TY - THES A1 - Somplatzki, Daniela T1 - Untersuchungen zur Rolle von PavA und der Fibronektin-vermittelten Interaktion von Streptococcus pneumoniae mit humanen Wirtszellen T1 - Role of PavA and fibronectin-mediated interactions of Streptococcus pneumoniae with host cells N2 - Der human pathogene Erreger Streptococcus pneumoniae besiedelt symptomlos den Nasenrachenraum des Menschen, löst aber auch Infektionen wie Otitis Media und invasive Erkrankungen wie Pneumonie und Meningitis aus. Einen essentiellen Schritt für den Infektionsprozess stellt die Anheftung von S. pneumoniae an die Epithel- und Endothelzellen des Wirtes dar. Im Infektionsverlauf ist auch das nachfolgende Eindringen der pathogenen Mikroorganismen in das humane Gewebe von wichtiger Bedeutung. An dieser Interaktion zwischen Erreger und Wirtszellen sind sowohl bakterielle Virulenzfaktoren als auch Komponenten des Wirtes beteiligt. Der pneumococcal adherence and virulence factor A (PavA) von S. pneumoniae ist ein Fibronektin-bindendes Oberflächenprotein und ist essentiell für die Virulenz in einem Sepsis- und einem Pneumonie-Mausinfektionsmodell (Holmes et al., 2001; Lau et al., 2001). In der vorliegenden Arbeit konnte PavA zusätzlich in einem experimentellen Maus-Meningitis-Modell als Virulenzfaktor identifiziert werden. In in vitro Infektionsstudien zeigten pavA-defiziente Pneumokokkenmutanten eine signifikant verringerte Adhärenz an und Invasion in alveoläre Epithelzellen A549 von Typ II Pneumozyten, in Larynxkarzinomzellen HEp-2, in humane Hirnendothelzellen HBMEC und in humane Nabelschnurendothelzellen HUVEC. Diese Zelllinien repräsentieren modellhaft typische Gewebezellen, mit denen S. pneumoniae während des Infektionsprozesses in Kontakt treten kann. Die signifikante Reduktion der Adhärenz der pavA-Mutante ist auf die Mutagenese des pavA-Gens zurückzuführen, da die Komplementierung mit einem aktiven pavA-Gen die Adhärenz an die humanen Zellen wiederherstellte. In Inhibitionsstudien blockierte anti-PavA-Antiserum die bakterielle Bindung an immobilisiertes Fibronektin, die über den C-terminalen Bereich des PavA-Proteins vermittelt wird. Im Gegensatz dazu wurde die Adhärenz von S. pneumoniae an die humanen Wirtszellen in Inhibitionsstudien mit anti-PavA-Antiserum oder rekombinantem PavA-Protein nicht blockiert. Zusammenfassend ist PavA ein wichtiger Virulenzfaktor für die Infektion und das Überleben der Erreger in vivo und spielt gleichzeitig auch eine Rolle während der Adhärenz von Pneumokokken an die humanen Wirtszellen in vitro. Allerdings beeinflusst PavA den Anheftungsprozess nicht direkt als Adhäsin, sondern scheint die Funktion anderer, wichtiger, bisher unbekannter Virulenzfaktoren von S. pneumoniae zu regulieren. Im zweiten Abschnitt der Arbeit wurde die Interaktion von S. pneumoniae mit dem Glykoprotein Fibronektin und deren Bedeutung für die Kolonisierung und den Infektionsmechanismus in vitro untersucht. S. pneumoniae bindet direkt an immobilisiertes Fibronektin (van der Flier et al., 1995). In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass Pneumokokken Fibronektin sowohl wirtsunabhängig aus dem Plasma rekrutieren als auch reines lösliches Fibronektin binden können. Dabei binden Pneumokokken sowohl die multimere, zelluläre Form des Fibronektins als auch das lösliche, dimere Plasma-Fibronektin. Die Zugabe von Fibronektin verstärkt die Adhärenz von S. pneumoniae an die humanen Nasopharynxepithelzellen Detroit 562, die Larynxzellen HEp-2, die Bronchialepithelzellen A549 und die Hirnendothelzellen HBMEC. Die Fibronektin-vermittelte Anheftung von Pneumokokken an die Nasopharynxzellen Detroit 562 und die Hirnendothelzellen HBMEC erfolgt wahrscheinlich über die Heparin-Bindungsdomäne, da die bakterielle Adhärenz durch die Zugabe von Heparin inhibiert wird. Weitere Inhibitionsstudien zeigten, dass weder die Präinkubation der Erreger mit anti-PavA-Antiserum noch die Zugabe von rekombinantem PavA-Protein die Fibronektin-vermittelte Adhärenz an die Wirtszellen blockierte. Die Interaktion von S. pneumoniae über das Brückenmolekül Fibronektin mit den humanen Wirtszellen findet damit nicht über das Fibronektin-bindende Oberflächenprotein PavA statt. Fibronektin vermittelt nicht nur die Adhärenz von S. pneumoniae an die Wirtszellen, sondern auch deren Internalisierung. In Inhibitionsstudien mit spezifischen Inhibitoren des Aktin-Zytoskeletts und der Mikrotubuli konnte gezeigt werden, dass die Dynamik des Zytoskeletts eine essentielle Rolle für die Fibronektin-vermittelte Internalisierung der Pneumokokken in die Wirtszellen spielt. Außerdem wurde durch die Zugabe von pharmakologischen Inhibitoren der Tyrosin Kinasen, der Familie der Src-Kinasen und der Phosphatidylinositol (PI-3)-Kinase die Fibronektin-vermittelte bakterielle Invasion in humane Zellen signifikant blockiert. Die Invasion von S. pneumoniae in Mausfibroblasten, die defizient für die fokale Adhäsionskinase (FAK) waren, war im Vergleich zu der bakteriellen Invasion in die Wildtyp-Fibroblasten reduziert. Diese Ergebnisse zeigen die Beteiligung der Src-Kinasen, der PI-3-Kinase und der FAK an der Signaltransduktion, die für die Fibronektin-vermittelte Invasion von S. pneumoniae in eukaryotische Zellen notwendig ist. N2 - The human pathogen Streptococcus pneumoniae causes infections such as otitis media, pneumonia and meningitis. Pneumococci colonize asymptomatically the human nasopharynx. But they can migrate also to the lungs and after breaching the lung barrier spread throughout the human body and induce severe invasive diseases. Adhesion of S. pneumoniae to epithelial and endothelial host cells is an essential first step for the establishment of colonization and invasive infections. Moreover subsequent bacterial invasion into the human tissue is important for developing disease as well. Both, bacterial virulence factors and host components participate in the interaction of pneumococci and human cells. The pneumococcal adherence and virulence factor A (PavA) of S. pneumoniae is a fibronectin binding surface protein and a crucial virulence determinant in a sepsis and in a pneumonia mouse model of infection (Holmes et al., 2001; Lau et al., 2001). Within this study, PavA was identified as an important factor causing disease and promoting survival in an experimental mouse meningitis model. PavA-deficient mutants of S. pneumoniae showed significantly reduced adherence and invasion into the alveolar epithelial cell type A549 of type II pneumocytes, larynx carcinoma epithelial cells HEp-2, human brain derived endothelial cells HBMEC and human umbilical vein derived endothelial cells HUVEC. These cell lines represent typical cells of the human tissue that are involved in the progression of pneumococcal infections. The adhesion level of a pavA-knockout mutant was restored by re-introducing the entire pavA gene, indicating that the observed effect was due to pavA-deficiency. In inhibition studies the addition of anti-PavA antisera inhibited pneumococcal attachment to immobilized fibronectin. Binding of fibronectin was mediated by the C-terminal part of the PavA protein. In contrast, bacterial adherence and invasion into host cells was not influenced by addition of anti-PavA antisera or recombinant PavA protein. In conclusion, PavA plays a pivotal role in pneumococcal adherence to host cells in vitro and is an important virulence factor for the progression of pneumococcal disease and survival in vivo. PavA is not directly involved in the pneumococcal adhesion process by acting as an adhesin. The results indicated that PavA affects colonization and pneumococcal survival by modulating the function of important but yet unknown virulence determinants of S. pneumoniae. In the second part of this study the interaction of S. pneumoniae with the host glycoprotein fibronectin and its role in colonization in vitro was investigated. S. pneumoniae binds directly to immobilized fibronectin (van der Flier et al., 1995). In this study is shown that pneumococci recruite fibronectin from plasma in a species-unspecific manner and bind pure soluble fibronectin. S. pneumoniae interacts with the multimeric cellular form of fibronectin as well as with the soluble dimeric plasma fibronectin. Host-cell bound fibronectin significantly enhances pneumococcal adherence to the human nasopharyngeal epithelial cell line Detroit 562, to larynx cells HEp-2, to alveolar cells A549 and to brain endothelial cells HBMEC. Fibronectin-mediated pneumococcal adherence to the nasopharyngeal cells Detroit 562 and to the brain endothelial cells HBMEC is probably mediated by the heparin binding site due to the fact that bacterial adherence is inhibited by the addition of heparin. Further inhibition studies demonstrated that neither pneumococcal preincubation with anti-PavA antisera nor addition of recombinant PavA protein inhibited fibronectin-mediated adherence. These results indicate that fibronectin-mediated adherence was not due to binding of PavA to fibronectin. Fibronectin plays a key role in pneumococcal adherence to host cells and, in addition, promotes pneumococcal internalization. Inhibition studies with specific inhibitors of the actin cytoskeleton an the microtubulis showed an essential impact of the cytoskeleton dynamic on the fibronectin-mediated pneumococcal invasion into host cells. In addition, presence of pharmacological inhibitors of tyrosine kinases, Src-kinases and Phosphatidylinositol (PI-3)-kinase significantly blocked fibronectin-mediated bacterial invasion in human cells. Pneumococcal invasion into fibroblasts deficient for the focal adhesion kinase (FAK) was reduced compared to wildtype fibroblasts. These results indicate the involvement of Src-kinases, PI-3-kinase and FAK in signal transduction leading to fibronectin-mediated internalization of S. pneumoniae in eukaryotic cells. KW - Streptococcus pneumoniae KW - Virulenzfaktor KW - Fibronectin KW - Pneumokokken KW - Virulenzfaktor KW - Fibronektin KW - pneumococci KW - virulence factor KW - fibronectin Y1 - 2007 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-23110 ER - TY - THES A1 - Lermann, Ulrich T1 - Molekulare Untersuchungen zur Regulation und Funktion der sekretierten Aspartatproteasen von Candida albicans T1 - Molecular investigations on regulation and function of secreted aspartic proteases of Candida albicans N2 - Die sekretorischen Aspartatproteasen (Saps) des Hefepilzes Candida albicans gelten als wichtiger Virulenzfaktor dieses opportunistischen Krankheitserregers. Die zehn Sap-Isoenzyme werden von einer Genfamilie codiert, deren Vertreter (SAP1-SAP10) in der Vergangenheit bereits intensiv untersucht wurden. SAP-Expressionsanalysen und die Charakterisierung von sap-Deletionmutanten, die in einem auxotrophen Laborstamm hergestellt wurden, führten aber zu teilweise widersprüchlichen Ergebnissen, weshalb die Rolle der einzelnen Proteine bis heute nicht zweifelsfrei aufgeklärt ist. Eine differentielle Expression der SAP-Gene in unterschiedlichen Stadien einer Infektion wurde jedoch in vielen unabhängigen Studien gezeigt. In der vorliegenden Arbeit wurde zunächst die Expression der Gene SAP1-SAP6 in einem etablierten in vitro-Modell einer Candida-Vaginitis untersucht, das auf der Infektion von rekonstituiertem humanem Epithel (RHE) basiert. Dazu wurden Reporterstämme verwendet, die bereits früher für Expressionsanalysen in verschiedenen in vivo-Infektionsmodellen in Mäusen eingesetzt worden waren. Dies erlaubte es einerseits unterschiedliche Nachweismethoden zur SAP-Genexpression in einem standardisierten Modell zu vergleichen und andererseits das Expressionsmuster der SAP-Gene in einem in vitro-Infektionsmodell mit den Ergebnissen von in vivo-Infektionsexperimenten zu korrelieren. Es zeigte sich in Übereinstimmung mit Ergebnissen früherer in vivo-Experimente in Mäusen, dass bei der Infektion des vaginalen Gewebes vor allem das SAP5-Gen induziert wurde. Allerdings weicht dieses Ergebnis deutlich von Ergebnissen anderer Studien ab, die mit Hilfe anderer Methoden ein ungleiches Muster der SAP-Expression detektierten. Um die Rolle der Gene SAP1-SAP6 bei der Infektion genauer zu untersuchen, wurden deshalb Mutanten hergestellt, in denen einzelne oder mehrere SAP-Gene mit Hilfe einer neuartigen Mutagenesestrategie erstmals aus dem Genom eines wildtypischen C. albicans-Stammes deletiert wurden. Überraschenderweise konnte sowohl in Einzelmutanten der Gene SAP1-SAP6 als auch in sap1 sap2 sap3- und sap4 sap5 sap6-Triplemutanten keine verminderte Fähigkeit zur Invasion und Schädigung von humanem Gewebe in RHE festgestellt werden. Eine in früheren Arbeiten beschriebene abgeschwächte Virulenz solcher Mutanten konnte auch in einem murinen Modell für eine disseminierende Infektion nicht beobachtet werden. Die Sekretion von Aspartatproteasen ermöglicht es C. albicans Proteine als alleinige Stickstoffquelle zum Wachstum zu verwenden. Unter diesen Bedingungen wird spezifisch die Expression des SAP2-Gens induziert; jedoch ist über die Mechanismen dieser Regulation noch wenig bekannt. Aus diesem Grund wurden in dieser Arbeit Promotor-Deletionsanalysen des SAP2-Gens und des mit diesem co-regulierten Oligopeptidtransportergens OPT1 durchgeführt. Es zeigte sich, dass unterschiedliche Bereiche innerhalb der 3,5 kb großen regulatorischen Region von SAP2 gemeinsam eine Expression dieses Gens unter induzierenden Bedingungen ermöglichen. Für das OPT1-Gen konnte eine regulatorische Region eingegrenzt werden, die für die Expression dieses Gens essentiell ist. In den für die Expression von SAP2 und OPT1 wichtigen Regionen wurden ähnliche Sequenzen gefunden, die als Bindungsstellen für regulatorische Faktoren dienen könnten. In dieser Arbeit wurden neue Erkenntnisse zur Regulation und Bedeutung der sekretierten Aspartatproteasen von C. albicans erhalten. Um eine endgültige Bewertung der Rolle dieser Enzyme in der Virulenz des Erregers zu ermöglichen, sind jedoch noch weitere detaillierte Studien unter Verwendung verschiedenster Infektionsmodelle nötig. N2 - The secreted aspartic proteases (Saps) of the yeast Candida albicans are considered as an important virulence trait of this opportunistic pathogen. The ten Sap isoenzymes are encoded by a gene family, whose members (SAP1-SAP10) have been analysed intensively already in the past. However, the analysis of the expression pattern of the SAP genes and the characterisation of sap deletion mutants, which were generated from an auxotrophic laboratory strain, yielded partially contradictory results. Therefore, the role of the individual proteins is still not fully elucidated. A differential expression of the SAP genes in various stages of an infection has been demonstrated in many independent studies. In the present work the expression of the SAP1-SAP6 genes was analyzed in an established in vitro model of vaginal candidiasis that is based on the infection of reconstituted human epithelium (RHE). For this purpose, reporter strains were used which had already been utilized previously to study the SAP expression pattern in various in vivo infection models in mice. This allowed the comparison of different detection methods for SAP gene expression in a standardized model and also to correlate the SAP expression pattern in an in vitro infection model with the results of in vivo infection experiments. It was found that SAP5 was the predominantly expressed SAP gene during infection of the vaginal tissue, in agreement with the results of previous in vivo experiments in mice. However, this result contrasts with those of other studies that, using alternative methods, detected a different SAP expression pattern. To investigate the role of the SAP1-SAP6 genes during infection in more detail, a new set of mutants was generated, in which single or multiple SAP genes were deleted for the first time from the genome of a C. albicans wild-type strain with the help of a novel mutagenesis strategy. Surprisingly, neither single mutants lacking one the SAP1-SAP6 genes nor triple mutants lacking all of the SAP1-SAP3 or the SAP4-SAP6 genes exhibited a detectable defect in invasion and damage of reconstituted human epithelium. A previously reported attenuated virulence of sap mutants was also not observed in a murine model of disseminated candidiasis. The secretion of aspartic proteases enables C. albicans to utilize proteins as a sole source of nitrogen for growth. Under these conditions expression of the SAP2 gene is specifically induced, however, little is known about the mechanisms of this regulation. Therefore, promoter deletion analyses of the SAP2 gene and the co-regulated oligopeptide transporter gene OPT1 were performed in the present work. It was found that different regions within the approximately 3,5 kb large SAP2 promoter jointly allowed the expression of this gene under inducing conditions. For OPT1, a region could be delimited that is essential for the expression of this gene. The regions that were found to be important for SAP2 and OPT1 expression contain similar sequences, which may serve as binding sites for regulatory factors. This study provides new insights into the regulation and importance of the secreted aspartic proteases of C. albicans. For a definite evaluation of the role of these enzymes in the virulence of the pathogen, however, further detailed studies that employ a variety of different infection models are necessary. KW - Candida KW - Candida albicans KW - Proteasen KW - Virulenzfaktor KW - Mykose KW - secreted aspartic proteases KW - candida albicans KW - virulence factor Y1 - 2008 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-29168 ER -