TY - THES A1 - Schweeberg, Sarah T1 - Biomedizinische Anwendung von Nanodiamant: Untersuchungen zu den Wechselwirkungen mit der biologischen Umgebung und zur gezielten Wirkstofffreisetzung T1 - Biomedical applications of nanodiamond: Examinations of the interactions with the biological environment and controlled drug release N2 - Nanodiamant bietet in der Medizin und in der Biologie zahlreiche Anwendungsmöglichkeiten aufgrund der guten Biokompatibilität und geringen Toxizität. Durch die umfangreichen Funktionalisierungsmöglichkeiten der Oberfläche der nanometergroßen Partikel können viele unterschiedliche Wirkstoffe, Rezeptormoleküle oder Peptidsequenzen angebunden werden ,die zusammen mit Nanodiamant ein anderes, durchaus besseres Wirkprofil aufweisen als der Wirkstoff allein. Ziel dieser Arbeit war die Synthese eines pH-labilen Linkersystems, dass hydroxylhaltige Wirkstoffe kovalent bindet und zusammen mit Nanodiamant in die Zelle, in der ein saurer pH-Wert herrscht, eingeschleust werden. Über die Änderung des pH-Wertes in der Zelle soll der Wirkstoff freigesetzt werden und seine Wirkung entfalten können. Weiterhin wurde ein pH-labiles Linkersystem auf der Basis eines Hydrazons hergestellt. Über das synthetisierte Hydrazinderivat können Wirkstoffe, die über eine Aldehyd- oder Ketonfunktion verfügen angebunden werden und pH-labil in der Zelle freigesetzt werden. Zusätzlich trägt der Nanodiamant ein kovalent angebundenes Targeting-Molekül, welches eine verbesserte Adressierung der Wirkorte gewähr¬leisten soll. Die Freisetzung wurde mittels UV-Vis-Spektroskopie detektiert und ausgewertet. Neben der spezifischen Funktionalisierung von Nanodiamant besitzt auch die Interaktion der Nanodiamantpartikel mit biologischen Medien eine besondere Bedeutung für zukünftige biomedizinische Anwendungen. Wenn die Partikeloberfläche durch Proteinadsorption gegenüber dem Wirkort abgeschirmt wird, so kann der angebundene Wirkstoff gegebenenfalls nicht freigesetzt werden und somit nicht seine Wirkung entfalten und bleibt letztlich ungenutzt. So war es von besonderem Interesse die Wechselwirkungen von Nanodiamant in Humanserum und auch weiteren physiologischen Medien zu untersuchen. Dabei wurden sowohl freie Nanodiamantpartikel als auch solche, die auf klinisch bereits eingesetzten Gerüstmaterialien im Bereich der Therapie großer Knochendefekte adsorbiert waren, untersucht. Auch wurden die Wechselwirkungen von Nanodiamant mit der physiologischen Umgebung untersucht, die zur Agglomeration der Nanopartikel führen können. Es wurde ein unter¬schiedliches Agglomerationsverhalten der Nanodiamanten in wässriger Umgebung verglichen mit Nanodiamanten in physiologischen Medien sowie deren Stabilität im Serum beobachtet. Durch die in dieser Arbeit vorgestellten Untersuchungen konnten wichtige Erkenntnisse zur Wechselwirkung verschieden präparierter und funktionalisierter Nanodiamanten mit physiologisch relevanten Umgebungen sowie zu stimuli-responsiven Wirkstofffreisetzung aus Nanodiamant-Konjugaten gewonnen werden. Zudem wurde mit der Untersuchung der angelagerten Proteine um Nanodiamant ein erster Schritt in Richtung eines umfassenden Verständnisses der Wechselwirkung dieses Materials mit biologischen Umgebungen unternommen. Auch wenn diese Wechselwirkungen sehr komplex sind, so sind erste Aussagen bezüglich der Art der angelagerten Proteine möglich. Erste Versuche der Stabilisierung von Nanodiamant in physiologischen Medien wurden ebenfalls erfolgreich durchgeführt und zeigen eine effiziente und einfache Möglichkeit, Nanodiamant in biologischen Medien vor der Agglomeration zu bewahren. Die im Rahmen dieser Arbeit gewonnen Erkenntnisse bezüglich mehrfacher Funktionalisierungsmöglichkeiten von Nanodiamant sowie dessen Stabilisierung in physiologischen Medien zeigen die breite Anwendungsmöglichkeit und das enorme Potential von Nanodiamant im Bereich medizinischer und biologischer Anwendungen auf. N2 - Nanodiamond offers various possible applications in medicine and biology because of its good biocompatibility and low toxicity. Due to the extensive opportunities functionalizing the surface of the nanosized particles it is possible to bind a lot of different active pharmaceutical ingredients (API), receptor molecules or peptide sequences. This functionalization can result in an improved efficacy compared to the profile of the drug alone. The aim of this thesis was the synthesis of a pH-labile linkersystem which covalently binds hydroxyl group-containing APIs and transfer them together with nanodiamond into the cells, where an acidic environment is predominant. Because of the change of the pH-value the drug gets released and can take its effect. Furthermore, a pH-labile linkersystem based on the formation of a hydrazon bond was synthesized. APIs containing an aldehyde or a ketone can be linked to the synthesized hydrazine derivative 70 and be released in cells due to the acid-labile bond. Additionally, the nanodiamond has a covalently bound targeting molecule to assure an improved uptake into the cell. The release of Doxorubicin was detected and evaluated via UV-Vis-spectroscopy. Besides the specific functionalization, the interaction of nanodiamond particles with biological media is gaining more and more importance regarding future biomedical applications. If the particle surface is shielded with proteins it is possible that the linked drug cannot be released, remains unused and cannot develop its desired effect. Because of this reason it was of main interest to examine the interactions of nanodiamond in human serum and further physiological media. Nanodiamond without further functionalization were analysed as well as nanodiamonds which are adsorbed on materials that are already in clinical usage in the field of greater bone defects. The interactions of nanodiamond with a physiological environment which can lead to the agglomeration of the particles was also examined. A different agglomeration bahaviour of nanodiamond in aqueous media was compared to nanodiamond in physiological media as well as their stability in serum. Due to the presented studies in this thesis important insights into the interactions of functionalized and different prepared nanodiamonds with physiological relevant environments as well as with stimuli-responsive drug release from nanodiamond conjugates were obtained. Furthermore, the examinations of the attached proteins around nanodiamond is the first step getting towards a better comprehensive understanding of the interactions of this material with its biological environment. Even if these interactions are very complex, first statements according to the type of attached proteins are possible. First trials of stabilizing nanodiamond in physiological media have been carried out successfully and demonstrate an easy and effective way to hinder agglomeration of nanodiamond in biological media. Finally, the insights gained in this thesis regarding the multiple possibilities of nanodiamond as well as their stabilization in physiological media offers a broad range of applications and the tremendous potential of nanodiamond in the field of medical and biological research. KW - Nanopartikel KW - nanodiamond KW - Wirkstofffreisetzung KW - drug release KW - Diamant KW - Wirkstofffreisetzung KW - Nanodiamant Y1 - 2019 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-174619 ER - TY - THES A1 - Heffels, Karl-Heinz T1 - Functional nanofibres for regenerative medicine T1 - Funktionelle Nanofasern für die regenerative Medizin N2 - This thesis concerned the design and examination of a scaffold for tissue engineering applications. The template for the presented scaffold came from nature itself: the intercellular space in tissues that provides structure and support to the cells of the respective tissue, known as extracellular matrix (ECM). Fibres are a predominant characteristic feature of ECM, providing adhesion sites for cell-matrix interactions. In this dissertation a fibrous mesh was generated using the electrospinning technique to mimic the fibrous structure of the ECM. Two base polymers were explored: a biodegradable polyester, poly(D,L-lactide-co-glycolide); and a functional PEG-based star polymer, NCO-sP(EO-stat-PO). This topic was described in three major parts: the first part was materials based, concerning the chemical design and characterisation of the polymer scaffolds; the focus was then shifted to the cellular response to this fibrous scaffold; and finally the in vivo performance of the material was preliminarily assessed. The first steps towards an electrospun mesh started with adjusting the spinning parameters for the generation of homogeneous fibres. As reported in Chapter 3 a suitable setup configuration was on the one hand comprised of a spinning solution that consisted of 28.5 w/v% PLGA RG 504 and 6 w/v% NCO-sP(EO-stat-PO) in 450 µL acetone, 50 µL DMSO and 10 µL of an aqueous trifluoroacetic acid solution. On the other hand an ideal spinning behaviour was achieved at process parameters such as a flow rate of 0.5 mL/h, spinneret to collector distance of 12-16 cm and a voltage of 13 kV. The NCO-sP(EO-stat-PO) containing fibres proved to be highly hydrophilic as the functional additive was present on the fibre surface. Furthermore, the fibres featured a bulk degradation pattern as a consequence of the proportion of PLGA. Besides the morphologic similarity to ECM fibres, the functionality of the electrospun fibres is also decisive for a successful ECM mimicry. In Chapter 4, the passive as well as active functionality of the fibres was investigated. The fibres were required to be protein repellent to prevent an unspecific cell adhesion. This was proven as even 6.5 % sP(EO-stat-PO) in the PLGA fibres reduced any unspecific protein adsorption of bovine serum albumin and foetal calf serum to less than 1 %. However, avidin based proteins attached to the fibres. This adhesion process was avoided by an additional fibre surface treatment with glycidol. The active functionalisation of NCO-sP(EO-stat-PO)/PLGA fibres was investigated with two fluorescent dyes and biocytin. A threefold, chemically orthogonal, fibre modification was achieved with these dyes. The chapters about the chemical and mechanical properties laid the basis for the in vitro chapters where a specific fibre functionalisation with peptides was conducted to analyse the cell adhesion and biochemical expressions. Beginning with fibroblasts in Chapter 5 the focus was on the specific cell adhesion on the electrospun fibres. While NCO-sP(EO-stat-PO)/PLGA fibres without peptides did not allow any adhesion of fibroblasts, a fibre modification with GRGDS (an adhesion mediating peptide sequence) induced the adhesion and spreading of human dermal fibroblasts on the fibrous scaffolds. The control sequence GRGES that has no adhesion mediating qualities did not lead to any cell adhesion as observed on fibres without modifications. While the experiments of Chapter 5 were a proof-of-concept, in Chapter 6 a possible application in cartilage tissue engineering was examined. Therefore, primary human chondrocytes were seeded on fibrous scaffolds with various peptide sequences. Though the chondrocytes exhibited high viability on all scaffolds, an active interaction of cells and fibres was only found for the decorin derived sequence CGKLER. Live-cell-imaging revealed both cell attachment and migration within CGKLER-modified meshes. As chondrocytes undergo a de-differentiation towards a fibroblast-like phenotype, the chondrogenic re-differentiation on these scaffolds was investigated in a long term cell culture experiment of 28 days. Therefore, the glycosaminoglycan production was analysed as well as the mRNA expression of genes coding for collagen I and II, aggrecan and proteoglycan 4. In general only low amounts of the chondrogenic markers were measured, suggesting no chondrogenic differentiation. For conclusive evidence follow-up experiments are required that support or reject the findings. The success of an implant for tissue engineering relies not only on the response of the targeted cell type but also on the immune reaction caused by leukocytes. Hence, Chapter 7 dealt with primary human macrophages and their behaviour and phenotype on two-dimensional (2D) surfaces compared to three-dimensional (3D) fibrous substrates. It was found that the general non-adhesiveness of NCO-sP(EO-stat-PO) surfaces and fibres does not apply to macrophages. The cells aligned along the fibres on surfaces or resided in the pores of the meshes. On flat surfaces without 3D structure the macrophages showed a retarded adhesion kinetic accompanied with a high migratory activity indicating their search for a topographical feature to adhere to. Moreover, a detailed investigation of cell surface markers and chemokine signalling revealed that macrophages on 2D surfaces exhibited surface markers indicating a healing phenotype while the chemokine release suggested a pro-inflammatory phenotype. Interestingly, the opposite situation was found on 3D fibrous substrates with pro-inflammatory surface markers and pro-angiogenic cytokine release. As the immune response largely depends on cellular communication, it was concluded that the NCO-sP(EO-stat-PO)/PLGA fibres induce an adequate immune response with promising prospects to be used in a scaffold for tissue engineering. The final chapter of this thesis reports on a first in vivo study conducted with the presented electrospun fibres. Here, the fibres were combined with a polypropylene mesh for the treatment of diaphragmatic hernias in a rabbit model. Two scaffold series were described that differed in the overall surface morphology: while the fibres of Series A were incorporated into a thick gel of NCO-sP(EO-stat-PO), the scaffolds of Series B featured only a thin hydrogel layer so that the overall fibrous structure could be retained. After four months in vivo the treated defects of the diaphragm were significantly smaller and filled mainly with scar tissue. Thick granulomas occurred on scaffolds of Series A while the implants of Series B did not induce any granuloma formation. As a consequence of the generally positive outcome of this study, the constructs were enhanced with a drug release system in a follow-up project. The incorporated drug was the MMP-inhibitor Ilomastat which is intended to reduce the formation of scar tissue. In conclusion, the simple and straight forward fabrication, the threefold functionalisation possibility and general versatile applicability makes the meshes of NCO-sP(EO-stat-PO)/PLGA fibres a promising candidate to be applied in tissue engineering scaffolds in the future. N2 - Diese Dissertation beschäftigte sich mit der Entwicklung und Untersuchung eines Gerüsts zur Geweberegeneration. Der interzelluläre Raum, der in Geweben für die Gewebestruktur verantwortlich ist, wurde als Vorbild aus der Natur für das entwickelte Gerüst verwendet. Fasern sind in dieser extrazellulären Matrix (EZM) ein charakteristischer Bestandteil, die Adhäsionssequenzen für Zell-Matrix-Interaktionen enthalten und zur strukturellen Organisation der Gewebe beitragen. In der vorliegenden Arbeit wurden Faservliese mit Hilfe des elektrostatischen Verspinnens hergestellt, um die natürlichen Fasern der EZM zu imitieren. Zwei Polymere bildeten die chemische Grundlage für diese Fasern: Ein bioabbaubarer Polyester, Poly(D,L-Laktid-co-Glykolid) (PLGA) und ein funktionales auf Polyethylenglykol basierendes, sternförmiges Polymer, NCO-sP(EO-stat-PO). Der erste Teil des in drei Hauptteile untergliederten Themas beschäftigte sich mit dem chemischen Design und der Fasercharakterisierung im Sinne der Materialeigenschaften. Der zweite Teil betrachtet die Auswirkungen der Fasern auf zellulärer Ebene, während der dritte Teil einen ersten Eindruck über die in vivo Reaktion auf die Materialien vermittelt. Die ersten Schritte in Richtung eines elektrostatisch gesponnenen Vlieses begannen mit der Erforschung geeigneter Einstellungen für eine homogene Faserproduktion. Kapitel 3 thematisiert geeignete Spinnparameter, zu denen auf der einen Seite eine spinnfähige Lösung gehörte, die aus 28.5 w/v% PLGA RG 504 und 6 w/v% NCO-sP(EO-stat-PO) in 450 µL Aceton, 50 µL DMSO und 10 µL trifluoressigsaurer wässriger Lösung besteht. Auf der anderen Seite wurden Prozessparameter gefunden, wie zum Beispiel eine Flussrate von 0.5 mL/h und ein Kollektor-Abstand von 12-16 cm, die bei einer Potentialdifferenz von 13 kV ein stabiles Spinnverhalten garantierten. Fasern mit dem Additiv NCO-sP(EO-stat-PO) zeigten eine äußerst starke Hydrophilie, da das Additiv während des Spinnprozesses an die Faseroberfläche segregierte. Des Weiteren sind die Fasern dank des PLGA-Anteils nach einem Volumenabbaumechanismus unter physiologischen Bedingungen degradierbar. Neben der morphologischen Ähnlichkeit zwischen natürlichen Fasern der EZM und elektrogesponnenen Fasern ist die Funktionalität der synthetischen Fasern entscheidend für eine erfolgreiche Imitation der EZM. Kapitel 4 betrachtet deswegen sowohl die passive als auch aktive Funktionalität der Fasern. Unter passive Funktionalität fällt das proteinabweisende Verhalten, welches eine unspezifische Zelladhäsion verhindert. Es wurde gezeigt, dass ein Anteil von 6.5 % sP(EO-stat-PO) in den PLGA-Fasern ausreicht, um die unspezifische Adhäsion von Albumin aus Rinderserum und fötalem Kälberserum auf weniger als 1 % zu senken. Dennoch adhärierten avidinbasierte Proteine auf den Fasern, was jedoch durch eine Behandlung mit Glycidol unterbunden werden konnte. Die aktive Funktionalisierung wurde exemplarisch mit zwei Fluoreszenzfarbstoffen und Biocytin untersucht. Mit diesen Modellmolekülen wurde eine dreifache, chemisch orthogonale Fasermodifizierung erreicht. Die Kapitel über die chemischen und mechanischen Eigenschaften haben die Grundlage für in vitro Zellversuche gelegt, bei denen eine Faserfunktionalisierung mit Peptidsequenzen durchgeführt wurde, um eine spezifische Zelladhäsion zu erreichen und die biochemische Reaktion der Zellen zu untersuchen. In Kapitel 5 lag der Fokus auf der spezifischen Adhäsion von humanen dermalen Fibroblasten an den elektrogesponnenen Fasern. Während NCO-sP(EO-stat-PO)/PLGA Fasern ohne Peptide keine Zelladhäsion zuließen, induzierte eine Fasermodifikation mit GRGDS, einer adhäsionsvermittelnden Peptidsequenz, sowohl die Adhäsion als auch Ausbreitung der Fibroblasten auf den Fasern. Eine Kontrollsequenz ohne adhäsionsvermittelnde Eigenschaften (GRGES), führte, wie auch Fasern ohne Peptide, zu keiner Zelladhäsion. Die Experimente von Kapitel 6 gingen über das reine Machbarkeitskonzept von Kapitel 5 hinaus, indem eine mögliche Anwendung im Bereich der Knorpelregeneration untersucht wurde. Daher wurden primäre humane Chondrozyten auf Faservliesen ausgesät, die mit unterschiedlichen Peptiden modifiziert wurden. Trotz einer allgemein sehr guten Vitalität der Zellen auf allen Fasertypen, zeigten die Chondrozyten nur auf Vliesen mit der aus Decorin abgeleiteten CGKLER-Sequenz eine aktive Interaktion. Diese konnte mit dem Live-Cell-Imaging-Verfahren anhand der Zelladhäsion und Zellmigration beobachtet werden. Da Chondrozyten in der 2D-Expansionszellkultur einer Dedifferenzierung in Richtung eines Fibroblasten ähnlichen Zelltypen unterliegen, wurde eine 28-tägige Studie durchgeführt, um das Redifferenzierungsverhalten auf den Fasergerüsten zu untersuchen. Dazu wurde sowohl die Glykosaminoglykanproduktion analysiert als auch die mRNA Expression der Gene, die die Kollagen I und II, Aggrecan und Proteoglykan 4 Produktion regulieren. Die chondrogenen Marker wurden in diesen Versuchen nur geringfügig ausgeschüttet, was in Anbetracht der großen Varianzen in den Messwerten auf keine Redifferenzierung schließen lässt. Für eine abschließende Beurteilung werden Folgeexperimente empfohlen, die die gemachten Beobachtungen bestärken oder widerlegen. Der Erfolg eines Implantats zur Geweberegeneration beruht nicht nur auf der gewünschten Reaktion des Zielzelltyps, sondern auch auf der Immunreaktion des Organismus, welche durch Leukozyten gesteuert wird. Folglich beschäftigte sich Kapitel 7 mit dem Verhalten und den Phänotypen primärer humaner Makrophagen auf dreidimensionalen Fasergerüsten und zweidimensionalen Oberflächen im Vergleich zueinander. Bei den Versuchen zeigte sich, dass die generelle Nicht-Adhäsivität von NCO-sP(EO-stat-PO) Oberflächen für Makrophagen nicht zutrifft. Die Zellen richteten sich an den Fasern auf den Oberflächen aus oder saßen in den Poren der Vliese. Auf flachen Oberflächen ohne dreidimensionale Struktur wiesen die Makrophagen ein verzögertes Adhäsionsverhalten auf und migrierten stark über die Oberfläche auf der Suche nach topographischen Unebenheiten, um dort adhärent zu werden. Des Weiteren zeigte eine detaillierte Untersuchung der Oberflächenmarker und der Zytokinausschüttung, dass Makrophagen auf 2D-Oberflächen gemäß der Oberflächenmarker einen entzündungs-hemmenden Phänotypen aufwiesen, während die Zytokinausschüttung einen entzündungs-fördernden Phänotypen suggerierte. Interessanterweise bot sich das entgegengesetzte Bild auf 3D-Faseroberflächen. Hier wurde die Erkenntnis gewonnen, dass die Morphologie einen größeren Einfluss auf die Zellreaktion hat als die Oberflächenchemie. Da die Immunantwort eines Organismus auf ein Implantat stark von der interzellularen Kommunikation abhängt, wurde gefolgert, dass die NCO-sP(EO-stat-PO)/PLGA Fasern eine adäquate Immunantwort hervorrufen mit vielversprechenden Aussichten, die Fasergerüste im Bereich der Geweberegeneration einzusetzen. Das letzte Kapitel der Dissertation berichtet über eine erste in vivo Studie der hier vorgestellten Fasern. Mit den Fasern wurde ein bestehendes Behandlungskonzept für Hernien des Zwerchfells erweitert und die Leistungsfähigkeit in einem Kaninchenmodell überprüft. Zwei Gerüsttypen wurden untersucht, die sich in der Oberflächenmorphologie maßgeblich unterschieden: In Serie A wurden die elektrogesponnenen Fasern in ein Gel aus NCO-sP(EO-stat-PO) gebettet, während die Fasern in Serie B nur mit einer dünnen Gelschicht bedeckt wurden, so dass die topografische Faserstruktur erhalten blieb. Nach 4 Monaten in vivo waren die behandelten Zwerchfelldefekte signifikant kleiner und überwiegend mit Narbengewebe gefüllt. Die ausgeprägte Granulombildung bei Fasergerüsten der Serie A konnte in der darauffolgenden Studie (Serie B) minimiert werden. Das gute Abschneiden dieser Studien wurde zum Anlass genommen, die Vliese weiterzuentwickeln und eine Medikamentenfreisetzung (Ilomastat) zu integrieren, um die Narbenbildung zu minimieren. Zusammenfassend beschreibt diese Dissertation einen einfachen und direkten Weg, Fasern für eine gezielte Geweberegeneration zu erzeugen, die dreifach funktionalisierbar und vielseitig anwendbar sind. Dies macht Fasergerüste auf der Basis von NCO-sP(EO-stat-PO)/PLGA zu einem vielversprechenden Kandidaten um in der Geweberegeneration eingesetzt zu werden. KW - Nanofaser KW - Gewebe KW - Regeneration KW - Extrazelluläre Matrix KW - Polymere KW - Elektrostatisches Verspinnen KW - Geweberegeneration KW - Fibroblasten KW - Makrophagen KW - Chondrozyten KW - Wirkstofffreisetzung KW - Oberflächenfunktionalisierung KW - Electrospinning KW - tissue engineering KW - surface functionalisation KW - drug release Y1 - 2012 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-75684 N1 - Die Arbeit wurde am Lehrstuhl für Funktionswerkstoffe der Medizin und der Zahnheilkunde angefertigt ER -