TY - INPR A1 - Seitz, Florian A1 - Jungnickel, Tina A1 - Kleiber, Nicole A1 - Kretschmer, Jens A1 - Dietzsch, Julia A1 - Adelmann, Juliane A1 - Bohnsack, Katherine E. A1 - Bohnsack, Markus T. A1 - Höbartner, Claudia T1 - Atomic mutagenesis of N\(^6\)-methyladenosine reveals distinct recognition modes by human m\(^6\)A reader and eraser proteins T2 - Journal of the American Chemical Society N2 - N\(^6\)-methyladenosine (m\(^6\)A) is an important modified nucleoside in cellular RNA associated with multiple cellular processes and is implicated in diseases. The enzymes associated with the dynamic installation and removal of m\(^6\)A are heavily investigated targets for drug research, which requires detailed knowledge of the recognition modes of m\(^6\)A by proteins. Here, we use atomic mutagenesis of m\(^6\)A to systematically investigate the mechanisms of the two human m\(^6\)A demethylase enzymes FTO and ALKBH5 and the binding modes of YTH reader proteins YTHDF2/DC1/DC2. Atomic mutagenesis refers to atom-specific changes that are introduced by chemical synthesis, such as the replacement of nitrogen by carbon atoms. Synthetic RNA oligonucleotides containing site-specifically incorporated 1-deaza-, 3-deaza-, and 7-deaza-m\(^6\)A nucleosides were prepared by solid-phase synthesis and their RNA binding and demethylation by recombinant proteins were evaluated. We found distinct differences in substrate recognition and transformation and revealed structural preferences for the enzymatic activity. The deaza m\(^6\)A analogues introduced in this work will be useful probes for other proteins in m\(^6\)A research. KW - modified nucleosides KW - N6-methyladenosine (m6A) KW - atomic mutagenesis KW - YTH reader proteins KW - demethylase enzymes FTO and ALKBH5 Y1 - 2024 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-352376 ER - TY - INPR A1 - Dietzsch, Julia A1 - Jayachandran, Ajay A1 - Mueller, Stefan A1 - Höbartner, Claudia A1 - Brixner, Tobias T1 - Excitonic coupling of RNA-templated merocyanine dimer studied by higher-order transient absorption spectroscopy T2 - Chemical Communications N2 - We report the synthesis and spectroscopic analysis of RNA containing the barbituric acid merocyanine rBAM2 as a nucleobase surrogate. Incorporation into RNA strands by solid-phase synthesis leads to fluorescence enhancement compared to the free chromophore. In addition, linear absorption studies show the formation of an excitonically coupled H-type dimer in the hybridized duplex. Ultrafast third- and fifth-order transient absorption spectroscopy of this non-fluorescent dimer suggests immediate (sub-200 fs) exciton transfer and annihilation due to the proximity of the rBAM2 units. KW - Barbituric Acid Merocyanines KW - Nucleobase Surrogate Incorporation KW - Higher-order Transient Absorption Spectroscopy KW - rBAM2-labeled RNA strands Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-327772 ET - submitted version ER - TY - JOUR A1 - Dietzsch, Julia A1 - Bialas, David A1 - Bandorf, Johannes A1 - Würthner, Frank A1 - Höbartner, Claudia T1 - Tuning Exciton Coupling of Merocyanine Nucleoside Dimers by RNA, DNA and GNA Double Helix Conformations JF - Angewandte Chemie International Edition N2 - Exciton coupling between two or more chromophores in a specific environment is a key mechanism associated with color tuning and modulation of absorption energies. This concept is well exemplified by natural photosynthetic proteins, and can also be achieved in synthetic nucleic acid nanostructures. Here we report the coupling of barbituric acid merocyanine (BAM) nucleoside analogues and show that exciton coupling can be tuned by the double helix conformation. BAM is a nucleobase mimic that was incorporated in the phosphodiester backbone of RNA, DNA and GNA oligonucleotides. Duplexes with different backbone constitutions and geometries afforded different mutual dye arrangements, leading to distinct optical signatures due to competing modes of chromophore organization via electrostatic, dipolar, - stacking and hydrogen-bonding interactions. The realized supramolecular motifs include hydrogenbonded BAM–adenine base pairs and antiparallel as well as rotationally stacked BAM dimer aggregates with distinct absorption, CD and fluorescence properties. KW - Chromophore Assembly KW - Merocyanine KW - Nucleobase Analogue KW - Supramolecular Element KW - Nucleic Acids Y1 - 2022 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-254565 ER - TY - THES A1 - Dietzsch, Julia T1 - Nucleic acid-mediated fluorescence activation and chromophore assembly T1 - Nukleinsäure-vermittelte Fluoreszenzaktivierung und Chromophorassemblierung N2 - Nucleic acids are not only one of the most important classes of macromolecules in biochemistry but also a promising platform for the defined arrangement of chromophores. Thanks to their precise organization by directional polar and hydrophobic interactions, oligonucleotides can be exploited as suitable templates for multichromophore assemblies with predictable properties. To expand the toolbox of emissive, base pairing nucleobase analogs several barbituric acid merocyanine (BAM) chromophores with tunable spectroscopic properties were synthesized and incorporated into RNA, DNA and glycol nucleic acid (GNA) oligonucleotides. A multitude of duplexes containing up to ten BAM chromophores was obtained and analysis by spectroscopic methods revealed the presence of dipolarly coupled merocyanine aggregates with properties strongly dependent on the chromophore orientation toward each other and the backbone conformation. These characteristics were exploited for various applications such as FRET pair formation and polymerase chain reaction (PCR) experiments. The observed formation of higher-order aggregates implies future applications of these new oligonucleotide-chromophore systems as light-harvesting DNA nanomaterials. Besides oligonucleotide templated covalent assembly of chromophores also non-covalent nucleic acid-chromophore complexes are a broad field of research. Among these, fluorogenic RNA aptamers are of special interest with the most versatile ones based on derivatives of the GFP chromophore hydroxybenzylidene imidazolone (HBI). Therefore, new HBI-derived chromophores with an expanded conjugated system and an additional exocyclic amino group for an enhanced binding affinity were synthesized and analyzed in complex with the Chili aptamer. Among these, structurally new fluorogenes with strong fluorescence activation upon binding to Chili were identified which are promising for further derivatization and application as color-switching sensor devices for example. N2 - Nukleinsäuren sind nicht nur eine der wichtigsten Klassen biochemisch relevanter Makromoleküle, sondern stellen auch eine vielversprechende Plattform für die definierte räumliche Organisation kleiner funktioneller Moleküle, wie beispielsweise Chromophore, dar. Oligonu-kleotide können aufgrund ihrer präzise gegliederten Struktur, die durch gerichtete polare und hydrophobe Wechselwirkungen hervorgerufen wird, als nützliche Template für die mehrfache kovalente und nicht-kovalente Anordnung von Chromophoren zu Aggregaten mit vorhersagbaren spektroskopischen Eigenschaften genutzt werden. Obwohl eine Vielzahl solcher Chromophorsysteme bereits in der Literatur beschrieben ist, basieren die meisten Chromophordesigns nur auf hydrophoben Wechselwirkungen zwischen den einzelnen Chromophoren und lassen die intrinsische Fähigkeit kanonischer Nukleobasen, komplementäre Basenpaare zu bilden, außen vor. Allerdings liegt es auf der Hand, dass die Berücksichtigung dieser polaren Wechselwirkungen nicht nur zu einer Stabilisierung der Oligonukleotid-Sekundärstruktur führen kann, sondern auch die Interpretation spektroskopischer Effekte vereinfacht. Um das bekannte Spektrum emittierender Nukleobasen-Analoga zu erweitern und den zusätz-lichen Einfluss dieser polaren Wechselwirkungen auszunutzen, wurden im Zuge dieser Arbeit verschiedene, strukturell unterschiedliche Barbitursäure-Merocyanin-Chromophore (BAM) entworfen. Die Barbitursäure-Akzeptoreinheit dieser künstlichen Nukleobasensurrogate ähnelt der Watson-Crick-Basenpaarungsseite der natürlichen T- und U-Nukleobasen und soll somit die Basenpaarung mit Adenosin ermöglichen. Durch die Kombination dieses Akzeptors mit unterschiedlich aufgebauten aromatischen Donoreinheiten, wie zum Beispiel Indol und Benzothiazol, konnten Merocyanine mit interessanten spektroskopischen Eigenschaften erhalten werden. Da die Konstitution des Nukleinsäurerückgrates einen starken Einfluss auf die Strukturparameter und die thermodynamische Stabilität der resultierenden Duplexstruktur hat, wurden die synthetisierten BAM-Chromophore in Phosphoramiditbausteine für die kovalente Assemblierung innerhalb verschiedener Oligonukleotidsysteme umgewandelt. Neben der Synthese entsprechender DNA- und RNA-Nukleotide wurden die BAM-Chromophore auch als Glykolnukleinsäure-Bausteine (GNA) mit einem azyklischen Rückgrat hergestellt. Der erfolgreiche Einbau der erhaltenen künstlichen Nukleoside konnte durch Festphasensynthese erreicht werden, wobei über 100 modifizierte Einzelstränge erhalten werden konnten. Die Hybridisierung der künstlichen Oligonukleotid-Einzelstränge mit ihren jeweiligen Gegensträngen führte zu einer Vielzahl kurzer Duplexstrukturen mit bis zu zehn BAM-Chromophoren in unterschiedlicher Anordnung. Mithilfe verschiedenster spektroskopischer Methoden konnte ein Einblick in die strukturelle Organisation der Merocyanine innerhalb dieser Systeme erhalten werden, wobei sich die Bildung dipolar-gekoppelter Merocyanin-Dimere und -Multimere zeigte. Die hierfür erforderliche ungewöhnliche \textit{syn}-Konformation der BAM-Chromophore wurde weiterhin durch Oligonukleotid-NMR bestätigt. Erstaunlicherweise wiesen die spektroskopischen und thermodynamischen Eigenschaften BAM-modifizierter Nukleinsäuren eine starke Abhängigkeit von der Chromophororientierung und der Konformation des Rückgrates auf. Dieser Effekt konnte für verschiedene Anwendungen wie die Bildung von FRET-Paaren und die Verwendung als internes fluoreszentes Stop-Nukleotid in Polymerasekettenreaktionen ausgenutzt werden. Mithilfe von Rasterkraftmikroskopie wurde außerdem die Bildung von Aggregaten höherer Ordnung beobachtet, was eine zukünftige Verwendung dieser neuen Oligonukleotid-Chromophor-Systeme als Materialien für Lichtsammelkomplexe oder für die DNA-Nanotechnologie denkbar macht. Ein weiteres großes Forschungsfeld neben kovalenten Chromophoranordnungen mit Oligonukleotiden als Templat sind nicht-kovalente Nukleinsäure-Chromophorkomplexe. Insbesondere fluorogene RNA-Aptamere sind hier von großer Bedeutung wobei die wichtigsten auf der Fluoreszenzaktivierung von Derivaten 4-Hydroxybenzylidenimidazolon-Fluorophors (HBI), dem Chromophor des natürlich vorkommenden grün fluoreszierenden Proteins (GFP), beruhen. Allerdings zeigen viele der berichteten Aptamer-Ligand-Systeme signifikante Nachteile wie unter anderem unspezifische Bindung, eine starke Tendenz zu Photoisomerisierung oder ineffiziente Zellpermeabilität. Deshalb wurden im Zuge dieser Arbeit neue, von HBI abgeleitete Chromophore mit einem vergrößerten konjugierten $\uppi$-System und einer zusätzlichen exozykli-schen Aminogruppe für eine erhöhte Bindungsaffinität synthetisiert und im Komplex mit dem bekannten Chili-Aptamer untersucht. Einige dieser strukturell neuen Chromophore zeigten einen starken Anstieg der Emission bei Bindung an dieses Aptamer und wurden daher weiter charakterisiert. Sie stellen eine vielversprechende Möglichkeit für weitere Derivatisierung und die zukünftige Anwendung beispielsweise als schaltbare Aptamer-basierte Fluoreszenzsensoren dar. KW - Nucleinsäuren KW - Merocyanine KW - Grün fluoreszierendes Protein KW - Aptamer KW - Exziton KW - Fluoreszenzaktivierung Y1 - 2022 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-259761 ER -