TY - THES A1 - Groma, Michaela T1 - Identification of a novel LysR-type transcriptional regulator in \(Staphylococcus\) \(aureus\) T1 - Identifizierung eines neuen Transkriptionsregulators vom LysR-Typ in \(Staphylococcus\) \(aureus\) N2 - Staphylococcus aureus is a facultative pathogen which causes a variety of infections. The treatment of staphylococcal infections is complicated because the bacteria is resistant to multiple common antibiotics. S. aureus is also known to express a variety of virulence factors which modulate the host’s immune response in order to colonize and invade certain host cells, leading to the host cell’s death. Among the virulence factors is a LysR-type transcriptional regulator (lttr) which is required for efficient colonization of secondary organs. In a recent report, which used transposon screening on S. aureus-infected mice, it was found that the amount of a novel lttr852 mutant bacteria recovered from the kidneys was significantly lower compared to the wildtype strains. This doctoral thesis therefore focused on phenotypical and molecular characterization of lttr852. An assessment of the S. aureus biofilm formation and the hemolysis revealed that lttr852 was not involved in the regulation of these virulence processes. RNA-sequencing for potential target genes of lttr852 identified differentially expressed genes that are involved in branched chain amino-acid biosynthesis, methionine sulfoxide reductase and copper transport, as well as a reduced transcription of genes encoding urease and of components of pyrimidine nucleotides. Promoter fusion with GFP reporters as as well as OmniLog were used to identify conditions under which the lttr852 was active. The promoter studies showed that glucose and high temperatures diminish the lttr852 promoter activity in a time-dependent manner, while micro-aerobic conditions enhanced the promoter activity. Copper was found to be a limiting factor. In addition, the impact on promoter activity of the lttr852 was tested in the presence of various regulators, but no central link to the genes involved in virulence was identified. The present work, thus, showed that lttr852, a new member of the class of LysR-type transcriptional regulators in S. aureus, has an important role in the rapid adaptation of S. aureus to the changing microenvironment of the host. N2 - Staphylococcus aureus ist ein fakultativer Erreger, der eine Vielzahl von Infektionen verursacht. Die Behandlung von Staphylokokken-Infektionen ist aufgrund des Auftretens einer Resistenz gegen mehrere gängige Antibiotika kompliziert. Es ist bekannt, dass S. aureus eine Vielzahl von Virulenzfaktoren exprimiert, um die Immunantwort des Wirts zu umgehen, und so in bestimmte Wirtszellen einzudringen und diese zu kolonisieren, was zum Tod von Wirtszellen führen kann. Unter den Virulenzfaktoren befindet sich ein Transkriptions-regulator vom LysR-Typ (lttr), der für eine effiziente Besiedlung von Sekundärorganen erforderlich ist. In einem kürzlich durchgeführten Transposon-Screen, bei dem Mäuse mit S. aureus infiziert wurden, wurde ein neuartiger lttr, der lttr852 identifiziert, bei dem aus den Nieren gewonnenen Bakterien signifikant dezimiert waren. Diese Doktorarbeit befasste sich mit der phänotypischen und molekularen Charakterisierung von lttr852. Die Auswertung der Biofilmbildung und der Hämolyse von S. aureus ergab, dass lttr852 nicht an der Regulation dieser Virulenzprozesse beteiligt war. Die RNA-Sequenzierung für potenzielle Zielgene von lttr852 identifizierte sowohl eine erhöhte Expression von Genen, die in der Aminosäuren-Biosynthese, Methionin-Sulfoxid-Reduktase und dem Kupfertransport involviert sind, als auch eine verringerte Transkription von codierenden Genen der Urease und Komponenten der Pyrimidin Nukleotide. Die Promotorfusion mit dem GFP-Reporter sowie das OmniLog System wurden verwendet, um Bedingungen zu identifizieren unter denen das lttr852 aktiv ist. Die Promotorstudien ergaben, dass die Anwesenheit von Glucose und eine erhöhte Temperatur die Promotoraktivität von lttr852 zeitabhängig herabsetzt, wobei die Aktivität durch mikroaerobe Bedingungen begünstigt wird. Kupfer wurde als limitierender Faktor identifiziert. Außerdem wurde der Einfluss diverser Regulatoren auf die transkriptionelle Regulation von lttr852 kontrolliert, jedoch keine zentrale Rolle in der Regulation von Virulenzgenen zugewiesen. Damit konnte innerhalb der vorliegenden Arbeit gezeigt werden, dass lttr852, ein neues Mitglied der Klasse der LysR-Typ Transkriptionsregulatoren in S. aureus, eine wichtige Rolle in der schnellen Adaption von S. aureus an die wechselnde Mikroumgebungen des Wirts hat. KW - Staphylococcus aureus KW - transcriptional regulation KW - metabolic adaptation KW - secondary site infection KW - LysR-type Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-246757 ER - TY - THES A1 - Schielke, Stephanie T1 - Functional and molecular characterization of FarR – a transcriptional regulator of the MarR family in Neisseria meningitidis T1 - Funktionelle und molekulare Charakterisierung von FarR, einem Transkriptionsregulator der MarR Familie in Neisseria meningitidis N2 - Neisseria meningitidis is a facultatively pathogenic human commensal and strictly adapted to its niche within the human host, the nasopharynx. Not much is known about the regulatory processes required for adaptation to this environment. Therefore the role of the transcriptional regulator NMB1843, one of the two predicted regulators of the MarR family in the meningococcal genome, was investigated. As this gene displayed a high sequence homology to FarR, the Fatty acid resistance Regulator in N. gonorrhoeae, we designated the meningococcal protein FarR (NmFarR). Homology modeling of this protein revealed a dimeric structure with the characteristic winged helix-turn-helix DNA binding motif of the MarR family. NmFarR is highly conserved among meningococcal strains and expression of farR during exponential growth is controlled post-transcriptionally, being highest in the late exponential phase. By means of electrophoretic mobility shift assays (EMSAs) the direct and specific binding of FarR to the farAB promoter region was shown, comparable to its homologue in gonococci. As FarR is involved in fatty acid resistance in N. gonorrhoeae, susceptibility assays with the medium chain lauric acid (C12:0), the long chain saturated palmitic acid (C16:0) and the long chain unsaturated linoleic acid (C18:2) were performed, testing a wide variety of strains of both species. In contrast to the unusually susceptible gonococci, a high intrinsic fatty acid resistance was detected in almost all meningococcal isolates. The molecular basis for this intrinsic resistance in N. meningitidis was elucidated, showing that both a functional FarAB efflux pump system as well as an intact lipopolysaccharide (LPS) are responsible for palmitic acid resistance. However, even despite circumvention of the intrinsic resistance, FarR could not be connected with fatty acid resistance in meningococci. Instead, FarR was shown to directly and specifically repress expression of the Neisseria adhesin A (nadA), a promising vaccine candidate absent in N. gonorrhoeae. Microarray analyses verified these results and disclosed no further similarly regulated genes, rendering the FarR regulon the smallest regulon in meningococci reported until now. The exact FarR binding site within the nadA promoter region was identified as a 16 bp palindromic repeat and its influence on nadA transcription was proved by reporter gene fusion assays. This repression was also shown to be relevant for infection as farR deficient mutant strains displayed an increased attachment to epithelial cells. Furthermore, farR transcription was attested to be repressed upon contact with active complement components within human serum. Concluding, it is shown that FarR adopted a role in meningococcal host niche adaptation, holding the balance between immune evasion by repressing the highly antigenic nadA and host cell attachment via this same adhesin. N2 - Neisseria meningitidis ist ein fakultativ pathogener menschlicher Kommensale und eng an die Bedingungen seiner spezifischen Nische, den Nasopharynx, angepasst. Über die regulatorischen Mechanismen, die für diese Anpassung vonnöten sind, ist nicht viel bekannt. Daher wurde die Rolle des Transkriptionsregulators NMB1843 untersucht, eines der beiden prognostizierten Regulatoren der MarR Familie im Meningokokken-Genom. Aufgrund einer hohen Sequenzhomologie dieses Gens zu FarR, dem Fatty acid resistance Regulator in N. gonorrhoeae, nannten wir das Meningokokken-Protein ebenfalls FarR (NmFarR). Homologie-Modellierung dieses Proteins ergab eine dimere Struktur mit dem charakteristischen winged helix-turn-helix DNA-Bindemotiv der MarR Familie. Es wurde gezeigt, dass NmFarR in Meningokokken-Stämmen hochkonserviert ist. Die Expression von farR wird während des exponentiellen Wachstums posttranskriptional kontrolliert und erreicht ihren Höchststand in der spätexponentiellen Phase. Wie bei seinem Homolog in Gonokokken konnte die direkte und spezifische Bindung von FarR an die farAB Promotorregion nachgewiesen werden. Da FarR in N. gonorrhoeae an der Fettsäureresistenz beteiligt ist, wurde die Suszeptibilität einer großen Auswahl von Stämmen beider Spezies gegenüber drei unterschiedlichen Fettsäuren getestet: Laurinsäure (C12:0), Palmitinsäure (C16:0) und Linolsäure (C18:2). Im Gegensatz zu den ungewöhnlich sensitiven Gonokokken konnte eine hohe inhärente Fettsäureresistenz in fast allen Meningokokken-Isolaten beobachtet werden. Nach Analyse der molekularen Grundlage dieser Resistenz konnte gezeigt werden, dass sowohl eine funktionale FarAB Efflux-Pumpe als auch ein intaktes Lipopolysaccharid (LPS) für die Palmitinsäureresistenz verantwortlich sind. Trotz Umgehung der inhärenten Resistenz konnte keine Verbindung von FarR mit Fettsäureresistenz in Meningokokken hergestellt werden. Stattdessen reprimiert FarR direkt und spezifisch die Expression des Neisseria Adhäsins A (nadA), eines vielversprechenden Impfstoffbestandteils. Microarrays bestätigten diese Ergebnisse, zeigten aber keine weiteren ähnlich regulierten Gene auf. Somit ist das FarR-Regulon das bisher kleinste Regulon in Meningokokken. Die genaue FarR-Bindestelle innerhalb des nadA Promotors wurde als ein 16 bp Palindrom identifiziert und dessen Einfluss auf die Transkription von nadA mittels Reportergenanalysen gezeigt. Auch in Infektionsversuchen wurde die Relevanz dieser Repression deutlich, da ein farR-deletierter Stamm eine höhere Adhärenz an Epithelzellen aufwies. Die Transkription von farR sank nach Kontakt mit aktiven Komplementbestandteilen aus humanem Serum. Zusammenfassend wurde gezeigt, dass FarR eine Rolle in der Nischenadaptation von Meningokokken zukommt, indem er zwischen Immunevasion durch Repression des hoch-immunogenen nadA und Wirtszelladhäsion durch eben dieses Adhäsin vermittelt. KW - Transkription KW - Neisseria gonorrhoeae KW - Neisseria meningitidis KW - Adhäsine KW - FarR KW - Transkriptionsregulation KW - NadA KW - Neisseria meningitdis KW - transcriptional regulation KW - FarR KW - Neisseria gonorrhoeae KW - niche adaptation Y1 - 2010 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-48550 ER -