TY  - THES
A1  - Wagner, Rabea Marie
T1  - The Bacterial Exo- and Endo-Cytoskeleton Spatially Confines Functional Membrane Microdomain Dynamics in \(Bacillus\) \(subtilis\)
T1  - Das bakterielle Außen- und Innenskelett begrenzt die Mobilität funktionaler Membranmikrodomänen in \(Bacillus\) \(subtilis\) räumlich
N2  - Cellular membranes form a boundary to shield the inside of a cell from the outside. This is of special importance for bacteria, unicellular organisms whose membranes are in direct contact with the environment. The membrane needs to allow the reception of information about beneficial and harmful environmental conditions for the cell to evoke an appropriate response. Information gathering is mediated by proteins that need to be correctly organized in the membrane to be able to transmit information. Several principles of membrane organization are known that show a heterogeneous distribution of membrane lipids and proteins. One of them is functional membrane microdomains (FMM) which are platforms with a distinct lipid and protein composition. FMM move within the membrane and their integrity is important for several cellular processes like signal transduction, membrane trafficking and cellular differentiation. FMM harbor the marker proteins flotillins which are scaffolding proteins that act as chaperones in tethering protein cargo to FMM. This enhances the efficiency of cargo protein oligomerization or complex formation which in turn is important for their functionality. The bacterium Bacillus subtilis contains two flotillin proteins, FloA and FloT. They form different FMM assemblies which are structurally similar, but differ in the protein cargo and thus in the specific function.
In this work, the mobility of FloA and FloT assemblies in the membrane was dissected using live-cell fluorescence microscopy techniques coupled to genetic, biochemical and molecular biological methods. A characteristic mobility pattern was observed which revealed that the mobility of both flotillins was spatially restricted. Restrictions were bigger for FloT resulting in a decreased diffusion coefficient compared to FloA. Flotillin mobility depends on the interplay of several factors. Firstly, the intrinsic properties of flotillins determine the binding of different protein interaction partners. These proteins directly affect the mobility of flotillins. Additionally, binding of interaction partners determines the assembly size of FloA and FloT. This indirectly affects the mobility, as the endo-cytoskeleton spatially restricts flotillin mobility in a size-dependent manner. Furthermore, the extracellular cell wall plays a dual role in flotillin mobility: its synthesis stimulates flotillin mobility, while at the same time its presence restricts flotillin mobility. As the intracellular flotillins do not have spatial access to the exo-cytoskeleton, this connection is likely mediated indirectly by their cell wall-associated protein interaction partners. Together the exo- and the endo-cytoskeleton restrict the mobility of FloA and FloT.
Similar structural restrictions of flotillin mobility have been reported for plant cells as well, where the actin cytoskeleton and the cell wall restrict flotillin mobility. These similarities between eukaryotic and prokaryotic cells indicate that the restriction of flotillin mobility might be a conserved mechanism.
N2  - Zelluläre Membranen bilden eine Barriere um das Zellinnere von dem -äußeren abzuschirmen. Das ist insbesondere bei Bakterien wichtig, einzellige Organismen, deren Membranen in direktem Kontakt zu ihrer Umgebung stehen. Die Membran muss es ermöglichen, Informationen über mögliche vorteilhafte oder schädliche Einflüsse in der Umgebung wahrzunehmen, damit die Zelle dementsprechend eine Reaktion initiieren kann. Die Informationsaufnahme und die resultierenden Reaktionen werden von Membranproteinen in Gang gesetzt, deren Organisation in der Membran Voraussetzung für ihre Funktionalität ist. Mehrere Prinzipien zur Membranorganisation sind bekannt, die alle eine heterogene Verteilung von Proteinen und Lipiden zu Grunde legen. Ein Beispiel für ein solches Prinzip sind funktionelle Membranmikrodomänen (FMM), Plattformen mit einer besonderen Lipid- und Proteinzusammensetzung. FMM bewegen sich in der Membran und ihre Integrität ist für viele zelluläre Prozesse wichtig, zum Beispiel für Signaltransduktion, Membrantransport oder zur zellulären Differenzierung. Flotilline sind Markerproteine für FMM. Sie bilden eine Art Gerüst und funktionieren als Chaperone, indem sie die sogenannten Frachtproteine in den FMM binden. Dort wird die Effizienz der Oligomerisierung oder Komplexbildung der Frachtproteine gesteigert, was für ihre Funktionalität und die ihrer assoziierten Prozesse von Bedeutung ist. In dem Bakterium Bacillus subtilis gibt es zwei Flotilline, FloA und FloT. Diese formen FMM Plattformen, die zwar strukturell ähnlich sind, sich aber in ihren Frachtproteinen und somit auch in ihren spezifischen Funktionen unterscheiden.
In dieser Arbeit wurde die Mobilität der FloA- und FloT-abhängigen Plattformen in der Membran untersucht. Dafür wurden Technologien der Fluoreszenzmikroskopie mit genetischen, biochemischen und molekularbiologischen Ansätzen kombiniert. Charakteristische Bewegungsmuster wurden beobachtet, die zeigten, dass die Beweglichkeit beider Flotilline räumlich begrenzt war. Dabei war die Einschränkung für FloT größer, und dementsprechend der Diffusionskoeffizient kleiner verglichen mit FloA. Die Mobilität von FloA und FloT hängt von dem Zusammenspiel mehrerer Faktoren ab. Zum einen bestimmen intrinsische Eigenschaften der Flotillinproteine ihre Fähigkeit verschiedene Interaktionspartner zu binden. Diese wirken sich dann direkt auf die Mobilität von Flotillinen aus. Des Weiteren bestimmt die Bindung verschiedener Interaktionspartner auch die Größe der FloA- und FloT- abhängigen Plattformen. Die resultierenden Größen beeinflussen die Mobilität indirekt, da das zelluläre Innenskelett die Flotillinmobilität räumlich in größenabhängiger Weise begrenzt. Außerdem spielt das Außenskelett der Zelle, die Zellwand, eine zweifache Rolle: die Zellwandsynthese fördert die Mobilität der Flotilline, während die Zellwand an sich gleichzeitig die Mobilität der Flotilline einschränkt. Da Flotilline räumlich keine Verbindung zum Außenskelett haben, wird diese Verbindung wahrscheinlich durch ihre Zellwand-assoziierten Interaktionspartner übermittelt. Zusammenfassend beschränken das Außen- und das Innenskelett die Mobilität von FloA und FloT.
In Pflanzen wurden ähnliche strukturelle Beschränkungen der Mobilität von Flotillinen durch das Aktin- Zytoskelett und die Zellwand beschrieben. Diese Ähnlichkeit zwischen prokaryotischen und eukaryotischen Zellen deutet darauf hin, dass die Beschränkung der Mobilität der Flotillin-Plattformen ein konservierter Mechanismus sein könnte.
KW  - Heubacillus
KW  - Bakterienzellwand
KW  - Plasmamembran
KW  - Zellskelett
KW  - Bacillus subtilis
KW  - functional membrane microdomains
KW  - membrane dynamics
KW  - bacterial lipid rafts
KW  - cytoskeleton
KW  - cell wall
Y1  - 2021
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-217458
ER  - 
TY  - THES
A1  - Spindler, Markus
T1  - The role of the adhesion and degranulation promoting adapter protein (ADAP) in platelet production
T1  - Die Rolle des adhesion and degranulation promoting adapter Proteins (ADAP) in der Thrombopoese
N2  - Bone marrow (BM) megakaryocytes (MKs) produce platelets by extending proplatelets into sinusoidal blood vessels. Although this process is fundamental to maintain normal platelet counts in circulation only little is known about the regulation of directed proplatelet formation. 
As revealed in this thesis, ADAP (adhesion and degranulation promoting adapter protein) deficiency (constitutive as well as MK and platelet-specific) resulted in a microthrombocytopenia in mice, recapitulating the clinical hallmark of patients with mutations in the ADAP gene. The thrombocytopenia was caused by a combination of an enhanced removal of platelets from the circulation by macrophages and a platelet production defect. This defect led to an ectopic release of (pro)platelet-like particles into the bone marrow compartment, with a massive accumulation of such fragments around sinusoids. In vitro studies of cultured BM cell-derived MKs revealed a polarization defect of the demarcation membrane system, which is dependent on F-actin dynamics. ADAP-deficient MKs spread on collagen and fibronectin displayed a reduced F-actin content and podosome density in the lowest confocal plane. In addition, ADAP-deficient MKs exhibited a reduced capacity to adhere on Horm collagen and in line with that the activation of beta1-integrins in the lowest confocal plane of spread MKs was diminished. These results point to ADAP as a novel regulator of terminal platelet formation. 
Beside ADAP-deficient mice, three other knockout mouse models (deficiency for profilin1 (PFN1), Wiskott-Aldrich-syndrome protein (WASP) and Actin-related protein 2/3 complex subunit 2 (ARPC2)) exist, which display ectopic release of (pro)platelet-like particles. As shown in the final part of the thesis, the pattern of the ectopic release of (pro)platelet-like particles in these genetically modified mice (PFN1 and WASP) was comparable to ADAP-deficient mice. Furthermore, all tested mutant MKs displayed an adhesion defect as well as a reduced podosome density on Horm collagen. These results indicate that similar mechanisms might apply for ectopic release.
N2  - Die Megakaryozyten (MKn) des Knochenmarks produzieren Thrombozyten durch die Ausbildung und Verlängerung von Proplättchen in die sinusoidalen Blutgefäße. Obwohl dieser Prozess für die Aufrechterhaltung der normalen Thrombozytenzahl in der Blutzirkulation von grundlegender Bedeutung ist, ist über die Regulation der gerichteten Proplättchenbildung und damit der Thrombozytenproduktion nur wenig bekannt.
Wie in dieser Arbeit gezeigt, führte sowohl die konstitutive als auch die MK- und Thrombozyten-spezifische Defizienz von ADAP (adhesion and degranulation promoting adapter protein) in Mäusen zu einer Mikrothrombozytopenie, ähnlich wie dies bei Patienten mit Mutationen im ADAP Gen zu beobachten ist. Die Thrombozytopenie wurde durch eine Kombination aus einer verstärkten Entfernung (clearance) von Thrombozyten aus der Zirkulation durch Makrophagen und einem Defekt in der Thrombozytenproduktion verursacht. Dieser Defekt führte zu einer ektopischen Freisetzung von Proplättchen-ähnlichen Partikeln ins Knochenmark und zur Anreicherung derartiger Fragmente um die Sinusoiden. In vitro-Studien an kultivierten MKn aus Zellen des Knochenmarks zeigten einen Polarisationsdefekt des Demarkationsmembransystems, welcher abhängig von der F-Aktin-Dynamik ist. ADAP-defiziente MKn wiesen nach Spreading auf Kollagen und Fibronektin einen reduzierten F-Aktin Gehalt und eine geringere Dichte von Podosomen in der untersten konfokalen Ebene auf. Zusätzlich zeigten ADAP-defiziente MKn beim Spreading Versuch eine verminderte Kapazität sich an Horm Kollagen anzuhaften, und die Aktivierung von beta1-Integrinen war in der untersten konfokalen Ebene von MKn reduziert. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass ADAP ein wichtiges Protein im terminalen Schritt der Thrombozytenproduktion ist. 
Neben ADAP-defizienten Mäusen existieren drei weitere Knockout-Mausmodelle (für die Proteine: Profilin1 (PFN1), Wiskott-Aldrich-Syndrom-Protein (WASP) und Actin-related protein 2/3 complex subunit 2 (ARPC2)), die eine ektopische Freisetzung von Proplättchen-ähnlichen Partikeln zeigen. Wie im letzten Teil der Arbeit gezeigt, war das Muster der ektopischen Freisetzung von Proplättchen-ähnlichen Partikeln in diesen genetisch veränderten Mäusen (PFN1 und WASP) zu den ADAP-defizienten Mäusen vergleichbar. Darüber hinaus zeigten die MKn von den knockout Mäusen einen Adhäsionsdefekt sowie eine reduzierte Podosomendichte auf Horm Kollagen. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass ähnliche Mechanismen für die Freisetzung von Proplättchen-ähnlichen Partikeln in das Knochenmark verantwortlich sein könnten.
KW  - Adhesion and degranulation promoting adapter protein
KW  - Megakaryocyte
KW  - ectopic release
KW  - platelet
KW  - cytoskeleton
Y1  - 2020
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-200977
ER  - 
TY  - THES
A1  - Scheller [geb. Birkholz], Inga
T1  - Studies on the role of actin-binding proteins in platelet production and function in mice
T1  - Zur Rolle von Aktin-bindenden Proteinen in der Bildung und der Funktion von Thrombozyten in der Maus
N2  - Platelet activation and aggregation at sites of vascular injury involves massive cytoskeletal re-organization, which is required for proper platelet function. Moreover, the cytoskeleton plays central roles in megakaryo- and thrombopoiesis. Thus, cytoskeletal protein aberrations can be the underlying reason for many pathological phenotypes. Although intensive research is carried out to identify the key players involved in cytoskeletal reorganization, the signaling cascades orchestrating these complex processes are still poorly understood. This thesis investigates the role of three actin-binding proteins, Coactosin-like (Cotl) 1, Profilin (Pfn) 1 and Thymosin (T) β4, in platelet formation and function using genetically modified mice.
ADF-H-containing proteins such as Twinfilin or Cofilin are well characterized as regulators of thrombopoesis and cytoskeletal reorganization. Although Cotl1 belongs to the ADF-H protein family, lack of Cotl1 did not affect platelet count or cytoskeletal dynamics. However, Cotl1-deficiency resulted in significant protection from arterial thrombus formation and ischemic stroke in vivo. Defective GPIb-vWF interactions and altered second wave mediator release present potential reasons for the beneficial effect of Cotl1-deficiency. These results reveal an unexpected function of Cotl1 as a regulator of thrombosis and hemostasis, establishing it as a potential target for a safe therapeutic therapy to prevent arterial thrombosis or ischemic stroke. 
Recent studies showed that the organization of the circumferential actin cytoskeleton modulates calpain-mediated αIIbβ3 integrin closure, thereby also controlling αIIbβ3 integrin localization. The second part of this thesis identified the actin-sequestering protein Pfn1 as a central regulator of platelet integrin function as Pfn1-deficient platelets displayed almost abolished αIIbβ3 integrin signaling. This translated into a profound protection from arterial thrombus formation and prolonged tail bleeding times in vivo which was caused by enhanced calpain-dependent integrin closure. These findings further emphasize the importance of a functional actin cytoskeleton for intact platelet function in vitro and in vivo. 
Tβ4 is a moonlighting protein, acting as one of the major actin-sequestering proteins in cells of higher eukaryotes and exerting various paracrine functions including anti-inflammatory, immunomodulatory and pro-angiogenic effects. Although excessively studied, its role for cytoskeletal dynamics, the distinction between endo- and exogenous protein function and its uptake and release mechanisms are still poorly understood. Constitutive Tβ4-deficiency resulted in thrombocytopenia accompanied by a largely diminished G-actin pool in platelets and divergent effects on platelet reactivity. Pre-incubation of platelets with recombinant Tβ4 will help to understand the function of endo- and exogenous protein, which is under current investigation.
N2  - Die Aktivierung und Aggregation von Thrombozyten bei Gefäßverletzungen zieht massive Umstrukturierungen des Zytoskeletts nach sich, die eine Voraussetzung für die intakte Funktion der Zellen darstellen. Des Weiteren nimmt das Zytoskelett eine zentrale Rolle in der Megakaryo- und Thrombopoese ein. Daher können Anomalien zytoskeletaler Proteine eine Vielzahl von Krankheitsbildern verursachen. Obwohl intensiv an den beteiligten Proteinen geforscht wird, sind die Signalkaskaden, die den komplexen Vorgang der Umstrukturierung des Zytoskeletts steuern, noch weitgehend unbekannt. In dieser Dissertation wurden drei Aktin-bindende Proteine, Coactosin-like (Cotl) 1, Profilin (Pfn) 1 und Thymosin (T) β4, hinsichtlich ihrer Rolle für die Bildung und Funktion von Thrombozyten mittels genetisch veränderter Mäuse untersucht. 
Proteine wie Twinfilin oder Cofilin, die ADF-H-Domänen enthalten, sind oftmals an der Thrombopoese sowie an zytoskeletaler Umstrukturierung beteiligt. Obgleich Cotl1 der ADF-H Proteinfamilie zugehörig ist, konnte in Cotl1-defizienten Mäusen weder eine Veränderung der Thrombozytenzahlen, noch der zytoskeletalen Dynamik festgestellt werden. Unerwarteter-weise zog eine Cotl1-Defizienz in vivo einen Schutz vor arterieller Thrombose und Schlaganfall nach sich. Defekte GPIb-vWF-Interaktionen sowie eine veränderte Freisetzung von sekundären intrazellulären Mediatoren zeigen mögliche Gründe für den schützenden Effekt einer Cotl1-Defizienz auf. Diese Ergebnisse verdeutlichen, dass Cotl1 ein zentraler Regulator von Thrombose und Hämostase ist und etabliert es damit als potentielle antithrombotische Zielstruktur für eine effektive und sichere Behandlung von kardio- und zerebrovaskulären Erkrankungen.
Studien zeigten, dass die Organisation des kortikalen Aktin-Zytoskeletts die Calpain-vermittelte αIIbβ3-Integrin-Inaktivierung moduliert und dadurch die Lokalisation der Integrine kontrolliert. Der zweite Teil dieser Dissertation identifizierte das Aktin-komplexierende Molekül Pfn1 als zentralen Regulator der Integrinfunktion in Thrombozyten, da Pfn1-defiziente Thrombozyten eine stark verminderte Reaktivität nach αIIbβ3-Integrin Aktivierung zeigten. Dies führte zu einem profunden Schutz vor arterieller Thrombusbildung und verlängerten Blutungszeiten in vivo, der durch eine verstärkte Calpain-vermittelte Integrin-Inaktivierung verursacht wurde. Diese Befunde unterstreichen erneut die zentrale Bedeutung eines funktionales Aktin-Zytoskeletts für die Aufrechterhaltung der Thrombozytenfunktion in vitro und in vivo. 
Tβ4 ist ein bivalentes Protein, das einerseits eine Funktion als Aktin-komplexierendes Protein in Zellen höherer Eukaryoten ausübt und andererseits unterschiedliche parakrine Funktionen hat, zu denen entzündungshemmende, immunmodulierende und pro-angiogene Wirkungen zählen. Obwohl intensiv an Tβ4 geforscht wird, ist seine Bedeutung für die Dynamik des Zytoskeletts sowie die Unterscheidung zwischen endo- und exogener Proteinfunktion und seine Aufnahme- und Freisetzungsmechanismen kaum verstanden. Konstitutive Tβ4-Defizienz zog eine Thrombozytopenie, begleitet von einem stark verminderten G-Aktin-Gehalt in Thrombozyten und gegensätzlichen Effekten auf die Thrombozytenreaktivität, nach sich. Der Effekt von rekombinant exprimiertem Tβ4 auf Thrombozyten, der derzeit untersucht wird, wird zum besseren Verständnis der endo- und exogenen Proteinfunktion, beitragen.
KW  - Thrombozyt
KW  - Zellskelett
KW  - Maus
KW  - platelet
KW  - cytoskeleton
KW  - Thymosin b4
KW  - Profilin
KW  - Coactosin-like
Y1  - 2020
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-168582
ER  - 
TY  - THES
A1  - Wenzel, Jens
T1  - Regulation of TLR-induced macrophage responses by cytoskeleton-associated phosphoproteins
T1  - Regulation der Antwort von Makrophagen auf TLR-Stimulation durch Zytoskelett-assoziierte Phosphoproteine
N2  - Toll-like receptors (TLR) are pattern recognition receptors (PRR) by which macrophages (MØ) sense pathogen-associated molecular patterns (PAMPs). The recognition of lipopolysaccharide (LPS), the PAMP of gram negative bacteria, by TLR4 triggers signaling cascades and leads to the pro-inflammatory activation of the cells. A recent quantitative and kinetic analysis of the phosphoproteome of LPS-activated primary macrophages highlighted the cytoskeleton as a cell compartment with an enriched protein phosphorylation. In total 44 cytoskeleton-associated proteins were regulated by this post-translational modification and thus might be involved in the control and regulation of key macrophage functions like spreading, motility and phagocytosis. 
To investigate the control of cytoskeleton-associated cell functions by TLR4 activation, we first developed a method to quantitatively measure the spreading response of bone marrow MØ after stimulation with LPS. Fluorescence microscopy was used for cell imaging and visualisation of the MØ contact area. In collaboration with the Fraunhofer Institute Erlangen, we developed and validated a software tool for the semi-automated segmentation and quantitation of MØ fluorescence microscopy data, which allowed fast, robust and objective image analysis. Using this method, we observed that LPS caused time-dependent spreading, which was detectable after 1-2 h and maximal after 24 h. Next, the impact of genetic or pharmacological inhibition of known TLR signaling components was investigated. Deficiency in the adapter protein MYD88 strongly reduced spreading activity at the late time points, but had no impact early after LPS-stimulation. A similar effect was observed upon pharmacological inhibition of ERK1/2 signaling, indicating that ERK1/2 mediates MYD88-dependent MØ spreading. In contrast, MØ lacking the MAPK p38 were impaired in the initial spreading response but responded normally 8-24 h after stimulation. The genetic deletion of the MAPK phosphatases DUSP1 and DUSP16 resulted in impaired late spreading, corroborating the essential role for functional MAPK signaling in TLR4-driven MØ spreading. 
To identify the contribution of other cytoskeletal phosphoproteins to MØ spreading, siRNA knockdown of selected candidate genes in primary murine MØ was employed and combined with automated quantitative image analysis. These experiments revealed a functional role for the Myosins MYO1e and MYO1f in MØ spreading. These motor proteins are strongly phosphorylated in LPS-activated MØ. Because of their ability to simultaneously bind to actin filaments and cell membrane or other proteins, we investigated their role in phagocytosis, cytokine production and antigen presentation. Phagocytosis and killing of bacteria were not affected in Myo1e-/- macrophages. However, MYO1e plays a role in chemokine secretion and antigen presentation processes. MCP1 (CCL2) release was selectively increased in Myo1e-deficient MØ and dendritic cells (DC), while cytokine secretion was unaffected. Furthermore, macrophages and DCs lacking MYO1e showed lower levels of MHC-II on the cell surface. However, mRNA levels of CCL2 and of MHC-II were unaltered. These data suggest a role for MYO1e in the transport of selected chemokines and of MHC-II molecules to the cell surface. MHC-II-restricted antigen presentation assays revealed an impaired capacity of macrophages and DC lacking MYO1e to stimulate antigen-specific T cells, suggesting that the reduced MHC-II expression is functionally relevant.
Taken together, in this study first a quantitative image analysis method was developed which allows the unbiased, robust and efficient investigation of the macrophage spreading response. Combination of this method with siRNA knockdown of selected cytoskeleton-associated phosphoproteins led to the identification of MYO1e and MYO1f as regulators of macrophage spreading. Furthermore, we identified MYO1e in MØ and DC to be essential for the intracellular transport of CCL2 and MHC-II to the cell surface and for optimal stimulation of antigen-specific CD4 T cells.
N2  - Toll-like Rezeptoren (TLR) sind Mustererkennungsrezeptoren (PRR) durch die Makrophagen (MØ) pathogen-assoziierte molekulare Muster (PAMPs) erkennen. Die Erkennung von Lipopolysacchariden (LPS), dem PAMP gramnegativer Bakterien, durch TLR4 löst Signalkaskaden aus, die zu einer pro-inflammatorischen Aktivierung der Zellen führen. Eine quantitative und kinetische Analyse des Phosphoproteoms LPS-aktivierter primärer Makrophagen identifizierte das Zytoskelett als ein Zellkompartiment mit gesteigerter Proteinphosphorylierung. Insgesamt wurden 44 Zytoskelett-assoziierte Proteine identifiziert, die durch diese post-translationale Modifikation reguliert wurden und demzufolge an der Regulation wichtiger Zellfunktionen von Makrophagen wie Spreading, Motilität und Phagozytose beteiligt sein könnten. 
Um die Kontrolle Zytoskelett-vermittelter Zellfunktionen nach TLR4 Aktivierung zu untersuchen, entwickelten wir zunächst eine Methode zur quantitativen Messung der Spreadingantwort von Knochenmarksmakrophagen nach LPS Stimulation. Die Visualisierung der Zellen sowie ihrer Kontaktfläche erfolgte hierbei mittels Fluoreszenzmikroskopie. Für eine schnelle, robuste und objektive Analyse der Fluoreszenzaufnahmen entwickelten und validierten wir in Kollaboration mit dem Fraunhofer Institut in Erlangen eine Software zur halbautomatischen Segmentierung und Quantifizierung der Kontaktfläche. Unter Verwendung dieser Methode konnte eine zeitabhängige LPS-induzierte Zunahme der Zellkontaktfläche beobachtet werden, die nach 1-2 Stunden detektierbar war und ein Maximum nach 
24 Stunden erreichte. Durch den Einsatz pharmakologischer Inhibitoren sowie genetisch veränderter Zellen wurde anschließend der Einfluss bekannter TLR4-Signalwegkomponenten untersucht. Die genetische Defizienz des Adapterproteins MYD88 führte hierbei zu einer stark reduzierten Spreadingaktivität der Zellen während der späten LPS Stimulationsphase, wohingegen das initiale Spreading nicht beeinflusst wurde. Ein vergleichbarer Effekt konnte unter Verwendung eines pharmakologischen Inhibitors zur Hemmung des ERK1/2 Signalweges identifiziert werden. Diese Beobachtungen deuten darauf hin, dass ERK1/2 für die Weiterleitung des MYD88 vermittelten Spreading notwendig ist. Im Gegensatz dazu wurde in p38-defizienten Makrophagen ein beeinträchtigtes initiales Spreading beobachtet, wohingegen das späte Spreading nach 8 – 24 Stunden nicht beeinflusst war. Die genetische Deletion der MAPK Phosphatasen DUSP1 und DUSP16 resultierte ebenfalls in einer Minderung des späten Spreadings, ebenfalls ein Hinweis auf die essentielle Rolle funktioneller MAPK Signalwege. 
Um die Beteiligung weiter Zytoskelett-Phosphoproteine am Zellspreading zu identifizieren, wurde die Expression ausgewählter Kandidatengene in primären Makrophagen mittels spezifischer siRNA unterdrückt und das Zellspreading mit Hilfe der entwickelten Software quantifiziert. Diese Versuche zeigten eine funktionelle Rolle der Myosine MYO1e und MYO1f. Diese Motorproteine weisen ebenfalls eine starke Phosphorylierung nach LPS Stimulation auf. Aufgrund ihrer Eigenschaft simultan mit Aktinfilamenten und Zellmembranen sowie anderen Proteinen zu interagieren, untersuchten wir ihre Rolle während der Phagozytose, Zytokinfreisetzung und Antigenpräsentation. Obwohl Myo1e defiziente Makrophagen keine Beeinträchtigung der Phagozytose oder Abtötung von Bakterien aufwiesen, spielte das Motorprotein eine wichtige Rolle in der Chemokinfreisetzung und Antigenpräsentation. Interessanterweise war die Sekretion des Chemokins MCP1 (CCL2) in Myo1e-defizienten Makrophagen und dendritischen Zellen (DC) selektiv erhöht, während die Zytokinfreisetzung unbeeinträchtigt war. Des Weiteren wiesen Myo1e KO Makrophagen und DC eine reduzierte MHC-II Oberflächen-Expression auf, obwohl die MHC-II als auch die CCL2 Transkription auf mRNA Ebene nicht beeinflusst war. Diese Daten legen nahe, dass MYO1e während des Transports bestimmter Chemokine, sowie von MHC-II zur Zelloberfläche eine wichtige Rolle spielt. Zudem zeigten Myo1e KO Makrophagen und DC in einem MHC-II-abhängigen Antigenpräsentationsassay eine abgeschwächte Fähigkeit zur Antigen-spezifischen T-Zell Aktivierung, was die funktionelle Relevanz der reduzierten Expression von MHC-II nahelegt.
Zusammenfassend wurde in dieser Studie zunächst eine Methode zur quantitativen Bildanalyse entwickelt, welche eine unvoreingenommene, robuste und effiziente Untersuchung des Spreadings von Makrophagen erlaubte. Die Kombination dieser Methode mit dem spezifischen siRNA Knockdown ausgewählter Zytoskelett-assoziierter Phosphoproteine führte zur Identifizierung von MYO1e und MYO1f als wichtige Regulatoren dieser Zellfunktion. Darüber hinaus konnte in Makrophagen und DC eine essentielle Rolle für MYO1e im intrazellulären Transport von CCL2 und MHC-II an die Zelloberfläche identifiziert werden, sowie dessen Notwendigkeit für eine vollständige Aktivierung antigen-spezifischer CD4 T Zellen.
KW  - Toll-like-Rezeptoren
KW  - Makrophage
KW  - Phosphoproteine
KW  - Zellskelett
KW  - macrophage
KW  - cytoskeleton
KW  - phosphorylation
KW  - TLR4
Y1  - 2014
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-98843
ER  - 
TY  - THES
A1  - Müller, Nora
T1  - Masern Virus Interferenz mit T-Zell-Aktivierung : Einfluß auf Zytoskelettdynamik, Mobilität und Interaktion mit Dendritischen Zellen
T1  - Measles Virus interference with T cell activation: effect on cytoskeleton dynamics, mobility and interaction with dendritic cell
N2  - Der Kontakt humaner T-Zellen mit dem MV Glykoproteinkomplex interferiert mit der CD3/CD28 stimulierten Aktivierung von PI3/Akt-Kinase Signalwegen. Damit verbunden ist der ineffiziente Transport PH-Domänen-enthaltender Proteine in Membran-rafts, wie der Akt-Kinase und Vav, den Guaninnukleotid-Austauschfaktor von Rho GTPasen. Es konnte gezeigt werden, dass infolge des MV-Kontaktes die CD3/CD28 stimulierte Aktivität der Rho GTPasen Cdc42 und Rac1 inhibiert ist. Dagegen war in MV-behandelten Zellen eine leichte RhoA Aktivierung festzustellen. Rho GTPasen spielen eine kritische Rolle in der Regulation von Zytoskelettorganisation von T-Lymphozyten. Übereinstimmend damit wurde gezeigt, dass der Kontakt mit MV die CD3/CD28 costimulierte Aktivierung und Polymerisation des F-Aktins inhibiert. Damit verbunden ist die reduzierte Fähigkeit MV-behandelter T-Zellen auf Fibronektin- und mit CD3/CD28 Antikörpern-beschichteten Objektträgern zu polarisieren. Die Ausbildung F-Aktin-getriebener morphologischer Veränderungen, wie Filopodien, Lamellipodien und Uropodien, ist drastisch reduziert. Rasterelektronenmikroskopische Auf-nahmen zeigten in nicht-stimulierten und CD3/CD28 costimulierten MV-behandelten T-Zellen einen nahezu kompletten Verlust an Mikrovilli und Lamellipodien. Die Bindung von MV induziert die Dephosphorylierung des F-Aktin–bindenden Proteins Cofilin und der ERM-Proteine. Es konnte demonstriert werden, dass der MV-Kontakt die Ausbildung einer reifen immunologischen Synapse stört. Trotz der morphologischen Veränderungen konjugieren MV-behandelte T-Zellen mit DCs. Die Anzahl MV-behandelter T-Zellen, die mit DCs inter-agieren, ist vergleichbar mit der mock-behandelter T-Zellen. Allerdings zeigt die 3-dimensionale Rekonstruktion der DC/T-Zell-Kontaktzone, dass in MV-behandelten T-Zellen die zentrale Akkumulation und Clusterbildung des CD3-Moleküls gestört ist und keine monozentrische Synapse ausbildet wird. Desweiteren erfolgt die Relokalisation des MTOC in T-Zellen in Richtung der DC unvollständig. Zusammenfassend kann gesagt werden, dass der MV Glykoproteinkomplex mit essentiellen Schritten einer erfolgreichen T-Zell-Aktivierung während der APC/T-Zell-Interaktion interferiert.
N2  - It was previously shown, that CD3/CD28-induced activation of PI3/Akt kinase pathway and proliferation are impaired in T cells after contact with the MV glycoprotein complex. As a result of PI3 kinase inactivation, membrane recruitment of PH domain containing proteins such as Akt kinase and the Rho GEF Vav, was abolished after CD3/CD28 coligation. The binding of MV interferes with CD3/CD28 coligation induced GTP-loading of the Rho GTPases, Cdc42 and Rac1. GTP-loading of RhoA was not impaired after MV treatment. Rather, RhoA was slightly activated by MV alone and this was enhanced upon CD3/CD28 ligation. Consisting with the failure of CD3/CD28 ligation to induce GTP-loading of Cdc42 and Rac1, polymerization of F-actin and morphological changes required for the formation of a contact plane such relaxation, flattening did not occur in MV treated T cells. MV treatment also efficiently interfered with the ability of T cells to adhere to ECM components. In contrast to mock treated, the majority of MV exposed T cells failed to aquire a polar front-rear organization. Thus, MV induced signaling efficiently impairs stimulation dependent reorganisation of the F-actin cytoskeleton and adhesion in T cells. As revealed by scanning electron microscopy, exposure of T cells to MV induced an almost complete breakdown of microvillar structures which could also not be restored upon CD3/CD28 costimulation. The almost complete collapse of membrane protrusions in MV treated cells was associated with reduced phosphorylation levels of cofilin and ERM proteins. The ability of MV exposed T cells to interact with DCs and form DC/T-cells conjugates is not affected. MV signaling to T cells interfered with clustering and recruitment of CD3 into the central supramolecular activation cluster of the IS. MV also prevents the redistribution of the MTOC in T cells towards the synapse. In summary, MV interferes with stimulated cytoskeleton remodeling, and this disturbes the ability of T cells to adhere, spread and cluster receptors essential for sustained activation. The signal given by the MV glycoprotein complex apparently prevents essential steps in APC/T cells interactions which are required for migration and successful activation.
KW  - Masernvirus
KW  - T-Lymphozyt
KW  - Immunsuppression
KW  - Zellskelett
KW  - Dendritische Zelle
KW  - Masern Virus
KW  - Immunsuppression
KW  - Costimulation
KW  - Zytoskelett
KW  - Dendritische Zellen
KW  - measles virus
KW  - immunosuppression
KW  - costimulation
KW  - cytoskeleton
KW  - dendritic cells
Y1  - 2006
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-17953
ER  - 
TY  - THES
A1  - Beland, Heidi
T1  - Molekulare Charakterisierung eines Tropomodulin-Homologen des Fuchsbandwurms E. multilocularis
T1  - Molecular characterisation of a tropomodulin- homologue from E. multilocularis
N2  - Zusammenfassend konnte im Rahmen dieser Arbeit erstmals ein Tropomodulin- homologer Faktor aus einem Plathelminthen auf molekularer Ebene charakterisiert werden. Zudem wurde die Interaktion des kodierten Faktors mit einem kürzlich isolierten Tropomyosin- Homologen aus E. multilocularis nachgewiesen. Basierend auf diesen Daten ist es nun möglich, die biologische Signifikanz der Interaktion von Elp mit EmTY weiterführend zu untersuchen. Sollte sich in diesen Studien herausstellen, daß der ERM- Faktor Elp in der Tat mit dem Tropomodulin- Tropomyosin- System der E. multilocularis- Zelle interferiert, könnte dies ein wichtiger Beitrag zu unserem Verständnis des signaltransduktorischen Geschehens zwischen der Plasmamembran und dem Zytoskelett bei E. multilocularis sein.
N2  - To sum it up it could be characterized in this work for the first time a tropomodulin- homologue factor from a plathelminth at the molecular level. In addition the interaction of the coded factor with a recently isolated tropomyosin- homologue of E. multilocularis could be proved. Based on these data it is now possible to continue the investigation of the biological significance of the interaction between Elp and EmTY. In the case these studies indicate an interaction of the ERM- factor Elp with the tropomodulin- tropomyosin- system of the E. multilocularis- cell, this could be an important contribution to our understanding of the signaltransductoric events between the plasmamembrane and the cytoskeleton of E. multilocularis.
KW  - Tropomodulin
KW  - E. multilocularis
KW  - Zytoskelett
KW  - Tropomyosin
KW  - ERM- Faktor
KW  - tropomodulin
KW  - e. multilocularis
KW  - cytoskeleton
KW  - tropomyosin
KW  - ERM- factor
Y1  - 2002
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-6168
ER  -