TY  - THES
A1  - Ganesan, Jayavarshni
T1  - The role of microRNA-378 in cardiac hypertrophy
T1  - Untersuchungen zur Rolle der MikroRNA-378 bei kardialer
Hypertrophie
N2  - MicroRNAs are endogenous ≈22 nt long non coding RNA molecules that modulate gene expression
at the post transcriptional level by targeting mRNAs for cleavage or translational repression.
MicroRNA-mRNA interaction involves a contiguous and perfect pairing within complementary
sites usually in the 3’ UTR of the target mRNA. Heart failure is associated with myocyte
hypertrophy and death, due to compensatory pathological remodeling and minimal functional repair
along with microRNA deregulation.

In this study, we identified candidate microRNAs based on their expression strength in
cardiomyocytes and by their ability to regulate hypertrophy. Expression profiling from early and
late stages of heart failure showed several deregulated microRNAs. Of these microRNAs, miR-378
emerged as a potentially interesting microRNA that was highly expressed in the mouse heart and
downregulated in the failing heart. Antihypertrophic activity of miR-378 was first observed by
screening a synthetic miR library for morphologic effects on cardiomyocytes, and validated in vitro proving the tight control of hypertrophy by this miR. We combined bioinformatic target prediction analysis and microarray analysis to identify the targets of miR-378. These analyses suggested that factors of the MAP kinase pathway were enriched among miR-378 targets, namely MAPK1 itself (also termed ERK2), the insulin-like growth factor receptor 1 (IGF1R), growth factor receptor bound protein 2 (GRB2) and kinase suppressor of ras 1 (KSR1). Regulation of these targets by miR-378 was then confirmed by mRNA and protein expression analysis. The use of luciferase reporter constructs with natural or mutated miR-378 binding sites further validated these four proteins as direct targets of miR-378. RNA interference with MAPK1 and the other three targets prevented the prohypertrophic effect of antimiR-378, suggesting that they functionally relate to miR-378. In vivo restoration of disease induced loss of miR-378 in a pressure overload mouse model of hypertrophy using adeno associated virus resulted in partial attenuation cardiac hypertrophy and significant improvement in cardiac function along with reduced expression of the four targets in heart.

We conclude from these findings that miR-378 is an antihypertrophic microRNA in cardiomyocytes, and the main mechanism underlying this effect is the suppression of the MAP kinase-signaling pathway on four distinct levels. Restoration of disease-associated loss of miR-378 through cardiomyocyte-targeted AAV-miR-378 may prove as an effective therapeutic strategy in myocardial disease.
N2  - MicroRNAs sind ca. 22 Nukleotide lange endogene, nicht-kodierende RNA-Moleküle, die die
Expression von Genen posttranskriptionell regulieren, indem sie den Abbau der Ziel-mRNA
herbeiführen oder deren Translation hemmen. Die Interaktion von microRNA und mRNA erfolgt
durch perfekt komplementäre Bindung in der 3’-untranslatierten Region der Ziel-mRNA. Eine
Deregulation der Expression verschiedener microRNAs lässt sich bei Herzinsuffizienz beobachten.
Im insuffizienten Herzen laufen kompensatorische pathologische Remodellingprozesse ab und es
kommt unter anderem zu Hypertrophie und Apoptose von Kardiomyozyten.
Im Rahmen dieser Arbeit haben wir Kandidaten-microRNAs nach folgenden Kriterien identifiziert:
1) Expr e s s ions s t ä rke in Ka rdiomyozyt en, 2) Fähigke i t zur Regul a t ion von
Kardiomyozytenhypertrophie im Screening einer synthetischen microRNA-Bibliothek auf
Kardiomyozytengröße und 3) Regulation ihrer Expression in frühem und späten Stadium eines
murinen Herzinsuffizienzmodells. Aus den resultierenden Kandidaten-microRNAs wurde im
folgenden miR-378 näher untersucht. MiR-378 war im gesunden Mausherz stark exprimiert. Die
Expression nahm bei Herzinsuffizienz ab. Weiterhin hatte die Überexpression von miR-378 in
neonatalen Kardiomyozyten einen antihypertrophen Effekt. Im Gegenzug führte die Expression von
antimiR-378 zu einer verstärkten Hypertrophie. Zur Target-Suche wurden zum einen
bioinformatische Vorhersage-Datenbanken verwendet und zum anderen ein Microarray
durchgeführt. Diese Analysen zeigten eine Anreicherung von Faktoren des MAP-Kinase-
Signalweges: Mitogen-aktivierte Proteinkinase 1 (MAPK1, auch als ERK2 bezeichnet), Insulinähnlicher
Wachstumsfaktorrezeptor 1 (IGF1R), Wachstumsfaktorbindeprotein 2 (GRB2) und
Kinasesuppressor von Ras 1 (KSR1). Die Regulation dieser Targets durch miR-378 wurde durch
Bestimmung der mRNA- und Proteinexpression nach Überexpression bzw. Inhibition von miR-378
bestätigt. Durch Luziferaseassays mit Reporterkonstrukten, die jeweils die exakten oder mutierte
Bindungsstellen der vier Targets enthielten, konnte gezeigt werden, dass die mRNAs der vier
Faktoren direkte Targets von miR-378 darstellen. Durch siRNA-mediierte Herabregulation der
Zielproteine konnte der prohypertrophe Effekt von antimiR-378 inhibiert werden. Daraus lässt sich
schließen, dass der Hypertrophie-Phänotyp direkt auf miR-378 zurückzuführen ist. Schließlich
wurde der Effekt von miR-378 im murinen Herzinsuffizienzmodell (Konstriktion der Aorta, TAC)
untersucht. TAC führte zu einer Abnahme der Expression von miR-378 im Herzen. Durch Adenoassoziierten
Virus (AAV) vermittelte exogene Expression von miR-378 wurde das Expressionslevel
des gesunden Herzens im TAC-Modell wiederhergestellt und die Expression der vier Targets
herabgesetzt. Dies resultierte in weniger ausgeprägten Kardiomyozytenhypertrophie sowie in einer signifikanten Verbesserung der Herzfunktion.
Aus diesen Daten schließen wir, dass miR-378 einen antihypertrophen Effekt auf Kardiomyozyten
hat, der wesentlich durch die Suppression des MAP-Kinase-Signalweges an vier Angriffspunkten
vermittelt wird. Die Wiederherstellung des “gesunden” Expressionsniveaus von miR-378 im
kranken Herzen durch Kardiomyozyten-spezifische Expression mit AAV-miR-378 könnte eine
Therapieoption bei Herzerkrankungen sein.
KW  - Hypertrophie
KW  - Herzinsuffizienz
KW  - miRNS
KW  - Herzmuskelzelle
KW  - Cardiomyocytes
KW  - Gene therapy
KW  - MicroRNA
KW  - Cardiac hypertrophy
KW  - Hypertrophy
Y1  - 2014
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-100918
ER  - 
TY  - THES
A1  - Wittmann, Tanja
T1  - Die Bedeutung von Phospholamban Pentameren für die Phospholamban-Phosphorylierung und die Regulation der SERCA2a-Aktivität
T1  - The role of phospholamban pentamers for phospholamban phosphorylation and regulation of SERCA2a activity
N2  - Phospholamban (PLN) reguliert in der Herzmuskelzelle die Aktivität der Kalzium-ATPase SERCA2a und damit maßgeblich die Kinetik des myozytären Kalzium-Kreislaufs. PLN liegt im Herz in Form von Monomeren und Pentameren vor, wobei angenommen wird, dass nur die Monomere die Aktivität der SERCA2a durch direkte Interaktion hemmen. Die Funktion der Pentamere ist noch immer unklar. In der vorliegenden Arbeit sollte untersucht werden, ob PLN-Pentamere für die PKA-abhängige Phosphorylierung des PLN und damit für die Regulation der PLN-Aktivität von Bedeutung sein können. 
Mit Hilfe transfizierter HEK293AD-Zellen und verschiedener PLN-Mutanten wurde gezeigt, dass sowohl PLN-Monomere als auch -Pentamere durch die PKA phosphoryliert werden, wobei die Phosphorylierung der Monomere in Anwesenheit von Pentameren geringer ist und verzögert abläuft. Ohne Pentamer war die Phosphorylierung der Monomere dagegen bereits basal und nach moderater PKA-Stimulation stärker. Ursache dafür schien eine höhere Affinität der PKA für PLN-Pentamere als für Monomere zu sein. Darüber hinaus konnte gezeigt werden, dass nicht nur PLN-Monomere sondern auch das PLN-Pentamer mit der SERCA2a interagieren und das Oligomer im Gegensatz zum PLN-Monomer nach PLN-Phosphorylierung zu einem kleinen Anteil an die SERCA2a gebunden bleibt. Auch spiegelten sich die unterschiedlichen Phosphorylierungsmuster von PLN-Pentamer und Monomer in den SERCA2a-Aktivitäten wieder. Messungen der SERCA2a-Aktivität in Mäuseherzen mit (Wildtyp und TgPLN) und ohne (TgAFA-PLN) PLN-Pentamere zeigten, dass Wildtyp-PLN und TgPLN die SERCA2a stärker inhibieren als TgAFA-PLN, was auf die stärkere basale Phosphorylierung des TgAFA-PLN zurückzuführen war. Nach PKA-Stimulation war der Anstieg der Enzymaktivität in Anwesenheit von TgPLN fast dreimal höher als in TgAFA-PLN. Analog zeigte TgPLN eine deutlichere Steigerung der Phosphorylierung der PLN-Monomere als TgAFA-PLN. 
Zusammenfassend konnte gezeigt werden, dass PLN-Pentamere durch Hemmung der Monomer-Phosphorylierung deren Aktivität erhöhen mit der Folge einer verstärkten Inhibition der SERCA2a. Da die inhibitorische Wirkung durch PKA-Stimulation vollständig aufgehoben werden kann, erhöhen die Pentamere die Regulationsmöglichkeiten der SERCA2a-Aktivität.
N2  - Phospholamban (PLN) regulates the activity of the calcium ATPase SERCA2a and thus the kinetics of myocyte calcium cycling. In the heart, PLN occurs in monomeric and pentameric form, however, only monomers are thought to inhibit the activity of SERCA2a by direct interaction. The function of the pentamer is still unclear. The aim of the present work was to investigate whether PLN pentamers may play a role for PKA dependent PLN phosphorylation and thus for regulating PLN activity.
Using transfected HEK293AD cells and various PLN mutants, it was shown that both PLN monomers and pentamers get phosphorylated by PKA. Intriguingly, phosphorylation of monomers was delayed in the presence of pentamers but increased in the absence of pentamers, both under basal conditions and moderate PKA stimulation. The underlying reason for this observation turned out to be a higher affinity of PKA for PLN pentamers compared to monomers. Furthermore, not only PLN monomers but also PLN pentamers interacted with SERCA2a. Unlike monomers, a small proportion of PLN oligomers was still bound to SERCA2a following PLN phosphorylation. Further, SERCA2a activity reflected the different phosphorylation patterns of monomers and pentamers. Measurements of SERCA2a activity in mouse hearts with (Wildtyp-PLN; TgPLN) and without PLN pentamers (TgAFA-PLN) showed that wild-type PLN and TgPLN strongly inhibit SERCA2a due to stronger phosphorylation of TgAFA-PLN. After PKA stimulation, the increase of SERCA2a enzyme activity was almost three times higher in TgPLN than in TgAFA-PLN. Likewise, the increase of monomer phosphorylation was more pronounced in TgPLN than in TgAFA-PLN.
Taken together, it was shown that PLN pentamers increase the activity of PLN monomers by attenuating monomer phosphorylation leading to increased inhibition of SERCA2a. Since this inhibition can be completely abolished by PKA stimulation, we conclude that PLN pentamers augment the regulatory range of SERCA2a.
KW  - Phospholamban
KW  - SERCA2a
KW  - Phosphorylierung
KW  - Herzmuskelzelle
KW  - Calciumtransport
Y1  - 2014
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-108286
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