TY - JOUR A1 - Sander, Brigitta A1 - de Jong, Daphne A1 - Rosenwald, Andreas A1 - Xie, Wanling A1 - Balagué, Olga A1 - Calaminici, Maria A1 - Carreras, Joaquim A1 - Gaulard, Philippe A1 - Gribben, John A1 - Hagenbeek, Anton A1 - Kersten, Marie José A1 - Molina, Thierry Jo A1 - Lee, Abigail A1 - Montes-Moreno, Santiago A1 - Ott, German A1 - Raemaekers, John A1 - Salles, Gilles A1 - Sehn, Laurie A1 - Thorns, Christoph A1 - Wahlin, Bjorn E. A1 - Gascoyne, Randy D. A1 - Weller, Edie T1 - The reliability of immunohistochemical analysis of the tumor microenvironment in follicular lymphoma: a validation study from the Lunenburg Lymphoma Biomarker Consortium JF - Haematologica N2 - The cellular microenvironment in follicular lymphoma is of biological and clinical importance. Studies on the clinical significance of non-malignant cell populations have generated conflicting results, which may partly be influenced by poor reproducibility in immunohistochemical marker quantification. In this study, the reproducibility of manual scoring and automated microscopy based on a tissue microarray of 25 follicular lymphomas as compared to flow cytometry is evaluated. The agreement between manual scoring and flow cytometry was moderate for CD3, low for CD4, and moderate to high for CD8, with some laboratories scoring closer to the flow cytometry results. Agreement in manual quantification across the 7 laboratories was low to moderate for CD3, CD4, CD8 and FOXP3 frequencies, moderate for CD21, low for MIB1 and CD68, and high for CD10. Manual scoring of the architectural distribution resulted in moderate agreement for CD3, CD4 and CD8, and low agreement for FOXP3 and CD68. Comparing manual scoring to automated microscopy demonstrated that manual scoring increased the variability in the low and high frequency interval with some laboratories showing a better agreement with automated scores. Manual scoring reliably identified rare architectural patterns of T-cell infiltrates. Automated microscopy analyses for T-cell markers by two different instruments were highly reproducible and provided acceptable agreement with flow cytometry. These validation results provide explanations for the heterogeneous findings on the prognostic value of the microenvironment in follicular lymphoma. We recommend a more objective measurement, such as computer-assisted scoring, in future studies of the prognostic impact of microenvironment in follicular lymphoma patients. KW - CD/metabolism KW - flow cytometry KW - antigens KW - regulatory T-cells KW - independent predictor KW - gene expression KW - high numbers KW - CD40 ligand KW - Riutximab KW - survival KW - marcophages KW - transformation KW - in-vitro Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-116875 SN - 1592-8721 VL - 99 IS - 4 ER - TY - THES A1 - Rennefahrt, Ulrike T1 - Die Rolle einer konstitutiv-aktiven MAP-Kinase SAPK-Beta bei der zellulären Transformation, Proliferation und Apoptose von NIH-3T3-Fibroblasten T1 - The role of a constitutively active MAP kinase SAPKbeta in cellular transformation, proliferation and apoptosis of NIH 3T3 fibroblasts N2 - Bei c-Jun N-terminalen Kinasen (JNKs) (auch als Stress-aktivierte Proteinkinasen SAPKs bezeichnet), handelt es sich um Mitglieder der Mitogen-aktivierten Proteinkinase Familie (MAPK), die die Genexpression als eine Antwort auf eine Vielzahl von physiologischen und nicht-physiologischen Stimuli regulieren. Gendeletionsexperimente (knockout) und der Einsatz von dominant-negativen Mutanten wiesen auf eine Funktion von SAPK/JNKs bei Prozessen der zellulären Differenzierung, dem Überleben und/oder Apoptose sowie onkogener Transformation hin. Direkte Analysen des transformierenden Potentials von SAPK/JNKs wurden bislang durch das Fehlen von konstitutiv-aktiven Mutanten verhindert. Erst unlängst konnte durch die Fusion der MAP Kinase mit seiner direkten, in der Kaskade vorgeschalteten, Aktivatorkinase solche Mutanten bereitgestellt werden. Im Rahmen dieser Doktorarbeit wurde ein SAPKb-MKK7 Hybridprotein generiert, mit dessen Hilfe das transformierende Potential von aktiviertem SAPKb charakterisiert werden konnte. Die induzierte Expression von SAPKb-MKK7 führte zur morphologischen Transformation von NIH 3T3 Fibroblasten. Darüber hinaus bildeten diese Zellen kleine Foci aus transformierten Zellen, wuchsen in Soft-Agar und vergleichbar mit onkogenem Ras oder Raf, resultierte auch die Expression von aktiviertem SAPKb in der Zerstörung des F-Aktins. Des Weiteren steigerte die Expression von SAPKb-MKK7 die Proliferationsraten von NIH 3T3 Zellen. Im Gegensatz zu den akut transformierenden Onkogenen wie ras oder raf, ist SAPKb-MKK7 jedoch nicht in der Lage, das Überleben der transformierten Zellen zu bewirken. Unsere Daten schlagen daher vor, das konstitutiv-aktives SAPK/JNK zwar die Hauptaspekte zellulärer Transformation verursacht, aber nicht imstande ist, alle Veränderungen zu induzieren, die benötigt werden, um einen vollständig transformierten Phänotypen zu etablieren, weshalb insgesamt gesehen, sein transformierendes Potential deutlich schwächer ausgeprägt ist. Wir haben zusätzlich damit begonnen, dass tumorgene Potential von SAPKb-MKK7 direkt im Nacktmausmodell zu verifizieren. Die Injektion von SAPKb-MKK7 exprimierenden Fibroblasten resultierte in der Etablierung eines gut definierten Fibrosarkoms, wobei die Latenzzeit länger war als bei v-Raf transformierten Zellen. Somit ist die Expression von aktiviertem SAPK/JNK ausreichend, um die Tumorentwicklung in vivo zu initieren, auch wenn die lange Latenzzeit auf die Notwendigkeit zusätzlicher genetischer Veränderungen hinweist. N2 - The c-Jun N-terminal kinases (JNKs) (also known as stress-activated protein kinases, SAPKs), members of the mitogen-activated protein kinase (MAPK) family, regulate gene expression in response to a variety of physiological and environmental stimuli. Gene knockout experiments and the use of dominant interfering mutants have pointed to a role of SAPK/JNKs in the processes of cell differentiation, survival and/or apoptosis as well as oncogenic transformation. Direct analysis of the transforming potential of JNKs has been hampered so far by the lack of constitutively active forms of these kinases. Recently such mutants have become available by fusion of the MAPK with its direct upstream activator kinase. In the context of this PhD thesis a constitutively active SAPKb-MKK7 hybrid protein was generated and used to characterize the transforming potential of activated SAPKb. Inducible expression of SAPKb-MKK7 caused morphological transformation of NIH 3T3 fibroblasts. Additionally, these cells formed small foci of transformed cells, grew anchorage-independent in soft agar and similar to oncogenic Ras and Raf, expression of activated SAPKb resulted in the degradation of F-actin stress fibers. Furthermore, expression of SAPKb-MKK7 increased proliferation rates of NIH 3T3 cells. However, in contrast to the classical oncogenes like ras and raf, SAPKb-MKK7 is not able to selectively support the survival of the transformed cells. Therefore, our data suggest that constitutive SAPK/JNK activation elicits major aspects of cellular transformation, but is unable to induce the complete set of changes which are required to establish the fully transformed phenotype. We have also begun to directly determine the tumorigenic potential of SAPKb-MKK7 in the nude mouse. Injection of SAPKb-MKK7 expressing fibroblasts resulted in the establishement of a well defined fibrosarcoma, albeit at much later timepoints than in the case of v-Raf transformed cells. The long latency with which they develop tumors suggests the requirement of further genetic alterations. Thus expression of activated SAPK/JNK is sufficient to initiate tumor development in vivo. KW - MAP-Kinase KW - Zelldifferenzierung KW - SAPK KW - JNK KW - Signaltransduktion KW - Transformation KW - Fibroblasten KW - SAPK KW - JNK KW - signal transduction KW - transformation KW - fibroblasts Y1 - 2002 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-4158 ER - TY - THES A1 - Hartkamp, Jörg T1 - Regulation von MAPK Signalwegen durch die Sein/Threonin Kinase MLK3 T1 - regulation of MAPK signaling pathways through mixed lineage kinase 3 N2 - MAPK Kaskaden spielen eine Schlüsselrolle bei der Übertragung und der Umwandlung von extrazellulären Reizen in intrazelluläre Signale und regulieren dadurch unterschiedliche Prozesse wie Differenzierung, Zellproliferation oder Stress Antworten. 'Mixed Lineage Kinasen' (MLKs) bilden eine Familie von Serin/Threonin Proteinkinasen mit mehreren Protein/Protein Interaktionsdomänen (SH3, Cdc42 Rac interactive binding sequence/CRIB, Leuzin Zipper), die am engsten mit der Familie der MAPKK Kinasen verwandt ist. In der voliegenden Arbeit zeigen wir, dass MLK3 Cdc42/Rac induzierte JNK/SAPK Aktivität vermittelt, welches zu einer anschließenden Phosphorylierung und verstärkter transkriptioneller Aktivität des zur AP-1 Familie gehörenden immediate early Gens c-Jun führt. Zusätzlich phosphoryliert MLK3 die dualspezifischen Kinasen MEK1/2 direkt in vitro und in vivo an den für die Aktivierung wichtigen Serinen 217/221. Wohingegen dies nur zu einer ERK Aktivierung in Überexpressionssystemen führte, demonstrieren die Analysen überzeugend, dass endogenes MEK1/2, welches von MLK3 phosphoryliert worden ist, nicht in der Lage ist, diese Aktivität auf das physiologische Substrat ERK1/2 in vitro wie auch in vivo zu übertragen. Wir postulieren daher, dass MLK3 vermittelte MEK1/2 Phosphorylierung die dualspezifischen Kinasen von ERK1/2 Aktivierung entkoppelt. Zusätzlich zeigen wir, dass Überexpression von Wild Typ MLK3 zur morphologischen Transformation von NIH 3T3 Fibroblasten und Wachstum in Soft Agar führt. In Übereinstimmung mit den anderen Analysen ist MEK1/2 stark phosphoryliert jedoch von ERK1/2 Aktivierung in MLK3 transformierten Zellen entkoppelt. Weiterhin kooperiert MLK3 mit aktivierter MEK1 in Foci Bildung, was zeigt, dass MLK3 andere Signalwege als ERK1/2 in der Zelltransformation benutzt. Vielmehr ist in MLK3 transformierten Fibroblasten Wachstumsfaktor-induzierte ERK1/2 Aktivierung und Expression des immediate early Gens junB partiell blockiert. Unsere Analysen zeigen zum ersten Mal für eine MAPKK Kinase, dass sie MAPK Signalwege unterschiedlich reguliert. Während MLK3 auf der einen Seite JNK/SAPK aktiviert, entkoppelt es MEK1/2 induzierte Phosphorylierung von ERK1/2 Aktivierung und blockiert sogar Wachstumsfaktor-induzierte ERK1/2 Ativierung partiell. N2 - MAPK cascades play a key role in transducing and converting signals from extracellular stimuli into intracellular signals thereby regulating diverse processes like differentiation, proliferation or stress responses. Mixed lineage kinases (MLKs) form a family of serin/threonin protein kinases with multiple protein/protein interaction domains (SH3, Cdc42 Rac interactive binding sequence/CRIB, leucine zipper), which are most closely related to the MAPKK kinase family. In this work we show that MLK3 mediates Cdc42/Rac induced JNK/SAPK activation resulting in subsequent phosphorylation and enhanced transcriptional activity of the immediate early gene c-jun, which belongs to the family of AP-1 proteins. In addition MLK3 directly phosphorylates the dual specificity kinases MEK1/2 in vitro and in vivo on serines 217/221, which are important for activation. Whereas this only resulted in activation of the ERK1/2 pathway in overexpression systems, the analyses demonstrate convincingly that endogenous MEK1/2 phosphorylated by MLK3 is unable to transmit its activity in vitro and in vivo to its physiological substrat, ERK1/2. Therefore we postulate that MLK3 mediated MEK1/2 phosphorylation uncouples the dual specificity kinases from ERK1/2 activation. Furthermore we show that overexpression of wild type MLK3 leads to morphological transformation of NIH 3T3 fibroblasts and growth in soft agar. Consistent with the other analyses MEK1/2 is highly phosphorylated but uncoupled from ERK1/2 activation in MLK3 transformed cells. In addition MLK3 cooperates with activated MEK1 in foci formation which demonstrates that MLK3 utilizes pathways different from ERK1/2 for cell transformation. Furthermore growth factor induced ERK1/2 activation and induction of the immediate early gene junB is partially blocked in MLK3 transformed fibroblasts. Our data provide evidence for the first time that a MAPKK kinase differentially regulates MAPK pathways. On the one hand MLK3 activates JNK/SAPK but on the other hand it uncouples MEK1/2 phosphorylation from ERK1/2 activation and even blocks growth factor induced ERK1/2 activation partially. KW - MAP-Kinase KW - Signaltransduktion KW - Protein-Serin-Threonin-Kinasen KW - MLK3 KW - ERK KW - MEK KW - JNK KW - jun KW - Transformation KW - MLK3 KW - ERK KW - MEK KW - JNK KW - jun KW - transformation Y1 - 2001 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-312 ER - TY - JOUR A1 - Elkon, Ran A1 - Loayza-Puch, Fabricio A1 - Korkmaz, Gozde A1 - Lopes, Rui A1 - van Breugel, Pieter C A1 - Bleijerveld, Onno B A1 - Altelaar, AF Maarten A1 - Wolf, Elmar A1 - Lorenzin, Francesca A1 - Eilers, Martin A1 - Agami, Reuven T1 - Myc coordinates transcription and translation to enhance transformation and suppress invasiveness JF - EMBO reports N2 - c‐Myc is one of the major human proto‐oncogenes and is often associated with tumor aggression and poor clinical outcome. Paradoxically, Myc was also reported as a suppressor of cell motility, invasiveness, and metastasis. Among the direct targets of Myc are many components of the protein synthesis machinery whose induction results in an overall increase in protein synthesis that empowers tumor cell growth. At present, it is largely unknown whether beyond the global enhancement of protein synthesis, Myc activation results in translation modulation of specific genes. Here, we measured Myc‐induced global changes in gene expression at the transcription, translation, and protein levels and uncovered extensive transcript‐specific regulation of protein translation. Particularly, we detected a broad coordination between regulation of transcription and translation upon modulation of Myc activity and showed the connection of these responses to mTOR signaling to enhance oncogenic transformation and to the TGFβ pathway to modulate cell migration and invasiveness. Our results elucidate novel facets of Myc‐induced cellular responses and provide a more comprehensive view of the consequences of its activation in cancer cells. KW - c‐Myc KW - transcriptional responses KW - translational regulation KW - transcription KW - transformation KW - metastasis KW - cancer KW - protein biosynthesis & quality control Y1 - 2015 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-150373 VL - 16 IS - 12 ER - TY - THES A1 - Eckert, Martin T1 - Zur Regulation und Expression von Aquaporinen unter Berücksichtigung des pflanzlichen Wasserhaushaltes T1 - On the regulation and expression of aquaporins with regard to plant water relation N2 - Die Methodik und Technik der Gaswechselmessung von Pflanzen wurde für den Modellorganismus Arabidopsis thaliana optimiert und für Untersuchungen zur Beteiligung des Aquaporins PIP1b an Wassertransportvorgängen während der Stomaöffnung verwendet. Die Messungen der Transpirationsraten von PIP1b-Antisense-Pflanzen ergaben keine Hinweise auf Veränderungen des zeitlichen Verlaufs der Stomaöffnung. Die Wasserpermeabilitäten von Schließzell-Plasmamembranen scheinen somit nicht von der Expression des Aquaporins PIP1b beeinflußt zu sein. - Gaswechselmessungen an Nicotiana tabacum NtAQP1-Antisense-Pflanzen zeigten eine Verringerung der Transpirationsraten im Licht und eine geringere Grundtranspiration im Dunkeln. Dies deutet auf eine Beteiligung von NtAQP1 am Wassertransport hin. - Ausgewählte Arabidopsis thaliana-Mutanten wurden hinsichtlich ihrer stomatären Antwort auf Rot- und Rot-/Blaulicht-Bestrahlung analysiert. Hierfür wurde ein Doppelbestrahlungs-Protokoll entwickelt. Vergleiche mit den Wildtypen ergaben signifikante Unterschiede bei der Phytochrom-Mutante phyA-103, der Abscisinsäure-Mutante aba3-2 und der Auxin-resistenten Mutante axr1-3. Ferner zeigte die Mutante npq1-2 nicht die beschriebene Abweichung der stomatären Antwort auf Blaulicht. - Die Expressionsmuster eines PIP1b-GFP-Reportergens in transgenen Arabidopsis thaliana-Pflanzen wurden analysiert. Hohe Promotor-Aktivitäten konnten in meristematischen Bereichen von Wurzel und Sproß, in Elementen der Leitbündel, in jungen Kotyledonen und in Staubblättern beobachtet werden. Es zeigte sich eine enge Korrelation zwischen PIP1b-Promotoraktivität und Streckungswachstum. - Eine Sequenzanalyse des NtAQP1-Promotors ergab Übereinstimmungen mit spezifischen Bindungsmotiven von MYB-ähnlichen Transkriptionsfaktoren. Mit Promotor-Reportergenen konnte die Beteiligung eines dieser Sequenzmotive an der GA- und ABA-induzierten Aktivierung des NtAQP1-Promotors gezeigt werden. Zur Analyse der Phytohormon-Wirkungen auf deletierte Promotorbereiche wurde ein duales Vektorsystem entwickelt und bei der transienten Transformation von BY2-Protoplasten eingesetzt. - Die Expression eines GFP::NtAQP1-Fusionsgens in BY2-Zellen zeigte die subzelluläre Lokalisation des Aquaporins in der Zytoplasmamembran. Ferner wurde Fusionsprotein in Vesikel-ähnlichen Strukturen beobachtet. N2 - Gas exchange measurement of plants was optimized for the model organism Arabidopsis thaliana. Consequently, studies on the participation of aquaporin PIP1b in water transport processes became possible. The transpiration rates obtained for PIP1b anti-sense plants revealed no differences in the time course of stomatal opening. Thus, water permeabilities of guard cell plasma membranes seem not to be influenced by the extend of PIP1b expression. - Gas exchange measurement of the Nicotiana tabacum NtAQP1 anti-sense plants showed a reduced transpiration in response to light and a reduced basal transpiration in the dark. This indicates the participation of NtAQP1 in water movement. - Selected Arabidopsis thaliana mutants were analyzed with regard to their stomatal response to red, red/blue light irradiation. For that, a dual beam protocol was developed. A comparison of the mutant lines to the wild-type revealed significant differences for the phytochrome A (phyA-103), the abscisic acid (aba3-2) and the auxin resistent (axr1-3) mutants. Furthermore, the mutant line npq1-2 did not show the abnormal stomatal response to blue light reported previously. - The expression patterns of a PIP1b-GFP-reporter gene in transgenic Arabidopsis thaliana plants were analyzed. High promotor activities were obtained in areas of meristematic tissue in roots and shoot, in vascular elements, in young cotyledons and in stamina. A close correlation between PIP1b-promoter activity and cell elongation was obvious. - Sequence analysis of the NtAQP1 promoter discovered DNA-motifs that correspond to specific binding sites of MYB-related transcriptional activators. By using promotor-reporter constructs, the involvement of one of this motifs in a GA- and ABA-induced increase of NtAQP1-promoter activity could be shown. In order to elucidate the effects of phytohormones on deleted promoter elements a dual vector system has been created, which was employed in the transient transfection of BY2-protoplasts. - The expression of a GFP::NtAQP1 translational fusion in BY2-cells revealed a subcellular location in the cytoplasmic membrane. Furthermore, the protein-fusion was recorded in small vesicle-like structures. KW - Pflanzen KW - Wasserhaushalt KW - Aquaporine KW - Genexpression KW - Genregulation KW - aquaporin KW - wasserhaushalt KW - stomata KW - GFP KW - protoplasten KW - transformation KW - aquaporins KW - water relation KW - stomata KW - GFP KW - protoplast transformation Y1 - 2000 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-1114 ER -