TY  - THES
A1  - Lotz, Arietta Lucia
T1  - Eine in-vitro-Untersuchung des Einflusses von Angiotensin II und Sulforaphan auf die Modulation des oxidativen Stresses anhand der NFκB- und Nrf 2-Aktivität in LLC-PK1 Zellen
T1  - The influence of angiotensin II and sulforaphane on the modulation of oxidative stress in vitro based on NFκB and Nrf 2 activity in LLC-PK 1 cells
N2  - Ausgangspunkt der Arbeit ist die klinische Beobachtung, dass Patienten mit arteriellem Hypertonus vermehrt Nierenerkrankungen entwickeln. Dabei zeigten sich in der Subgruppenanalyse vor allem erhöhte Inzidenzen der Niereninsuffizienz und der Nierenzellkarzinome. Als möglicher Pathomechanismus steht das Renin-Angiotensin-Aldosteron-System (RAAS-System) im Vordergrund. Dabei wird postuliert, dass erhöhte Angiotensin II-Spiegel zu einem Missverhältnis zwischen den Oxidations- und Reduktionspartnern in der Zelle führen, wodurch sich das oxidative Potential der Zelle ändert, und es vermehrt zur Bildung von Radikalen (ROS) kommt, die meist ungepaarte Elektronen in der Valenzschale oder instabile Verbindungen enthalten, wodurch sie besonders reaktionsfreudig mit Proteinen, Lipiden, Kohlenhydraten und auch der DNA interagieren. In der Folge kommt es zu DNA-Veränderungen in Form von Doppel- oder Einzelstrangbrüchen, DNA-Protein-Crosslinks, Basenmodifikationen und Basenverlusten, wodurch sich ein hohes mutagenes Potential ergibt. Dieser Ansatz zur Pathophysiologie bestätigte sich auch an den hier verwendeten porkinen Nierenzellmodell. Dabei zeigte sich nicht nur eine Veränderung der genomischen Stabilität nach Exposition gegenüber erhöhten Angiotensin II-Spiegeln, sondern auch eine Veränderung der DNA in Abhängigkeit von der Expositionsdauer der Zellen. Als nächster Schritt konnte die Modulation der Transkriptionsfaktoren Nrf 2 und NF-κB durch die Behandlung mit Angiotensin II und Sulforaphan nachgewiesen werden. Bei der Behandlung mit Sulforaphan ließ sich eine Nrf 2-Induktion nachweisen mit vermehrter Expression von antioxidativen und detoxifizierender Enzyme. Weiterhin zeigte sich im Rahmen der Behandlung erniedrigte NF-κB-Level. Bei der Modulation durch Angiotensin II stellte sich zunächst ein signifikant erniedrigtes Level an Nrf 2 in den Zellen dar, das im Verlauf von 24 Stunden anstieg und konsekutiv ließ sich eine maximale Proteinexpression zwischen 24 und 48 Stunden messen. Weiterhin wiesen die Zellen, die mit Angiotensin II behandelt wurden, erhöhte NF-κB Mengen/Zelle auf. Zudem zeigte sich der Einfluss erhöhter Glucosekonzentrationen auf eine progrediente genomischen Instabilität, die Veränderung der Transkriptionsfaktoren mit erhöhter Nrf 2-Induktion und mit Deregulation des Transkriptionsfaktors NF-κB wurde durch die Behandlung mit Sulforaphan nachgewiesen. Aufgrund dieser Rolle in der Tumorgenese sind mittlerweile einige Bestandteile des NF-κB- und des Nrf 2-Signalweges und auch Nrf 2-Aktivatoren wie Sulforaphan wichtige Zielstrukturen für die Entwicklung neuer Medikamente und Therapieoptionen. Besonders zeigt sich hierbei die Wichtigkeit bei Diabetes induzierten kardiovaskulären Folgeschäden mit frühzeitiger medikamentöser Behandlung.
N2  - The starting point of this work is the clinical observation that patients with arterial hypertension develop more renal diseases. The subgroup analysis showed an increased incidence of renal insufficiency and renal cell carcinoma. The renin-angiotensin-aldosterone system (RAAS system) has been implicated as a possible pathomechanism. It is postulated that increased angiotensin II levels lead to a mismatch between the oxidation and reduction partners in the cell, which alters the oxidative potential of the cell and results in increased formation of radicals (ROS), most of which contain unpaired electrons in the valence shell or unstable compounds, making them particularly reactive with proteins, lipids, carbohydrates, and DNA. As a result, DNA changes occur in the form of double or single strand breaks, DNA-protein crosslinks, base modifications, and base losses, resulting in a high mutagenic potential. This approach to pathophysiology was also confirmed in the porky kidney cell model. This showed not only a change in genomic stability after exposure to elevated angiotensin II levels, but also a change in DNA depending on the duration of exposure of the cells. Next, modulation of the Nrf 2 and NF-κB transcription factors by angiotensin II and sulforaphane treatment was demonstrated. Treatment with sulforaphane showed Nrf 2 induction with increased expression of antioxidant and detoxifying enzymes. Furthermore, treatment revealed decreased NF-κB levels. When modulated by angiotensin II, cells initially showed a significantly reduced level of Nrf 2, which increased over the course of 24 hours. In addition, cells treated with angiotensin II demonstrated increased NF-κB levels. Moreover, the influence of increased glucose concentrations on progressive genomic instability, the alteration of transcription factors with increased Nrf 2 induction and with deregulation of the transcription factor NF-κB was demonstrated by treatment with sulforaphane. Because of this role in tumorigenesis, some components of the NF-κB and Nrf 2 signaling pathways, as well as Nrf 2 activators such as sulforaphane, are now important targets for the development of new drugs and therapeutic options. The importance of this is particularly evident in diabetes-induced cardiovascular complications with early drug treatment.
KW  - Oxidativer Stress
KW  - Angiotensin II
KW  - Sulforaphan
KW  - Nrf 2
Y1  - 2023
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-310573
ER  - 
TY  - THES
A1  - Link, Samuel
T1  - Aldosteron-vermittelte oxidative Nierenschädigung – Einfluss der antioxidativen Abwehr
T1  - Aldosterone-dependent oxidative kidney damage – influence of the antioxidative defense
N2  - Patienten mit erhöhten Aldosteronspiegeln zeigen eine gesteigerte Inzidenz für Malignome, insbesondere von Nierenzellkarzinomen. Das Ziel dieser Arbeit war es, die Aldosteron-vermittelte oxidative Nierenschädigung näher zu analysieren sowie die auf Zellebene gezeigte Beeinflussung der antioxidativen Schutzmechanismen im lebenden Organismus nachzuweisen und mögliche therapeutische Ansatzpunkte zu identifizieren. Dazu wurde ein Interventions-versuch über 28 Tage durchgeführt. Neben einer Aldosterongabe wurden folgende Interventionen verwendet: Spironolacton zur Blockade des Mineralkortikoid-Rezeptors (MR), Apocynin als Hemmstoff der NADPH-Oxidasen (Nox), L-NAME zur Blockade der NO-Synthasen (NOS), PDTC, einen Hemmstoff des Transkriptionsfaktors NF-kB sowie Sulforaphan, ein natürlicher Nrf2-Induktor. Eine weitere Gruppe erhielt Sulforaphan ohne additive Aldosterongabe. Die Nierenschäden wurden mittels histopathologischer Schädigungsscores und der Anzahl an DNA-Doppelstrangbrüche analysiert. Die Beeinflussung der antioxidativen Abwehr wurde durch die Aktivierung des Transkriptionsfaktors Nrf2 und durch die Quantifizierung antioxidativer Enzyme bestimmt.
Im Nierengewebe führte Aldosteron zu einer Zunahme von oxidativem Stress. Histologisch zeigte sich ein Anstieg von glomerulären Schäden. Auch kam es zu einer deutlichen Zunahme von Doppelstrangbrüchen der DNA. Des Weiteren konnten wir zeigen, dass Aldosteron auch in vivo zu einer Zunahme der Nrf2-Aktivität führte, wobei sich dies auf Proteinebene nicht in einer (dauerhaften) Synthesesteigerung von antioxidativen Enzymen wiederspiegelte und keinen ausreichenden Schutz des Nierengewebes bot. Für die Interventionsgruppen konnte keine signifikante Auswirkung auf das Vorliegen von oxidativem Stress gezeigt werden. Dies könnte an der Versuchsdauer bzw. an der gewählten Nachweismethode gelegen haben. Nichtsdestotrotz zeigte die Blockade der Nox durch Apocynin bzw. der NOS durch L-NAME eine effektive Reduktion der histologischen und genomischen Schäden. Die L-NAME-Gruppe wies dabei die höchsten Blutdruckwerte auf, diese waren auch zur Aldosterongruppe signifikant gesteigert. Die beobachteten Effekte waren folglich nicht durch den in der Aldosterongruppe erfolgten Blutdruckanstieg, sondern vielmehr durch den Anstieg von oxidativem Stress zu erklären. Ebenfalls blieb die Nrf2-Aktivität bei der Gabe von Apocynin und L-NAME weitgehend auf Kontrollniveau, was dafürspricht, dass der in der Aldosterongruppe messbare Nrf2-Anstieg am ehesten als Reaktion auf chronisch erhöhten oxidativen Stress erfolgte, welcher durch die Interventionen ausblieb. Die Blockade von NF-κB mittels PDTC führte zu vergleichbaren Effekten wie Apocynin und L-NAME. Das deutet darauf hin, dass Aldosteron über die Aktivierung von NF-κB die vermehrte Synthese von pro-oxidativen Enzymen wie Nox und NOS anregt. Die Gabe von Spironolacton hatte den stärksten protektiven Effekt, sowohl auf histologische Veränderungen als auch auf das Entstehen von DNA-Doppelstrangbrüchen, wobei die Nrf2-Aktivität in dieser Gruppe ebenfalls auf Kontrollniveau blieb. Die Aldosteroneffekte wurden folglich über den MR vermittelt. Eine additive Nrf2-Induktion mittels Sulforaphan konnte auch keinen (dauerhaften) Effekt auf die Synthese antioxidativer Enzyme zeigen. Dennoch zeigte diese Gruppe einen ähnlich effektiven Schutz vor den oxidativen Nierenschäden wie die Gabe von Spironolacton. Vieles spricht dafür, dass die Wirkung von Sulforaphan dabei über seine Wirkung als direktes Antioxidans bzw. Radikalfänger und nicht über den Nrf2-Weg zu erklären ist.
Aldosteron führt in der Niere über oxidativen Stress zu glomerulärer Fibrose und DNA-Schäden. Das könnte eine Erklärung für die gesteigerte Inzidenz von Nierenzellkarzinomen in Patienten mit erhöhten Aldosteronspiegeln darstellen. Unsere Ergebnisse sprechen dafür, dass Aldosteron über eine Signalkaskade über den MR zu einer Aktivierung von Nox und NOS führt. Der Aktivierung des Transkriptionsfaktors NF-κB scheint dabei durch die Synthese pro-oxidativer Enzyme eine Art Verstärker-Effekt zuzukommen. Als Reaktion auf den durch Aldosteron gesteigerten oxidativen Stress kommt es zu einer Aktivierung des antioxidativen Transkriptionsfaktors Nrf2, jedoch ohne dass dies zu einem ausreichenden Schutz des Nierengewebes führt. Mögliche therapeutische Ansatzpunkte für einen Schutz vor den durch Aldosteron vermittelten oxidativen Nierenschäden scheinen eher innerhalb der Aldosteronsignalkaskade, insbesondere in der Blockade des MR, als in der antioxidativen Abwehr zu liegen.
N2  - Patients with hyperaldosteronism show an increased risk for kidney cancer. It is known that aldosterone leads to oxidative stress and DNA damage through NADPH-Oxidase (Nox) and NO-Synthase (NOS) which could be a possible starting point for mutagenesis. We investigated aldosterone-dependent oxidative damage in rat kidney and the influence of the anti-oxidative pathway regulated by nuclear factor-erythroid-2-related factor 2 (Nrf2). In rats with hyperaldosteronism the following interventions were used: Inhibition of the mineralocorticoid receptor (MR) with spironolactone, blockade of Nox with apocynin, inhibition of NOS by L-NAME, blocking of the proinflammatory transcription factor NF-κB with PTDC and activating of the Nrf2 pathway with sulphoraphane. Mediated by the MR aldosterone led to glomerulosclerosis and vascular remodeling in the kidney. The changes in the glomeruli seemed only partially induced by oxidative stress and were prevented by sulforaphane. Spironolacton, apocynin, L-NAME and PTDC were able to prevent aldosterone-induced vascular remodeling, suggesting that oxidative stress mediated by the MR and influenced by NF-κB seems to play a major role in vascular remodeling. In kidney tissue aldosterone led to an increase in oxidative stress and a clear rise of Nrf2 activation. Protein levels of GCLC, TRX, HO-1 and SOD showed no persistent effects to the changes in Nrf2 activation. Despite the activation of Nrf2 aldosterone led to a clear rise of DNA double-strand breaks in cortex and medulla. The different interventions were all able to reduce the aldosterone-induced DNA damage significantly, with the spironolactone group showing the lowest counts of DNA double-strand breaks. Even though the L-NAME-group showed the highest blood pressure levels it also had reduced DNA damage, proving that the observed effects were independent of increased blood pressure. Sulforaphane led to the strongest Nrf2-activation but was not able to enhance the Nrf2 levels significantly higher than aldosterone. Nonetheless sulforaphane clearly prevented aldosterone-induced DNA-damage, suggesting that sulforaphane acted at least partially as a direct radical scavenger.
KW  - Aldosteron
KW  - Oxidativer Stress
KW  - Antioxidans
KW  - Spironolacton
KW  - Hypernephrom
KW  - Sulforaphane
KW  - Sulforaphan
Y1  - 2019
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-186037
ER  - 
TY  - THES
A1  - Ferber, Elena
T1  - Transkriptionelle, metabolische und physiologische Anpassung nach Selbstintoxikation mit reaktiven Sekundärstoffen: die Glukosinolat-Bombe in Arabidopsis thaliana
T1  - Transcriptional, metabolic and physiological adaptation after self-intoxication with reactive secondary substances: the glucosinolate bomb in Arabidopsis thaliana
N2  - In Brassicaceae werden bei einer Gewebszerstörung unreaktive Glukosinolate durch das Enzym Myrosinase hydrolysiert. Es entstehen reaktive Substanzen wie Isothiocyanate (ITCs). Da diese Reaktion sehr schnell erfolgt wird sie auch als Senföl-Glukosid-Bombe bezeichnet. In Arabidopsis thaliana erfolgt nach Verwundung und Pathogeninfektion eine massive Akkumulation des ITCs Sulforaphan (SF), welches eine reaktive elektophile Spezies (RES) darstellt. Zu der Gruppe der RES zählen auch einige Oxylipine mit einer α,β-ungesättigten Carbonylgruppen wie 12-oxo-Phytodiensäure (OPDA) oder Phytoprostan A1 (PPA1). Die Fähigkeit der kovalenten Modifikation von Peptiden und Proteinen gilt als essentiell sowohl für die toxischen als auch die Gen-induzierenden Eigenschaften der RES. Neben ihrer Reaktivität spielt auch die Lipophilie eine Rolle für die Fähigkeit über Membranen zu diffundieren und unspezifisch an Proteine zu binden. 
Die in der vorliegenden Arbeit durchgeführten Transkriptomanalysen an Arabidopsis-Keimlingen mit sub-toxischen Konzentrationen von SF, Benzylisothiocyanat (BITC) und dem Oxylipin Prostaglandin A1 (PGA1) zeigten, dass strukturell sehr verschiedene RES einen gemeinsamen Satz von 55 Genen induzieren. Unter diesen befanden sich verschiedene Hitzeschock-, Stressassoziierte- und Detoxifizierungsgene. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Aktivierung über eine Muster-spezifische Erkennung der RES erfolgt. Als einen möglichen Mechanismus der RES-vermittelten Geninduktion wird die Regulation durch die Veränderung des zellulären Redox-Potentials als Folge kovalenter Modifikation von GSH durch RES diskutiert. Die Untersuchung der GSH-Gehalte sowie des Redox-Potential nach Behandlung mit sub-toxischen RES-Konzentrationen in Arabidopsis-Keimlingen zeigte jedoch unter den getesteten Bedingungen keine Veränderung. 
Neben dem Erkennungs- und Signaltransduktionsmechanismus ist auch die biologische Bedeutung von RES für die Vermittlung einer Stresstoleranz noch weitgehend unklar. Durch die Untersuchung der Genexpression in Arabidopsis-Pflanzen nach Verwundung konnte gezeigt werden, dass eine wundinduzierte Akkumulation von SF zur Induktion einiger Gene der Hitzeschockreaktion (HSR) im Wildtyp, jedoch nicht in der myrosinase-defiziten tgg1tgg2-Mutante führte. Auch in der Transkriptomanalyse war nach RES-Gabe ebenfalls eine starke Induktion hitze-responsiver Gene, deren Regulation über den Masterregulator dem Hitzeschock-TF A1 vermittelt wird, zu beobachten. Besonders die Induktion der HSPs, welche als Chaperone fungieren und damit Thiolgruppen von Proteinen vor Modifikation schützen können, haben vermutlich bei chemischer Intoxikation protektive Eigenschaften für die Zellen. Tatsächlich zeigte sich unter den gewählten Bedingungen die hsfa1a,b,d,e-Mutante empfindlicher gegenüber ITCs als der Wildtyp. Die Fähigkeit, eine HSR ausbilden zu können, scheint in Arabidopsis bei chemischer Intoxikation eine bedeutende Rolle zu spielen. Eine Vorbehandlung mit RES wie SF, BITC oder dem HSP90-Inhibitor Radicicol in Arabidopsis-Keimlingen konnte eine Schutzwirkung vor chemischer Intoxikation vermitteln. Dies erfolgte jedoch nicht nach Behandlung mit moderater Hitze (zwei Stunden, 37 °C). Somit scheint die HSR alleine nicht ausreichend für den Aufbau eines effektiven Schutzes vor BITC-Intoxikation zu sein.
Als metabolische Antwort von Arabidopsis-Keimlingen auf Intoxikation mit RES konnte eine konzentrationsabhängige Senkung der maximalen Quantenausbeute am Photosystem II (PSII), sowie gleichzeitig eine Akkumulation an TAG-Spezies beobachtet werden. Diese metabolische Reaktion ist in der Literatur bereits als Schutz gegen Hitzestress beschrieben. Die Bedeutung der TAG-Akkumulation nach chemischem ITC-Stress ist noch unklar.
N2  - In Brassicaceae, unreactive glucosinolates are hydrolyzed by the enzyme myrosinase during tissue destruction. Reactive substances such as isothiocyanates (ITCs) are formed. Since this reaction takes place very quickly, it is also called mustard oil bomb. In Arabidopsis thaliana, after wounding and pathogen infection, a massive accumulation of the ITC Sulforaphan (SF) occurs, which is a reactive electophilic species (RES). The group of RES also includes some oxylipins with a α,β-unsaturated carbonyl group such as 12-oxo-phytodienoic acid (OPDA) or phytoprotane A1 (PPA1). The ability to covalently modify peptides and proteins is considered essential for the toxic and gene inducing properties of RES. In addition to their reactivity, lipophilia also plays a role in the ability to diffuse across membranes and bind unspecifically to proteins. 
The transcriptome analyses performed on Arabidopsis-seedlings with sub-toxic concentrations of SF, benzylisothiocyanate (BITC) and oxylipin prostaglandin A1 (PGA1) showed that structurally very different RES induce a common set of 55 genes. Among the induced genes were several heat shock, stress associated and detoxification genes. These observations suggest that activation is via pattern-specific recognition of RES. As a possible mechanism of RES-mediated gene induction, regulation by alteration of the cellular redox potential as result of covalent modification of GSH by RES is discussed. However, the study of GSH levels and redox potential after treatment with sub-toxic RES concentrations in Arabidopsis-seedlings showed no change under the tested conditions. 
In addition to the recognition and signal transduction mechanism for RES, the biological significance of RES for the mediation of stress tolerance is still largely unclear. By studying the gene expression of Arabidopsis-plants after wounding, it was shown that wound induced accumulation of SF led to the induction of some genes of heat shock response (HSR) in the wild type, but not in the myrosinase-deficient tgg1tgg2-mutant. Also in transcriptome analysis a strong induction of heat-responsive genes could be observed after RES administration, whose regulation is mediated by the master regulator of the heatshock-TF A1 (HSFA1). In particular, the induction of HSPs, which act as chaperones and can thus protect thiol groups of proteins from modification, presumably have protective properties for the cells during chemical intoxication. In fact, under the conditions tested, the hsfa1a,b,d,e-mutants were more sensitive to ITCs than the wild type. The ability to form HSR seems to play an important role in chemical intoxication in Arabidopsis. Pretreatment with RES such as SF, BITC or the HSP90 inhibitor radicicol in Arabidopsis-seedlings could mediate a protective effect against chemical intoxication. However, this was not done after treatment with moderate heat (two hours, 37 °C). Thus, HSR alone does not seem to be sufficient to provide effective protection against BITC intoxication.
As a metabolic response of Arabidopsis-seedlings to intoxication with RES, a concentration-dependent reduction of the maximum quantum yield at the photosystem II (PSII), as well as an accumulation of TAG species could be observed. This metabolic reaction is already described in the literature as protection against heat stress. The significance of TAG accumulation after chemical stress in the form of ITC intoxication is still unclear.
KW  - Ackerschmalwand
KW  - Glucosinolate
KW  - Isothiocyanate
KW  - reaktive elektrophile Spezies
KW  - Sulforaphan
KW  - Schmalwand <Arabidopsis>
Y1  - 2019
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-185116
ER  -