TY - THES A1 - Braeutigam, Carina T1 - Das Leichtketten-Kappa-Immunglobulinrepertoire in der kindlichen Tonsille T1 - The light chain kappa immunglobulinrepertoire in the pediatric tonsil N2 - Die kappa Leichtketten Rearrangements von den verschiedenen B Zelluntergruppen in Keimzentren der kindlichen Tonsille wurden mit Hilfe der Einzelzell PCR analysiert. Sie wurden anschliessend mit IgD+ B Zellen aus dem Nabelschnurblut und IgM+ B Zellen aus dem Erwachsenenblut verglichen. Analysiert wurde die Verteilung der Einzelgene und die somatischen Hypermutationen. N2 - The kappa lightchain rearrangements of B cell subgroups within germinal centers of the pediatric tonsil was analysed with the help of single cell pcr. They were then compared to IgD+ B cells from the cord blood and IgM+ B cells from adult blood. The distribution of the usage of single Vkappa genes and somatic hypermutations were analysed. KW - Kappa Leichtketten Repertoire KW - Tonsille KW - kindlich KW - Keimzentrum KW - kappa light chain KW - pediatric tonsil KW - immunglobulinrepertoire KW - germinal center Y1 - 2004 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-13260 ER - TY - THES A1 - Böhm, Jannic T1 - Regulation der BOB.1/OBF.1-Expression und der BOB.1/OBF.1-Proteinstabilität T1 - Regulation of the BOB.1/OBF.1 expression and of the BOB.1/OBF.1 protein stability N2 - Der transkriptionelle Koaktivator BOB.1/OBF.1 spielt eine wichtige Rolle in der oktamer-abhängigen Transkription in B-Lymphozyten. Mäuse, denen dieser Koaktivator fehlt, zeigen verschiedene Defekte in der B-Zellentwicklung. Besonders auffällig ist hierbei das völlige Fehlen der Keimzentren. Übereinstimmend mit diesem Phänotyp zeigten B-Zellen des Keimzentrums eine stark erhöhte BOB.1/OBF.1-Expression im Vergleich zu ruhenden B-Zellen. Im Gegensatz zu primären B-Zellen unterschiedlicher Entwicklungsstadien zeigen transformierte korrespondierende B-Zellen keine Regulation der BOB.1/OBF.1-Expression. T-Zellen exprimieren im Gegensatz dazu BOB.1/OBF.1 erst nach Stimulation mit PMA und Ionomycin. Um die unterschiedliche Regulation in B-Zellen versus T-Zellen zu untersuchen wurde der BOB.1/OBF.1-Promotor kloniert. Die Analyse der Promotor-Sequenz ergab Bindungsstellen für die Transkriptionsfaktoren CREB, NF-AT und ein SRY-Motiv. In Transfektionsstudien konnte eine deutliche Zellspezifität des Promotors gezeigt werden. Die erwartete induzierbare Aktivierung in T-Zellen war hingegen nur schwach. Die Analyse der BOB.1/OBF.1-Regulation in B-Zellen des Keimzentrums ergab, daß die verstärkte BOB.1/OBF.1-Expression nur partiell auf eine erhöhte Expression des BOB.1/OBF.1-Transkriptes zurück zu führen ist. Vielmehr zeigte sich eine deutliche Regulation des BOB.1/OBF.1-Proteins. In einem "yeast-two hybrid screen" mit der amino-terminalen Domäne von BOB.1/OBF.1 als "bait" (Köder) konnten die beiden Proteine SIAH1 und SIAH2 als Interaktionspartner identifiziert werden. Eine beschriebene Funktion von SIAH1 und SIAH2 liegt in der Regulation der Proteinstabilität ihrer Interaktionspartner. In Ko-Transfektionsexperimenten konnte gezeigt werden, daß SIAH1 die BOB.1/OBF.1-Proteinstabilität vermindert, ohne die transkriptionelle Expression zu beeinflussen. Die Inhibition des Proteasoms führt hierbei zu einer stark verminderten BOB.1/OBF.1-Degradation. Abschließend konnte gezeigt werden, daß die Aktivierung des B-Zellrezeptors zu einer Degradation von BOB.1/OBF.1 durch SIAH1 führt und folglich die transkriptionelle Aktivierung BOB.1/OBF.1-abhängiger Reporterkonstrukte vermindert wird. In einem zweiten "yeast-two hybrid screen" mit der carboxy-terminalen Domäne von BOB.1/OBF.1 als "bait", konnten die Interaktionspartner ABP 280 und Mcm7 identifiziert werden. Besonders die Rolle von Mcm7 in der Transkription könnte neue Aufschlüsse über die Wirkungsweise des transkriptionellen Aktivators BOB.1/OBF.1 geben. N2 - The BOB.1/OBF.1 coactivator is critically involved in mediating octamer-dependent transcriptional activity in B lymphocytes. Mice lacking this coactivator show various defects in B cell development most notably they completely lack germinal centers. Consistent with this phenotype, BOB.1/OBF.1 levels are massively upregulated in germinal center B cells as compared to resting B cells. In contrast to primary B cells, all transformed B cell lines express BOB.1/OBF.1 in comparable amounts. In T cells, BOB.1/OBF.1 expression can be induced by stimulation with PMA and ionomycin. To analyse the different regulation in B cells versus T cells, I cloned the BOB.1/OBF.1 promoter. Analyses of the promoter sequence showed binding sites for the transcription factors CREB, NF-AT and SRY/SOX-protein. Transfection experiments revealed a clear cell type specificity of the promoter. However the promoter was only poorly inducible in stimulated T-cells. I have addressed the mechanism of BOB.1/OBF.1 upregulation in germinal center B cells and found that only a minor part of this regulation can be attributed to increased levels of BOB.1/OBF.1-specific mRNA. Apparently, BOB.1/OBF.1 is also regulated at the protein level. In support of this suggestion I have been able to identify two related BOB.1/OBF.1 interacting proteins, SIAH1 and SIAH2, in a yeast two-hybrid screen using the amino-terminal domain as "bait". SIAH1 and SIAH2 are known regulators of protein stability. Cotransfection experiments revealed that coexpression of SIAH results in a destabilisation of BOB.1/OBF.1 protein without affecting mRNA levels. Furthermore, proteasome inhibitors block the degradation of BOB.1/OBF.1 protein. Finally B cell receptor cross-linking also resulted in the degradation of BOB.1/OBF.1 via SIAH1 and consequently reduced transcriptional activation of BOB.1/OBF.1-dependent reporters. Using the carboxy-terminal domain of BOB.1/OBF.1 as "bait", I identified in a second yeast-two hybrid screen the proteins ABP 280 and Mcm7 as potential interaction partners. Especially the role of Mcm7 in transcription could give new insights as to how BOB.1/OBF.1 is able to function as a transcriptional activator. KW - B-Lymphozyt KW - Zelldifferenzierung KW - Transkriptionsfaktor KW - BOB.1/OBF.1 KW - OCA-B KW - SIAH1 KW - B-Zelle KW - Keimzentrum KW - BOB.1/OBF.1-Promotor KW - BOB.1/OBF.1 KW - OCA-B KW - SIAH1 KW - B-cell KW - germinal center KW - BOB.1/OBF-1-promoter Y1 - 2001 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-1180139 ER - TY - THES A1 - König, Anika T1 - The role of the transcriptional regulators NFATc1 and Blimp-1 in follicular T-cells T1 - Die Rolle der Transkriptionsregulatoren NFATc1 und Blimp-1 in follikulären T-Zellen N2 - The defense against invading pathogens is, amongst other things, mediated via the action of antibodies. Class-switched antibodies and antibodies of high affinity are produced by plasma cells descending from germinal center B (GCB) cells. GCB cells develop in the germinal center (GC), a specialized microstructure found in the B-cell follicle of secondary lymphoid organs. GCB-cell maturation and proliferation are supported by follicular T- helper (Tfh) cells. On the other hand, follicular regulatory T (Tfr) cells control this process in quantity and quality preventing, for instance, the formation of autoantibodies directed against endogenous structures. The development of GCB, Tfh and Tfr cells essentially depends on the migration into the GC, which is mediated via the expression of the chemokine receptor CXCR5. One transcription factor highly expressed in follicular T cells, comprising Tfh and Tfr cells, is NFATc1. Tfr cells additionally express the transcriptional repressor Blimp-1, which is not expressed in Tfh cells. We found that NFATc1 is transactivating Cxcr5 via response elements in the promoter and enhancer in vitro. Blimp-1 binds to the same elements, transactivating Cxcr5 expression in cooperation with NFATc1, whilst mediating Cxcr5- repression on its own. In Tfr cells Blimp-1 suppresses CXCR5 expression in the absence of NFATc1. Blimp-1 itself is necessary to restrict Tfr-cell frequencies and to mediate Tfr- cell function as in mice with Blimp-1-ablated Tregs high frequencies of Tfr cells do not reduce GCB- or Tfh cell frequencies. NFATc1 and Blimp-1 double deficient Tfr cells show additional loss of function, which becomes visible in clearly expanded antibody titers. To evaluate the function of NFATc1 in Tfr cells, we not only deleted it, but also overexpressed a constitutive active form of NFATc1/aA (caNFATc1/aA) in regulatory T cells (Tregs). The latter is leading to an upregulation of CXCR5 per cell, without changing Tfh or Tfr-cell frequencies. However, the high density of surface CXCR5 enhances the migration of Tfr cells deep into the GC, which results in a tighter control of the antigen- specific humoral immune response. Additionally, caNFATc1/aA increases the expression of genes coding for Tfr effector molecules like Il1rn, Il10, Tigit and Ctla4. Interestingly, this part of the transcriptional change is dependent on the presence of Blimp-1. Furthermore, Blimp-1 regulates the expression of multiple chemokine receptor genes on the background of caNFATc1/aA. In contrast, when caNFATc1/aA is overexpressed in all T cells, the frequencies of Tfh- and GCB cells are dominantly reduced. This effect seems to stem from the conventional T- cell (Tcon) side, most probably originating from increased secretion of interleukin-2 (IL- 2) via the caNFATc1/aA overexpressing Tcons. IL-2 is known to hinder the germinal center reaction (GCR) and it might in its abundance not be neutralizable by Tfr cells. Taken together, NFATc1 and Blimp-1 cooperate to control the migration of Tfr cells into the GC. Tfr cells in the GC depend on NFATc1 and Blimp-1 to perform their proper function. Overexpression of caNFATc1 in Tregs strengthens Tfr function in a Blimp-1-dependent manner, whilst overexpression of caNFATc1 in all T cells dominantly diminishes the GCR. N2 - Die Abwehr von Krankheitserregern durch das Immunsystem wird unter anderem (u.a.) durch die Wirkung von Antikörpern vermittelt. Antikörper, welche einen Klassenwechsel und eine hohe Affinität aufweisen, werden von Plasmazellen gebildet, welche sich von Keimzentrums-B (GCB) -Zellen ableiten. GCB-Zellen evolvieren innerhalb des Keimzentrums (GC), einer Mikrostruktur, welche sich innerhalb des B-Zellfollikels sekundärer lymphoider Organe bildet. Die GCB-Zell-Reifung und -Proliferation wird durch follikuläre T-Helfer (Tfh) -Zellen unterstützt und durch follikuläre regulatorische T (Tfr) -Zellen kontrolliert, wodurch u.a. die Bildung von Autoantikörpern, welche körpereigene Strukturen angreifen, unterbunden wird. Die Entwicklung von GCB-, Tfh- und Tfr-Zellen ist in entscheidender Weise abhängig von der Expression des Chemokinrezeptors CXCR5 und der damit verbundenen Migration in das GC. NFATc1 ist ein Transkriptionsfaktor, welcher in follikulären T-Zellen, bestehend aus Tfh- und Tfr-Zellen, stark exprimiert wird. Im Gegensatz zu Tfh-Zellen exprimieren Tfr-Zellen zusätzlich den Transkriptionsrepressor Blimp-1. Wir haben herausgefunden, dass NFATc1 die Expression von Cxcr5 über die Bindung an Elemente innerhalb des Cxcr5-Promotors und -Enhancers in vitro transakiviert. Blimp-1 bindet an selbige Elemente und transaktiviert in Kooperation mit NFATc1 die Cxcr5-Expression, während es die Cxcr5- Expression alleine hemmt. In Tfr-Zellen supprimiert Blimp-1 die CXCR5-Expression in Abwesenheit von NFATc1. Blimp-1 beschränkt darüber hinaus das Vorkommen von Tfr-Zellen und spielt eine Rolle in der Effektorfunktion von Tfr-Zellen. Dies wird deutlich da das verstärkte Tfr-Zell-Vorkommen in Mäusen mit Blimp-1 defizienten Tregs nicht zu einer Reduktion der GCB-oder Tfh-Zellen führt. Der Verlust der Effektorfunktion akkumuliert in NFATc1 und Blimp-1 doppel-defizienten Tfr-Zellen, was sich in einem deutlichen Anstieg der Antikörpertiter im Serum immunisierter Tiere zeigt. Zur Überprüfung der Funktion von NFATc1 in Tfr-Zellen untersuchten wir sowohl dessen Deletion, als auch die Überexpression einer konstitutiv aktiven Form von NFATc1/aA (caNFATc1/aA) in regulatorischen T-Zellen (Tregs). Letztere steigert die CXCR5- Expression pro Zelle ohne das Vorkommen von Tfh- oder Tfr-Zellen zu verändern. Jedoch führte die erhöhte Oberflächenexpression von CXCR5 zu einer verstärkten Migration der Tfr-Zellen in das GC, was in einer verstärkten Kontrolle der antigenspezifischen Antikörpertiter resultierte. Darüber hinaus erhöht caNFATc1/aA in Abhängigkeit von Blimp-1, die Expression der Gene Il1rn, Il10, Tigit und Ctla4, welche mit der Effektorfunktion von Tfr-Zellen assoziiert werden. Blimp-1 wirkt auf dem Hintergrund der Überexpression von NFATc1 vor allem regulierend auf die Expression von Chemokinrezeptorgenen. Im Gegensatz zur Überexpression von caNFATc1/aA in Tregs allein, führt selbige Veränderung in allen T-Zellen zu einer deutlichen Reduktion des Vorkommens von Tfh- und GCB-Zellen nach Immunisierung. Dieser Effekt scheint durch konventionelle T-Zellen (Tcons) vermittelt zu sein und entsteht vermutlich durch eine erhöhte Sekretion von Interleukin-2 (IL-2) durch die caNFATc1/aA überexprimierenden Tcons. Dieses IL-2 scheint in seiner Menge nicht durch die vorliegenden Tfr-Zellen neutralisierbar zu sein und die Keimzentrumsreaktion (GCR) zu hemmen. Die vorliegende Arbeit zeigt, dass NFATc1 und Blimp-1 kooperieren, um die Migration von Tfr-Zellen in das GC zu kontrollieren. Tfr-Zellen im GC sind in der Erfüllung ihrer ordnungsgemäßen Funktion abhängig von NFATc1 und Blimp-1. Die Überexpression von caNFATc1 in Tregs stärkt die Funktion von Tfr-Zellen in einer Blimp-1-abhängigen Weise, während die Überexpression von caNFATc1 in allen T-Zellen die GCR extrem minimiert. KW - Signaltransduktion KW - NFATc1 KW - follikuläre regulatorische T-Zelle KW - T-Lymphozyt KW - Blimp-1 KW - CXCR5 KW - germinal center KW - follicular regulatory T cell KW - Keimzentrumsreaktion KW - Zellmigration KW - Immunisierung Y1 - 2022 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-209727 ER -