TY - THES A1 - Helmerich, Dominic Andreas T1 - Einflüsse der Photophysik und Photochemie von Cyaninfarbstoffen auf die Lokalisationsmikroskopie T1 - Impact of photophysics and photochemistry of cyanine dyes on localization microscopy N2 - In den letzten Jahren haben sich hochauflösende Fluoreszenzmikroskopiemethoden, basierend auf der Lokalisation einzelner Fluorophore, zu einem leistungsstarken Werkzeug etabliert, um Fluoreszenzbilder weit unterhalb der Auflösungsgrenze zu generieren. Hiermit können räumliche Auflösungen von ~ 20 nm erzielt werden, was weit unterhalb der Beugungsgrenze liegt. Dabei haben zahlreiche Optimierungen und Entwicklungen neuer Methoden in der Einzelmolekül-Lokalisationsmikroskopie die Genauigkeit der orstspezifischen Bestimmung einzelner Fluorophore auf bis zu ~ 1 – 3 nm erhöht. Eine Auflösung im molekularen Bereich, weit unterhalb von ~ 10 nm bleibt allerdings herausfordernd, da die Lokalisationsgenauigkeit nur ein Kriterium hierfür ist. Allerdings wurde sich in den letzten Jahren überwiegend auf die Verbesserung dieses Parameters konzentriert. Weitere Kriterien für die fluoreszenzmikroskopische Auflösung sind dabei unter anderem die Markierungsdichte und die Kopplungseffizienz der Zielstruktur, sowie der Kopplungsfehler (Abstand zur Zielstruktur nach Farbstoffkopplung), die sich herausfordernd für eine molekulare Auflösung darstellen. Auch wenn die Kopplungseffizienz und -dichte hoch und der Kopplungsfehler gering ist, steigt bei Interfluorophordistanzen < 5nm, abhängig von den Farbstoffen, die Wahrscheinlichkeit von starken und schwachen Farbstoffwechselwirkungen und damit von Energieübertragungsprozessen zwischen den Farbstoffen, stark an. Daneben sollten Farbstoffe, abhänging von der Lokalisationsmikroskopiemethode, spezifische Kriterien, wie beispielsweise die Photoschaltbarkeit bei dSTORM, erfüllen, was dazu führt, dass diese Methoden häufig nur auf einzelne Farbstoffe beschränkt sind. In dieser Arbeit konnte mithilfe von definierten DNA-Origami Konstrukten gezeigt werden, dass das Blinkverhalten von Cyaninfarbstoffen unter dSTORM-Bedingungen einer Abstandsabhängigkeit aufgrund von spezifischen Energieübertragungsprozessen folgt, womit Farbstoffabstände im sub-10 nm Bereich charakterisiert werden konnten. Darüber hinaus konnte diese Abstandsabhängigkeit an biologischen Proben gezeigt werden. Hierbei konnten verschiedene zelluläre Rezeptoren effizient und mit geringem Abstandsfehler zur Zielstruktur mit Cyaninfarbstoffen gekoppelt werden. Diese abstandsabhänigen Prozesse und damit Charakterisierungen könnten dabei nicht nur spezifisch für die häufig unter dSTORM-Bedingungen verwendeten Cyaninfarbstoffen gültig sein, sondern auch auf andere Farbstoffklassen, die einen Auszustand zeigen, übertragbar sein. Darüber hinaus konnte gezeigt werden, dass hochauflösende dSTORM Aufnahmen unabhängig vom Farbstoffkopplungsgrad der Antikörpern sind, welche häufig für Standardfärbungen von zellulären Strukturen verwendet werden. Dabei konnte durch Photonenkoinzidenzmessungen dargelegt werden, dass aufgrund komplexer Farbstoffwechselwirkungen im Mittel nur ein Farbstoff aktiv ist, wobei höhere Kopplungsgrade ein komplexes Blinkverhalten zu Beginn der Messung zeigen. Durch die undefinierten Farbstoffabstände an Antikörpern konnte hier kein eindeutiger Energieübertragungsmechanismus entschlüsselt werden. Dennoch konnte gezeigt werden, dass Farbstoffaggregate bzw. H-Dimere unter dSTORM-Bedingungen destabilisiert werden. Durch die zuvor erwähnten DNA-Origami Konstrukte definierter Interfluorophordistanzen konnten Energieübertragungsmechanismen entschlüsselt werden, die auch für die Antikörper diverser Kopplungsgrade gültig sind. Des Weiteren konnten, ausgelöst durch komplexe Energieübertragungsprozesse höherer Kopplungsgrade am Antikörper, Mehrfarbenaufnahmen zellulärer Strukturen generiert werden, die über die spezifische Fluoreszenzlebenszeit separiert werden konnten. Dies stellt hier eine weitere Möglichkeit dar, unter einfachen Bedingungen, schnelle Mehrfarbenaufnahmen zellulärer Strukturen zu generieren. Durch die Verwendung des selben Farbstoffes unterschiedlicher Kopplungsgrade kann hier nur mit einer Anregungswellenlänge und frei von chromatischer Aberration gearbeitet werden. Neben den photophysikalischen Untersuchungen der Cyaninfarbstoffe Cy5 und Alexa Fluor 647 wurden diese ebenso photochemisch näher betrachtet. Dabei konnte ein neuartiger chemischer Mechanismus entschlüsselt werden. Dieser Mechanismus führt, ausgelöst durch Singulett-Sauerstoff (1O2), zu einer Photozerschneidung des konjugierten Doppelbindungssystems um zwei Kohlenstoffatome, was zu strukturellen und spektroskopischen Veränderungen dieser Farbstoffe führt. Auf Grundlage dieses Mechanismus konnte eine neue DNA-PAINT Methode entwickelt werden, die zu einer Beschleunigung der Aufnahmezeit führt. N2 - In recent years, high-resolution fluorescence microscopy methods based on the localization of individual fluorophores have become a powerful tool for generating fluorescence images below the diffraction limit. This means that spatial resolutions of ~ 20 nm can now be achieved, which are far below the diffraction limit. Numerous optimizations and developments of new methods in single molecule localization microscopy have increased the localization precision up to ~ 1 - 3 nm. However, a spatial resolution in the molecular range, far below ~ 10 nm, remains challenging, because the localization precision is only one criterion for achieving molecular resolution. However, in recent years the main focus has been on improving this parameter. Additional challenging criteria for achieving molecular resolution include the coupling density and the coupling efficiency of the target structure, as well as the linkage error (distance to the target structure after dye coupling). Even if a high coupling density and coupling efficiency, as well as a low linkage error can be achieved, interfluorophore distances < 5 nm increase the probability of strong and weak dye interactions and thus energy transfer processes between the dyes strongly increase. In addition, depending on the localization microscopy method, dyes should fulfill specific criteria, such as photoswitchability for dSTORM, which means that these methods are often limited to a few dyes. In this work it could be shown with the help of defined DNA origami constructs that the blinking behavior of cyanine dyes follows a distance dependence under dSTORM conditions due to specific energy transfer processes. With this, dye distances in the sub-10 nm range could be characterized. In addition, this distance dependency could be shown on biological samples. Here, different cellular receptors could be efficiently labeled with Cy5 dyes at a low linkage error. These distance dependent processes and thus characterizations could not only be specifically valid for cyanine dyes that are frequently used under dSTORM conditions, but also be transferable to other classes of dyes that show a fluorescence off states. In addition, it could be shown that high resolution dSTORM images are independent of the degree of labeling of antibodies, which are often used for standard staining of cellular structures. It could be shown by photon antibunching measurements that, due to complex strong and weak dye interactions, only one dye is emitting on average, showing a complex blinking behavior at the beginning of the measurement with higher degrees of labeling. Due to the undefined distance between the dyes on antibodies, no clear energy transfer mechanism could be deciphered. Nevertheless, it could be shown that dye aggregates or H-dimers are destabilized under dSTORM conditions. The mentioned DNA origami constructs of defined interfluorophore distances made it possible to decipher energy transfer mechanisms that are also valid for antibodies of various degrees of labeling. Furthermore, triggered by complex energy transfer processes at higher degree of labeling on the antibody, multicolor images of cellular structures could be generated, which could be separated over the specific fluorescence lifetime. This represents a further possibility to generate fast multicolor images of cellular structures at simple buffer conditions. Here, by using the same dyes at different degrees of labeling, it is possible to work with only one excitation wavelength and free of chromatic aberration. In addition to the photophysical investigations of the cyanine dyes Cy5 and Alexa Fluor 647, the photochemical behaviour of these dyes was also examined more closely. Here, a novel chemical mechanism could be deciphered. This mechanism, triggered by singlet oxygen (1O2), leads to a phototruncation of the conjugated double bond system by two carbon atoms resulting in structural and spectroscopic changes of this dye. On the basis of this mechanism, a new DNA-PAINT method could be developed, leading to faster recording times. KW - Einzelmolekülmikroskopie KW - Cyaninfarbstoff KW - hochauflösende Fluoreszenzmikroskopie KW - Photophysik KW - Photochemie Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-247161 ER - TY - THES A1 - Neubert, Franziska T1 - Markierung postsynaptischer Proteine für die hochauflösende Fluoreszenzmikroskopie T1 - Labeling of postsynaptic proteins for super-resolution microscopy N2 - Das menschliche Gehirn ist ein Organ, das aufgrund seiner Komplexität und zellulären Diversität noch am wenigsten verstanden ist. Eine der Ursachen dafür sind zahlreiche Herausforderungen in diversen neurobiologischen Bild-gebungsverfahren. Erst seit der Erfindung der hochauflösenden Fluoreszenz-mikroskopie ist es möglich, Strukturen unterhalb der Beugungsgrenze zu visua-lisieren und somit eine maximale Auflösung von bis zu 20 nm zu erreichen. Zusätzlich hängt die Fähigkeit, biologische Strukturen aufzulösen, von der Markierungs-größe und -dichte ab. Derzeit ist die häufigste Methode zur Proteinfärbung die indirekte Antikörperfärbung, bei der ein Fluorophor-markierter Sekundärantikörper an einen Epitop-spezifischen Primärantikörper bindet. Dabei kann der Abstand von Zielstruktur und Fluorophor bis zu 30 nm betragen, was eine Auflösungs-verminderung zur Folge haben kann. Aufgrund dessen wurden in dieser Arbeit alternative Markierungsmethoden getestet, um postsynaptische Proteine sicht-bar zu machen. Zunächst wurde der postsynaptische N-Methyl-D-Aspartat (NMDA)-Rezeptor mit Hilfe konventioneller indirekter Antikörperfärbung markiert. Hier war die NR1-Untereinheit des NMDA-Rezeptors von besonderem Interesse, da diese in der Autoimmunerkrankung Anti-NMDA-Rezeptor-Enzephalitis invol-viert ist. Patienten dieser seltenen Krankheit bilden Autoantikörper gegen die NR1-Untereinheit, wodurch ein schneller reversibler Verlust der NMDA-Rezeptoren auf der Postsynapse induziert wird. Wichtige Informationen können nicht mehr ausreichend weitergegeben werden, was psychiatrische und neurologi-sche Störungen zur Folge hat. In dieser Arbeit wurden sowohl kommerzielle NR1-Antikörper, als auch rekombinante monoklonale NR1-Antikörper von Patien-ten mit Anti-NMDA-Rezeptor-Enzephalitis getestet. In konfokalen und in hochaufgelösten SIM- (engl. structured illumination microscopy) und dSTORM- (engl. direct stochastic optical reconstruction microscopy) Messun-gen konnten kommerzielle NR1-Antikörper keine erfolgreichen Färbungen erzielen. Dagegen erwiesen sich die rekombinanten monoklonalen NR1-Patientenantikörper als sehr spezifisch, sowohl in primären Neuronen als auch im Hippocampus von murinen Gehirnschnitten und lieferten gute Kolokalisati-onen mit dem postsynaptischen Markerprotein Homer. Um die optische Auflösung zu verbessern, wurde eine neue Markierungs-methode mit sog. „Super-Binde-Peptiden“ (SBPs) getestet. SBPs sind modifi-zierte Peptide, die erhöhte Affinitäten und Spezifitäten aufweisen und mit ei-ner Größe von ~ 2,5 nm wesentlich kleiner als Antikörper sind. In dieser Arbeit bestätigte sich ein kleines hochspezifisches SPB, das an den Fluoreszenzfarb-stoff Tetra- methylrhodamin (TMR) gekoppelt ist, als effektiver Marker für das Ankerpro-tein Gephyrin. Gephyrin ist für die Lokalisation und Verankerung einiger post-synaptischer Rezeptoren zuständig, indem es sie mit dem Cytoskelett der Zelle verbindet. SIM-Messungen in primären Neuronen zeigten eine bessere Clus-terrepräsentation bei der Färbung von Gephyrin mit SBPs, als mit Antikörper-färbung. Zusätzlich wurden Kolokalisationsanalysen von Gephyrin zusammen mit dem inhibito-rischen präsynaptischen vesikulären GABA-Transporter VGAT durchgeführt. Eine weitere Färbemethode stellte die bioorthogonale Click-Färbung durch die Erweiterung des eukaryotischen genetischen Codes (engl. genetic code ex-pansion, GCE) dar. Dabei wurde eine unnatürliche, nicht-kanonische Amino-säure (engl. non-canonical amino acid, ncAA) ins Zielprotein eingebaut und in Kombination mit der Click-Chemie ortsspezifisch mit organischen Tetrazin-Farbstoff-Konjugaten angefärbt. Organische Fluorophore haben den Vorteil, dass sie mit einer Größe von 0,5 – 2 nm sehr klein sind und damit die natürli-chen Funktionen der Proteine in der Zelle kaum beeinflussen. In dieser Arbeit wurde zum ersten Mal gezeigt, dass der tetramere postsynaptische NMDA-Rezeptor durch die Amber-Supres-sionsmethode bioorthogonal angefärbt werden konnte. Aus sieben verschiede-nen Amber-Mutanten der NR1-Untereinheit stellte sich die Y392TAG-NR1-Mutante als diejenige mit der besten Proteinexpression, Färbeeffizienz und rezeptorfunktionalität heraus. Dies konnte durch Fluoreszenzmikroskopie- und Whole-Cell Patch-Clamp-Experimenten gezeigt werden. Die bioorthogo-nale Click-Färbung durch GCE eignete sich für die Färbung des NMDA-Rezeptors in verschiedenen Zelllinien, mit unterschiedlichen Tetrazin-Farbstoff-Konjugaten und für Lebendzellexperimente. In dSTORM-Messungen erwies sich das Tetrazin-Cy5-Farbstoff-Konjugat als ideal aufgrund seiner Grö-ße, Photostabilität, Helligkeit und seines geeigneten Blinkverhaltens, sodass eine homogene NMDA-Rezeptorverteilung auf der Zellmembran gezeigt wer-den konnte. NR1-Antikörperfärbungen wiesen dagegen starke Clusterbildun-gen auf. Die Ergebnisse konnten belegen, dass kleinere Farbstoffe eine deut-lich bessere Zugänglichkeit zu ihrem Zielprotein haben und somit besser für die hochauflösende Fluoreszenzmikroskopie geeignet sind. N2 - Due to its complexity and cellular diversity, the human brain is an organ which is poorly understood. In particular, there are numerous challenges in different neurobiological imaging processes. The advent of super-resolution fluorescence microscopy, where a maximal optical resolution of up to 20 nm is achievable, made it feasible to visualize structures beyond the diffraction limit. The ability to resolve biological structures is further dependent on the labeling size and density. Currently, indirect antibody staining is the most common method for protein labeling. Thereby, a fluorophore marked secondary anti-body binds an epitope specific primary antibody. Consequently, the off-distance between target structure and fluorophore can be up to 30 nm, which could provoke a decrease of resolution. As a result, alternative labeling methods were tested in this work to visualize postsynaptic proteins. Initially, labeling of the postsynaptic N-methyl-D-aspartate (NMDA) recep-tor was performed with conventional indirect antibody staining. Here, the NR1 subunit of the NMDA receptor was of special interest because it is involved in the autoimmune disease of Anti-NMDA receptor encephalitis. Patients of this rare disorder produce autoantibodies against the NR1 subunit, which induces a fast and reversible reduction of NMDA receptors on the postsynapse. Important synaptic information cannot be transferred sufficiently which results in psychiatrical and neurological deficiencies. In this work commercial NR1 antibodies as well as recombinant monoclonal NR1 antibodies from patients with Anti-NMDA receptor encephalitis were tested. In confocal and super-resolved SIM (structured illumination microscopy) and dSTORM (direct sto-chastic optical reconstruction microscopy) measurements the commercial NR1 antibodies could not obtain a successful staining. In contrast, recombinant monoclonal NR1 patient antibodies turn out to be very specific, both in primary neurons and in the hippocampus of murine brain slices. Additionally, they show perfect colocaliza-tion together with the postsynaptic marker protein Homer. To further improve the optical resolution, a new labeling method was tested with so called “super-binding peptides” (SBPs). SBPs are modified peptides with enhanced affinity and specificity. With a size of ~ 2.5 nm, they are much smaller than antibodies. In this work a small, highly specific SBP, coupled to the fluorescent dye tetramethylrhodamine (TMR), turned out to be an efficient marker for the postsynaptic anchor protein gephyrin. Gephyrin is responsible for the localization and anchoring of postsynaptic receptors by connecting them with the cytoskeleton of the cell. SIM measurements in primary neurons showed better cluster representation of gephyrin stained with SBPs than with antibody stain-ing. In addition, colocalization analysis of gephyrin together with the inhibitory presynaptic vesicular GABA transporter VGAT was performed. Another staining method was the bioorthogonal click chemistry by the eu-karyotic genetic code expansion (GCE). Thereby, an unnatural, non-canonical amino acid (ncAA) is incorporated into the target protein and click-labeled site- specifically with an organic tetrazine dye conjugate. Organic dyes are very small with a size of only 0.5 – 2 nm and barely influence the natural function of proteins within the cell, which is beneficial for super-resolution microscopy. In this work, tetrameric postsynaptic NMDA receptors were bioorthogonally la-beled via the amber suppression method for the first time. From a series of seven different amber mutants of the NR1 subunit, the Y392TAG mutant was the one with the best protein expression, labeling efficiency and receptor functionality, as shown by fluorescence microscopy and whole-cell patch clamp experiments. The bioortho-gonal click staining by GCE was suitable for the NMDA receptor stain-ing in different cell lines, with various tetrazine dye conjugates and for live-cell experiments. In dSTORM measurements the tetrazine-Cy5 dye conjugate was ideal because of its size, photostability, brightness and appropriate blinking be-havior. Accordingly, a homogenous NMDA receptor distribution on the cell membrane was observed. In contrast, NR1 antibody staining showed big cluster formation. The results show that small labels have a better accessibility to its target and are therefore much more suitable for super-resolution microscopy. KW - hochauflösende Fluoreszenzmikroskopie KW - Markierungen synaptischer Proteine Y1 - 2019 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-192394 ER -