TY  - THES
A1  - Bremicker, Johannes
T1  - T2/T2*-Messung an VSOP-gelabelten Makrophagen und Sensitivität der Preußisch-Blau-Färbung
T1  - T2/T2*-Measurements of VSOP-labeled Makrophages and Sensitivity of Prussian-Blue-Staining
N2  - Zielsetzung: Diese Arbeit untersuchte die Beziehung zwischen intrazellulärem Eisengehalt (pgFe/Zelle) und der Fähigkeit der Histochemie und des MRT, in vitro mit Eisenoxidnanopartikel gelabelte Zellen zu detektieren. Methoden: Immortalisierte murine Peritonealmakrophagen wurden mit Very Small Iron Oxide Nanoparticles (VSOP) in aufsteigenden Konzentrationen (n=10) von 0 bis 200 µg/ml für 4 Stunden inkubiert. Die MRT-Messungen wurden an einem 7-Tesla Bruker Biospec durchgeführt. Für jedes Label-Protokoll wurden Objektträgerproben (n=6) mit den Zellen angefertigt und mit der PB-, DAB-PB- und AgAu-DAB-PB-Färbung gefärbt. Es wurde der prozentuale Anteil der sichtbar gefärbten Zellen ermittelt. Über ICP-MS bestimmten wir den intrazellulären Eisengehalt und TEM-Aufnahmen bestätigten den vesikulären Uptake von VSOP. Zusätzlich wurde der Einfluss der Zelldichte auf MR-Detektionsgrenzen an identisch gelabelten Zellen zwischen 2x10^5 und 8x10^6 Zellen/0,5ml zwischen nierigen (0,22 pgFe/Zelle) und hohen (3,81pgFe/Zelle) Eisenbeladungen untersucht. Ergebnisse: Der intrazelluläre Eisengehalt reichte von 0.12 bis 12.25 pgFe/Zelle. Die Histochemie zeigte einen höheren Prozentsatz an eisen-positiven Zellen mit steigendem Eisengehalt. Das Enhancement der Preußisch Blau Färbung(PB) mit Diaminobenzidin (DAB) und einer modifizierten AgAu-DAB Färbung führte zu einer höheren Sensitivität für intrazelluläres Eisen (>50% gefärbte Zellen bei 1,3 pgFe/Zelle versus 1,6 pgFe/Zelle) als die Preußisch Blau Färbung selbst (2,2 pgFe/Zelle). Jedoch zeigten beide Färbungen bei einem Eisengehalt unter 0,7 pgFe/Zelle weniger als 25% eisenpositive Zellen. Die T2 und T2* verkürzenden Effekte von VSOP zeigten eine positive Korrelation zur intrazellulären Eisenbeladung und zur Zelldichte. Selbst bei 0.26 pgFe/Zelle war eine sichtbare Änderung der Relaxationsraten sichtbar. Schlussfolgerung: Diese Arbeit zeigte, dass in MRT-Messungen selbst kleinste Mengen an intrazellulärem VSOP nachgewiesen werden können, welche in der Histochemie noch nicht nachgewiesen werden können. Es wurde ebenso gezeigt, dass positive Korrelationen zwischen der Zelldichte, dem intrazellulären Eisengehalt und der T2/T2*-Relaxationsraten bestehen.
N2  - Purpose: This work investigated the relation between intracellular iron content (pgFe/cell) and the capability of histochemistry and MRI to detect in vitro iron-oxide-nanoparticles labeled cells. Methods: Immortalized peritoneal mouse macrophages were incubated with Very Small Iron Oxide Nanoparticles (VSOP) at increasing concentrations (n=10) ranging from 0 to 200 μg/ml for 4 hours. MR relaxometry was performed on a 7 Tesla Bruker Biospec. Histological slides (n=6) were prepared from cells of each labeling-protocol for PB-, DAB-PB- and AgAu-DAB-PB-staining and the percentage of apparently stained cells was recorded. ICP-MS was used to determine intracellular iron content and TEM images confirmed vesicular uptake of VSOPs. Additionally, the impact of cell densitiy on MR detection limits was investigated on 2x10^5 to 8x10^6 identically prepared cells per 0.5 ml with low (0.22 pgFe/cell) and high (3.81 pgFe/cell) iron content. Results: Intracellular iron content after cell labeling ranged form 0.12 to 12.25 pg/cell. Histological slides showed a higher percentage of iron-positive cells with increasing intracellular iron content. The enhancement of Prussian-blue (PB) by diaminobenzidine (DAB) and a modified AgAu-DAB staining lead to a higher sensitivity for intracellular iron (>50% stained cells at 1,3 pgFe/cell versus 1,6 pgFe/cell) than PB staining alone (2,2 pgFe/cell) . Nevertheless at iron contents below 0,7 pgFe/cell both staining methods showed less than 25% iron positive cells. The T2 and T2* shortening effects of VSOP were positively correlated with intracellular iron content and cell density. Even at 0.26 pg/cell a significant change of relaxation rates was observed. Conclusion: We have shown that MRI is able to detect even low amounts of intracellular VSOP that histochemistry might fail to detect. We also showed that there are positive correlations between cell density, intracellular iron content and T2/T2*-values.
KW  - Makrophage
KW  - Kontrastmittel
KW  - Berliner Blau
KW  - NMR-Tomographie
KW  - Sensitivität
KW  - Macrophages
KW  - Contrast agent
KW  - Prussian Blue
KW  - NMR-Tomography
KW  - Sensitivity
Y1  - 2011
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-72766
ER  - 
TY  - THES
A1  - Hubertus, Klaus Valentin
T1  - Sensitive Messung von Superoxidanionen in kardiovaskulären Geweben
T1  - Sensitive Measurement of superoxide anion in cardiovascular tissue
N2  - Superoxidanionen (O2˙‾) sind eine von mehreren sogenannten reaktiven Sauerstoffspezies, die im menschlichen Körper intra-, aber auch extrazellulär vorkommen. Verschiedene Enzyme, z.B. in der mitochondrialen Atmungskette, die NADPH-Oxidase oder endotheliale NO-Synthasen bilden O2˙‾. Da es sich um eine sehr reaktive Substanz handelt, die mit der DNA sowie mit Proteinen und Lipiden interagiert und diese schädigen kann, spielt sie bei kardiovaskulären Erkrankungen wie etwa der chronischen Herzinsuffizienz, Hypertonie oder Arteriosklerose eine große Rolle, ist aber auch an vielen anderen Erkrankungen wie z.B. dem Diabetes mellitus pathophysiologisch beteiligt. Dies macht verständlich, dass es für die Forschung von entscheidender Bedeutung ist, Methoden zu entwickeln, die zur Erkennung und Quantifizierung von O2˙‾ geeignet sind. Bereits heute gibt es verschiedene Methoden, O2˙‾ nachzuweisen. Jede dieser Methoden hat jedoch ihre ganz spezifischen Vor- aber auch Nachteile. Wir haben eine neue, einfache, sehr schnelle und sensitive HPLC-Methode mit einem internen Standard entwickelt, mit der die O2˙‾-Produktion in Endothelzellen und aortalem Gewebe gut zu messen ist. Sie beruht auf der Tatsache, dass Dihydroethidium (DHE) mit O2.- zu 2-Hydroxyethidium (2-OH-E+) reagiert. Nach Trennung mittels HPLC wurde die Menge an entstandenem 2-OH-E+ durch einen elektrochemischen Detektor gemessen. Die Proben wurden durch isokrate Elution aufgetrennt, was bisher bei der Detektion von 2-OH-E+, DHE und O2˙‾ mit vielen Nachteilen verbunden war. Durch eine spezielle mobile Phase, die ein Ionen-Paar-Reagens enthielt, konnte diese Form der Elution nun auch zur Erkennung von O2˙‾ angewandt werden. DHE und seine Reaktionsprodukte konnten nicht nur eindeutig aufgetrennt werden, sondern die Auftrennung erfolgte auch sehr schnell in nur etwa 15min, was gegenüber älteren Methoden einen eindeutigen Zeitvorteil bringt. Anstatt zwei benötigten wir darüber hinaus nur eine Pumpe, was ebenfalls ein Vorteil der isokraten Elution ist. Wir erreichten auch über längere Messreihen stabile Bedingungen, da für die isokrate Elution die mobile Phase nicht verändert werden muss. Des Weiteren haben wir 3,4-Dihydroxyzimtsäure als internen Standard eingeführt, der sich hinsichtlich seiner Retentionszeit als sehr geeignet erwies und mit einem elektrochemischen Detektor klar und eindeutig nachweisbar war. Dies bietet große Vorteile gegenüber Methoden ohne internen Standard. Veränderungen der Konzentrationen von DHE, 2-OH-E+ und Ethidium aufgrund von Verdampfen des Lösungsmittels Methanol können ebenso erkannt werden wie Ungenauigkeiten während der Präparation sowie Schwankungen im HPLC-System, wie sie etwa bei langen Messreihen durch Auswaschungs-Effekte oder Verunreinigungen auftreten können. Da sich die Konzentration des internen Standards 3,4-Dihydroxyzimtsäure stets mitverändert, können die Messwerte normalisiert werden und somit die Verfälschungen aufgehoben werden. Dem zu Folge sind Messungen mit einem internen Standard gegenüber solchen ohne internen Standard deutlich valider. Sowohl die Stimulation von humanen aortalen Endothelzellen (HAEC) mit Glukose bzw. Tumornekrosefaktor α, als auch die Infusion von Angiotensin II bei männlichen Mäusen mit anschließender Untersuchung der Aorta führt bekanntermaßen zu einem Anstieg von O2˙‾. Dieser Effekt konnte nun auch mit unserer neu etablierten HPLC-Methode nachgewiesen werden. Ebenfalls war ein Anstieg des aortalen O2˙‾-Spiegels bei Ratten nach induziertem Myokardinfarkt bereits in mehreren früheren Arbeiten beschrieben worden. Dieser lag auch bei Messung mit unserer neu etablierten HPLC-Methode eindeutig vor. Die Signale waren hierbei für die untersuchten Substanzen 2-OH-E+, DHE sowie für den internen Standard 3,4-Dihydroxyzimtsäure eindeutig und gut voneinander getrennt. Zusammenfassend konnte somit gezeigt werden, dass sich anhand mehrerer etablierter in vitro und in vivo Modelle erhöhter Sauerstoffradikal-Produktion der Anstieg von O2˙‾ auch mit unserer neuen Variante der HPLC mit isokrater Elution, internem Standard und Messung mittels elektrochemischem Detektor nachweisen ließ. Es handelt sich um eine zuverlässige und sensitive Methode, die zusätzliche Vorteile für die Messung von O2˙‾ mit sich bringt.
N2  - A new method of measuring superoxid anion in cardiovasvascular tissue.
KW  - HPLC
KW  - Sensitivität
KW  - Hyperoxidion
KW  - Superoxidanion
KW  - Dihydroethidium
KW  - HPLC
KW  - Sensitivity
KW  - Hyperoxidion Dihydroethidine
Y1  - 2012
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-70162
ER  -