TY - THES A1 - Bruno, Raphael Romano T1 - Auswirkung von Infusionslösungen mit Hydroxyethylstärke (HES) auf humane proximale Tubulusepithelzellen der Niere in vitro T1 - The impact of fluid solutions with hydroxyethylstarch (HES) on human proximal tubular cells of the kidney in vitro N2 - Die Volumentherapie durch Infusionslösungen spielt eine herausragende Rolle im klinischen Alltag von Intensivmedizin, perioperativer Medizin und Notfallmedizin. Für diesen Zweck stehen verschiedene kristalloide und kolloidale Infusionslösungen zur Verfügung. Das in Deutschland am häufigsten eingesetzte Kolloid ist die Hydroxyethylstärke (HES). Dessen Stellenwert ist stark umstritten. Insbesondere die Wirkung von Hydroxyethylstärke auf die für den kritisch Kranken eine zentrale Rolle spielende Niere gilt als zentrales Problem. Die vorliegende Arbeit untersuchte aufbauend auf die in vivo-Versuche von Schick et al. die Auswirkungen klinisch relevanter Dosierungen von Hydroxyethylstärke und anderen Infusionslösungen (Gelatine, Humanalbumin, 0,9% NaCl, Sterofundin® ISO) auf die Viabilität von immortalisierten humanen proximalen Tubulusepithelzellen (HK-2). Im Anschluss wurde die Relevanz des pH - Wertes, der Osmolalität, der Trägerlösung, des Molekülursprungs, der Molekülgröße, der HES - Generation und der Inkubationsdauer auf die von HES ausgelösten Effekte geprüft. Danach wurde gezeigt, ob der beobachtete Effekt reversibel war, ob es sich um ein direkt zytotoxisches Phänomen handelte, ob die HES _ Wirkung durch proinflammatorische Stimuli verstärkt und ob HES selbst eine Inflammation auf mRNA - Ebene induzieren konnte. HES bewirkte keine proinflammatorische Stimulation der Zellen und wird durch die Anwesenheit proinflammatorischer Stimuli in seiner schädigenden Wirkung nicht verstärkt. Die mitochondriale Leistungsfähigkeit als Schlüsselaspekt des kritisch Kranken wurde durch den EZ4U („Viabilität“) bestimmt. Ein Messartefakt konnte nicht identifiziert werden. HES reduziert mit steigender Dosis die Viabilität der HK - 2 Zellen in deutlichem Ausmaß, obwohl die Zellen immortalisiert und nicht vorgeschädigt waren. Diese Reduktion erfolgte durch alle untersuchten HES - Präparate. Dabei war niedermolekulares HES leicht weniger schädlich als hochmolekulares HES. Der HES - Effekt war unmittelbar nach Beginn der Inkubation nachweisbar. Der Viabilitätsreduktion stand eine verzögert einsetzende Zytoxoxizität gegenüber. Der HES - Effekt war auch nach einer „Regenerationsphase“ der Zellen nachweisbar und somit in vitro nur partiell reversibel. Gelatine erwies sich im Vergleich als ebenso bis schlechter verträglich. Gelatine war deutlich zytotoxischer. Humanalbumin zeigte in niedrigen Dosierungen protektive, in hohen Dosierungen ebenfalls negative Einfluss auf Zellviabilität und war in höheren Dosierungen zytotoxisch. Die balancierte Vollelektrolytlösung Sterofundin® ISO war größtenteils inert, in seiner Wirkung auf die mRNA im Vergleich zur 0,9% NaCl Kontrolllösung protektiv. Zusammenfassend konnte eine Übergelegenheit des HES der „3. Generation“ gegenüber anderen HES - Präparaten nicht gefunden werden. Alles deutete darauf hin, dass ausschließlich die applizierte Gesamtmasse von HES ausschlaggebend ist. Synthetische Kolloide sind in vitro nephrotoxisch und beeinträchtigen die mitochondriale Funktionsf ähigkeit deutlich. Diese Beobachtungen entsprechen denen großer klinischer Studien. Die Ursache dieses Phänomens bleibt unklar. Weitere Grundlagenforschung ist notwendig, um den zugrundeliegenden Pathomechanimus aufzuklären. N2 - Background: Renal failure is a common complication of critically ill patients. Volume therapy is a standard procedure in daily perioperative care. There is an ongoing discussion about the benefits of colloid resuscitation with hydroxyethylstarch (HES), gelatin, or albumin. Furthermore reports about the nephrotoxic side effects of synthetic colloids in septic patients are increasing. Therefore, we investigated the influence of colloids (various HES-preparations, gelatin (Gelafundin®), human albumin, and the crystalloid Sterofundin® ISO on cell viability of human proximal tubular (HK-2) cells. To validate that the HES molecule itself is harmful, regardless of its molecule size or origin, we conducted a comprehensive study to elucidate the influence of different HES preparations on human proximal tubular cells (PTC) viability in vitro. Methods: HK-2 cells were incubated with colloids (0.1%–4.35%) or with equivalent volumes of the crystalloid solution Sterofundin® ISO. The pH values of all applied solutions were adjusted to 7.4 (± 0.5). After 0, 2, 4 and 21 hours, cell viability of HK-2 cells was measured by EZ4U assay (dye XTT). Cell viability of human PTC was measured with a cytotoxicity assay, quantifying the reduction of tetrazolium salt to colored formazan. To investigate uptake of HES 130/0.4 into HK-2 cells, we labeled HES130/0.4 with fluorescent 8-aminopyrene-1, 3, 6 – trisulfonic acid (APTS). Furthermore HK-2 cells were cultured +/- lipopolysaccharid (LPS) and tumor necrosis factor-α (TNF-α), each with and without 1.5 % HES. Further experiments were performed by assessing the influence of different carrier solutions of HES (balanced, non-balanced or cell culture medium), different average molecular weights (70, 130, 200 kDa), different origins (potato or corn derived), and various durations of incubation (0–21 hours). In addition, HES 130/0.4 was fractionated by ultrafiltration. The impact on cell viability of average single-size fractions with <3, 3 to 10, 10 to 30, 30 to 50, 50 to 100, and >100 kDa was investigated. We also tested the possible synergistic effects of inflammation induced by tumor necrosis factor-α and LPS. Cell viability was measured with XTT- (EZ4U), cell toxicity after 4 and 21 hours with LDH-test. Quantitative polymerase chain reactions were run with fluorescein amidite– labeled TaqMan® probes to detect ICAM-1 and CCL-2. For statistical analysis a 2-sided t test with the same variances was used; P values ≤ 0.05 and 0.001 were classified as statistically significant. Results: Osmolarity as well as pH values of the solutions were in the physiological range, remained stable during the experiments, and showed no differences in comparison with the 0% control groups. HK-2 cells incubated with 4.35% APTS-HES for 21 hours showed both vesicular-like uptake of fluorescence but also bigger agglomerates of APTS-HES situated in gaps of red-stained DNA. In vitro neither LPS nor TNF-α did worsen the HES-induced reduction of cell viability in PTC cells. We hypothesized that HK-2 cells could be insensitive to TNF-α due to their immortalization, although HK-2 cells are commonly used for inflammatory investigations. Therefore, we measured the effect of TNF-α on CCL-2 and ICAM-1 mRNA expression and discovered a significantly increased level of both. Furthermore, there was no significant increase of CCL-2 or ICAM-1 mRNA expression after HES treatment, while gelatin shows proinflammatory and human albumin anti-inflammatory effects. Application of HES 130/0.4 alone decreased cell viability significantly in a concentration-dependent manner (86.80±10.79% by 0.5% HES down to 24.02±4.27% by 4% HES). Human albumin (>1.25%) as well as gelatin (>1%) also showed deleterious effects on HK-2 cells. Interestingly, in lower concentrations, human albumin and the crystalloid solution Sterofundin® ISO were cytoprotective in comparison with control. In conclusion, synthetic and natural colloids showed a harmful impact on HK-2 cells in higher concentrations without any prior proinflammatory stimulus. HES130/0.4 exhibited the most distinctive harmful impact, whereas the application of crystalloid Sterofundin® ISO revealed cytoprotective effects. All tested HES solutions, regardless of origin or carrier matrix, decreased cell viability in an equivalent, dose-dependent manner. Additional incubation with TNF - α did not worsen HES-induced reduction of cell viability. Minor differences were detected comparing 70, 130, and 200 kDa preparations. Analysis of fractionated HES revealed that each fraction decreased cell viability. Even small HES molecules (10–30 kDa) were significantly deleterious. Conclusion: We demonstrated that HES accumulated in renal proximal tubule cells (PTCs). Synthetic and natural colloids caused harmful side effects, whereas human albumin exhibited a cytoprotective effect at low concentrations. The crystalloid solution showed for the most part a cytoprotective pattern on the human PTCs in vitro. For the first time, we demonstrated in vitro that only the pure mass of HES molecules might be responsible for impairment of human PTC. Neither the carrier solution (balanced, sodium chloride based, or cell medium), the origin (potato or corn derived), the molecule size nor inflammation influenced the reduction of PTC viability. Our data show that HES itself has a negative impact on renal PTC, which should be considered when HES is used clinically. The related pathomechanism has not been discovered yet. KW - Hydroxyäthylstärke KW - Nephrotoxizität KW - Volumensubstitution KW - Starch volumetherapy nephrotoxicity HK-2 cells KW - HÄS KW - HES KW - HK-2 Zellen KW - Volumentherapie KW - Kolloidale Volumenersatztherapie Y1 - 2015 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-123278 ER - TY - THES A1 - Hoffmann, Dana T1 - Neue Biomarker zum Nachweis von Nierentoxizität T1 - Novel Biomarker of Nephrotoxicity N2 - Der Prozess von der Entdeckung und Entwicklung eines potentiellen Arzneistoffs bis zu dessen Zulassung ist extrem kosten‐ und zeitintensiv und eine Vielzahl dieser Stoffe kann aufgrund toxischer Nebenwirkungen in präklinischen Studien nicht weiterentwickelt werden. Dabei ist die Niere eines der Hauptziele von Xenobiotika‐induzierter Organtoxizität, jedoch ist eine frühe Detektion von Nierenschäden schwierig. Den derzeitig verwendeten klinischen Parameter, wie Blutharnstoff (BUN) und Serumkreatinin fehlt es an Sensitivität und Spezifität, da sie Fremdstoff‐induzierte Toxizität meist erst aufzeigen, wenn schon ein erheblicher Teil der Nierenfunktion beeinträchtigt ist. Daher ist es notwendig, empfindlichere und zuverlässigere Biomarker zu identifizieren und zu validieren, welche kleinste Nierenschädigungen früher als traditionelle Parameter erkennen. In den letzten Jahren wurden in der Literatur aber auch von verschiedenen Projekten eine Reihe neuer gen‐basierender und Urinbiomarker (Kim‐1, Clusterin, Lipocalin‐2, Timp‐1) identifiziert. Ziel dieser Dissertation war es die Aussagekraft dieser Marker im Vergleich zu traditionellen Endpunkten, einschließlich klinische Chemie und Histopathologie an Gewebe‐, Urin‐ und Serumproben von männlichen Ratten, welche mit Modellsubstanzen für Nephrotoxizität (Aristolochiasäure und Gentamicin) oder nephrotoxischen Arzneistoffkandidaten (PredTox Projekt) behandelt wurden, mittels qRT‐PCR, Immunhistochemie und ELISA zu untersuchen. Zusammenfassend kann man sagen, dass die Effekte auf Ebene der Gen‐ und Proteinexpression generell sehr gut mit den histopathologischen Veränderungen korrelieren. Sie konnten meist früher oder in niedrigeren Dosierungen als die traditionellen Nierenmarker BUN und Serumkreatinin detektiert werden. Eine erhöhte Expression und Exkretion von Kim‐1 zeigte sich in allen Studien als eine der frühesten Antworten auf Schädigung der proximalen Tubuli und stellt somit den empfindlichsten Biomarker dar. Die erhöhte Ausscheidung von Clusterin konnte teilweise vor einer veränderten Gen‐ und Proteinexpression im Gewebe detektiert werden und unterstützen die Verwendung von Clusterin als nicht‐invasiven Biomarker. Obwohl eine gesteigerte Exkretion von Lipocalin‐2 sehr früh nach Schädigung des proximalen Tubulus detektiert werden konnte, ist diese nicht spezifisch für einen Nierenschaden. Dennoch könnte die vermehrte Expression/Ausscheidung von Lipocalin‐2 als frühe Antwort auf eine Entzündung oder einen Gewebeschaden eine sinnvolle Ergänzung der routinemäßigen Testung auf Toxizität darstellen. Ebenfalls konnte ein dosis‐ und zeitabhängiger Konzentrationsanstieg von einem Großteil der potentiellen Biomarker des „WideScreen™ Rat Kidney Toxicity Panels 1 and 2“ im Urin beobachtet werden. Da jedoch die potentiellen Biomarker unterschiedliche Empfindlichkeiten besitzen und unter Umständen auch vom Mechanismus der Toxizität von Verbindungen abhängen, erscheint eine Kombination von verschiedenen Biomarkern zur frühzeitigen Erkennung von proximalen Nierenschäden sowie zur Verlaufskontrolle von Nierenerkrankungen sinnvoll. Durch die einfache Probenahme und leichte Bestimmung ist die Messung der neuen potentiellen Nierenbiomarker im Urin neben der Bestimmung der traditionellen Parameter der klinischen Chemie sowie der Histopathologie sinnvoll für die Identifizierung von Nierenschädigungen in präklinischen Studien. N2 - The discovery and development of new drugs is very costly and time‐consuming and the rate of drug failure due to late‐breaking findings in preclinical toxicity studies is high. The kidney is a major target of xenobiotic induced organ toxicity but early detection of renal damage or minor effects on renal function is challenging due to the functional reserve of the kidney. Current clinical pathology parameters of nephrotoxicity such as blood urea nitrogen (BUN) and serum creatinine are relatively insensitive and non specific, revealing kidney damage not until 70‐80 % of the renal epithelial mass has been lost. There is a clear need for the identification and validation of more sensitive and reliable biomarkers, which are indicators of minimal kidney damage rather than impaired kidney function. Recently a range of novel gene‐based and urinary kidney biomarker (Kim‐1, clusterin, lipocalin‐2 and Timp‐1) was identified from literature and various colloraborative projects. The aim of this work was to investigate the performance of these markers compared to traditional endpoints, such as clinical chemistry and histopathology in tissue, urine and serum samples collected from studies, in which male Wistar rats were treated either with model compounds of nephrotoxicity (aristolochic acid and gentamicin) or drug candidates (PredTox) using qRT‐PCR, immunohistochemistry and ELISA. In summary, effects on marker gene and protein expression generally correlated well with the renal histopathology alterations and were frequently detected at earlier time‐points or lower doses than the traditional clinical parameters BUN and serum creatinine. Overexpression and enhanced urinary excretion of Kim‐1 was one of the earliest responses to proximal tubule damage and might be seen as the most sensitive marker of nephrotoxicity. Furthermore, urinary Clusterin was increased before changes in gene and protein expression or even histopathological alterations were evident, confirming urinary clusterin as a sensitive, non‐invasive marker for renal injury. Although changes in urinary lipocalin‐2 occurred very early after proximal tubule damage, lipocalin‐2 may not specific for kidney injury. However, its rapid response to inflammation and tissue damage in general may reinforce its use in routine toxicity testing. A dose‐ and time‐dependent increase in most of the novel urinary biomarkers was evident using the “WideScreen™ Rat Kidney Toxicity Panels 1 and 2”. Due to the the variable sensitivity of a single biomarker, a combination of many different biomarkers to detect kidney injury appears to be useful. Concerning of the easy sampling and measurement, the additional determination of potential urinary biomarkers of nephrotoxcity next to the traditional clinical chemistry parameters and histopathological changes is helpful to identify kidney damage at early time‐points. KW - Biomarker KW - Nephrotoxizität KW - Niere KW - biomarker KW - nephrotoxicity KW - kidney Y1 - 2010 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-48562 ER - TY - THES A1 - Reiser, Pia T1 - Das Adverse Outcome Pathway (AOP) – Konzept als Grundlage für die Entwicklung mechanistischer tierversuchsfreier Ansätze: Eine Fallstudie über Nephrotoxizität initiiert durch rezeptorvermittelte Endozytose und lysosomalen Overload T1 - The Adverse Outcome Pathway (AOP) concept as a framework for the development of mechanistic non-animal approaches: a case study of nephrotoxicity initiated by receptor-mediated endocytosis and lysosomal overload N2 - Zur Verbesserung der Prüfung und Risikobewertung der zunehmenden Menge von Chemikalien und Arzneimitteln, gilt es neue Alternativen in Form von in vitro Prüfmethoden mit mechanistisch relevanten Endpunkten zu finden. Einen solchen Rahmen bietet das konzeptionelle Konstrukt des Adverse Outcome Pathway (AOP)- Konzepts. Es erzeugt auf der Basis bestehenden Wissens einen mechanistischen und kausalen Zusammenhang mit Hilfe von mehreren Schlüsselereignissen (Key Event [KE]) zwischen einem initierenden molekularen Ereignis (Molecular Initiating Event [MIE]) und einem adversen Effekt (Adverse Outcome [AO]) auf biologischer Ebene. Im Rahmen dieser Arbeit wurde der AOP „Rezeptorvermittelte Endozytose und lysosomaler Overload führen zu Nephrotoxizität“ am Zellkulturmodell proximaler Nierentubuluszellen weiterentwickelt. Es wurden in vitro Assays für die Zelllinien RPTEC/TERT1 (Mensch) und NRK-52 E (Ratte) für jedes KE etabliert. In dem AOP wird die Initiierung der Schädigung des Nierengewebes durch rezeptorvermittelte Endozytose der Substanzen (MIE) mit folgendem lysosomalem Overload (KE 1) und der lysosomalen Membranruptur (KE 2) beschrieben. Es kommt zur Zellschädigung (KE 3) und endet mit einem Schaden auf Organebene (AO). Für KE 1 erfolgte die Visualisierung des lysosomal-assoziierten Membranproteins (lysosomal-associated Membranprotein [LAMP]) und in KE 2 die Darstellung der Protease Cathepsin D (CTSD) mittels Immunfluoreszenz. Für KE 3 wurden spezifische Toxizitätsdaten der Testsubstanzen mit dem CellTiter-Glo® Lumineszenz-Zellviabilitätstest generiert. Gewählte Stressoren für den AOP war die Gruppe der Polymyxin-Antibiotika (Polymyxin B, Colistin, Polymyxin B Nonapeptid), das Aminoglykosid Gentamicin, das Glykopeptid Vancomycin sowie Cadmiumchlorid. In Zusammenschau der Ergebnisse der drei KEs war die Rangfolge der Auswirkungen der drei Polymyxin-Derivate über alle KEs konsistent. Polymyxin B erwies sich als aktivste Substanz, während Polymyxin B Nonapeptid die geringsten Auswirkungen zeigte. Als Ausblick in weiterführenden Analysen der Arbeitsgruppe konnten bei Cadmiumchlorid trotz einer signifikanten Zytotoxizität (KE 3) nur geringe Auswirkungen in der LAMPExpression (KE 1) aufgezeigt werden. Des Weiteren erfolgte die Erstellung von Response-Response-Analysen, um mittels vorgeschalteter Schlüsselereignisse nachfolgende Effekte vorhersagen zu können. Projektpartner der Universität Utrecht entwickelten darüber hinaus eine quantitative in vitro in vivo Extrapolation (QIVIVE) mittels eines physiologisch basierten pharmakokinetischen (PBPK) Modells. N2 - To improve testing and risk assessment of the increasing amount of chemicals and drugs, new alternatives of in vitro testing methods with mechanistically relevant endpoints need to be found. The conceptual construct of the Adverse Outcome Pathway (AOP) concept provides such a framework. It generates a mechanistic and causal relationship based on existing knowledge using multiple key events (KE) between an initiating molecular event (MIE) and an adverse outcome (AO) at a biological level. In this work, the AOP "Receptor-mediated endocytosis and lysosomal overload lead to nephrotoxicity" was further developed using a cell culture model of proximal renal tubular cells. In vitro assays were established for the RPTEC/TERT1 (human) and NRK-52E (rat) cell lines for each KE. In the AOP, initiation of renal tissue damage by receptor-mediated endocytosis of substances (MIE) with subsequent lysosomal overload (KE 1) and lysosomal membrane rupture (KE 2) is described. Cell damage occurs (KE 3) and ends with organ damage (AO). For KE 1, visualization of lysosomal-associated membrane protein (LAMP), and for KE 2, visualization of protease cathepsin D (CTSD) was used by immunofluorescence. For KE 3, specific test substance toxicity data were generated using the CellTiter-Glo® luminescence cell viability assay. Selected stressors for the AOP were polymyxin antibiotics (polymyxin B, colistin, polymyxin B nonapeptide), the aminoglycoside gentamicin, the glycopeptide vancomycin, and cadmium chloride. All results of the three KEs combined, the ranking of the effects of the three polymyxin derivatives was consistent across all KEs. Polymyxin B proved to be the most active compound, while polymyxin B nonapeptide showed the lowest effects. In further analyses of the working group, only minor effects in LAMP expression (KE 1) could be shown with cadmium chloride despite a significant cytotoxicity (KE 3). Furthermore, response-response analyses were performed to predict upstream effects by downstream key events. Project partners from Utrecht University also developed a quantitative in vitro to in vivo extrapolation (QIVIVE) using a physiologically based pharmacokinetic (PBPK) model. KW - Nephrotoxizität KW - Lysosom KW - Endozytose KW - Adverse Outcome Pathway KW - rezeptorvermittelte Endozytose KW - lysosomaler Overload KW - tierversuchsfrei Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-318046 ER -