TY  - THES
A1  - Fouquet, Wernher
T1  - Analysis of synapse assembly in Drosophila melanogaster
T1  - Analyse des synaptischen Aufbaus der Drosophila melanogaster
N2  - The majority of rapid cell-to-cell communication mechanisms and information processing within the nervous system makes use of chemical synapses. Fast neurotransmission on these sites not only requires very close apposition of pre- and postsynaptic partners, but also depends on an effective structural arrangement of cellular components on both sides of the synaptic cleft. Synaptic vesicles fuse at active zones (AZs), characterized by an electron-dense protein mesh of insufficiently characterized composition and function. EM analysis of synapses identified electron dense structures thought (but not proven) to play an important role for vesicle release efficacy. The molecular organization of presynaptic AZs during Ca2+ influx–triggered neurotransmitter release is currently a focus of intense investigation. Due to its appearance in electron micrographs, dense bodies at Drosophila synapses were named T-bars. Together with the lab of Erich Buchner, we recently showed that Bruchpilot (BRP) of the Drosophila melanogaster, homologous to the mammalian CAST/ERC family in its N-terminal half, is essential for the T-bar assembly at AZs and efficient neurotransmitter release respectively. The question, in which way BRP contributes to functional and structural organization of the AZ, was a major focus of this thesis. First, stimulated emission depletion microscopy (STED), featuring significantly increased optical resolution, was used to achieve first insights into ‘cytoarchitecture’ of the AZ compartment. In addition, in vivo live imaging experiments following identified populations of synapses over extended periods were preformed to address the trafficking of protein at forming synapses and thereby providing a temporal sequence for the AZ assembly process. Apart from BRP, two additional AZ proteins, DLiprin-α and DSyd-1, were included into the analysis, which were both shown to contribute to efficient AZ assembly. Drosophila Syd-1 (DSyd-1) and Drosophila Liprin-α (DLiprin-α) clusters initiated AZ assembly, finally forming discrete ‘quanta’ at the AZ edge. ELKS-related Bruchpilot, in contrast, accumulated late from diffuse pools in the AZ center, where it contributed to the electron dense specialization by adopting an extended conformation vertical to the AZ membrane. We show that DSyd-1 and DLiprin-α are important for efficient AZ formation. The results of this thesis describe AZ assembly as a sequential protracted process, with matured AZs characterized by sub-compartments and likely quantal building blocks. This step-wise, in parts reversible path leading to mature AZ structure and function offers new control possibilities in the development and plasticity of synaptic circuits.
N2  - Durch Ca2+ abhängige Neurotransmitterfreisetzung vermitteln chemische Synapsen die schnelle Informationsübertragung zwischen Nervenzellen. Vorausetzung hierfür sind gewisse zelluläre Eigenschaften, wie eine enge Korrelation zwischen der Prä- und Postsynapse und eine hoch spezialisierte Zusammensetzung von Proteinen. Synaptische Vesikel fusionieren mit der präsynaptischen aktiven Zone (AZ), welche sich aus einem dichten Netzwerk an vielfach noch unerforschter synaptischer Proteine zusammensetzt, das im Transmissionselektronenmikroskop elektronendicht erscheint. Des Weiteren sind ultrastrukturell elektronendichte präsynaptische Spezialisierungen erkennbar (dense bodies), die vermutlich (aber nicht nachweislich) bei der Freisetzung synaptischer Vesikel eine tragende Rolle spielen. Der molekulare Aufbau der AZ ist zurzeit ein weitverbreitetes Studienthema. Die Synapsen der Fruchtfliege Drosophila melanogaster sind präsynaptisch gekennzeichnet durch eine elektronendichte Struktur, welche aufgrund ihrer charakteristischen Form auch als „T-bar“ bezeichnet wird. Durch die Kooperation mit dem Labor von Erich Buchner gelang es uns, das synaptische Protein Bruchpilot (BRP) zu identifizieren. BRP weist im N-terminalen Bereich Homologien zu der in Säuger gefundenen CAST/ERC Proteinfamilie auf, und ist essenziell für die Ausbildung der elektronendichten T-bars an den AZs und für eine effiziente Ausschüttung von Neurotransmitter. In wie weit BRP für die funktionelle und strukturelle Organisation der AZ verantwortlich ist, sollte in der vorliegenden Arbeit erläutert werden. Durch die neu entdeckte „stimulated emission depletion“ Mikroskopie (STED), ist es nun möglich, dank der erhöhten optischen Auflösung, neue Einsichten in die Architektur der AZ zu erlangen. Zusätzlich wurden mit Hilfe von in vivo Experimenten an lebenden Tieren Populationen von Synapsen über längere Zeiträume verfolgt, um so die Synapsenentstehung und den Proteintransport zu untersuchen. Auf diesem Weg sollte eine Abfolge der an der AZ Assemblierung beteiligten Proteine erstellt werden. Neben BRP wurden daher noch zwei weitere AZ Proteine berücksichtigt (DLiprin-α und DSyd-1), welche ebenfalls bei der Bildung neuer synaptischer Kontakten mitwirken. Es konnte gezeigt werden, dass Proteincluster aus Drosophila Syd-1 (DSyd-1) und Drosophila Liprin-α (DLiprin-α) sehr früh während der Bildung neuer synaptischer Kontakte erscheinen und hierbei diskrete ‚Quanta‘ ausbilden, welche sich am Rand der AZ anlagerten. BRP hingegen erreichte die AZ zu einem späteren Zeitpunkt, wahrscheinlich aus diffusen Reservoirs und akkumulierte schließlich im Zentrum der AZ. Mit Hilfe der STED und konfokalen Mikroskopie konnte gezeigt werden, dass sich BRP in einer getreckten, vertikal zur Membran stehenden Orientierung in die elektronendichte Stuktur, den T-bar, einfügt. Zudem sind DSyd-1 und DLiprin-α für eine effiziente Entstehung neuer AZs erforderlich. Die in dieser Arbeit vorgestellten Ergebnisse deuten auf ein länger andauerden sequenziellen Assemblierungsprozess der AZ hin, in dem aus quantalen Baueinheiten Subkompartimente an ausgereiften AZs gebildet werden. Dieser gestaffelte, teils reversible Reifungsablauf der AZ eröffnet neue Möglichkeiten zur Kontrolle der Entwicklung und Plastizität neuronaler Netzwerke durch einen noch nicht beschriebenen Mechanismus.
KW  - Synapse
KW  - Drosophila
KW  - STED
KW  - confocal microscopy
KW  - active zone
KW  - Bruchpilot
Y1  - 2008
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-38173
ER  - 
TY  - THES
A1  - Schauß, Astrid Claudia
T1  - Charakterisierung des mitochondrialen Teilungsproteins Dnm1p mittels quantitativer hochauflösender Lichtmikroskopie
T1  - Characterization of the mitochondrial fission protein Dnm1p using quantitative high resolution light microscopy
N2  - Mitochondrien verändern dynamisch durch ein balanciertes Verhältnis von Teilung und Fusion die Gestalt ihrer Netzwerke und reagieren so auf interne und externe Signale. Ein Schlülsselprotein der mitochondrialen Teilung ist die Dynamin-verwandte GTPase Dnm1p, die in dieser Arbeit charakterisiert wurde. Da Mitochondrien aufgrund ihres endosymbiontischen Ursprungs zwei Membranen besitzen, erfordert deren Teilung eine besondere Koordination. Unter Verwendung von photokonvertierbarem GFP wird in dieser Arbeit gezeigt, dass in S. cerevisiae die Teilung der inneren und äußeren Membran zeitlich eng gekoppelt verläuft. Dieser Prozess wird durch die GTPase Dnm1p, aber auch durch die Adaptor-Proteine Mdv1p und Caf4p sowie dem integralen Membrananker Fis1p v ermittelt. Dnm1p lagert sich zu Spiralen um den tubulären Strang an und trennt GTP-abhängig die Mitochondrien voneinander. Eine Voraussetzung für die Anlagerung dieser Spiralen stellen Matrix-Konstriktionen dar. In dieser Arbeit wird gezeigt, dass Dnm1p und auch Fis1p für die Ausbildung dieser mitochondrialen Einschnürungen nicht essentiell sind. Die Untersuchung der Verteilung, Orientierung und Größe der Epitop-markierten Dnm1p-Cluster bildet den Schwerpunkt der Arbeit. Weiterhin wird der Einfluss der Teilungsproteine Fis1p, Mdv1p und Caf4p auf diese Dnm1p-Charakteristika ermittelt. Die Analyse basiert auf quantitativen Konfokalmikroskopie-Aufnahmen, zusätzlich werden auch neue hochauflösende Lichtmikroskope (4Pi und STED) zur genauen Lokalisation und Größenbestimmung eingesetzt. Die Ergebnisse zeigen, dass im Wildtyp und in Mdv1p-Deletionsstämmen die Mehrheit der Cluster mit den Mitochondrien assoziiert ist, während in Fis1p- und Caf4p-Deletionszellen die Rekrutierung der Cluster zu den Mitochondrien gestört erscheint. Nur wenige Cluster bilden Spiralen um Matrix-Konstriktionen aus, die überwiegende Mehrheit der nicht an aktuellen Teilungsprozessen beteiligten Dnm1p-Aggregate weist dagegen im Wildtyp und in Mdv1p-Deletionszellen eine polare Orientierung Richtung Zellcortex auf. Die in dieser Arbeit zum ersten Mal beschriebene Polarität ist in Fis1p- und Caf4p-Deletionsstämmen aufgehoben, bleibt jedoch auch nach der Zerstörung des Aktin-Gerüstes aufrechterhalten. Die Ergebnisse der Arbeit deuten darauf hin, dass Dnm1p in einem Komplex mit Fis1p und Caf4p zusätzlich zu seiner Funktion als Teilungsprotein an der Anheftung der Mitochondrien an den Zellcortex beteiligt ist. Zudem scheinen die Adaptorproteine Mdv1p und Caf4p trotz molekularer Ähnlichkeit unterschiedliche Aufgaben in der Zelle zu erfüllen.
N2  - Mitochondrial networks dynamically change their shape by balanced fission and fusion in response to internal and external signals. The key protein in mitochondrial fission, the dynamin-related GTPase Dnm1p, is characterised in this study. Because of their endosymbiotic origin mitochondria possess two membranes, whose separations must be coordinated. Using photoconvertable GFP, it is shown that the division of outer and inner membranes are tightly coupled in S. cerevisiae. This separation is due to the GTPase Dnm1p, but the adaptor proteins Mdv1p and Caf4p, as well as the membrane anchor Fis1p, are also involved in mitochondrial division in yeast. Dnm1p forms spirals around the mitochondrial tubes and separates them in a GTPase-dependant manner. Matrix constrictions are presumably one precondition for the formation of spirals. In this work it is shown that Dnm1p as well as Fis1p are not essential for the formation for this mitochondrial narrowing. The main focus of the work is the analysis of the distribution, orientation and size of the epitope-tagged Dnm1p clusters in yeast cells. Additionally, the influence of the other division proteins, Fis1p, Mdv1p and Caf4p, on these Dnm1p characteristics is determined. The analysis is based on both quantitative confocal images and high resolution 4Pi and STED microscopy, for better localization and determination of the cluster sizes. The results demonstrate that in wild type and Mdv1p deletion cells, the majority of clusters are associated with mitochondria, whereas the recruitment of Dnm1p-clusters is disturbed in Fis1p and Caf4p deletion cells. While just a few clusters form spirals around matrix constrictions, the overwhelming majority of clusters, which are not involved in an actual fission process, show a polar orientation towards the cell cortex in wild type and Mdv1p deletion cells. This polarity, described for the first time in this work, is abolished in Fis1 and Caf4p deletion cells, but is maintained after the destruction of the actin cytoskeleton. The results of this work point to an additional role of Dnm1p, together with Fis1p and Caf4p, in the attachment of mitochondria to the cell cortex. Furthermore it is shown that the adaptor proteins Mdv1p and Caf4p have different roles within the cell despite of their molecular similarity.
KW  - Hefeartige Pilze
KW  - Mitochondrium
KW  - Mikroskopie
KW  - Mitochondrien
KW  - Dynamik
KW  - Hefe
KW  - STED
KW  - 4Pi
KW  - mitochondria
KW  - dynamic
KW  - yeast
KW  - STED
KW  - 4Pi
Y1  - 2006
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-17566
ER  -