TY - THES A1 - von Hayn, Kathrin T1 - Untersuchungen zur Ca2+-abhängigen Regulation von cAMP in intakten vaskulären Myocyten T1 - Analysis of the Ca2+-dependent regulation of cAMP in intact vascular smooth muscle cells N2 - Die Regulation des Tonus glatter Muskelzellen wird entscheidend von den beiden antagonistisch wirkenden second messengern cAMP und Ca2+ beeinflusst. Ein Ziel dieser Arbeit war herauszufinden, ob diese beiden Botenstoffe auch direkten Einfluss aufeinander haben können und welche Enzyme in diesem Fall an den Prozessen beteiligt sind. cAMP-Signale in intakten Zellen konnten wir in Echtzeit mit Hilfe des FRET-basierten cAMP-Sensors Epac1-camps beobachten; Ca2+-Signale durch Markieren der Zellen mit Fura-2. Anstiege der intrazellulären Ca2+-Konzentration in VSMCs wurden durch Aktivierung von endogen exprimierten, Gq-gekoppelten P2Y6-Rezeptoren mit Uridindiphosphat (UDP) ausgelöst. Durch eine zusätzliche in-vitro Kalibrierung des Epac1-camps konnten darüber hinaus absolute cAMP-Konzentrationen in einzelnen lebenden Zellen berechnet werden. Während ein Anstieg der Ca2+-Konzentration auf nicht vorstimulierte VSMCs keinen signifikante Einfluss auf die intrazellulären cAMP-Konzentrationen hatte, bewirkte die Aktivierung der purinergen Rezeptoren einen deutlichen Rückgang der intrazellulären cAMP-Konzentration in mit Isoproterenol vorstimulierten VSMCs. Dieser Effekt konnte sowohl durch die Komplexierung von Ca2+ mit BAPTA-AM als auch durch die Überexpression der Ca2+-insensitiven AC4 antagonisiert werden. Adenylatcyclase-Aktivitäts-Assays in VSMC-Membranen zeigten ebenfalls einen Rückgang der Cyclaseaktivität nach Zugabe von 2 und 5 μM freiem Ca2+. Die Hemmung der einzigen Ca2+-regulierbaren PDE1 mit dem selektiven PDE1-Inhibitor 8-Methoxymethyl-IBMX (8-MM-IBMX) hatte im Gegensatz dazu keinen Einfluss auf die durch UDP verursachte Änderung der cAMP-Konzentration in vorstimulierten VSMCs. Schließlich bewirkte die Herunterregulation der Ca2+-inhibierbaren AC5 und 6 mit siRNA einen signifikante Hemmung des durch UDP verursachten Effekts. Fasst man alle diese Ergebnisse zusammen, so lässt sich folgende Schlussfolgerung ziehen: Der durch purinerge Stimulation verursachte Rückgang der cAMP-Konzentration in mit Isoproterenol vorstimulierten VSMCs wird durch eine Hemmung der Ca2+-hemmbaren AC5 und 6 vermittelt. Dadurch sind zwei für die Regulation des Tonus wichtige Signalwege in VSMCs miteinander verbunden, die sich somit gegenseitig entscheidend beeinflussen können. Ein weiterer Bestandteil dieser Arbeit war die Entwicklung eines transgenen Mausmodells, das glattmuskelspezifisch den cAMP-Sensor Epac1-camps exprimiert. Mit Hilfe eines solchen Tiermodells könnten in Zukunft cAMP-Änderungen in intakten Geweben und vielleicht sogar in lebenden Tieren beobachtet werden. Durch Anwendung des Cre-loxP-Rekombinationssystems gelang es eine glatt¬muskelspezifische, für den Epac1-camps transgene Mauslinie zu generieren. Mit isolierten VSMCs dieser Tiere konnten bereits erste FRET-Messungen durchgeführt und agonistinduzierte cAMP-Änderungen beobachtet werden. N2 - Regulation of smooth muscle tone is crucially determined by the antangonistic second messengers cAMP and Ca2+. One aim of this work was to investigate, if these two mediators can also affect each other directly and which enzymes take part in these processes. For observing cAMP signals in living cells with a temporally high resolution, we used the fluorescence resonance energy transfer (FRET)-based cAMP sensor Epac1-camps. For monitoring changes in intracellular Ca2+, cells were labeled with Fura-2. Rises in intracellular Ca2+ were achieved by activation of on vascular smooth muscle cells (VSMCs) endogenously expressed Gq-coupled P2Y6 receptors with uridine diphosphate (UDP). Additional, in-vitro calibration of the Epac1-camps allowed the calculation of absolute cAMP concentrations in single living cells. An increase of Ca2+ concentrations in non-prestimulated VSMCs did not significantly influence intracellular cAMP concentrations. Activation of purinergic receptors of isoproterenol-prestimulated cells with UDP provoked a clear decrease of intracellular cAMP concentrations. This effect was blocked by the complexation of Ca2+ with BAPTA-AM as well as by overexpression of Ca2+-insensitive AC4. Furthermore, adenylyl cyclase activity assays in the presence of 2 and 5 μM free Ca2+ in VSMC membranes showed a decline in cyclase activity. Inhibition of PDE1, the only Ca2+-dependent phosphodiesterase (PDE), with the selective PDE1 inhibitor 8-methoxymethy-IBMX, in contrast, had no effect on UDP-evoked changes in cAMP concentrations in isoproterenol-prestimulated VSMCs. Finally, knockdown of Ca2+-inhibitable AC5 and 6 with siRNA significantly inhibited the UDP-evoked decrease in cAMP concentrations in isoproterenol-prestimulated VSMCs. To merge all these results, one can draw the following conclusion: The purinergically evoked decrease in cAMP concentrations in isoproterenol-prestimulated VSMCs is caused by an inhibition of AC5 and 6 which is mediated by Ca2+. This mechanism interlinks two essential antagonistic signaling pathways for the regulation of smooth muscle tone. An additional part of this work was to develop a transgenic mouse model, which expresses smooth-muscle-specifically Epac1-camps. In the future, these animals could provide the possibility to observe cAMP signals in intact tissues or even in living animals. With the help of the Cre-loxP recombination system, we achieved to generate such a smooth-muscle-specific transgene. Afterwards FRET measurements in isolated vascular smooth muscle cells of these animals were possible and we were also able to observe agonist-induced cAMP changes in these isolated cells. KW - Glatte Muskulatur KW - Cyclo-AMP KW - Calcium KW - Calcium KW - cAMP KW - vaskuläre glatte Muskelzellen KW - FRET KW - calcium KW - cAMP KW - vascular smooth muscle cells KW - FRET Y1 - 2010 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-47709 ER - TY - THES A1 - Hubertus, Katharina T1 - Regulation des cAMP Spiegel und der Signaltransduktion in humanen Thrombozyten durch Prostanoid-Rezeptoren T1 - Regulation of cAMP level and signaltransduction in human platelets by prostanoid-receptors N2 - Prostanoide wirken über Prostanoid-Rezeptoren auf die Aktivierung oder Hemmung der Thrombozyten. In dieser Arbeit wurde die Existenz und Funktionsweise der Prostanoid-Rezeptoren anhand synthetischer Agonisten und Antagonisten in humanen Thrombozyten nachgewiesen. Weiter wurde untersucht, über welche Prostanoid-Rezeptoren die Signaltransduktion der natürlichen Agonisten wie PGE2, PGE1 und PGA1 vermittelt wird, sowie das Zusammenspiel der Prostanoid-Rezeptoren auf die Aktivierung oder Hemmung der Thrombozyten gezeigt. Das Vorhandensein der Prostaglandin E2 Synthase 3 wurde nachgewiesen sowie erste Anhaltspunkte für die Existenz eines Komplexes aus Prostaglandin E2 Synthase 3, Hitzeschockprotein-90 sowie Casein Kinase 2 gezeigt. N2 - Prostanoids act to platelet activation or inhibition via prostanoid-receptors. In this work, the existence and function of prostanoid receptors in human platelets was shown by using sythetic agonists and antagonists. Further, the prostanoid receptors taking part at the signaltransduction induced by endogen prostanoids like PGE2, PGE1 and PGA1 were examinated. The interactions of the prostanoid receptors in platelet activation and inhibition were shown. The existence of prostaglandin E2 synthase 3 in human platelets was shown and first evidence for a complexe of prostaglandin E2 synthase 3, heat shock protein 90 and casein kinase 2 was given. KW - Prostaglandine KW - Rezeptor KW - Cyclo-AMP KW - Prostanoid-Rezeptor KW - cAMP KW - Prostanoide KW - Thrombozyt KW - prostanoid receptor KW - platelets KW - cAMP KW - prostanoids Y1 - 2012 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-71996 ER - TY - THES A1 - Klengel, Torsten T1 - Molekulare Charakterisierung der Carboanhydrase Nce103 im Kontext des CO2 induzierten Polymorphismus in Candida albicans T1 - Molecular characterisation of the carbonic anhydrase Nce103 in the context of carbon dioxide induced polymorphism in Candida albicans N2 - Die Detektion von Umweltsignalen und die gezielte zelluläre Reaktion ist eine zentrale und für das Überleben aller Lebewesen essentielle Fähigkeit. Candida albicans, als dominierender humanpathogener Pilz, ist hochgradig verschiedenen biochemischen und physikalischen Umweltbedingungen ausgesetzt, welche sowohl die Zellmorphologie als auch die Virulenz dieses Erregers beeinflussen. In der vorliegenden Arbeit wurde der Einfluss von Kohlendioxid, als ubiquitär vorkommendes Gasmolekül, auf die Zellmorphologie und Virulenz untersucht. Erhöhte Konzentrationen von Kohlendioxid stellen ein äußerst robustes Umweltsignal dar, welches die morphologische Transition vom Hefewachstum zum hyphalen Wachstum, einem Hauptvirulenzfaktor, in Candida albicans stimuliert. In diesem Zusammenhang wurde die Rolle der putativen Carboanhydrase Nce103 durch die Generation von knock – out Mutanten untersucht. Die Disruption von NCE103 in C. albicans führt zu einem Kohlendioxid – abhängigen Phänotyp, welcher Wachstum unter aeroben Bedingungen (ca. 0,033% CO2) nicht zulässt, jedoch unter Bedingungen mit einem erhöhten CO2 Gehalt von ca. 5% ermöglicht. NCE103 ist also für das Wachstum von C. albicans in Wirtsnischen mit aeroben Bedingungen essentiell. Durch Untersuchungen zur Enzymkinetik mittels Stopped – flow wurde in dieser Arbeit gezeigt, dass Nce103 die Funktion einer Carboanhydrase erfüllt. Die biochemische Funktion dieser Carboanhydrase besteht in der Fixation von CO2 bzw. HCO3ˉ in der Zelle zur Unterhaltung der wesentlichen metabolischen Reaktionen. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass die Induktion hyphalen Wachstums durch CO2 in C. albicans nicht durch den Transport von CO2 mittels des Aquaporins Aqy1 beeinflusst wird. CO2 bzw. HCO3ˉ aktiviert in der Zelle direkt eine Adenylylcyclase (Cdc35), welche sich grundlegend von den bisher gut charakterisierten G-Protein gekoppelten Adenylylcylasen unterscheidet. Die Generation von cAMP beeinflusst in der Folge direkt die Transkription hyphenspezifischer Gene und nachfolgend die morphologische Transition vom Hefewachstum zum elongierten, hyphalen Wachstum. Dieser Mechanismus konnte sowohl in Candida albicans als auch in Cryptococcus neoformans nachgewiesen werden, was auf einen panfungal konservierten Signaltransduktionsmechanismus schliessen lässt. Die Inhibition dieser spezifischen Kaskade eröffnet neue Ansätze zur Entwicklung spezifischer antimykotischer Wirkstoffe. N2 - Detection of environmental signals and subsequently directed reaction is essential for the survival of all living organisms. Candida albicans, as the predominant human fungal pathogen is exposed to severely different physical and chemical conditions, which influence cell morphology as well as virulence in human. In the present work, the influence of carbon dioxide as ubiquitous gaseous molecule on virulence and cell morphology was analysed. Elevated concentrations of carbon dioxide are a robust signal to induce the morphological transition from yeast growth to an elongated hyphal growth form, which is believed to be one of the main virulence factors in Candida albicans. The role of the putative carbonic anhydrase Nce103p in carbon dioxide signalling is reviewed by generating knockout mutant strains, which exhibited a carbon dioxide dependent phenotype. Growth under aerobic conditions (0,033 % carbon dioxide) is inhibited but feasible in 5% carbon dioxide. Therefore, Nce103p is essential for growth in host niches with aerobic conditions. Analysis of the biochemical properties of Nce103p by stopped – flow kinetics revealed carbonic anhydrase activity. It is hypothesised, that Nce103p is essential for fixation of carbon dioxide and bicarbonate within the cell in order to sustain basic metabolic reactions. Furthermore, the induction of hyphal growth was independent of aquaporine-mediated transport of carbon dioxide. Bicarbonate rather carbon dioxide activates directly the adenylyl cyclase Cdc35p generating cyclic AMP as second messenger and influencing the transcription of hyphal specific genes in Candida albicans thus promoting the morphological transition from yeast growth to elongated hyphal growth. This signal transduction cascade is present in Candida albicans as well as Cryptococcus neoformans and it is believed to be a pan fungal signal transduction cascade. The specific inhibition of carbon dioxide mediated polymorphism may serve as a new target for antifungal therapeutic agents. KW - Candida KW - Candida albicans KW - Kohlendioxid KW - Kohlendioxidfixierung KW - Virulenz KW - Morphologie KW - Signaltransduktion KW - Cyclo-AMP KW - Soor KW - Carboanhydrase KW - Cryptococcus neoformans KW - Morphogenese KW - Hyphe KW - Hefeartige Pilze KW - Knockout KW - Aquaporin KW - Candida albicans KW - Morphology KW - carbon dioxide KW - carbonic anhydrase KW - aquaporine Y1 - 2008 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-34573 ER - TY - THES A1 - Herz, Michaela T1 - Molecular characterization of the serotonin and cAMP-signalling pathways in Echinococcus T1 - Molekulare Charakterisierung der Serotonin- und cAMP-Signalwege in Echinococcus N2 - Alveolar and cystic echinococcosis, caused by Echinococcus multilocularis and Echinococcus granulosus respectively, are severe zoonotic diseases with limited treatment options. The sole curative treatment is the surgical removal of the complete parasite material. Due to late diagnosis, chemotherapeutic treatment often is the only treatment option. Treatment is based on benzimidazoles, which merely act parasitostatic and often display strong side effects. Therefore, new therapeutic drugs are urgently needed. Evolutionarily conserved signalling pathways are known to be involved in hostparasite cross-communication, parasite development and survival. Moreover, they represent potential targets for chemotherapeutic drugs. In this context the roles of the serotonin- and cAMP-signalling pathways in Echinococcus were studied. Genes encoding serotonin receptors, a serotonin transporter and enzymes involved in serotonin biosynthesis could be identified in the E. multilocularis and E. granulosus genomes indicating that these parasites are capable of synthesizing and perceiving serotonin signals. Also the influence of exogenous serotonin on parasite development was studied. Serotonin significantly increased metacestode vesicle formation from primary cells and re-differentiation of protoscoleces. Inhibition of serotonin transport with citalopram significantly reduced metacestode vesicle formation from primary cells and caused death of protoscoleces and metacestodes. Furthermore, it could be shown that serotonin increased phosphorylation of protein kinase A substrates. Taken together, these results show that serotonin and serotonin transport are essential for Echinococcus development and survival. Consequently, components of the serotonin pathway represent potential drug targets. In this work the cAMP-signalling pathway was researched with focus on G-protein coupled receptors and adenylate cyclases. 76 G-protein coupled receptors, including members of all major families were identified in the E. multilocularis genome. Four genes homologous to adenylate cyclase IX were identified in the E. multilocularis genome and three in the E. granulosus genome. While glucagon caused no significant effects, the adenylate cyclase activator forskolin and the adenylate cyclase inhibitor 2’, 5’ didesoxyadenosine influenced metacestode vesicle formation from primary cells, re-differentiation of protoscoleces and survival of metacestodes. It was further shown that forskolin increases phosphorylation of protein kinase A substrates, indicating that forskolin activates the cAMP-pathway also in cestodes. These results indicate that the cAMP signalling pathway plays an important role in Echinococcus development and survival. To complement this work, the influence of different media and additives on E. granulosus protoscoleces was investigated. Anaerobic conditions and the presence of FBS prolonged protoscolex survival while different media influenced protoscolex activation and development. Taken together, this work provided important insights into developmental processes in Echinococcus and potential drug targets for echinococcosis chemotherapy. N2 - Alveoläre und zystische Echinokokkose, hervorgerufen durch Echinococcus multilocularis und Echinococcus granulosus, sind schwere zoonotische Erkrankungen mit eingeschränkten Behandlungsmöglichkeiten. Die einzig kurative Therapie besteht in der chirurgischen Entfernung des gesammten Parasitenmaterials. Aufgrund später Diagnosestellung stellt Chemotherapie oft die einzige Behandlungsmöglichkeit dar. Die derzeitige Therapie basiert auf Benzimidazolen, welche nur parasitostatisch wirken und oft schwere Nebenwirkungen hervorrufen. Neue Medikamente werden daher dringend benötigt. Evolutionär konservierte Signalwege sind bekanntermaßen an Wirt-Parasit Kreuzkommunikation, Parasitenentwicklung und deren Überleben beteiligt. Darüber hinaus stellen sie auch mögliche Angriffspunkte für Chemotherapeutika dar. In diesem Zusammenhang wurden die Rollen des Serotonin- und des cAMP-Signalwegs in Echinococcus untersucht. Gene für Serotoninrezeptoren, einen Serotonintransporter und für Enzyme, die in der Serotoninsynthese involviert sind, konnten in den E. multilocularis und E. granulosus Genomen identifiziert werden, was darauf schließen lässt, dass diese Parasiten in der Lage sind, Serotonin selbst herzustellen und zu sensieren. Des Weiteren wurde der Einfluss von exogenem Serotonin auf die Parasitenentwicklung untersucht. Serotonin förderte die Bildung von Metazestodenvesikeln aus Primärzellen und die Rückdifferenzierung von Protoskolizes signifikant. Die Hemmung des Serotonintransports mit Citalopram reduzierte die Bildung von Metazestodenvesikeln aus Primärzellen signifikant und führte zum Absterben von Protoskolizes undMetazestoden. Des Weiteren konnte gezeigt werden, dass Serotonin die Posphorylierung von Proteinkinase A Substraten erhöht. Zusammengefasst zeigen diese Ergebnisse, dass Serotonin und Serotonintransport essentiell f¨ur die Entwicklung und das Überleben von Echinococcus sind. Folglich stellen Komponenten des Serotoninsignalwegs potentielle Angriffspunkte für Medikamente dar. In dieser Arbeit wurde der cAMP-Signalweg mit Schwerpunkt auf G-Protein gekoppelte Rezeptoren und Adenylatzyklasen untersucht. 76 G-Protein gekoppelte Rezeptoren, inclusive Mitglieder aller Hauptfamilien, wurden im E. multilocularis-Genom identifiziert. Vier Homologe zur Adenylatzyklase IX wurden im E. multilocularis- Genom und drei im E. granulosus-Genom identifiziert. Während Glukagon keine signifikanten Effekte hervorrief, beeinflussten der Adenylatzyklase-Aktivator Forskolin und der Adenylatzyklase-Inhibitor 2’, 5’-Didesoxyadenosin die Bildung von Metazestodenvesikeln aus Primärzellen, die Rückdifferenzierung von Protoskolizes und das Überleben vonMetazestoden. Zudem wurde gezeigt, dass Forskolin die Phosphorylierung von Proteinkinase A-Substraten erhöht. Dies bestätigt, dass Forskolin den cAMP-Signalweg aktiviert. Diese Ergebnisse legen nahe, dass der cAMP-Signalweg eine wichtige Rolle in der Entwicklung und dem Überleben von Echinococcus spielt. Um diese Arbeit zu vervollständigen, wurde der Einfluss von verschiedenen Medien und Zusätzen auf E. granulosus Protoskolizes untersucht. Anaerobe Bedingungen und die Anwesenheit von FBS verlängerten das Überleben von Protoskolizes, während verschiedene Medien die Aktivierung und die Entwicklung von Protoskolizes beeinflussten. Insgesamt gibt diese Arbeit wichtige Einblicke in Entwicklungsprozesse von Echinococcus und zeigt potentielle Angriffspunkte für Medikamente auf. KW - Serotonin KW - Cyclo-AMP KW - Fuchsbandwurm KW - cAMP KW - Echinococcus Y1 - 2015 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-139249 ER - TY - THES A1 - Stangl, Christoph T1 - Lichtgesteuerte Manipulation Zentraler Second Messenger in Pflanzen T1 - Manipulation of Crucial Second Messengers in Plants by light N2 - In der vorliegenden Arbeit wurden lichtaktivierte Nucleotidcyclasen auf Basis der lichtaktivierten Adenylatcyclase bPAC (=BlaC, Ryu et al., 2010; Stierl et al., 2011), sowie der direkt lichtaktivierbare Kationenkanal Channelrhodopsin-2 (Nagel et al., 2003) eingesetzt, um lichtinduzierte und damit nicht-invasive Manipulationen der Second Messenger cAMP, cGMP und Calcium, sowie des Membranpotentials in Pflanzenzellen vorzunehmen. Nach transienter Transfektion von N. benthamiana konnte sowohl die Expression der beiden Channelrhodopsinvarianten C128A::YFP und C128T::YFP (unveröffentlichte Daten von R. Gueta und G. Nagel, 2008, Berndt et al., 2009; Bamann et al., 2010), als auch deren Lokalisation in der Plasmamembran von Protoplasten fluoreszenzmikroskopisch gezeigt werden. Die Funktion von Channelrhodopsin als lichtaktivierbarer Kationenkanal konnte in dieser Arbeit erstmals elektrophysiologisch in Pflanzenzellen nachgewiesen werden. In Einstichmessungen im Mesophyllgewebe von N. benthamiana wurden reproduzierbar blaulichtinduzierte Depolarisationen der Plasmamembran erzielt, die in Dauer und Frequenz über das applizierte Lichtmuster steuerbar waren. In Patch-Clamp-Messungen an epidermalen Protoplasten von N. benthamiana, welche transient Channelrhodopsin-2-C128A und Channelrhodopsin-2-C128T exprimierten, konnten zudem blaulichtinduzierte Einwärts-Ströme gezeigt werden. Die Expression der beiden verwendeten Channelrhodopsinvarianten schien hierbei annähernd unabhängig von der vorliegenden Konzentration des zugegebenen Retinals. Des Weiteren konnte in A. thaliana sowohl die Expression als auch die Funktion der lichtaktivierbaren Adenylatcyclase bPAC::YFP (Stierl et al., 2011), sowie einer hieraus durch gezielte Mutation (nach Ryu et al., 2010) abgeleiteten lichtaktivierbaren Guanylatcyclase (bPGC::YFP) erstmalig in höheren Pflanzen gezeigt werden. Nach Bestätigung der Funktion dieser beiden lichtaktivierbaren Nucleotidcyclasen in transient transfizierten Protoplasten von A. thaliana wurden zwei stabil transgene Pflanzenlinien generiert. ZUSAMMENFASSUNG DER ARBEIT - 190 - Pflanzen dieser Linie exprimierten neben dem konstitutiv unter der Kontrolle des 35S-CaMV-Promotors exprimierten Calciumreporterprotein Aequorin zusätzlich und unter der Kontrolle eines östrogeninduzierbaren Glucocorticoidpromotors (Zuo et al., 2000) die lichtaktivierten Nucleotidcyclasen bPAC::YFP bzw. bPGC::YFP. In beiden stabil transgenen Pflanzenlinien wurden Expression und Funktion der jeweiligen lichtaktivierten Nucleotidcyclase gezeigt. In Messungen an einem modifizierten Luminometer konnten weiterhin erstmals blaulichtinduzierte Calciumsignaturen in Pflanzenzellen generiert werden. Auf die Folge von Blaulichtpulsen kam es wiederholt zum Calciumeinstrom in Zellen der erstellten transgenen Pflanzenlinien. Neben der Möglichkeit, sowohl die Konzentration der cyclischen Nucleotide als auch des cytoplasmatischen Calciums über Licht zu manipulieren, wurde durch diese Pflanzen ein direkter Zusammenhang beider Second Messenger gezeigt. Weiterhin sind phänotypische Auffälligkeiten der erstellten Pflanzenlinien beobachtet worden. Es kam zur Verzögerung des Keimungszeitpunktes bPAC::YFP-exprimierender Samen im Licht, jedoch wuchsen die Pflanzen im Anschluss an die verzögerte Keimung normal und uneingeschränkt weiter. In bPAC::YFP-exprimierenden Pollen von Nicotiana SR-1 konnte zudem das Wachstum der Pollenschläuche durch blaues Licht gestoppt werden. bPGC::YFP-exprimierende Pollen hingegen zeigten auch im blauen Licht unverändertes Pollenschlauchwachstum. Neben den beiden erfolgreich generierten, stabil transgenen Pflanzenlinien wurden in analogen Ansätzen transgene A. thaliana Col-0 Aequorin Zellkulturlinien generiert, die neben dem konstitutiv aktiven Calciumreporterprotein Aequorin ebenso bPAC::YFP bzw. bPGC::YFP unter der Kontrolle des östrogeninduzierbaren Glucocorticoidpromotors (Zuo et al., 2000) exprimierten. Auch hier konnten Expression und Funktion beider Nucleotidcyclasen immunologisch und fluoreszenzmikroskopisch gezeigt werden. Über den Einsatz einer sog. 2A-Sequenz wurde weiterhin ein funktionsfähiges Fusionskonstrukt aus dem cAMP-aktivierten Kationenkanal CNGA2 (C460W-E583M, nach Rich et al., 2001) und der lichtaktivierten Adenylatcyclase EuPACα (Iseki et al., 2002) erstellt. Die Funktion dieses Fusionskonstruktes wurde elektrophysiologisch sowie immunologisch gezeigt. N2 - In this study, light-activated nucleotide cyclases based on bPAC (= BlaC, Ryu et al., 2010; Stierl et al., 2011), and the direct light-activated cation channel channelrhodopsin-2 (Nagel et al., 2003) have been used to non-invasively manipulate the level of the second messengers cAMP, cGMP and calcium as well as the membrane potential in plant cells by means of light. After transient transfection of N. benthamiana, the expression of the two channelrhodopsin variants C128A and C128T (unpublished data from Ronnie Gueta and G. Nagel 2008; Berndt et al., 2009; Bamann et al., 2010) as well as their correct localization in the plasma membrane, was shown by fluorescence microscopy imaging. The general function of channelrhodopsin as a light-activated cation channel was shown for the first time electrophysiologically in higher plants. Using impalement measurements on leaf discs, blue-light-induced depolarizations of the plasma membrane could reproducibly be evoked, which followed the given light pattern in duration and frequency. By Patch-Clamp recordings on N. benthamiana protoplasts, clear blue-light-induced inward currents were demonstrated. The expression of both employed channelrhodopsin variants C128A and C128T was almost independent from supplementation of Retinal during their expression. Furthermore, expression and function of the light activated adenylyl cyclase bPAC::YFP (Stierl et al., 2011) and a therefrom derived light activated guanylyl cyclase bPGC::YFP (according to Ryu et al., 2010) was shown for the first time in higher plants. Two stable transgenic plant lines have been generated, which, aside to the constitutively expressed calcium reporter protein Aequorin, express the light-activated nucleotide cyclases bPAC::YFP and bPGC::YFP, respectively, under the control of an estrogen-inducible glucocorticoid promotor (Zuo et al., 2000). Also in these transgenic plants, expression and function of both light-activated nucleotide cyclases was shown. ZUSAMMENFASSUNG DER ARBEIT - 192 - For the first time, blue-light-induced calcium signatures in plant cells were evoked by illumination of leafdiscs of the transgenic plant lines as an implication of an elevated cNMP-level. Beside the possibility to manipulate cNMP-levels as well as the free cytoplasmic calcium concentration in those plants by means of light, a direct interrelation between these two second messengers was shown. Also physiological impairments in the generated plant lines were observed. The germination of bPAC::YFP expressing seeds was considerably delayed when grown in light. Further, the pollen tube growth of transiently bPAC::YFP-transfected pollen of Nicotiana SR-1 was fully stopped by illumination with blue light, whereas normal growth was documented under dark conditions. In contrast, bPGC-transfected pollen did not show affected growth of their pollen tubes neither in darkness nor upon blue light illumination. Beside the generated stable transgenic plant lines, two stable transgenic Arabidopsis thaliana Col-0-Aequorin cell-culture lines have been generated in an analogous approach. Also in this case, the expression of bPGC::YFP and bPAC::YFP was estrogen-inducibly expressed under control of the glucocorticoid-promotor (Zuo et al., 2000), and expression as well as function was shown by means of fluorescence microscopy imaging and cNMP-quantification using ELISA. Furthermore, a fused construct of the cAMP-gated cation channel CNGA2 (C460W-E583M, according to Rich et al., 2001) and the light activated adenylyl-cyclase EuPACα (Iseki et al., 2002) was cloned using a 2A-sequence (Tang et al., 2009) and expressed in oocytes. The function of this construct has been shown electrophysiologically and immunologically. KW - Calciumion KW - Sekundärer Bote KW - Cyclo-AMP KW - Cyclo-GMP KW - Calcium KW - cAMP KW - cGMP KW - lichtgesteuerte Manipulation KW - Calcium KW - cAMP KW - cGMP KW - lightinduced manipulation KW - Pflanzen KW - Licht Y1 - 2012 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-85940 ER - TY - THES A1 - Kapustjansky, Alexander T1 - In vivo imaging and optogenetic approach to study the formation of olfactory memory and locomotor behaviour in Drosophila melanogaster T1 - In vivo Imaging und der optogenetische Ansatz zu Untersuchung der Gedächtnissbildung und lokomotorischem Verhalten bei Drosophila melanogaster N2 - Understanding of complex interactions and events in a nervous system, leading from the molecular level up to certain behavioural patterns calls for interdisciplinary interactions of various research areas. The goal of the presented work is to achieve such an interdisciplinary approach to study and manipulate animal behaviour and its underlying mechanisms. Optical in vivo imaging is a new constantly evolving method, allowing one to study not only the local but also wide reaching activity in the nervous system. Due to ease of its genetic accessibility Drosophila melanogaster represents an extraordinary experimental organism to utilize not only imaging but also various optogenetic techniques to study the neuronal underpinnings of behaviour. In this study four genetically encoded sensors were used to investigate the temporal dynamics of cAMP concentration changes in the horizontal lobes of the mushroom body, a brain area important for learning and memory, in response to various physiological and pharmacological stimuli. Several transgenic lines with various genomic insertion sites for the sensor constructs Epac1, Epac2, Epac2K390E and HCN2 were screened for the best signal quality, one line was selected for further experiments. The in vivo functionality of the sensor was assessed via pharmacological application of 8-bromo-cAMP as well as Forskolin, a substance stimulating cAMP producing adenylyl cyclases. This was followed by recording of the cAMP dynamics in response to the application of dopamine and octopamine, as well as to the presentation of electric shock, odorants or a simulated olfactory signal, induced by acetylcholine application to the observed brain area. In addition the interaction between the shock and the simulated olfactory signal by simultaneous presentation of both stimuli was studied. Preliminary results are supporting a coincidence detection mechanism at the level of the adenylyl cyclase as postulated by the present model for classical olfactory conditioning. In a second series of experiments an effort was made to selecticvely activate a subset of neurons via the optogenetic tool Channelrhodopsin (ChR2). This was achieved by recording the behaviour of the fly in a walking ball paradigm. A new method was developed to analyse the walking behaviour of the animal whose brain was made optically accessible via a dissection technique, as used for imaging, thus allowing one to target selected brain areas. Using the Gal4-UAS system the protocerebral bridge, a substructure of the central complex, was highlighted by expressing the ChR2 tagged by fluorescent protein EYFP. First behavioural recordings of such specially prepared animals were made. Lastly a new experimental paradigm for single animal conditioning was developed (Shock Box). Its design is based on the established Heat Box paradigm, however in addition to spatial and operant conditioning available in the Heat Box, the design of the new paradigm allows one to set up experiments to study classical and semioperant olfactory conditioning, as well as semioperant place learning and operant no idleness experiments. First experiments involving place learning were successfully performed in the new apparatus. N2 - Das Verständniss für die komplexen Interaktionen und Zusammenhänge, die von der molekularen Ebene bis zum Auftreten von bestimmten Verhaltensmustern führen, erfordert die interdisziplinäre Zusammenarbeit unterschiedlicher Forschungsrichtungen. Das Ziel der vorgelegten Arbeit war es einen solchen interdisziplinären Ansatz für die Erforschung und die Manipulation von Verhalten und ihm zu Grunde liegenden Mechanismen zu verwirklichen. Optisches in vivo Imaging ist eine neue, sich ständig weiterentwickelnde Methode, welche es ermöglicht, nicht nur lokale sondern auch weitläufige Aktivitäten innerhalb des Nervensystem zu untersuchen. Drosophila melanogaster stellt aufgrund der leichten genetischen Zugänglichkeit einen herausragenden experimentellen Organismus dar, bei welchem neben optischem Imaging eine ganze Reihe optogenetischer Methoden angewandt werden kann, um die neuronalen Grundlagen des Verhaltens zu erforschen. Im Rahmen dieser Arbeit wurde mit Hilfe von vier genetisch kodierten Sensoren in vivo die Dynamik der cAMP Konzentration in den horizontalen Loben des Pilzkörpers, bei Applikation unterschiedlicher physiologischer und pharmazeutischer Stimuli untersucht. Dabei wurden mehrere transgene Fliegenlinien mit Sensorkonstrukten Epac1, Epac2, Epac2K390E und HCN2 an unterschiedlichen genomischen Insertionsorten, hinsichtlich ihrer Signalqualität untersucht, eine der Linien wurde für weitere Experimente ausgewählt. Zunächst wurde an dieser die in vivo Tauglichkeit des Sensors gezeigt, indem die Konzentration von cAMP durch pharmakologische Applikationen von 8-Bromo-cAMP und Forskolin, einer Substanz welche die Aktivität von cAMP produzierenden Adenylatcyclasen stimuliert, appliziert wurden. Anschließend wurde eine Untersuchung der cAMP Dynamik als Antwort auf einen elektrischen Schock, unterschiedliche Düfte, sowie einen durch Applikation von Acetylcholin simulierten Duftstimulus durchgeführt. Vorläufige Ergebnisse bestärken das aktuelle Modell der klassischen olfaktorischen Konditionierung durch die Koinzidenzdetektion auf der Ebene der Adenylatcyclase. In einem weiteren Experiment wurde der Versuch einer optogenetischen neuronalen Aktivierung unternommen, dabei wurde basierend auf einem Laufball Paradigma eine Methode entwickelt, das Laufverhalten der Fliegen zu analysieren während ihr Gehirn durch eine Imaging-Präparation freigelegt wurde, um gezielt bestimmte durch fluoreszierende Proteine markierte Gehirnbereiche anzuregen. Erste Aufzeichnungen des Laufverhaltens bei Aktivierung der protocerebrallen Brücke, einer Substruktur des Zentralkomplexes, wurden durchgeführt. Schließlich wurde eine neue Apparatur (Shock Box) für die Konditionierung von Einzeltieren entwickelt und gebaut, das Design beruht auf dem der sogenannten Heat Box, ermöglicht jedoch klassische und semioperante olfaktorische Konditionierung zusätzlich zu der in der Heat Box möglichen räumlichen und operanten Konditionierung. Die ersten Versuche für räumliches Lernen wurden in der Apparatur durchgeführt. KW - Taufliege KW - Pilzkörper KW - Cyclo-AMP KW - Gedächtnis KW - In vivo KW - Imaging KW - Drosophila KW - Memory KW - In vivo KW - Imaging KW - Drosophila KW - Memory Y1 - 2011 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-69535 ER - TY - THES A1 - Dünnes, Sarah T1 - Einfluss der NO-sensitiven Guanylyl-Cyclase auf den cGMP/cAMP-Crosstalk und die Steifigkeit der murinen Aorta T1 - Influence of NO-sensitive guanylyl-cyclase on cGMP/cAMP crosstalk and the stiffness of the murine aorta N2 - Die NO/cGMP-vermittelte Signalkaskade ist im vaskulären System entscheidend an der Regulation des Blutdrucks beteiligt. Innerhalb der Kaskade nimmt die NO-sensitive Guanylyl-Cyclase (NO-GC) eine Schlüsselfunktion als wichtigster Rezeptor für das Signalmolekül Stickstoffmonoxids (NO) ein. NO wird endogen von verschiedenen Isoformen der NO Synthase produziert. Die Bindung von NO an die NO GC führt zur Produktion des sekundären Botenstoffs cyclisches Guanosinmonophosphat (cGMP). Dieser Botenstoff aktiviert verschiedene Effektor-Moleküle und bewirkt letztlich eine Relaxation der glatten Muskulatur. Ein weiterer sekundärer Botenstoff, das Signalmolekül cyclisches Adenosinmonophosphat (cAMP), ist ebenfalls an der Regulation des Tonus der glatten Muskulatur und dadurch an der Blutdruckregulation beteiligt. Unterschiedliche Phosphodiesterasen (PDE) bauen die sekundären Botenstoffe ab und beenden dadurch die Signalkaskaden. Die PDE3 spielt hierbei eine besondere Rolle, da sie eine gemischte Substratspezifität besitzt. Um den Einfluss der NO-GC auf das kardiovaskuläre System zu untersuchen, wurden NO-GC Knockout(KO)-Mäuse mit globaler (GCKO) oder Glattmuskel-spezifischer (SMC-GCKO) Deletion der NO-GC generiert. Um das Zusammenspiel von cAMP und cGMP näher zu beleuchten, wurde im ersten Teil dieser Arbeit die PDE3 genauer untersucht. Im Gefäßsystem wird lediglich die PDE3A und nicht die PDE3B exprimiert. Die Aorten von GCKO- und SMC-GCKO-Tieren reagieren sensitiver auf PDE3A-Blockade als die Kontroll-Tiere. Auch die akute Blockade der NO-GC führt zu diesem Sensitivitätseffekt. Die PDE3A ist in Folge der NO-GC-Deletion sowohl in ihrer Expression, als auch ihrer Aktivität um die Hälfte reduziert. Dies dient vermutlich kompensatorisch dazu, das cAMP-Signal weitgehend zu erhalten und so eine cAMP-induzierte Relaxation der Gefäße zu gewährleisten. Ohne Rückkopplung zwischen den beiden Signalwegen käme es vermutlich zu weiteren negativen Konsequenzen für das Herz-Kreislaufsystem. Diese Daten weisen auf eine direkte Regulation der PDE3 in glatten Muskelzellen durch die NO/cGMP-Signalkaskade und einen PDE3-vermittelten cAMP/cGMP-Crosstalk hin. Der genaue Mechanismus dieser Expressionsregulation ist noch unklar. Denkbar wäre eine cGMP-vermittelte Transkriptionsregulation oder eine Modulation der Translation der PDE3A. Der Verlust der NO-GC führt in GCKO- und SMC-GCKO-Mäusen zu einem erhöhten systolischen Blutdruck von ~30 mmHg. Bei der Entwicklung der arteriellen Hypertonie könnte eine erhöhte Aortensteifigkeit beteiligt sein, die im zweiten Teil dieser Arbeit näher untersucht wurde. In GCKO-Mäusen ist die aortale Steifigkeit und daraus resultierend die Pulswellengeschwindigkeit (PWV) deutlich erhöht. Die Steigerung der PWV wird in den GCKO-Tieren zusätzlich durch den verminderten Aorten-Durchmesser bedingt. Außerdem weisen die Aorten dieser Tiere eine veränderte Wandstruktur auf, die zu einer Verminderung der aortalen Windkesselfunktion führt. Diese Veränderungen könnten die Blutdruckerhöhung in GCKO-Mäusen erklären. In SMC-GCKO-Tieren tritt keine dieser Gefäß-Modifikationen auf. Eine Aortensteifigkeit als mögliche Ursache für den erhöhten systolischen Blutdruck in den SMC-GCKO-Tieren kann somit ausgeschlossen werden. Zur Aufklärung müssen weitere Versuche zum Aufbau der Gefäßwände und zur Bestimmung des peripheren Widerstands gemacht werden. Auch der Einfluss anderer Zelltypen, wie z.B. Perizyten oder Fibroblasten, auf die Blutdruckregulation sollte untersucht werden. N2 - The NO/cGMP-mediated signaling cascade is crucially involved in the regulation of blood pressure. Within the cascade, NO-sensitive guanylyl cyclase (NO-GC) plays a key role as the most important receptor for the signaling molecule nitric oxide (NO). NO is endogenously produced by three different isoforms of NO synthase. Binding of NO to NO-GC stimulates the production of the second messenger cyclic guanosine monophosphate (cGMP). cGMP, in turn, activates various effector molecules, finally leading to smooth muscle relaxation. Another second messenger, the signalling molecule cyclic adenosine monophosphate (cAMP), also participates in the regulation of smooth muscle tone and is thus also involved in the regulation of blood pressure. Phosphodiesterases (PDE) degrade cyclic nucleotides thereby ending their signalling. In order to investigate the effect of NO-GC on the cardiovascular system, mice with global (GCKO) or smooth muscle-specific (SMC-GCKO) deletion of NO-GC have been generated. To shed light into the interplay of cAMP and cGMP, PDE3 was studied in the first part of this thesis. PDE3 plays a special role in cGMP/cAMP crosstalk based on its mixed substrate specificity. From the two PDE3 isoenzymes (PDE3A and PDE3B), only PDE3A is expressed in the aorta. The aortas of GCKO- and SMC-GCKO animals are more sensitive to PDE3A inhibition than those from control animals. The acute blockade of NO-GC using ODQ also leads to this sensitivity effect. As a result of NO-GC deletion, PDE3A expression and activity are reduced by approx. 50%. This is probably a compensatory response in order to maintain functional cAMP signalling and to guarantee cAMP-induced relaxation of blood vessels. These results indicate a direct regulation of PDE3A in smooth muscle cells by the NO/cGMP-signalling cascade and a PDE3-mediated cAMP/cGMP crosstalk. The exact mechanism how NO-GC/cGMP regulates PDE3A expression remains unclear; conceivable options are a cGMP-mediated regulation of transcription or a modulation of PDE3A translation. Loss of NO-GC in GCKO and SMC-GCKO mice leads to an elevated systolic blood pressure by around 30 mmHg. In the second part of this thesis, stiffness of aortae from these KO animals was examined. In GCKO mice, the pulse wave velocity (PWV) was significantly faster than in control animals indicating an increased aortic stiffness. The increase in PWV in GCKO animals is likely to be explained by a reduced aortic diameter. Even though elastin and collagen content were unchanged, the aortas of these animals have an altered wall structure. SMC-GCKO animals show neither an increase in PWV nor morphological changes of the aorta. Thus, an increased aortic stiffness can be excluded as cause for the elevated systolic blood pressure in GCKO animals. KW - Knock-Out KW - Maus KW - Guanylatcyclase KW - Cyclo-GMP KW - Aorta KW - Guanylyl-Cyclase KW - Cyclo-AMP KW - Stickstoffmonoxid KW - Phosphodiesterase 3 KW - Pulswellengeschwindigkeit Y1 - 2016 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-141479 ER - TY - THES A1 - Werthmann, Ruth T1 - Echtzeit-Untersuchungen zur Thrombin-abhängigen Änderung der cAMP-Konzentration in lebenden Endothelzellen T1 - Real-time monitoring of thrombin-dependent changes of the cAMP concentration in living endothelial cells N2 - Das Endothel bildet eine einschichtige Zellbarriere zwischen Blut und interstitiellem Gewebe, deren Durchlässigkeit entscheidend durch die sekundären Botenstoffe Ca2+ und cAMP reguliert wird. Während Ca2+ durch eine verstärkte Kontraktion der Endothelzellen die Permeabilität erhöht, fördert cAMP die Adhäsion der Zellen und unterstützt somit die Barrierefunktion. Es ist bekannt, dass Thrombin durch einen Anstieg der intrazellulären Ca2+-Konzentration und vermutlich auch durch eine Hemmung der cAMP-Konzentration zu einer Permeabilitätserhöhung führt. Ziel dieser Arbeit war es, Thrombin-induzierte Änderungen der cAMP-Konzentration in Echtzeit in lebenden Endothelzellen mittels Fluorescence-Resonance-Energy-Transfer (FRET) zu untersuchen. Hierfür wurden Human-Umbilical-Vein-Endothelial-Cells (HUVECs) mit dem FRET-basierten cAMP-Sensor Epac1-camps transfiziert. Die Bindung von cAMP an Epac1-camps führt zu einer Konformationsänderung des Sensors und damit zu einer Abschwächung des FRET. Mit Hilfe dieses Sensors kann die cAMP-Konzentration mit hoher zeitlicher Auflösung in einzelnen lebenden Zellen gemessen werden. Untersucht wurde der Effekt von Thrombin auf die cAMP-Konzentration in Endothelzellen, deren cAMP-Konzentration durch Stimulierung endogener β-Rezeptoren erhöht war. Thrombin erniedrigte Ca2+-abhängig die cAMP-Konzentration um ca. 30 %. Dieser Abfall der cAMP-Konzentration folgte zeitlich verzögert dem Thrombin-induzierten Ca2+-Signal. Die cAMP-Konzentration erreichte ca. 30 s nach der Thrombinzugabe ein Minimum und stieg danach wieder an. Durch die Herunterregulierung der durch Ca2+ direkt inhibierten Adenylatzyklase 6 (AC6) mittels siRNA wurde die Thrombin-induzierte Abnahme der cAMP-Konzentration vollständig aufgehoben. Dies bestätigte, dass Thrombin durch die Ca2+-vermittelte Inhibierung der AC6 eine Abnahme der cAMP-Konzentration verursacht. Ohne β-adrenerge Stimulation führte die Applikation von Thrombin zu einem langsamen Anstieg der cAMP-Konzentration, der mehrere Minuten anhielt. Dieser cAMP-Konzentrationsanstieg beruhte auf der Ca2+-abhängigen Aktivierung der Phospholipase A2 (PLA2). Diese setzt Arachidonsäure aus Membranphospholipiden frei, die als Substrat für die Synthese verschiedener Prostaglandine dient. Durch die pharmakologische Beeinflussung von Zyklooxygenasen und Prostazyklinrezeptoren konnte gezeigt werden, dass die Synthese von Prostazyklin und die anschließende Stimulation Gs-gekoppelter Prostazyklinrezeptoren zum Thrombin-induzierten Anstieg der cAMP-Konzentration führte. Da die Physiologie der Endothelzellen im Gefäß stark von Faktoren aus der unmittelbaren Umgebung beeinflusst wird, ist die Messung der Änderungen der cAMP-Konzentration in Endothelzellen, die sich innerhalb eines Gewebes befinden, von sehr großer Bedeutung. Deshalb war die Generierung transgener Mäuse mit einer gewebespezifischen Expression des FRET-Sensors Epac1-camps in Endothelzellen ein weiteres Ziel dieser Arbeit. Durch Anwendung eines Cre-Rekombinase/loxP-Ansatzes konnten transgene Mäuse generiert werden, die Epac1-camps spezifisch in Endothelzellen exprimierten. An isolierten pulmonären Endothelzellen konnte die Funktionalität des transgen exprimierten Sensors Epac1-camps nachgewiesen werden. Die Echtzeitmessung der Thrombin-induzierten Änderungen der cAMP-Konzentration verdeutlichte ein zeitlich sehr komplexes Wechselspiel zwischen Ca2+- und cAMP-Signalen, das die Barrierefunktion des Endothels maßgeblich beeinflussen wird. Die transgene Expression von Epac1-camps in Endothelzellen ermöglicht in Zukunft die Untersuchung der Thrombin-verursachten Änderungen der cAMP-Konzentration und der Permeabilität innerhalb eines intakten Gefäßes. N2 - Endothelial cells form a semi permeable barrier between blood and interstitial tissues. The permeability of this barrier is mainly regulated by the second messengers Ca2+ and cAMP. While Ca2+ increases the permeability by inducing cell contraction, cAMP increases the adherence of the cells and, thereby, supports the barrier function. The Ca2+-elevating agent thrombin was demonstrated to increase endothelial permeability and to decrease cAMP levels. The aim of this thesis was to investigate thrombin-induced changes of the cAMP concentration in real time in living endothelial cells via fluorescence resonance energy transfer (FRET). Therefore, human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) were transfected with the FRET-based cAMP sensor Epac1-camps. Binding of cAMP to the binding domain of Epac1-camps induces a conformational change of the sensor that results in a decrease of FRET. With help of this sensor, changes in cAMP concentration can be monitored with high temporal resolution. First, the influence of thrombin on cAMP levels was investigated after elevating cAMP levels by stimulation of β-adrenergic receptors. Thrombin led to a Ca2+-dependent decrease of cAMP levels by approximately 30 %. The decrease of cAMP levels was delayed compared to the thrombin-induced Ca2+ signal. This decrease was also transient and reached a minimum value 30 s after thrombin stimulation. A siRNA-mediated downregulation of the Ca2+-inhibited adenylyl cyclase 6 (AC6) completely abolished the thrombin-induced decrease of cAMP concentration. This provided the first direct evidence that the Ca2+-mediated inhibition of AC6 accounts for the thrombin-induced decrease in cAMP levels. In the absence of a β-adrenergic-mediated increase of cAMP concentration, thrombin led to a slow increase in cAMP concentration that lasted for several minutes. This increase in cAMP concentration was caused by the Ca2+-dependent activation of phospholipase A2 (PLA2). PLA2 releases arachidonic acid, which represents the substrate for prostaglandin synthesis. It was confirmed by pharmacological interference of cyclooxygenases and prostacyclin receptors that the synthesis of prostacyclin and subsequent stimulation of Gs-protein-coupled prostacyclin receptors caused the thrombin-induced increase in cAMP concentration. The real time monitoring of changes in cAMP concentration in endothelial cells within the vascular system is highly important as the physiology of endothelial cells in vivo is strongly influenced by factors contained in the surrounding blood or tissue. Therefore, a further aim of this thesis was the generation of transgenic mice expressing the FRET-based sensor Epac1-camps specifically in endothelial cells. Using a Cre-recombinase/loxP-approach transgenic mice were generated that specifically expressed Epac1-camps in endothelial cells, and the functionality of the transgenic sensor was proven in isolated pulmonary endothelial cells. Real time monitoring of thrombin-induced changes of cAMP concentration in endothelial cells revealed a temporally complex crosstalk between Ca2+ and cAMP signals that will affect endothelial barrier function. The transgenic expression of Epac1-camps opens the door for the investigation of thrombin-induced changes of cAMP levels and of endothelial permeability within intact vessels. KW - Cyclo-AMP KW - Endothelzelle KW - Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer KW - Thrombin KW - cyclo-AMP KW - endothelial cells KW - fluorescence resonance energy transfer KW - thrombin Y1 - 2009 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-46066 ER - TY - THES A1 - Vielmuth, Franziska T1 - Die Rolle von cAMP bei Pemphigus vulgaris T1 - The role of cAMP in pemphigus vulgaris N2 - Desmosomen sind Zell-Zell-Kontakte, die eine starke interzelluläre Haftung vermitteln. Sie sind daher besonders wichtig für die Integrität von Geweben wie der Haut, die laufend einer starken mechanischen Beanspruchung ausgesetzt sind. Pemphigus vulgaris ist eine Autoimmundermatose, die zur Ausbildung schlaffer Blasen durch Spaltbildung in der Epidermis führt. Als ursächlich dafür wurden Autoantikörper gegen die desmosomalen Cadherine Dsg1 und 3 herausgestellt, die in Desmosomen vorkommen. cAMP ist ein wichtiger Botenstoff des Zellstoffwechsels und an der Regulierung und Modulation einer Vielzahl von zellulären Prozessen beteiligt, darunter auch die Stabilisierung der Endothelbarriere über Stärkung der Haftung eines klassischen Cadherins, nämlich VE-Cadherin. In Anknüpfung an die vorliegenden Daten aus Pemphigus- und Endothelforschung beschäftigt sich diese Arbeit mit der Rolle von cAMP bei Pemphigus vulgaris. Es wurde in Keratinozytenkultur sowie im neonatalen Pemphigus-Mausmodell untersucht, ob die Erhöhung der intrazellulären cAMP-Spiegel einen Einfluss auf PV-IgG-induzierte morphologische und funktionelle Veränderungen hat. Eine Erhöhung des intrazellulären cAMP-Spiegels konnte sowohl in vitro als auch in vivo als protektiv herausgestellt werden. In Keratinozytenkultur konnte gezeigt werden, dass eine Erhöhung des intrazellulären cAMP-Spiegels durch Forskolin/Rolipram oder Isoproterenol in der Lage war, die PV-IgG-induzierten morphologischen Veränderungen, die Dsg3-Depletion, sowie den Adhäsionsverlust zu blockieren. Weiterhin konnte die Blasenbildung in vivo durch cAMP-Erhöhung vollständig verhindert werden. Im Anschluss wurde untersucht, ob die Inkubation mit PV-IgGs einen Einfluss auf die intrazellulären cAMP-Spiegel in vitro hat. Dabei konnte gezeigt werden, dass die Zellen mit einer Erhöhung der cAMP-Spiegel reagieren, wenn auch in einem geringeren Ausmaß als durch die eingesetzten Mediatoren. Somit kann cAMP als Rettungsmechanismus der Zellen angesehen werden und es wurde daraufhin der Einfluss von cAMP auf die Regeneration von Keratinozyten nach PV-IgG-Inkubation untersucht. Dieser Prozess konnte durch eine cAMP-Erhöhung verbessert werden und erwies sich als partiell abhängig von PKA. Schlussendlich konnte nachgewiesen werden, dass cAMP in vitro wie in vivo über die Blockade der p38MAPK-Aktivierung protektiv wirkt. Zusammenfassend konnte so ein neuer Einblick in die zelluläre Antwort von Keratinozyten auf Pemphigus-Autoantikörperbindung gewonnen werden. Dieser könnte auch im Hinblick auf die Entwicklung neuer therapeutischer Strategien bei Pemphigus vulgaris wichtig sein. N2 - Desmosomes are cell-cell-contacts which provide strong intercellular adhesion. They are most abundant and important in tissues which are continuously exposed to mechanical stress such as the epidermis of the skin. Pemphigus vulgaris (PV) is a severe autoimmune blistering disease characterized by intraepidermal cleavage leading to flaccid blisters of the skin. These phenomena are caused by autoantibodies against the desmosomal adhesion molecules desmoglein (Dsg) 1 and 3. Cyclic adenosine-monophosphat (cAMP) is an important second messenger in various signaling pathways and takes part in regulation and modulation of distinct cellular processes. For instance, cAMP is capable to stabilize the endothelial barrier by increasing adhesion of another cadherin-type adhesion molecule referred to as vascular endothelial cadherin (VE-cadherin). Therefore, based on the knowledge from pemphigus and endothelial barrier research, the scope of the present dissertation is to clarify the role of cAMP in pemphigus vulgaris pathogenesis. Investigations in keratinocyte cell cultures and in a neonatal pemphigus mouse model were carried out to analyze the effect of an increased intracellular cAMP level on desmosomal adhesion. The data demonstrated that increased cAMP-levels are protective against the pathogenic effects of autoantibodies from PV patients (PV-IgG) in vitro and in vivo. In cultured keratinocytes the increase of intracellular cAMP mediated by application of either forskolin/rolipram or isoproterenol was capable to block PV-IgG-induced morphological changes as well as Dsg3-depletion and loss of cell cohesion. Further, development of flaccid blisters and intraepidermal cleavage formation was abolished in vivo. Since cAMP signaling in vitro as well as in vivo was effective to prevent autoantibody-induced p38MAPK activation, which is a central mechanism in pemphigus pathogenesis, it can be concluded that the signaling function of desmogleins was modulated by this approach. Next, we examined whether incubation with PV-IgG affected intracellular cAMP levels in vitro. Interestingly, we found that keratinocytes responded to PV-IgG incubation with an increase in cAMP levels, albeit to a smaller extend compared to the applied mediators. These data indicate that increase of cAMP may serve as a cellular rescue mechanism to enhance intercellular cohesion. Finally, the effect of cAMP on spontaneous regeneration of cell cohesion after PV-IgG incubation was examined. Here, it was observed that regeneration was improved by increase of cAMP and was at least partially PKA-dependent. In summary, this work provides new insights into the cellular responses of keratinocytes to the binding of pemphigus autoantibodies. This may be important especially with respect to development of new therapeutic approaches in pemphigus vulgaris. KW - Pemphigus KW - Cyclo-AMP KW - Autoimmundermatose KW - Keratinozyten KW - neonatales Pemphigus-Maus-Modell KW - Signalwege Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-107757 ER - TY - THES A1 - Leweke, Rhea T1 - Die Rolle der NF-κB-Aktivierung beim LPS-induzierten Zusammenbruch der Endothelbarriere T1 - Role of NF-κB activation in LPS-induced endothelial barrier breakdown N2 - Eine intakte Endothelbarriere ist eine unabdingbare Voraussetzung für die uneingeschränkte Funktion sämtlicher Organe. Wird die Barrierefunktion durch entzündliche Prozesse gestört, so kommt es zum Austritt von Gefäßflüssigkeit ins Interstitium. Dies resultiert in Organversagen und ist Mitverursacher der hohen Sterblichkeit bei systemischen Entzündungsreaktionen und Sepsis. Vorangehende Untersuchungen haben bereits wichtige Mechanismen aufgedeckt, die zum Barriereverlust führen (Schlegel et al., 2009). In dieser Studie wurde untersucht, ob die Aktivierung des Transkriptionsfaktors NF ĸB für den LPS-induzierten Zusammenbruch der Endothelbarriere von Bedeutung ist. In der vorliegenden Arbeit wurde gezeigt, dass die Einwirkung von LPS in zwei verschiedenen Endothelzelllinien, den makrovaskulären PSEC sowie den mikrovaskulären HDMEC, zu einer signifikanten Aktivierung von NF ĸB führte. Dies wurde sowohl mittels Kernextraktionsversuchen als auch durch Immunfluoreszenzfärbungen nachgewiesen. Messungen des TER zeigten eine Abnahme des endothelialen Widerstands und folglich der Barrierefunktion nach Applikation von LPS, gefolgt von einer spontanen Regeneration der Barriere nach einer Inkubationszeit von 24 h. Eine Erhöhung des intrazellulären cAMP Spiegels durch Applikation von Forskolin/Rolipram verhinderte zwar die LPS induzierte Bildung interzellulärer Lücken, nicht jedoch die Aktivierung des Transkriptionsfaktors NF ĸB. Vielmehr verstärkte eine cAMP Erhöhung sogar eine NF ĸB Aktivierung in HDMEC nach 4 h, ohne die Morphologie der Endothelzelljunktionen zu schädigen. Der selektive NF ĸB Inhibitor NBD Peptid vermochte im Gegensatz dazu die LPS induzierte NF ĸB Aktivierung deutlich zu hemmen, verhinderte allerdings weder die interzelluläre Lückenbildung noch den Abfall des TER durch LPS. Im Gegenteil – da unter Einwirkung von NBD Peptid die spontane Regeneration des TER nach LPS Applikation ausblieb, schienen barrierekompromittierende Effekte von LPS durch Hemmung der NF ĸB Aktivierung mittels NBD-Peptid sogar verstärkt zu werden. In Übereinstimmung mit diesen Ergebnissen hemmte auch die Repression von NF ĸB p65 durch eine spezifische p65 siRNA den LPS induzierten Zusammenbruch der Endothelbarriere nicht. Weitere NF ĸB abhängige Proteine wie VASP und Caveolin 1, deren Beteiligung am Pathomechanismus von anderen Arbeitsgruppen vorgeschlagen wurde, blieben in unseren Experimenten unter LPS Exposition unverändert. Zusammenfassend scheint die NF ĸB Aktivierung initial nicht entscheidend am LPS induzierten Zusammenbruch der Endothelbarriere beteiligt zu sein. Unsere Ergebnisse legen vielmehr nahe, dass die Aktivierung des Transkriptionsfaktors möglicherweise Teil eines „Rescue“ Mechanismus sein könnte. N2 - An intact endothelial barrier is indispensable for the functioning of all organs. Inflammatory processes like sepsis lead to increased endothelial permability, causing edema which often result in organ failure. Previous studies uncovered important mechanisms leading to endothelial barrier breakdown (Schlegel et al., 2009). This study analyses if activation of NF ĸB is involved in LPS-induced damage to intercellular junctions. It is demonstrated that LPS leads to activation of NF ĸB in two different endothelial cell lines, PSEC and HDMEC, shown by nuclear extraction and immunofluorescence experiments. Measurements of TER visualise reduction of endothelial resistance and thus integrity of the endothelial barrier after application of LPS, followed by spontaneous regeneration after 24 hours. Increase of intracellular cAMP levels by application of Forskolin/Rolipram prevented LPS-induced intercellular gap formation, while activation of NF ĸB was not affected. Rather, increased cAMP levels intensified activation of NF ĸB in HDMEC after 4 h, without damaging morphology of endothelial cell junctions. The selective NF ĸB-inhibitor NBD-peptide prevented LPS-induced NF ĸB activation but not intercellular gap formation and reduction of TER. Because NBD-peptide blocked spontaneous regeneration of TER after LPS application, barrier compromising effects of LPS appeared to be intensified by inhibition of NF ĸB activation. In accordance with these results repression of NF ĸB p65 by siRNA did not prevent LPS-induced barrier breakdown. Other NF ĸB-dependent proteins like VASP and Caveolin-1, both suggested to be involved in the pathomechanism, remained unaffected. In summary, NF ĸB activation appears not to be initially involved in LPS-induced endothelial barrier breakdown. The results of this study suggest activation of NF ĸB might be part of a “rescue” mechanism. KW - Sepsis KW - Cyclo-AMP KW - Endothel KW - Endotoxin KW - LPS KW - Endothelbarriere KW - Sepsis KW - LPS KW - cAMP KW - endothelial barrier Y1 - 2013 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-83810 ER - TY - THES A1 - Wuttke, Martin T1 - Die Kommunikation zwischen Aldosteron, dem humanen Mineralokortikoidrezeptor und der cAMP/CRE - Signalkaskade T1 - The communication between Aldosterone, the human mineralocorticoid receptor and the cAMP/CRE signal pathway N2 - Doktorarbeit über den Einfluss von Aldosteron auf den intrazellulären Betarezeptorsignalweg. Erklärungsansatz für profibrotische Effekte von Aldosteron. N2 - Dissertation about the influence of aldosterone on the intracellular beta receptor pathway. Proposal for a mechanism by which aldosterone may act profibrotic. KW - Aldosteron KW - Renin-Angiotensin-System KW - Beta-Rezeptor KW - Cyclo-AMP KW - Fibrose KW - Kollagen KW - Aldosterone KW - Beta-Receptor KW - cAMP KW - kollagen Y1 - 2009 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-48072 ER - TY - THES A1 - Nikolaev, Viacheslav T1 - Development and application of fluorescent cAMP und cGMP biosensors T1 - Entwicklung und Anwendung fluoreszierender Biosensoren für cAMP und cGMP N2 - The cyclic nucleotides cAMP and cGMP are two ubiquitous important second messengers, which regulate diverse physiological responses from vision and memory to blood pressure and thrombus formation. They act in cells via cAMP- and cGMP-dependent protein kinases (PKA and GK), cyclic nucleotide-gated channels and Epac. Although the concept of cyclic nucleotide signalling is well developed based on classical biochemical studies, these techniques have not allowed to analyze cAMP and cGMP in live cells with high temporal and spatial resolution. In the present study fluorescence resonance energy transfer was used to develop a technique for visualization of cAMP and cGMP in live cells and in vitro by means of fluorescent biosensors. Ligand-induced conformational change in a single nucleotide-binding domain flanked with green fluorescent protein mutants was used for dynamic, highly sensitive measurements of cAMP and cGMP. Such biosensors retained binding properties and chemical specificity of unmodified domains, allowing to image cyclic nucleotides in a physiologically relevant range of concentrations. To develop cAMP-sensors, binding domains of PKA, Epac and cAMP-gated HCN-channel were used. cGMP-sensors were based on single domains of GK and phosphodiesterases (PDEs). Sensors based on Epac were used to analyze spatio-temporal dynamics of cAMP in neurons and macrophages, demonstrating that cAMP-gradients travel with a high speed (~ 40 μm/s) throughout the entire cytosol. To understand the mechanisms of cAMP-compartmentation, kinetics properties of phosphodi-esterase (PDE2) were, next, analyzed in aldosterone producing cells. PDE2 is able to rapidly hydrolyze extensive amounts of cAMP, so that the speed of cAMP-hydrolysis is much faster than that of its synthesis, which might serve as a basis of compartmentation. cAMP-sensors were also used to develop a clinically relevant diagnostic method for reliable detection of β1-adrenergic receptor autoantibodies in cardiac myopathy patients, which has allowed to significantly increase the sensitivity of previously developed diagnostic approaches. Conformational change in a single binding domain of GK and PDE was, next, used to create novel fluorescent biosensors for cGMP. These sensors demonstrated high spatio-temporal resolution and were applied to analyze rapid dynamics of cGMP production by soluble and particulate guanylyl cyclases as well as to image cGMP in mesangial cells. In summary, highly sensitive biosensors for cAMP and cGMP based on single cyclic nucleotide-binding domains have been developed and used in various biological and clinically relevant applications. N2 - Die zyklischen Nukleotide cAMP and cGMP sind zwei ubiquitäre Botenstoffe, die verschiedene physiologische Prozesse regulieren, vom Sehen und Gedächtnis bis zu Blutdruck und Thrombusbildung. Sie wirken über cAMP- und cGMP-abhängige Kinasen (PKA und GK), Kanäle und Epac. Obgleich die Funktionen von zyklischen Nukleotiden in klassischen biochemischen Studien gut untersucht sind, ermöglichen diese Methoden nicht, cAMP und cGMP in lebenden Zellen mit hoher zeitlicher und räumlicher Auflösung zu analysieren. In dieser Arbeit wurde Fluoreszenzresonanzenergietransfer benutzt, um eine Technik für die Visualisierung von cAMP and cGMP in lebenden Zellen und in vitro zu entwickeln. Ligand-induzierte Konformationsänderung in einer einzelnen, mit Grünfluoreszenzproteinmutanten fusionierten Bindungsdomäne diente als Grundlage für Biosensoren, die dynamische, hochsensitive Messungen von cAMP und cGMP ermöglichen. Bei solchen Sensoren wurden die chemischen und Bindungseigenschaften von unmodifizierten Domänen aufrechterhalten, was die cAMP- und cGMP-Messungen im physiologischen Konzentrationsbereich in lebenden Zellen ermöglicht. Für die Entwicklung der cAMP-Sensoren wurden die Domänen von PKA, Epac und von einem cAMP- gesteuerten HCN-Kanal benutzt. cGMP-Sensoren beruhen sich auf den Bindungsdomänen von GK und Phosphodiesterasen (PDEs). Mit Hilfe der auf Epac-basierten Sensoren wurde die cAMP-Dynamik in Neuronen und Makrophagen zeitlich und räumlich aufgelöst. In diesen Zellen diffundiert cAMP mit hoher Geschwindigkeit (~ 40 μm/s) frei durch das ganze Zytosol. Um die Mechanismen der cAMP-Kompartimentierung besser zu verstehen, wurden die kinetischen Eigenschaften der PDE2 in aldosteronproduzierenden Zellen analysiert. PDE2 ist imstande, große Mengen von cAMP äußerst schnell zu hydrolisieren, so dass die Geschwindigkeit der cAMP-Hydrolyse viel höher ist als von cAMP-Synthese, was eine Grundlage der cAMP-Kompartimentierung sein könnte. cAMP-Sensoren wurden auch benutzt, um eine klinisch relevante diagnostische Methode zu entwickeln, die Autoantikörper gegen β1-adrenergen Rezeptoren bei Herzinsuffizienzpatienten zuverlässig nachweist. Diese Methode hat ermöglicht, die Sensitivität der früher entwickelten Techniken zu verbessern. Konformationsänderung in einzelnen Bindungsdomänen von GK und PDE wurde als nächstes benutzt, um ein Reihe neuer fluoreszierender Biosensoren für cGMP zu entwickeln. Diese Sensoren zeigten hohe räumliche und zeitliche Auslösung und wurden zur Analyse schneller Dynamik von cGMP-Synthese und für cGMP-Imaging in Mesangialzellen angewandt. Zusammenfassend wurden hochsensitive Biosensoren für cAMP und cGMP auf Grund einzelner, mit Grünfluoreszenzproteinmutanten fusionierter Bindungs-domäne entwickelt und in verschiedenen biologischen und klinisch relevanten Applikationen eingesetzt. KW - Cyclo-AMP KW - Cyclo-GMP KW - Biosensor KW - Fluoreszenz KW - Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer KW - cAMP KW - cGMP KW - FRET KW - Fluoreszenz KW - Sensor KW - cAMP KW - cGMP KW - FRET KW - fluorescence KW - sensor Y1 - 2005 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-15673 ER - TY - THES A1 - Konrad, Charlotte T1 - Biochemische Charakterisierung von cAMP-Gradienten – Einfluss von Phosphodiesterasen T1 - Biochemical Characterization of cAMP Gradients – Influence of Phosphodiesterases N2 - Cyclisches Adenosinmonophosphat ist ein ubiquitärer zweiter Botenstoff zahlreicher Signalwege im menschlichen Körper. Auf eine Vielzahl verschiedenster extrazellulärer Signale folgt jedoch eine Erhöhung desselben intrazellulären Botenstoffs - cAMP. Nichtsdestotrotz schafft es die Zelle, Signalspezifität aufrecht zu erhalten. Ein anerkanntes, wenn auch bisher unverstandenes Modell, um dieses zu ermöglichen, ist das Prinzip der Kompartimentierung. Die Zelle besitzt demnach Areale verschieden hoher cAMP-Konzentrationen, welche lokal begrenzt einzelne Signalkaskaden beeinflussen und somit eine differenzierte Signalübertragung ermöglichen. Eine mögliche Ursache für die Ausbildung solcher Bereiche geringerer cAMP- Konzentrationen (hier als Domänen bezeichnet), ist die hydrolytische Aktivität von Phosphodiesterasen (PDEs), welche als einzige Enzyme die Fähigkeiten besitzen, cAMP zu degradieren. In dieser Arbeit wird der Einfluss der cAMP-Hydrolyse verschiedener PDEs auf die Größe dieser Domänen evaluiert und mit denen der PDE4A1 verglichen, welche bereits durch unsere Arbeitsgruppe aufgrund ihrer Größe als Nanodomänen definiert wurden. Der Fokus wird dabei auf den Einfluss von kinetischen Eigenschaften der Phosphodiesterasen gelegt. So werden eine PDE mit hoher Umsatzgeschwindigkeit (PDE2A3) und eine PDE mit hoher Substrataffinität (PDE8A1) verglichen. Mithilfe sogenannter Linker, Abstandshaltern definierter Länge, werden zusätzlich die Nanodomänen ausgemessen, um einen direkten Zusammenhang zwischen Größe und kinetischer Eigenschaft anzugeben. Die Zusammenschau der Ergebnisse zeigt, dass die maximale Umsatzgeschwindigkeit der Phosphodiesterasen direkt mit der Größe der Nanodomänen korreliert. Durch den unmittelbaren Vergleich der gesamten PDE mit ihrer katalytischen Domäne wird zusätzlich der Einfluss von regulatorischen Domänen evaluiert. Es wird gezeigt, dass diese cAMP-Gradienten modulieren können. Bei der PDE2A3 geschieht die Modulation u.a. durch Stimulation mit cGMP, welche höchstwahrscheinlich dosisabhängig ist und somit graduell verläuft. Hiermit präsentieren sich die Domänen als dynamische Bereiche, d.h. sie können in ihrer Ausprägung reguliert werden. In dieser Arbeit wird die Hypothese bestätigt, dass Phosphodiesterasen eine wichtige Rolle in der Kompartimentierung von cAMP spielen, die Gruppe jedoch inhomogener ist, als bislang angenommen. Die Gradienten-Bildung lässt sich nicht bei jeder Phosphodiesterase darstellen (PDE8A1). Einige Phosphodiesterasen (PDE2A3) jedoch bilden Kompartimente, die durch externe Stimuli in ihrer Größe reguliert werden können. Die Arbeit legt den Grundstein zur breiteren Charakterisierung des spezifischen Einflusses weiterer PDEs auf cAMP-Kompartimentierung, welches nicht nur das Verständnis der Kompartimentierungs-Strategien voranbringt, sondern auch essentiell für das Verständnis der Pathophysiologie zahlreicher Krankheitsbilder, aber auch für das Verständnis bereits angewandter aber auch potentiell neuer Medikamente ist. N2 - Cyclic AMP is a ubiquitous second messenger, which is involved in a huge variety of signaling pathways. Nevertheless, thinking about signaling specificity, it is unclear how numerous diverse signals are all translated via the same second messenger. However, to ensure downstream specificity there is one accepted model - the compartmentalization of cAMP. Different levels of cAMP therefore lead to signaling islets or areas, which ensure a more diverse downstream signaling. One example, which guarantees areas with lower cAMP concentration, is the local hydrolysis of cAMP due to phosphodiesterases’ hydrolytic activity. In this thesis the ability of different phosphodiesterases to build cAMP gradients is compared to the ability of the PDE4 to build cAMP domains in the scale of nanometers, which was already shown by our group. To discriminate influence factors of the formation of those nanodomains, the focus was set on distinct PDEs’ kinetic properties. Therefore, a PDE with a high velocity (PDE2A3) for cAMP hydrolysis is compared to the PDE with the highest known affinity (PDE8A1) to cAMP. Furthermore, with the tools provided by our group, linkers, which are “nanorulers” of distinct size, were used to directly measure the radius of those domains. It is revealed, that the size of the nanodomains directly correlates with the hydrolysis velocity. Furthermore, by comparison of full length PDE with its catalytic domain, it is shown, that their regulatory domains can modulate the ability of phosphodiesterases to create cAMP gradients. In PDE2A3, modulation of cAMP gradients was observed upon cGMP stimulation, which probably occurs in a concentration-dependent matter. Thus, cAMP domains seem to be dynamic areas, i.e. they can be regulated in their size. It is postulated, that phosphodiesterases are one important force for creating compartments, but the family of PDEs itself is inhomogeneous. Not every PDE can build detectable compartments (PDE8A1), but others can build compartments, which are regulated through external stimuli (PDE2A3). The thesis builds the foundation for additional characterization of the other PDE families, which would provide further insight in strategies of cAMP compartmentalization. Moreover, the knowledge of distinct functions of PDEs on cAMP compartments is crucial for the understanding of the pathophysiology of several diseases and the understanding of present and future pharmacological therapies. KW - Cyclo-AMP KW - Phosphodiesterase KW - cAMP KW - PDE Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-205728 ER - TY - THES A1 - Poppe, Heiko Anton T1 - Bestimmung der Substrat- und Inhibitorspezifität von Phosphodiesterasen mittels Mikrokaloriemetrie T1 - Phosphodiesterase activity and specificity measured using microcalorimetry N2 - Neben den cAMP- und cGMP-abhängigen Proteinkinasen (PKA bzw. PKG) sind als zyklonukleotid-regulierte Effektorproteine die Ionenkanäle CNG1-4, der "guanine nucleotide exhange factor“ Epac sowie die zyklonukleotid-spaltende Familie der Phosphodiesterasen (PDEs) von Bedeutung. Industriell synthetisierte cGMP- und cAMP-Analoga besitzen zwar meist eine hohe Affinität für ihr Zielprotein, über ihre Hydrolysestabilität gegenüber PDEs in der Zelle ist jedoch wenig bekannt. In dieser Arbeit wurden die kinetischen Konstanten von elf der am häufigsten genutzten cAMP-und cGMP-Analoga an verschiedenen Vertretern der PDE-Familien mittels Mikrokaloriemetrie bestimmt. Zudem konnte in den Messungen der inhibitorisch Effekt hydrolysestabiler Derivate auf die PDEs qualitativ und quantitativ ermittelt werden kann. Die Ergebnisse zeigen, dass Phosphodiesterasen in der Lage sind, auch chemisch modifizierte Analogsubstanzen der Cyclonukleotide cAMP und cGMP zu hydrolysieren. Hydrolysestabile Derivate dagegen entwickeln häufig inhibitorische Wirkung auf die PDEs und verursachen dadurch Veränderungen der intrazellulären cAMP und cGMP Konzentrationen. So vermag z. B. die Epac-spezifische Substanz Sp-8-pCPT-2’-O-Me-cAMPS in den in vitro Experimenten die PDEs mit ki-Werten im einstelligen mikromolaren Bereich zu inhibieren. In mit Sp-8-pCPT-2’-O-Me-cAMPS stimulierten Thrombozyten steigt als Folge dieser PDE-Hemmung die cGMP Konzentration in der Zelle an und man beobachtet eine als Folge eine PKG-vermittelte Phosphorylierung des Substratproteins VASP – eine unerwünschte Nebenreaktion. Die erhobenen Daten lassen außerdem Rückschlüsse auf den Inhibitionsmechanismus zu. Einige Analoga inhibieren die cGMP-bindenden GAF-Domänen in den PDEs 2A, 5A, 6cone und 10A sowie die PDE 4D3 nach dem linear-mixed-Typ und beeinflussen daher, neben der katalytischen Aktivität, vermutlich auch regulatorische Zentren dieser Enzyme. Zusammenfassend erleichtern die erhobenen Daten Wissenschaftlern die Auswahl des für ihre Fragestellung am besten geeigneten Derivates. N2 - cAMP and cGMP are critical second messengers that regulate multiple targets including different cAMP/cGMP-dependent protein kinases (PKA/PKGs), exchange proteins directly activated by cAMP (Epacs), phosphodiesterases (PDEs) and cyclic nucleotide-gated ion channels (CNGs). Second and third generation cyclic nucleotide analogs are widely used to elucidate specificity of cellular signaling, mediated by these target proteins. However, the selectivity and stability of these analogs need to be fully understood in order to properly interpret results and rigorously assess the mechanisms by which these analogs work in the cell. To better understand the selectivity and cross-reactivity of these analogs I measured the activation or inhibitory activity of 13 commonly-used cyclic nucleotide analogs 8 different PDEs. To measure their stability to hydrolysis I utilized isothermal microcalorimetry, a method that allows to evaluate whether or not an analog can function as a substrate or inhibitor for PDEs. I demonstrate that indeed some of these analogs can be hydrolyzed by multiple PDEs and others are competitive inhibitors. Herein I provide Ki data for all of the non-hydrolyzable analogs and Km and Vmax values for all of the hydrolyzable analogs. Each of these values, as well as their mode of inhibition can be determined in a single experiment. The data strongly implied that several of these analogs might, in addition to their primary effects, also cause elevation of cAMP or cGMP indirectly by inhibiting PDEs in the cell. Such an effect could of course cloud interpretation of the use of these analogs. Similarly, those that are PDE substrates also might have their duration of action substantially reduced. To illustrate this point we show that Sp-8-pCPT-2’-O-Me-cAMPS, a highly specific non-hydrolyzable Epac activator in vitro, can under certain conditions enhance cGMP/PKG and cAMP/PKA signaling pathways in intact platelets. Specifically we found enhanced VASP phosphorylation at both PKA and PKG phosphorylation sites after the addition of Sp-8-pCPT-2’-O-Me-cAMPS. These data indicate that this “selective Epac activator” is able to indirectly activate the cAMP/PKA and cGMP/PKG signalling pathways presumably through inhibition of platelet PDE5 and/or PDE3. The data together allow to provide recommendations for how best to probe the different cyclic nucleotide signalling pathways using cyclic nucleotide analogs. In summary, the data provide evidence that most cAMP and cGMP analogs have multiple targets. Therefore, interpretation of any effects these analogs have in cells should take into consideration their possible cross-target reactivities. KW - Cyclisches Nucleotid Phosphodiesterase <3 KW - 5-> KW - Proteinkinase A KW - Hydrolyse KW - Mikrokalorimetrie KW - Cyclo-GMP KW - Cyclo-GMP-Derivate KW - Dissoziationskonstante KW - Enzymkinetik KW - Inhibition KW - Cyclo-AMP KW - Signaltransduktion KW - Thrombozyt KW - Immunoblot KW - Stickst KW - Proteinkinase G KW - Adenylatcyclase KW - Epac KW - Linear Mixed Inhibition KW - GAF Domaine KW - Proteinkinase G KW - Adenylylcyclase KW - Epac KW - Linear mixed inhibition KW - Gaf domaine Y1 - 2009 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-34477 ER - TY - THES A1 - Wobbe, Thomas T1 - Beeinflussung der Signaltransduktion des humanen Parathormon (PTH)-2 Rezeptors mittels Einzel- und Kombinationsmutationen T1 - Signaling characteristics of the human type 2 receptor for parathyroid hormone using receptor chimeras N2 - Parathormon (PTH) aktiviert am PTH-1 Rezeptor (P1R) mindestens zwei Signalwege: Über Guanosintriphosphat-bindende Proteine (Gs) kommt es intrazellulär zu einem Anstieg von zyklischem Adenosinmonophosphat (cAMP) und zu einer Aktivierung der Proteinkinase A (PKA). Gq Protein-vermittelt erfolgt eine Aktivierung der Phospholipase C (PLC) und ein intrazellulärer Anstieg des Inositoltriphosphat (IP3). Der verwandte PTH-2 Rezeptor (P2R) wird einerseits durch seinen vermutlich physiologischen Liganden, das tuberoinfundibuläre Peptid (TIP39), und andererseits durch PTH aktiviert. Im Gegensatz zum P1R zeigt der P2R nur eine Ankopplung an den cAMP Signalweg und keine an den PLC Signalweg. Voruntersuchungen hatten gezeigt, dass intrazelluläre Abschnitte der zweiten und dritten Schleife sowie Bereiche des C-Terminus des P1R für die Aktivierung des PLC Signalweges verantwortlich sind. In der vorliegenden Dissertation erfolgte eine stufenweise Angleichung intrazellulärer Abschnitte des P2R an den P1R. Die generierten Hybridrezeptoren wurden hinsichtlich ihres Signaltransduktionsverhaltens untersucht. Mit der Bestimmung der akkumulierten Gesamtinositole und des intrazellulären Calciums [Ca]i konnte gezeigt werden, dass trotz einer 95%-igen Übereinstimmung der intrazellulären Aminosäuresequenzen der P2R-Hybridrezeptoren mit denen des P1R, die Ankopplung an den PLC Signalweg nicht übertragen werden kann. Diese Ergebnisse wurden für Stimulationen mit PTH und TIP39 nachgewiesen. Durch Hemmung der Proteinkinasen A und C konnte, wie erwartet, am P1R ein verstärktes IP3 Signal beobachtet werden. Eine Aktivierbarkeit des PLC Signalweges wurde auch hierbei für die Hybridrezeptoren nicht gesehen. Für die Aktivierung des cAMP Signalweges der Hybridrezeptoren konnte beobachtet werden, dass diese sich weitestgehend in Anlehnung zum P2R verhalten. Außerdem konnte gezeigt werden, dass für eine effiziente Ankopplung an den cAMP Signalweg alle aus dem P1R in den P2R einfügten Teilabschnitte (zweite, dritte Schleife und C-Terminus) zusammenwirken. Der Hybridrezeptor, an dem alle drei Teilabschnitte ausgetauscht wurden, führte zu einer signifikant besseren Ankopplung an den cAMP Signalweg, als die Einzelmutation des C-Terminus. Die Messung zum cAMP Signalweg wurden mit den Liganden TIP39 und PTH durchgeführt. Für die Aktivierung des Gs Protein-vermittelten cAMP Signalweg am P1R oder P2R sind daher vermutlich Interaktionen verschiedener Rezeptorabschnitte verantwortlich. Insgesamt konnten in dieser Arbeit weitere wichtige Erkenntnisse bezüglich unterschiedlicher Aspekte der Signaltransduktion des P1R und des P2R gewonnen werden. N2 - Activation of the phospholipase C (PLC) pathway upon stimulation with PTH is unique to the PTH-1 receptor (P1R) and is virtually absent in the PTH-2 receptor (P2R). The sites of P1R mutations known to reduce PLC signaling may achieve this indirectly by disturbing coupling at other sites. We therefore chose a more stringent approach and attempt to reestablish PLC signaling in the closely (70%) related P2R by gradually adapting the P2Rs cytosolic interface to a P1R-like sequence by engineering hybrid P1R/P2R constructs. Key differing regions of the P1R´s second loop (DT272-273:EK), third loop (IW344-345:LR), and C-terminal tail (T440-end: K-end) were put into the P2R. A fourth chimeric P1R/P2R receptor, combining all these changes, thus had a > 90% sequence identity with the cytosolic interface of the P1R. All mutants were expressed on the cell surface of stably transfected HEK 293 cells, using a radioreceptor assay with [125I]-Nle8,21-Tyr34-rat PTH(1-34), with a similar density of 1.1 to 2.5 mio receptors/cell. Activation of the PLC pathway was assessed by: 1) accumulation of total inositol phosphates in myo[3H]-inositol-prelabeled cells. No increase was detectable in the P2R or any of the receptor chimeras, even after enhancing the possible response by blockade of protein kinases A and C, despite an up to 13-fold increase with the P1R upon PTH stimulation. 2) Similarly, a PTH-induced increase in intracellular calcium (detected by fluo-3) of the wildtype P1R with as little as 1 nM hPTH(1-34) was completely absent in all mutants as well as in the P2R. The PTH-induced max. response of the cyclic AMP pathway was virtually identical for the P1R and P2R. However, the max. response of the mutant with the P1R tail sequence was reduced to only 35% (PTH) and 26% (TIP39) of the P2R response. Surprisingly, this signaling loss could be overcome by introducing more P1R sequence into the second and third cytoplasmic loop of this P1R/P2R hybrid receptor thus regaining a max. cAMP response of 64% (PTH) and 85% (TIP39). Presumably, an interaction of P1R sequences seems to result in a more effective coupling to the cAMP signaling pathway. In conclusion, these results suggest that the activation of the IP / intracellular calcium signaling pathway by the P1R is highly dependent on a P1R-like intracellular contact interface, which can not be mimicked easily even in the presence of > 90% of P1R sequence in the cytosolic interface of the P2R. KW - Parathormon KW - Epithelkörperchen KW - Signaltransduktion KW - Cyclo-AMP KW - Inosittriphosphate KW - Ligand KW - Rezeptor-Kinasen KW - Wirkstoff-Rezep KW - PTH-1 Rezeptor KW - PTH-2 Rezeptor KW - TIP39 KW - Calcium KW - GPCR KW - PTH-1 receptor (P1R) KW - PTH-2 receptor (P2R) KW - PLC signaling KW - cAMP signaling pathway Y1 - 2007 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-27880 ER -