. The T7SSb requires several proteins to build up the secretion machinery. This work focuses on the structural and functional investigation of the motor ATPase EssC and the putative pore forming, multi-pass membrane component EsaA. Both proteins are indispensable for substrate secretion. EssC belongs to the FtsK/SpoIIIE ATPase family and is conserved among the T7SSs. It contains three C-terminal, cytosolic ATPase domains, designated as EssC- D1, -D2 and -D3, whereby EssC-D3 is the most distal one. In this thesis, I am presenting the crystal structure of the EssC-D3 at 1.7 Å resolution. As the deletion of EssC-D3 abrogates substrate export, I have demonstrated that this domain comprises a hydrophobic, surface-exposed pocket, which is required for substrate secretion. More specifically, I have identified two amino acids involved in the secretion process. In addition, my results indicate that not only EssC-D3 is important for substrate interaction but also EssC-D2 and/or EssC-D1. Unlike in the related Yuk T7SSb of Bacillus subtilis, the ATPase activity of D3 domain contributes to substrate secretion. Mutation of the modified Walker B motif in EssC-D3 diminishes substrate secretion completely. The membrane protein EsaA encompasses an extracellular segment spanning through the cell wall of S. aureus. I was able to reveal that this part folds into a stable domain, which was crystallized and diffracted up to 4 Å. The first attempts to dissolve the structure failed due to a lack of homologues structures. Therefore, crystals for single-wavelength anomalous dispersion, containing selenomethionyl-substitutes, were produced and the structure solution is still in progress. Preliminary experiments addressing the function of the extracellular domain indicate an important role in substrate secretion and bacterial competition. N2 - Das Typ VII Sekretionssystem (T7SS) ist wichtig für Virulenz und Langzeit- Pathogenität von Gram-positiven Bakterien. Zu diesen gehört auch Staphylococcus aureus, bekannt als Kommensal und Pathogen im Menschen. Das Typ VIIb Sekretionssystem (T7SSb) exportiert kleine, toxische Proteine, die antibakterielle Immunantworten auslösen und für bakterielle Persistenz verantwortlich sind. Außerdem ist es an dem Konkurrenzkampf zwischen Bakterien beteiligt. Das System benötigt verschiedene Komponenten, um eine Sekretion zu ermöglichen. Diese Doktorarbeit konzentriert sich auf zwei dieser Proteine, die ATPase EssC und das Membranprotein EsaA. Beide Komponenten sind unentbehrlich für eine vollständige Funktionalität. EssC gehört zu der Familie der FtsK/SpoIIIE ATPasen und ist evolutionär in allen T7SSs erhalten. EssC besitzt drei C-terminale, zytosolische ATPase Domänen, bezeichnet als EssC-D1, -D2 und D3, wobei EssC-D3 C-terminal gelegen ist. In dieser Arbeit präsentiere ich die Kristallstruktur der ATPase Domäne EssC-D3, aufgelöst bis zu 1.7 Å. Die Domäne ist unabdingbar für die Sekretion. Durch die Strukturauflösung wurde eine hydrophobe, Oberflächen-exponierte Substrat- Bindetasche bestimmt, die eine essenzielle Rolle für den Export der toxischen Substrate einnimmt. Durch dieses Projekt konnten zwei Aminosäuren in dieser Tasche bestimmt werden, die für den Prozess der Substratsekretion wichtig sind. Weiterhin wurde bewiesen, dass nicht nur EssC-D3, sondern auch die ATPase Domäne EssC-D2 und/oder EssC-D1 mit den Substraten interagieren kann. Im Gegensatz zu dem verwandten T7SSb in Bacillus subtilis, verfügt EssC-D3 über ATPase Aktivität und ermöglicht dadurch den Substratexport. Das Membranprotein EsaA besitzt einen extrazellulären Abschnitt, der sich durch die Zellwand von S. aureus erstreckt. Dieser extrazelluläre Part besteht aus einer stabilen Domäne, welche kristallisiert werden konnte und bis zu 4 Å diffraktiert. Aufgrund von fehlenden homologen Strukturen konnte die Struktur der Domäne noch nicht bestimmt werden. Für die Phasenbestimmung, die wichtig für die Strukturauflösung ist, wurden Kristalle mit Selenomethionyl-Substituten hergestellt. Die Strukturauflösung ist noch nicht beendet. Erste Experimente bezüglich der extrazellulären Domäne zeigen, dass diese ebenfalls wichtig für die Substratsekretion und zusätzlich am Konkurrenzkampf zwischen Bakterien beteiligt ist. KW - Secretion KW - Gram-positive bacteria KW - Type VIIb secretion system KW - Staphylococcus aureus Y1 - 2020 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-214824 ER - TY - THES A1 - Seo, Ean Jeong T1 - Construction of recombinant E. coli Nissle 1917 (EcN) strains for the expression and secretion of defensins T1 - Konstruktion von rekombinanten E. coli Nissle 1917 (EcN) Stämmen, die Defensine exprimieren bzw. sekretieren N2 - Der probiotische Escherichia coli Stamm Nissle 1917 (EcN) ist eines der wenigen Probiotika, die als aktive Komponente eines Medikaments in mehreren Ländern zugelassen sind. Am besten ist die Wirksamkeit des EcN für die Remissionserhaltung von an Colitis Ulcerosa leidenden Patienten dokumentiert. Diese Fähigkeit ist vermutlich darauf zurückzuführen, dass EcN in der Lage ist die Produktion des humanen beta-Defensins 2 (HBD2) mittels seiner Flagelle zu Induzieren. In dieser Studie wurden rekombinante EcN Stämme konstruiert, die ein Defensin zu produzieren vermögen. Zu diesem Zweck wurden Kodon-optimierte Defensingene in Expressionsplasmidvektoren kloniert, die entweder die Proform mit der Signalsequenz oder die reife Defensinform des humanen -Defensins 5 (HD5) oder des humanen -Defensins 2 (HBD2) unter der Kontrolle des T7-Promotors kodieren. Die Synthese dieser Defensine wurde mittels Western-Blot nach der Induktion der Expression und der Lyse der rekombinanten EcN Stämme demonstriert. Das rekombinante reife HBD2 mit einem N-terminalen His-Tag konnte mittels Ni-Säulen-Chromatographie aufgereinigt werden. Das so gewonnene HBD2 zeigte antimikrobielle Aktivität gegen E. coli, Salmonella enterica Serovar Typhimurium und Listeria monocytogenes. In einem zweiten Ansatz wurde der Teil des HBD2-Gens mit dem yebF-Gen fusioniert, der das reife HBD2 kodiert. Das resultierende Fusionsprotein YebFMHBD2 wurde von dem entsprechenden EcN Stamm nach Induktion der Expression sekretiert. Die Präsenz von YebFMHBD2 im Medium war nicht das Ergebnis von Zellyse wie Western-Blots spezifisch für die -Galaktosidase und das Maltose-Bindeprotein mit dem Kulturüberstand zeigten. Dieser Kulturüberstand inhibierte das Wachstum von E. coli, Salmonella enterica Serovar Typhimurium und Listeria monocytogenes nach Dialyse und Aufkonzentration sowohl in Agardiffusionsassays als auch in Flüssigcokultur. Damit konnte gezeigt werden, dass EcN ein für die Produktion von bestimmten humanen Defensinen geeignetes Probiotikum darstellt. EcN ist bei der Behandlung von Morbus Crohn Patienten nicht aktiv. Dies ist vermutlich in der genetisch bedingten Unfähigkeit zur ausreichenden Defensinproduktion solcher Individuen begründet. Als ein erster Schritt in der Entwicklung von alternativen Ansätzen zur Behandlung Morbus Crohn Patienten wurden in dieser Arbeit EcN Stämme konstruiert, die in der Lage sind HD5 oder HBD2 zu produzieren. N2 - The probiotic Escherichia coli strain Nissle 1917 (EcN) is one of the few probiotics licensed as a medication in several countries. Best documented is its effectiveness in keeping patients suffering from ulcerative colitis (UC) in remission. This might be due to its ability to induce the production of human beta defensin 2 (HBD2) in a flagellin-dependent way in intestinal epithelial cells. In contrast to ulcerative colitis, for Crohn´s disease (CD) convincing evidence is lacking that EcN might be clinically effective, most likely due to the genetically based inability of sufficient defensin production in CD patients. As a first step in the development of an alternative approach for the treatment of CD patients, EcN strains were constructed which were able to produce human alpha-defensin 5 (HD5) or beta-defensin 2 (HBD2). For that purpose codon-optimized defensin genes encoding either the proform with the signal sequence or the mature form of human alpha defensin 5 (HD5) or the gene encoding HBD2 with or without the signal sequence were cloned in an expression vector plasmid under the control of the T7 promoter. Synthesis of the encoded defensins was shown by Western blots after induction of expression and lysis of the recombinant EcN strains. Recombinant mature HBD2 with an N-terminal His-tag could be purified by Ni-column chromatography and showed antimicrobial activity against E. coli, Salmonella enterica serovar Typhimurium and Listeria monocytogenes. In a second approach, that part of the HBD2-gene which encodes mature HBD2 was fused with yebF gene. The resulting fusion protein YebFMHBD2 was secreted from the encoding EcN mutant strain after induction of expression. Presence of YebFMHBD2 in the medium was not the result of leakage from the bacterial cells, as demonstrated in the spent culture supernatant by Western blots specific for ß-galactosidase and maltose-binding protein. The dialyzed and concentrated culture supernatant inhibited the growth of E. coli, Salmonella enterica serovar Typhimurium and Listeria monocytogenes in radial diffusion assays as well as in liquid coculture. This demonstrates EcN to be a suitable probiotic E. coli strain for the production of certain defensins. KW - Escherichia coli KW - Probiotikum KW - Rekombinante DNS KW - Genexpression KW - Defensine KW - Probiotic KW - Recombinant defensins KW - E. coli Nissle 1917 KW - HBD2 KW - HD5 KW - Antimicrobial activity KW - Secretion Y1 - 2012 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-72005 ER -