TY  - THES
A1  - Oerter, Sabrina
T1  - Expression von Natrium/Glukose-Cotransportern im menschlichen Gehirn bei Todesfällen durch Schädel-Hirn-Trauma und Todesfällen durch Ersticken
T1  - Expression of sodium/glucose cotransporter in the human brain following death by traumatic brain inury and suffocation
N2  - Glukosetransporter spielen eine wichtige Rolle in der Versorgung des Gehirns mit Nährstoffen und somit für den Erhalt der physiologischen Zellintegrität. Glukose wird über die Blut-Hirn-Schranke (BHS) mittels spezifischen transmembranen Transportproteinen der SLC-Genfamilie (GLUT, SGLT) befördert. Dabei scheint während physiologischen Bedingungen hauptsächlich der Glukosetransporter GLUT1 (SLC2A1) für die Energieversorgung des Gehirns zuständig zu sein. 
Die Erforschung der SGLT-Expression ist in den letzten Jahren ein wichtiger Ansatzpunkt für neue Behandlungsstrategien vieler Erkrankungen, wie Diabetes Mellitus, maligne Neoplasien oder eines Herzinfarkts, geworden. Jedoch ist über deren Expression und Funktion im menschlichen Gehirn nur wenig bekannt. Besonders die Lokalisation entlang der BHS bleibt fraglich. Ein Großteil bisheriger Forschungsarbeiten beschäftigt sich hauptsächlich mit der Expressionsanalyse des Transporters SGLT1 im tierischen Gehirn in vivo (Poppe et al. 1997; Balen et al. 2008; Yu et al. 2013). Es konnte aufgezeigt werden, dass SGLT1 mRNA exklusiv in Neuronen und nicht an der BHS exprimiert wird. Dies wird durch in vitro Analysen einer humanen Hirnendothelzelllinie bestätigt. Demnach kann kein SGLT1 unter physiologischen Bedingungen nachgewiesen werden (Sajja et al. 2014). Im menschlichen Hirngewebe besitzen SGLTs somit keine zentrale Funktion für den Glukosetransport an der BHS. Im Gegensatz dazu konnte eine Expression von SGLT sowohl in vivo als auch in vitro während hypoglykämischen Bedingungen belegt werden (Vemula et al. 2009; Sajja et al. 2014). Die Expression der SGLT-Transporter während einer ischämischen Hypoglykämie führt zu der Annahme, dass diese Transporter für die Aufrechterhaltung der Energieversorgung des geschädigten Hirngewebes notwendig sind. Um die physiologischen Mechanismen nach einem Glukosemangel zu untersuchen, wurden SHT-Modelle etabliert (Salvador et al. 2013). In einem experimentellen Modell des Schädel-Hirn-Traumas im Rahmen eines DFG-gefördertes Projekts ist ein Expressionsverlauf von Glukosetransportern im Maushirn und in Hirnendothelzellen erarbeitet worden (Wais 2012; Salvador et al. 2015). Somit könnten SGLTs als Ansatzpunkt für den Nachweis der Überlebenszeit nach einem SHT fungieren.
Die vorliegende Arbeit fokussiert sich auf die Expression der Natrium-abhängigen Glukosetransporter SGLT1 und SGLT2 im menschlichen Gehirn. Hierbei liegt das Hauptaugenmerk auf der Lokalisation dieser Transporter an der menschlichen BHS von post mortalem Hirngewebe. Weiterhin wird untersucht ob die Expressionsstärke von SGLT1 und SGLT2 eine Aussage über die Überlebenszeit von Verstorbenen nach einer traumatisch bedingten Hirnveränderung zulässt.
Die Lokalisation von SGLT1 und SGLT2 an der menschlichen BHS konnte durch die Etablierung eines Protokolls zur Isolation von Hirnkapillaren erfolgen. Vorab wurden alle verwendeten Antikörper auf ihre Spezifität mittels siRNA Transfektion und Blockierung der Immunfluoreszenzsignale mittels immunisierten Peptids getestet. Somit ist die Spezifität der detektierten SGLT1- und SGLT2-Expression in menschlichen Hirnkapillaren gewährleistet. Anschließend wird untersucht, in welchen zeitlichem Verlauf nach einer traumatisch bedingten Hirnveränderung die verschiedenen Formen der Glukosetransporter exprimiert werden und ob ggf. der Umfang und die Verteilung von SGLT1, SGLT2 und GLUT1 sowie das Verhältnis zueinander Auskünfte über eine vitale bzw. postmortale Entstehung eines Traumas bzw. dessen Überlebenszeit zulässt. Hierfür wird ein Expressionsschema der Glukosetransporter generiert, abhängig von Todeszeitpunkt und Todesursache. Es konnte festgestellt werden, dass GLUT1 nicht als Target für die Ermittlung der Überlebenszeit nach einem Trauma geeignet ist. Dahingegen zeigen SGLT1 und SGLT2 eine signifikante Änderung der Expressionsstärke im contusionalen Gewebe in Abhängigkeit von der Überlebenszeit. Obwohl diese vorläufigen Daten einen neuen Ansatzpunkt für die forensische Fragestellung aufzeigen, müssen weitere Experimente mit einem erhöhten Umfang der Probenanzahl und kürzere Zeitspannen der Überlebenszeiträume durchgeführt werden.
N2  - The transport of glucose across the endothelial cells of the human blood-brain barrier (hBBB) plays a major role for energy supply of the brain and therefor for neuronal integrity. Glucose enters the brain cells through specific transmembrane transporter proteins of the SLC-gene family (GLUT, SGLT). Under physiological conditions glucose uptake across the BBB seems to be mediated primarily by facilitated diffusion through glucose transporter 1 (GLUT1).
Although SGLTs are a known drug target for diabetes and furthermore play a role in other disease like cancer and cardiac ischemia, active glucose transport by SGLTs is hardly observed and very little is known about their expression or activity in human brain. Especially the function along the BBB remains uncertain. Up to now, expression analysis focused on SGLT1 and has been confirmed in vivo by analyzing brain tissue of animals (Poppe et al. 1997; Balen et al. 2008; Yu et al. 2013). Here detection mainly occurs in neurons, no SGLT1 mRNA in capillaries of the BBB could be found. Similarly in vitro experiments with a human brain microvascular endothelial cell line reveals no expression of SGLT1 under physiological conditions (Sajja et al. 2014). In human brain, SGLT1 is hardly expressed and so far could not be found along the BBB. In contrast to these findings, expression of SGLT1 could be detected in vivo as well as in vitro under hypoglycemic conditions (Vemula et al. 2009; Sajja et al. 2014). The occurrence of these transporters during ischemic hypoglycemia could lead to the conclusion that the secondary active glucose transport by SGLTs is necessary for additional glucose supply in injured brain. To investigate if SGLTs are required for the reconstruction of energy supply after glucose deficiency, traumatic brain injury (TBI) models were established to study secondary physiological mechanisms along the BBB (Salvador et al. 2013). In an experimental CCI (controlled cortical impact) mouse model within a DFG-funded project, an expression pattern of glucose transporters in the mouse brain and in brain endothelial cells has been developed (Wais 2012; Salvador et al. 2015). Thus it could lead as a Target for evidence of the time of survival after TBI.
This study focuses on the sodium-dependent glucose transporters SGLT1 and SGLT2 expression in human brain. The main topic is to localize the sodium-dependent glucose transporters along the human BBB of post mortem brain tissue and to examine whether SGLT expression allow a conclusion to be drawn about the survival time of a patient after TBI. First of all the localization of SGLT1 and SGLT2 at the human BBB could be shown by establishment a capillary isolation protocol of human post mortem brain tissue. Therefore the antibody specificity was tested by a siRNA transfection protocol and blocking the immunofluorescence signal with an immunized peptide. Thus, specific SGLT1 and SGLT2 expression at the endothelial lining of the capillary lumen could be demonstrated. After attaching the value of SGLTs at the human BBB, the relationship of the glucose transporter expression in TBI tissue according to the survival time of the patient is presented. Hereby it should be clarified whether the expression and distribution of the transporters GLUT1, SGLT1 and SGLT2 as well as the relation to each other provide information on a vital or post mortal development of a trauma or its survival time. It could determine that GLUT1 is not suitable as a target for the representation of survival time after TBI. However, SGLT1 and SGLT2 show a significant change in the expression profile of traumatic brain regions. Here an increase according to the survival time after trauma can be shown. Although these preliminary data suggest a novel target for forensic questions, more experiments with an increased scope of survival time frames should be carried out.
KW  - Sodium-Glucose Transporter 2
KW  - Glucosetransportproteine
KW  - Natrium/Glukose Cotransporter
KW  - SGLT
KW  - Schädel-Hirn-Trauma
KW  - sodium-dependend glucose transporter
KW  - traumatic brain injury
KW  - Rechtsmedizin
Y1  - 2018
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-164093
ER  - 
TY  - THES
A1  - Friedrich, Alexandra
T1  - Beeinflussung des Na+-D-Glukose-Kotransporters SGLT1 und der Na+-Nukleosidtransporter CNT durch Peptidmotive des Regulatorproteins RS1 im Darm
T1  - Effects of RS1-derived peptides on Na+-D-glucose cotransporter SGLT1 and Na+- nucleoside cotransporters CNTs in small intestine
N2  - Der Natrium-D-Glukose Kotransporter 1 (SGLT1) spielt eine wichtige Rolle bei der Aufnahme von Glukose aus dem Darmlumen in die Enterozyten des Darms. Anhand von Untersuchungen an Xenopus laevis-Oozyten konnte in unserem Labor das Protein RS1 als posttranslationales Regulatorprotein für SGLT1 und diverse andere Transporter ermittelt werden. Es wurde eine regulatorische Domäne aus RS1 mit vielen potentiellen Phosphorylierungsstellen isoliert (RS1-Reg) und gezeigt dass RS1-Reg die Abschnürung von Transporter enthaltenen Vesikeln vom Transgolgi-Netzwerk hemmt. Neben SGLT1 reguliert RS1 auch die konzentrierenden Nukleosidtransporter (CNTs) am TGN. Die Regulation der Transporter ist vom Phosphorylierungszustand von RS1-Reg abhängig. So wurde durch Versuche an Oozyten von Xenopus laevis und Injektion von RS1-Reg Mutanten gezeigt, dass die Phosphorylierung von RS1-Reg an einigen Stellen zu einer Inhibition von SGLT1 führte, während der Nukleosidtransporter CNT1 durch die dephosphorylierte Mutante herunterreguliert wurden. Neben der phosphorylierungsabhängigen Regulation konnte für SGLT1 auch gezeigt werden, dass die Herunterregulation nur unter Niedrigzucker-Bedingungen erfolgte, nicht jedoch bei hohen Glukosekonzentrationen. Für die CNTs war eine derartige Zuckerabhängigkeit nicht zu beobachten. 
Im Rahmen der vorliegenden Studie wurde untersucht, ob die Ergebnisse aus den Oozytenmessungen auch in vivo in einem Säugetier gezeigt werden können. Hierzu wurden Mutanten der regulatorischen Domäne (RS1-Reg) des Maus-Proteins, welche den phosphorylierten Zustand simulierten (RS1-Reg (S19E)), oder die Phosphorylierung verhinderten (RS1-Reg (S19A)) eingesetzt. Diese wurden an ein Nanohydrogel gekoppelt, um eine Aufnahme in die Enterozyten im Darm zu gewährleisten. Es wurde in der RS1KO-Mausohne funktionelles RS1 gezeigt, dass auch im in vivo-System eine Herunterregulation von SGLT1 durch mRS1-Reg (S19E), nicht jedoch durch mRS1-Reg (S19A) erfolgte, während die CNTs nur durch mRS1-Reg (S19A) inhibiert wurden. Des Weiteren führte mRS1-Reg (S19A) in der Wildtypmaus bei niedrigen Zuckerkonzentrationen zu einer Stimulation von SGLT1, was für eine Kompetition mit dem endogenen RS1-Proteins spricht. Es konnte indirekt der Beweis erbracht werden, dass über Nanohydrogele längere Proteine in die Zelle gebracht werden können und dort funktionell freigesetzt werden.
N2  - The Sodium-D-glucose cotransporter 1 (SGLT1) is important for the uptake of glucose from the intestinal lumen into the enterocytes. In experiments with Xenopus-laevis oocytes, which were performed in our laboratory, we identified protein RS1 as a regulatory protein for SGLT1. A sequence of 80 aminoacids was identified to be the regulatory domain of RS1 (RS1-Reg) and prevents the constriction of transporter-containing vesicles from the transgolgi-network (TGN). Besides SGLT1, RS1 is able to regulate concentrative nucleoside transporters (CNTs) and the organic cation transporter 2 (OCT2). The regulation of the transporters depends on the phosphorylation-state of RS1-Reg. While SGLT1 is inhibited by the phosphorylated form of the regulatory domain, CNTs are regulated by the dephosphorylated form. In addition, the regulation of SGLT1 depends on the glucose concentration of the cells. RS1 only inhibits SGLT1 under low glucose conditions, while the regulation of CNTs is independent of glucose.
In the following study we analyzed whether the results of the oocyte measurements could be reproduced in vivo. For this, we used mutants of the mouse regulatory domain (mRS1-Reg). In one mutant, the phosphorylation was mimicked (mRS1-Reg (S19E)), in a second mutant, phosphorylation was prevented (mRS1-Reg (S19A)). The mutants were coupled to nanohydrogels, to enable the uptake into enterocytes. By usage of a mouse-strain without functional RS1 and a wildtype-mouse-strain, I was able to discriminate between direct effects of the mutant and competition of mutants with endogenous RS1. Only mRS1-Reg (S19E) down regulates SGLT1, but not mRS1-Reg (S19A), while CNTs were downregulated by mRS1-Reg (S19A) but not by mRS1-Reg (S19E). In the wildtype-mouse mRS1-Reg (S19A) leads to an increase of SGLT1-activity which could be due to a competition with the endogenous RS1. The fact, that some peptides were able to regulate transporters leads to the conclusion, that longer proteins can be transported into cells by nanohydrogels and that these proteins are released in the cells in a functional active state.
KW  - Glucosetransport
KW  - SGLT1
KW  - RS1
KW  - Regulation
KW  - Glatter Krallenfrosch
KW  - Oozyte
KW  - Glucosetransportproteine
KW  - Darm
Y1  - 2015
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-127394
ER  -