TY - THES A1 - Zugelder, Laurens T1 - Etablierung eines stabilen induzierbaren Multikassetten-Systems für shRNA-Knockdown-Konstrukte in Myelom Zelllinien und Anwendung zur Analyse des NFκB-Signalwegs T1 - Establishment of a stable and inducible Multicassette-shRNA-Knockdown System in Myeloma Cell Lines and Adaption to the Evaluation of the NFκB-Pathway in Multiple Myeloms N2 - Das Multiple Myelom muss trotz stetiger Fortschritte im Hinblick auf die verfügbaren Therapieoptionen und die Krankheitsprognose weiterhin im Wesentlichen als eine unheilbare Erkrankung angesehen werden. Dies kann vor allem auf die große inter- und intraindividuelle Heterogenität des MM zurückgeführt werden, welche die Entwicklung gezielter molekularer Therapiestrategien erheblich erschwert. Hierbei stellen loss-of-function- Experimente, welche die Identifikation einzelner oder mehrerer potenziell therapeutisch relevanter Zielstrukturen durch die (kombinierte) Depletion von Proteinen ermöglichen, eine wichtige Säule dar, für deren Durchführung verschiedene Systeme mit jeweils eigenen Vor- und Nachteilen zur Verfügung stehen. Im Rahmen dieser Arbeit konnte die Etablierung eines auf RNA-Interferenz basierenden stabilen und induzierbaren Knockdownsystems durch Elektroporation von MM Zelllinien mit Einzel- und Mehrfach-shRNA-Vektoren abgeschlossen werden. Die Transfektion von tet-Repressor-exprimierenden Zellinien mit einer oder mehreren shRNAExpressionskassetten innerhalb eines Plasmidvektors ermöglicht durch die vollständige Repression der shRNA-Transkription im nicht-induzierten Zustand die Selektion erfolgreich transponierter Zellen ohne Effekt-vermittelte Bias und die Generierung großer Zellmengen für Versuchsreihen in vergleichsweise kurzer Zeit. Die Induktion der verschiedenen in dieser Arbeit evaluierten Einzel- und Mehrfach-shRNA-Konstrukte gegen (Kombinationen von) Zielstrukturen im Ras/MAPK- sowie im NFκB-Signalsystem mittels Doxyzyklin als Induktionsagens zeigte durchweg deutliche und den Erwartungen aus transienten Experimenten entsprechende Knockdownergebnisse. Auch die Resultate hinsichtlich funktioneller Readouts und zellphysiologischer Effekte der induzierten Knockouts stehen im Einklang mit vorangegangenen Experimenten und bestätigen somit die Äquivalenz des stabilen induzierbaren Systems zu transienten Ansätzen auf RNAi-Basis oder zu pharmakologischen Inhibitoren. Der hierbei erzielte hypomorphe Phänotyp innerhalb einer polyklonalen Zellpopulation bildet die Realität einer medikamentösen Blockade einer oder weniger Zielstrukturen einer heterogenen MM Tumorpopulation näherungsweise ab, weshalb das vorgestellte System ein hilfreiches, kosteneffizientes und leicht zu handhabendes Werkzeug für die Identifikation potenziell relevanter Zielstrukturen für molekulare Therapieansätze im Multiplen Myelom darstellt N2 - Despite steady progress concerning the therapeutic arsenal available to and the improved prognosis for newly diagnosed patients, multiple myeloma still has to be regarded as an incurable malignancy in the overwhelming majority of cases. This is mainly due to the disease’s high grade of inter- and intraindividual heterogeneity, which greatly complicates the development of molecular therapies. Loss-of-function studies, which enable researchers to identify individual or combinations of drug targets with a potential for clinical relevance by correlating the (combined) depletion of proteins with the resulting phenotype, represent an important cornerstone in the process of developing new molecular therapies, for the execution of which a broad variety of systems with their individual advantages and disadvantages is available. During this thesis project, the establishment of a stable and inducible knockdown system by way of electroporation of myeloma cell lines with single- and multiple-shRNA- expression vectors was successfully completed. Transfecting cell lines which constitutively express the tet-repressor protein with a single plasmid vector carrying one or multiple shRNA expression cassettes allows for the selection of successfully transposed cells without any effect mediated bias and the creation of large amounts of cells for experiments in a comparatively short time, thanks to the full repression of the transcription of the transfected shRNA genes in an un-induced state. Inducing their transcription by adding doxycycline to the cell suspension resulted in strong and specific knockdowns for all single and multiple constructs against different (combinations of) targets in the Ras/MAPK- and the NFκB-pathway which were tested in the experiments shown in this thesis. Results regarding knockdowns, functional readouts and alterations in cellular metabolism mirrored with experiments conducted previously with both transiently expressed shRNAs and pharmacological inhibitors and therefore attest to the universal applicability of the system. The resulting polyclonal cell population with a hypomorphic phenotype depicts the reality conveyed by a pharmacological inhibition of one or more targets within a heterogenic myeloma tumour rather well and therefore this stable and inducible system represents a useful, economical and easily applicable tool for the identification of potentially relevant targets for the development of new molecular therapies in multiple myeloma. KW - Plasmozytom KW - Multiples Myelom KW - shRNA KW - reverse genetics Y1 - 2019 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-188377 ER - TY - THES A1 - Hertzig, Tobias T1 - Funktionelle Charakterisierung des coronaviralen Replikationskomplexes T1 - Functional characterisation of the coronaviral replication complex N2 - Coronaviren besitzen mit etwa 30 kb das größte Genom aller bisher bekannten RNA-Viren. Die Synthese der subgenomischen RNAs findet durch einen einzigartigen Mechanismus, die sog. diskontinuierliche Transkription, statt. Diese beiden Besonderheiten erfordern einen leistungsfähigen Replikationskomplex, der sich aus den Prozessierungsprodukten der Polyproteine 1a und 1ab und einigen zellulären Proteinen zusammensetzt. Die Aktivitäten und die Expression der beteiligten Proteine werden auf co- und posttranslationeller Ebene reguliert. Dazu gehört eine ribosomale Leserasterverschiebung, die das Verhältnis zwischen den ORF1aund ORF1b-kodierten Proteinen festlegt, sowie eine umfangreiche proteolytische Prozessierung durch virale Proteasen. Während die hochkonservierten ORF1b-kodierten Proteine vor allem RNA-synthetisierende und -prozessierende Funktionen besitzen, übernehmen die weniger konservierten ORF1a-kodierten Proteine vor allem organisierende oder regulierende Funktionen. So sind sie beispielsweise maßgeblich an der intrazellulären Lokalisation, strukturellen Organisation und proteolytischen Regulation des Replikationskomplexes beteiligt und haben darüber hinaus nichtessentielle Aufgaben, die möglicherweise bei spezifischen Interaktionen des Virus mit seinem Wirt von Bedeutung sind. Die meisten der bisher charakterisierten ORF1bkodierten Proteine besitzen essentielle Enzymfunktionen im viralen RNA-Metabolismus. Einige dieser Enzyme, wie die NendoU oder ExoN, sind spezifisch für die Nidovirales oder nur bestimmte Nidovirusfamilien. In der vorliegenden Arbeit wurde mittels eines revers-genetischen Ansatzes versucht, die Funktion und Bedeutung verschiedener viraler Proteine im Replikationszyklus von HCoV-229E zu untersuchen. Dazu wurden Transkripte von HCoV-229E-cDNAs genomischer Länge, in die entsprechende Substitutionen eingeführt worden waren, in Zellen transfiziert und anschließend analysiert, inwieweit eine virale RNA-Synthese stattfand. Sofern sich infektiöse Viren im Zellkulturüberstand befanden, wurde diese näher charakterisiert, insbesondere um mögliche Defekte in der Virusreplikation und Veränderungen in der Sequenz zu identifizieren. Es wurde gezeigt, dass die Nichtstrukturproteine 13, 14, 15 und 16 wichtige Funktionen innerhalb der viralen RNA-Synthese besitzen, wobei die Aktivitäten von nsp13 und nsp16 essentiell waren. Als besonders kritisch erwiesen sich auch die zinkbindenden Reste der Nterminalen Subdomäne (ZBD) des Nichtstrukturproteins 13. Das Nichtstrukturprotein 14 besitzt ebenfalls eine zentrale Rolle innerhalb der viralen RNA-Synthese und scheint darüber hinaus an der Synthese der subgenomischen RNAs beteiligt zu sein. Die Bedeutung von nsp15 für die Lebensfähigkeit von HCoV-229E konnte anhand entsprechender Mutanten zweifelsfrei nachgewiesen werden, wobei die maßgeblichen Defekte wohl nicht ausschießlich in der RNASynthese, sondern eher in einem späteren Schritt des Replikationszyklus zu suchen sind. Mittels verschiedener Mutanten, die Substitutionen an Spaltstellen der MPRO trugen, konnte die essentielle Bedeutung der posttranslationellen Regulation der Replikaseaktivität durch die Hauptprotease gezeigt werden. In den allermeisten Fällen führten Mutationen, die die Spaltungseffizienz reduzierten, zu einem Abfall in der RNA-Synthese und lebensfähige Viren konnten nicht isoliert werden. Im Rahmen dieser Arbeit wurde ein Replikon auf der Basis des HCoV-229E hergestellt, das über Monate in Zellkultur gehalten und dessen Reportergenexpression durch Fluoreszenz- Mikroskopie beobachtet werden konnte. Es zeigte sich, dass für eine dauerhafte Koexistenz von Wirtszelle und Replikon-RNA nur wenige Veränderungen im viralen Genom notwendig waren. Mit Hilfe eines mutierten Derivats dieses Replikons gelang es, den Defekt einer viralen nsp15- Mutante näher zu charakterisieren. Der Hauptteil der Arbeit widmete sich der Charakterisierung von chimären HCoV-229E-Klonen, deren Nichtstrukturproteine 7 und 8 bzw. 7 bis 9 gegen die entsprechenden Proteine des HCoVNL63 ausgetauscht wurden. Es konnte gezeigt werden, dass die Nichtstrukturproteine 7 und 8 von derselben Spezies stammen müssen, damit RNA-Synthese stattfindet, was auf eine essentielle Interaktion zwischen diesen beiden Proteinen schließen ließ. Die Identifizierung und Analyse adaptiver Mutationen in allen hier untersuchten chimären Klonen zeigte, dass offenbar neben der nsp7-nsp8-Interaktion noch weitere Interaktionen dieser Proteine mit anderen Proteinen, wie zum Beispiel nsp12 und nsp13, auf funktioneller und/oder struktureller Ebene von Bedeutung sind. Darüber hinaus ließen eine Reihe von Mutationen im Bereich des Leserasterverschiebungselements darauf schließen, dass sich bei diesen Viren die Leserasterverschiebungsrate geändert haben könnte. Diese Hypothese konnte durch In-vitro- Translationsexperimente bestätigt werden. Es zeigte sich, dass durch diese Mutationen die Leserasterverschiebungsrate von 50 % in der wildtypischen Situation auf 65 - 70 % angehoben wurde. Diese relative Überexpression von ORF1b-Proteinen scheint zur Kompensation funktioneller Defekte, die durch die Fremdproteine nsp7 und nsp8 verursacht wurden, beizutragen. Obwohl bei den meisten chimären Klonen eine RNA-Synthese auf nahezu wildtypischem Niveau beobachtet werden konnte, wiesen Reduktionen im Virustiter um 60 - 90 % auf verbliebene funktionelle Defekte im Replikationszyklus dieser Viren hin. N2 - With genome sizes of about 30 kb, coronaviruses have the largest genomes of all known RNA viruses. The synthesis of subgenomic RNAs employs a unique mechanism called discontinuous transcription. These two specific features require a powerful replication complex which is comprised of the proteolytic processing products of the polyproteins 1a and 1ab and several cellular proteins. The activities and the expression of the viral proteins are co- and posttranslationally regulated. This regulation involves ribosomal frameshifting, which determines the molar ratio between ORF1a- and ORF1b-encoded proteins, as well as extensive proteolytic processing by viral proteases. The highly conserved proteins encoded by ORF1b are mainly associated with RNA synthesis and RNA processing functions, whereas the less conserved proteins encoded by ORF1a generally serve structural and regulatory functions. Thus, for example, they play a key role in the intracellular localization, structural organization and proteolytic regulation of the replication complex. Furthermore, they mediate nonessential functions, which might be involved in specific virus-host interactions. Most of the previously characterized ORF1b-encoded proteins have essential enzymatic functions in viral RNA metabolism. Some of these enzymes, e.g. NendoU and ExoN, are only conserved in the Nidovirales or specific nidovirus families . In this study, the functions and biological roles of several viral proteins in the replication cycle of HCoV-229E were studied using a reverse-genetics approach. For this purpose, in vitro transcripts carrying specific mutations, which were produced from genome-length HCoV-229EcDNAs, were transfected into cells and viral RNA synthesis was analyzed. If infectious virus was present in the tissue culture supernatant, it was studied in more detail to identify potential growth defects as well as mutations. The study revealed that nonstructural proteins 13 to 16 have important functions in viral RNA synthesis, with the activities of nsp13 and nsp16 being essential. Thus, for example, the study demonstrates the critical importance of the N-terminal zinc-binding residues of nsp13. Furthermore, nsp14 was shown to be involved in viral RNA replication and, most likely, in a specific step in subgenomic RNA synthesis. Furthermore, it was established that the activity of nsp15 is required for viral reproduction. The major defects observed for HCoV-229E nsp15 mutants appeared to be mainly associated with a late step in the viral life cycle rather than viral RNA synthesis itself. Using a set of mutants with MPRO cleavage site substitutions, the essential importance of the MPRO-mediated posttranslational regulation of the replicase activity was demonstrated. In most cases, mutations that reduced the cleavage efficiency at specific MPRO cleavage sites caused a decline of RNA synthesis and viable viruses could not be isolated. In this study, a replicon that was based on HCoV-229E was generated. The replicon could be propagated in cultured cells over several months and the expression of a reporter gene could be monitored by fluorescence microscopy. The data showed that the replicon RNA only acquired a very small number of mutations to be able to coexist with its host cell. Using a mutant derivative of the replicon RNA, the functional defect that had previously been observed in an HCoV-229E nsp15 mutant was further characterized. The main focus of the study was the characterization of chimeric HCoV-229E isolates, whose nonstructural proteins 7 and 8 or 7 to 9 were substituted with the corresponding proteins from HCoV-NL63. The data revealed that only nonstructural proteins 7 and 8 that were derived from the same species were capable of initiating RNA synthesis, indicating critical interactions between these two proteins. The identification and analysis of adaptive mutations that all these chimeric viruses acquired after repeated passaging in tissue culture strongly suggests that, besides interactions between nsp7 and nsp8, the two proteins are engaged in additional structural and/or functional interactions with other proteins, particularly with nsp12 and nsp13. Furthermore, mutations close to the ribosomal frameshift element were identified, suggesting that the frameshift efficiency may have been changed in these viruses. This hypothesis was supported by in vitro translation data, which showed that these mutations increased the frameshifting rate from 50 % in the wild-type situation to about 65 – 70 %. It seems reasonable to suggest that the resulting relative overexpression of ORF1b-encoded proteins compensates some of the functional defects caused by the HCoV-NL63 nonstructural proteins 7 and 8. Even though most of these chimeric viruses synthesized RNAs at near wild-type levels, reduced virus titers by 60 – 90 % suggest that, despite the acquisition of adaptive mutations, functional defects had remained in these viruses. KW - Coronaviren KW - Replikation KW - Coronavirus KW - HCoV-229E KW - Replikationskomplex KW - reverse Genetik KW - Coronavirus KW - HCoV-229E KW - replication complex KW - reverse genetics Y1 - 2006 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-20152 ER -