TY  - THES
A1  - Mäurer, André Germar Paul
T1  - Analysis of the Chlamydophila pneumoniae and host transcriptome in the acute and iron depletion-mediated persistent infection
T1  - Analyse des Transkriptoms von Chlamydophila pneumoniae und der Wirtszelle während der akuten und der durch Eisenmangel vermittelten persistenten Infektion
N2  - The obligate intracellular gram-negative bacterium, Chlamydophila pneumoniae (Cpn), has a significant impact as an acute and chronic disease-causing pathogen. Its potential to undergo persistent infections has been linked to chronic diseases. Several in vitro cell culture models are used to study persistent conditions, mainly IFN_ stimulation, treatment with antibiotics and iron depletion. Little is known about changes in the Cpn transcriptome during the acute and persistent infection. Therefore, the Cpn transcriptome during its acute developmental cycle and iron depletion-mediated persistence was examined in this study. Based on expression profiles, genes with similar expression changes formed 12 clusters using the self-organizing map algorithm. While other studies define genes based on their onset of transcription, here the important feature for clustering was the expression profile. This turned out to be more appropriate for comparing the time specific relevance of a certain cluster of genes to their proposed functions in the cycle. The Cpn clusters were grouped into the 'Early', 'Mid' and 'Late' classes as described for Ctr. Additionally, a new gene expression class containing genes with steadily increasing expression at the end of the developmental cycle was defined and termed 'Tardy' class. Comparison of the Cpn clusters to published proteomics data showed that genes encoding elementary body (EB) proteins peaked in the 'Late' gene cluster. This indicated that genes of the ‘Late’ and ‘Tardy’ class have different roles in RB to EB re-differentiation. Moreover, using lexical comparison the EB mRNA profile was significantly linked to the ‘Tardy’ cluster class. This provided evidence that initial translation in the cycle might be directed from stable transcripts present in the infectious EB form. Based on these criteria the novel ‘Tardy’ class was separated from the ‘Late’ class. The gene ontologies were used to identify specific pathways and physiological functions active during the different phases of development. Additionally, the transcriptome of Cpn in the persistent stage was compared to that of the acute developmental cycle. The Cpn transcriptome was altered in the iron-depletion mediated persistence. Genes upregulated were linked to clusters at the beginning of the developmental cycle, and genes down-regulated were linked to clusters at the end of the developmental cycle. These data provided strong evidence that the Cpn transcriptome during persistence is a gene expression arrest in mid-development. In early acute infection convergently or divergently oriented gene pairs preferentially had an antagonistic expression profile, whereas tandemly oriented gene pairs showed a correlated expression profile. This suggests that the Cpn genome is organized mainly in tandemly arranged operons and in convergently or divergently oriented genes with favored antagonistic profiles. The microarray studies done with the Cpn strain CWL029 also showed expression signals for several genes annotated only for the Cpn strains AR39 and J138. BLAST comparison verified that these genes are also coded in the CWL029 genome. Several of these genes were convergently arranged with their neighboring gene and shared overlapping genome information. Among these were parB, involved in DNA segregation and rpsD, an alternative sigma factor responsible for the transcription at late stages of the developmental cycle. Both genes have been described to have major roles in the chlamydial cycle. These genes had an antagonistic expression profile at the beginning of the acute developmental cycle and in persistence, as described before to be predominant for convergently oriented genes. Real time RT-PCR analysis showed that full-length rpsD mRNA transcripts were down-regulated, whereas short-length rpsD mRNA transcripts were up-regulated during the persistent infection. This demonstrated that the rpsD promoter is activated during the persistent infection and that because of the collision of the RNA polymerases full length transcripts were down-regulated. This sigma factor-independent mechanism is known as ‘Transcriptional Interference’. This is the first description on how the alternative sigma factor rpsD might be down-regulated during persistent infections. Finally, the host cell transcriptome was analyzed in the acute and persistent infection mediated by the depletion of iron. Cpn infection triggered the upregulation of relB, involved in an alternative NF-KB signaling pathway. Several genes coding for cell cycle proteins were triggered, including cyclin G2 and cyclin D1 and inhibitors of CDK4. Taken together, this work provides insights into the modulation of the pathogen and the host transcriptome during the acute infection and the iron mediated persistent infection.
N2  - Das obligat intrazelluläre, gram-negative Bakterium Chlamydophila pneumoniae (Cpn) wird mit akuten und chronischen Krankheiten in Verbindung gebracht. Besonders sein Potential persistente Infektionen zu durchlaufen ist mit chronischen Krankheiten korreliert worden und deshalb von besonderem Interesse. Verschiedene in vitro Zellkulturmodelle werden verwendet um persistente Infektionen zu untersuchen, darunter IFN_ Stimulation, Antibiotika Behandlung und Eisenmangel. Über die Genregulation von Cpn als auch der Wirtzelle in der akuten und persistenten Infektion ist jedoch wenig bekannt. In dieser Arbeit wurde das Cpn Transkriptom als auch das von epithelialen Wirtszellen in der akuten und in der durch Eisenmangel induzierten Infektion untersucht. Mittels eines Algorithmuses für ‚selbstorganisierende Netzwerke’ (SOM) wurden signifikant regulierte Gene aufgrund ihres Expressionsprofiles in 12 Cluster gegliedert. Diese 12 Cluster wurden wiederum in die Klassen der ‘Frühen’ (engl.: ‘Early’), ‘Mittleren’ (engl.: ‘Mid’) und ‘Späten’ (engl.: ‘Late’) Gene eingeteilt. Diese Unterteilung lehnt sich an schon beschriebenen Genexpressionsstudien für Ctr an. Weiterhin wurde die neue Klasse der ‘Verspäteten’ (engl.: ‘Tardy’) Gene eingeführt. Diese hatten am Ende des Entwicklungszykluses ein kontinuierlich ansteigendes Expressionsprofil. Mit publizierten Proteinen aus chlamydialen Elementarkörperchen (EK) korrelierten vor allem Gene aus den ‘Späte’ jedoch nicht aus den ‘Verspätete’ Klassen. Gene dieser beiden Klassen müssen also eine unterschiedliche Rolle im EK Redifferenzierungsprozess spielen. Weiterhin waren überdurchschnittlich viele mRNA Transkripte aus der Klasse der ‘Verspäteten’ Gene in den EK vorhanden. Dies führte zu der Annahme, daß ein Teil der initiale Proteinexpression von stabilen mRNA-Transkripten aus der infektiösen EK Form erfolgt. Anschließend wurden, Gene, die für spezifische Signalwege und physiologische Funktionen von Cpn kodieren, basierend auf der ‚Gene Ontology’ während des Entwicklungszykluses untersucht. Weiterhin wurde das Transkriptom von Cpn in der Persistenz mit dem Transkriptom der akuten Infektion verglichen. Unter Persistenzbedingungen zeigte Cpn ein verändertes Expressionsprofil. Hochregulierte Gene konnten akuten Clustern am Anfang des akuten Entwicklungszykluses und herunterregulierte Gene Clustern am Ende des akuten Entwicklungszykluses zugeordnet werden konnten. Dies legt nahe, daß es sich bei der Persistenz nicht um ein neues Transkriptionsprofil handelt, sondern eher um eine Arretierung des Transkriptomes in der Mitte des akuten Entwicklungszykluses. Weiterhin zeigten konvergent und divergent orientierte Gene am Anfang des Zyklus bevorzugt ein antagonistisches Expressionsprofil, während in Reihe angeordnete (‘tandem’) Gene ein korreliertes Expressionsprofil aufwiesen. Bei den mit dem Cpn Stamm CWL029 durchgeführten Mikroarrayexperimenten konnten auch Expressionswerte für einige ausschließlich für die Stämme AR39 und J138 beschriebenen Gene gemessen werden. Ein Vergleich mittels BLAST zeigte, daß diese Gene auch im CWL029 Genom kodiert sind. Dazu gehörten mehrere Gene, welche konvergent zu ihren Nachbargenen orientiert waren und eine Sequenzüberlappung mit diesen aufwiesen. Darunter fielen parB, welches eine Rolle für die Trennung der DNA in der Zellteilung spielt, und rpsD, ein alternativer Sigma-Faktor, der für die Transkription in der späten Phase des Entwicklungszyklus verantwortlich ist. Für beide Genpaare konnte in der frühen akuten und in der persistenten Infektion ein antagonistisches Expressionsprofil beobachtet werden, wie es bei konvergent orientierten Genpaaren überwiegt. Mittels quantitativer qRT-PCR wurde für rpsD gezeigt, dass vollständige mRNA-Fragmente in der Persistenz herunterreguliert, während kurze mRNA-Fragmente hochreguliert waren. Als Erklärung für diesen Effekt dient ein Modell, welches auf einer Kollision der RNA Polymerasen basiert. Dieser Sigma-Faktor unabhängige Mechanismus ist in der Literatur als ‘Transkriptionelle Interferenz’ bekannt und führt so trotz einer Promoteraktivierung zu einer verminderten Anzahl an vollständigen mRNA Transkripten. Die Herunterregulation von RpsD auf Proteinebene in der Cpn Persistenz ist beschrieben worden. Im letzten Teil dieser Arbeit wurde das Wirtszelltranskriptom in der akuten und persistenten Infektion untersucht.Infektion mit Cpn führte zu einer Hochregulation von relB, welches an alternativen NF-KB Signalwegen beteiligt ist und das anti-apoptotische Potential verstärkt. Weiterhin waren Gene differentiell exprimiert, welche für die Zellzyklusproteine Cyclin-G2 und Cyclin-D1 sowie Inhibitoren von CDK4 kodieren. Zusammenfassend gibt diese Arbeit gibt einen Einblick sowohl in das Transkriptom des Pathogens als auch der Wirtszelle während der akuten und durch Eisenmangel ausgelösten persistenten Infektion als auch potentiellen Mechanismen zu Persistenzentstehung auf der Ebene der Genregulation.
KW  - Chlamydia pneumoniae
KW  - Infektion
KW  - Transkriptom
KW  - Eisenmangel
KW  - Transkiptom
KW  - Eisen
KW  - Chlamydien
KW  - Chlamydophila pneumoniae
KW  - Mikroarray
KW  - transkiptome
KW  - iron
KW  - Chlamydia
KW  - Chlamydophila pneumoniae
KW  - microarray
Y1  - 2006
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-21415
ER  - 
TY  - THES
A1  - Schneider, György
T1  - Studies on the architecture and on transferability of pathogenicity islands of uropathogenic Escherichia coli strain 536
T1  - Untersuchungen zur genetischen Struktur und Übertragbarkeit von Pathogenitätsinseln des uropathogenen Escherichia coli Stammes 536
N2  - The establishment of genomic approaches including the sequence determination of complete bacterial genomes started a new era in microbiological research. Since then more than two hundred prokaryotic and eukaryotic genomes have been completely sequenced, and there are additional complete genome projects including different bacterial species and strains in progress (http://www.tigr.org, http://www.sanger.ac.uk). The continously growing amount of bacterial DNA sequence information gives us also the possibility to gain deeper insight into bacterial pathogenesis. With the help of comparative genomics, microbiological research can focus on those DNA sequences that are present in pathogenic bacteria but are absent in non-pathogenic strains. With this knowledge and with the help of molecular biological methods such as PCR,DNA-chip technology, subtractive hybridisation, transcriptomics and proteomics we can analyse in detail what makes a particular bacterial strain pathogenic. This knowledge also gives us the possibility to develop new vaccines, therapeutic approaches or diagnostic tools. The aim of this work was the structural and functional analysis of DNA regions of uropathogenic Escherichia coli strain 536 that belong to the flexible E. coli gene pool. The first part of this thesis focused on the identification and structural characterisation of pathogenicity island V of strain 536 (PAI V536). PAI V536 is integrated at the pheV tRNA gene at 64 minutes of the E. coli K-12 chromosome. In addition to the intact pheV tRNA gene, a truncated copy ('pheV) that represents the last 22 bp of this gene’s 3'-end was identified 49 kb downstream of pheV on PAI V536. The analysis of the DNA sequence flanked by pheV and 'pheV revealed characteristics that are typical of PAIs. This DNA region exhibits homology to IS-elements and prophages and also comprises determinants coding for the Pix fimbriae, a phosphoglycerate transport system, an autotransporter, as well as for hypothetical proteins. Downstream of 'pheV, the K15 capsule determinant (kpsK15) of this strain is located. Structural analysis of the 20-kb kpsK15 locus revealed a so far unknown genetic organisation indicative of recombination events between a group 2 and group 3 capsule gene cluster. Downstream of the capsule determinant, the genes encoding a type II secretion system (general secretion pathway -GSP) are located on PAI V536. The K15 capsule locus was functionally characterized. Specific inactivation of each of the regions 1 to 3 of the kpsK15 gene cluster, and the use of a K15 capsule-specific antiserum demonstrated that this determinant is the functional K15 capsule locus of strain 536. It has been shown in an experimental murine model of ascending urinary tract infection with suckling mice that the K15 capsule contributes to urovirulence. Interestingly, the K15 capsule is not involved in serum resistance of strain 536. Inactivation of the PAI V536-encoded type II secretion system excluded a role of this general secretion pathway for capsule biosynthesis and virulence of strain 536 in the murine ascending urinary tract infection model. In the second part of the thesis, the transferability of PAIs was further investigated. Using PAI II536 as a model, mobilisation of this island from strain 536 into suitable recipient strains was investigated. For this purpose, an antibiotic resistance cassette, the R6K origin of replication as well as plasmid pGP704 carrying the mobilisation region of plasmid RP4 have been inserted into PAI II536. Transformation with the helper plasmid RP4, resulted a derivative of strain 536 that was used as a donor for conjugation experiments, while for recipient the pir + laboratory strain SY327 was used. After deletion the circularised PAI II536 was mobilised with the help of the conjugative helper plasmid (RP4) into the recipient laboratory strain SY327. The frequency of this event was about 10-8. It was also demonstrated that in the transconjugant strains the mobilized PAI II536 could be permanently present as a circular form and also can be integrated into the chromosome at the same chromosomal insertion site (leuX) as in the donor strain 536. Furthermore, after mobilisation and chromosomal integration of PAI II536 it was possible to remobilise this PAI back to a PAI II536-negative derivative of strain 536. The results obtained in this thesis increase our knowledge of the structure and function of a pathogenicity island of uropathogenic E. coli strain 536 and shed some light on the mechanisms contributing to genome plasticity and evolution of pathogenic E. coli variants.
N2  - Mit der Einführung von Genomanalytik einschließlich der Sequenzbestimmung bakterieller Genome, startete eine neue Ära in der mikrobiologischen Forschung. Seit Beginn dieser Ära sind mehr als 200 prokaryotische und eukaryotische Genome komplett sequenziert worden. Weitere Genomanalysen über verschiedene Bakterienspezies und Stämme sind in Arbeit(http://www.tigr.org, http://www.sanger.ac.uk). Durch die stetig anwachsende Menge an Informationen über bakterielle DNA Sequenzen, sind wir in der Lage, einen tieferen Einblick in die bakterielle Pathogenität zu bekommen. Mittels vergleichender Genomanalyse kann sich die mikrobiologische Forschung auf bestimmte DNA Sequenzen konzentrieren, welche in pathogenen Stämmen vorhanden sind, in apathogenen Stämmen aber fehlen. Mit diesem Wissen und durch molekularbiologische Methoden wie Polymerase Kettenreaktion, DNA-Chip- Technologie, Subtraktiver Hybridisierung, Transkriptom- und Proteom-Analyse können wir im Detail untersuchen, welche Faktoren für die Pathogenität eines speziellen Bakterienstammes verantwortlich sind. Diese Erkenntnisse geben uns auch die Möglichkeit neue Impfstoffe, therapeutische Verfahren und diagnostische Werkzeuge zu entwickeln. Ziel dieser Arbeit war die Untersuchung der Struktur und Funktion von DNA-Regionen des uropathogenen Escherichia coli Stammes 536, welche zum flexiblen Genpool von E. coli gehören. Der erste Teil dieser Arbeit konzentriert sich auf die Identifizierung und strukturelle Charakterisierung der Pathogenitätsinsel V des E. coli Stammes 536 (PAI V536). Die Integrationsstelle von PAI V536 liegt im E. coli K-12 Chromosom beim tRNA Gen pheV bei 64 Minuten. Zusätzlich zum intakten pheV tRNA Gen wurde auf der PAI V536 eine verkürzte Kopie des Gens (´pheV) 49 kb stromabwärts von pheV identifiziert. Diese Kopie repräsentiert die letzten 22 bp des 3´-Endes von pheV. Eine Analyse der von pheV und ´pheV eingeschlossenen DNASequenz zeigte typische Eigenschaften einer Pathogenitätsinsel. Die untersuchte DNA-Region besitzt Homologie zu IS-Elementen und Prophagen, außerdem beinhaltet sie Determinanten, die für Pix Fimbrien, ein Phosphoglycerat-Transportsystem, einen Autotransporter sowie für unbekannte Proteine kodieren können. Stromabwärts von ´pheV liegt die K15 Kapsel Determinante (kpsK15) des E. coli Stammes 536. Eine strukturelle Analyse des 20-kb kpsK15 Lokus zeigte eine bislang unbekannte genetische Anordnung, welche auf ein Rekombinationsereignis zwischen einem Gruppe 2 und einem Gruppe 3 Kapsel Gencluster hinweist. Stromabwärts der Kapsel Determinante sind auf der PAI V Gene lokalisiert, welche für ein Typ II Sekretionssystem („General Secretion Pathway“) kodieren. Der K15 Kapsel Lokus wurde funktional charakterisiert. Die spezifische Inaktivierung der Regionen 1 bis 3 des kpsK15 Genclusters und die Verwendung eines K15 Kapsel-spezifischen Antiserums zeigten, daß es sich tatsächlich um den funktionalen K15 Kapsellokus des E. coli Stammes 536 handelt. Im Tiermodel einer aufsteigenden Harnwegsinfektion bei neugeborenen und säugenden Mäusen, konnte gezeigt werden, daß die K15 Kapsel zur Urovirulenz beiträgt. Interessanterweise trägt die K15 Kapsel des E. coli Stammes 536 nicht zur Serumresistenz bei. Die Inaktivierung des in der PAI V536 kodierten Typ II Sekretionssystems schließt eine Rolle des „General Secretion Pathways“ bei der Kapsel Biosynthese und bei der Virulenz des E. coli Stammes 536 im Mausinfektionsmodel einer aufsteigenden Harnwegsinfektion aus. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde die Mobilisierung von Pathogenitätsinseln untersucht. PAI II536 wurde als Model genutzt, um den Transfer einer PAI von E. coli 536 in einen geeigneten Rezipientenstamm zu zeigen. Zu diesem Zweck wurde eine Antibiotikaresistenzkassette, der Replikationsstartpunkt RK6 und das Plasmid pGP704, das die Mobilisierungsregion des Plamides RP4 besitzt, in die PAI II536 inseriert. Nach Transformation des Helferplasmids RP4 wurde das daraus resultierende Derivat des E. coli Stammes 536 als Donor für Konjugationsexperimente mit dem Rezipientenstamm SY327 eingesetzt. Diese Mobilisierungsexperimente zeigten, daß die gesamte PAI II536 mit einer Frequenz von ungefähr 10-8 in einen Rezipientenstamm übertragen werden kann. In den Transkonjuganten konnte PAI II536 an derselben chromosomalen Insertionsstelle (leuX) wie im Donorstamm E. coli 536 inserieren. Weiterhin war es möglich PAI II536, nach Mobilisierung und chromosomaler Integration in einem Rezipientenstamm, wieder zurück in ein PAI II536 negatives Derivat von E. coli 536 zu transferieren. Die Ergebnisse dieser Arbeit erweitern unser Wissen hinsichtlich der Struktur und Funktion einer Pathogenitätsinsel des uropathogenen E. coli Stammes 536 und geben Aufschluß über den Mechanismus, der zur Genomplastizität und Evolution pathogener E. coli Varianten beiträgt.
KW  - Escherichia coli
KW  - Urogenitalsystem
KW  - Infektion
KW  - Pathogenität
KW  - Genanalyse
KW  - Escherichia coli
KW  - UTI
KW  - Pathogenitätsinseln
KW  - Kapsel
KW  - Übertrag
KW  - Escherichia coli
KW  - UTI
KW  - pathogenicity islands
KW  - capsule
KW  - transfer
Y1  - 2005
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-14231
ER  -