TY - THES A1 - Majumder, Snigdha T1 - Selective inhibition of NFAT in mouse and human T cells by CRISPR/Cas9 to ameliorate acute Graft-versus-Host Disease while preserving Graft-versus-Leukemia effect T1 - Selektive Hemmung von NFAT in murinen und humanen T-Zellen durch CRISPR/Cas9 zur Linderung der akuten Graft-versus-Host-Erkrankung bei gleichzeitigem Erhalt des Graft-versus-Leukemia-Effekts N2 - Allogenic hematopoietic stem cell transplantation (allo-HCT) is a curative therapy for the treatment of malignant and non-malignant bone marrow diseases. The major complication of this treatment is a highly inflammatory reaction known as Graft-versus-Host Disease (GvHD). Cyclosporin A (CsA) and tacrolimus are used to treat GvHD which limits inflammation but also interferes with the anticipated Graft-versus-Leukemia (GvL) effect. These drugs repress conventional T cells (Tcon) along with regulatory T cells (Treg), which are important for both limiting GvHD and supporting GvL. Both of these drugs inhibit calcineurin (CN), which dephosphorylates and activates the nuclear factor of activated T-cells (NFAT) family of transcription factors. Here, we make use of our Cd4cre.Cas9+ mice and developed a highly efficient non-viral CRISPR/Cas9 gene editing method by gRNA-only nucleofection. Utilizing this technique, we demonstrated that unstimulated mouse T cells upon NFATc1 or NFATc2 ablation ameliorated GvHD in a major mismatch mouse model. However, in vitro pre-stimulated mouse T cells could not achieve long-term protection from GvHD upon NFAT single-deficiency. This highlights the necessity of gene editing and transferring unstimulated human T cells during allo-HCT. Indeed, we established a highly efficient ribonucleoprotein (RNP)-mediated CRISPR/Cas9 gene editing for NFATC1 and/or NFATC2 in pre-stimulated as well as unstimulated primary human T cells. In contrast to mouse T cells, not NFATC1 but NFATC2 deficiency in human T cells predominantly affected proinflammatory cytokine production. However, either NFAT single-knockout kept cytotoxicity of human CD3+ T cells untouched against tumor cells in vitro. Furthermore, mouse and human Treg were unaffected upon the loss of a single NFAT member. Lastly, NFATC1 or NFATC2-deficient anti-CD19 CAR T cells, generated with our non-viral ‘one-step nucleofection’ method validated our observations in mouse and human T cells. Proinflammatory cytokine production was majorly dependent on NFATC2 expression, whereas, in vitro cytotoxicity against CD19+ tumor cells was undisturbed in the absence of either of the NFAT members. Our findings emphasize that NFAT single-deficiency in donor T cells is superior to CN-inhibitors as therapy during allo-HCT to prevent GvHD while preserving GvL in patients. N2 - Die allogene hämatopoetische Stammzelltransplantation (allo-HCT) ist eine kurative Therapie zur Behandlung bösartiger und nicht bösartiger Knochenmarkerkrankungen. Die Hauptkomplikation dieser Behandlung ist eine hochgradige Entzündungsreaktion, die als Graft-versus-Host-Disease (GvHD) bekannt ist. Zur Behandlung der GvHD werden Cyclosporin A (CsA) und Tacrolimus eingesetzt, die die Entzündung eindämmen, aber auch den gewünschten Graft-versus-Leukämie-Effekt (GvL) beeinträchtigen. Diese Medikamente unterdrücken sowohl konventionelle T-Zellen (Tcon) als auch regulatorische T-Zellen (Treg), die sowohl für die Begrenzung der GvHD, als auch für die Unterstützung der GvL wichtig sind. Beide Medikamente hemmen Calcineurin (CN), das die Transkriptionsfaktoren der Familie der Nuclear Factor of Activated T-Cells (NFAT) dephosphoryliert und aktiviert. Hier nutzten wir unsere Cd4cre.Cas9+-Mäuse und entwickelten eine hocheffiziente, nicht-virale CRISPR/Cas9-Geneditierungsmethode mittels reiner gRNA-Nukleofektion. Mithilfe dieser Technik konnten wir zeigen, dass unstimulierte T-Zellen der Maus nach Ablation von NFATc1 oder NFATc2 die GvHD in einem Major-Mismatch-Mausmodell mildern. In vitro vorstimulierte T-Zellen von Mäusen konnten jedoch keinen langfristigen Schutz vor GvHD bei NFAT-Einzeldefizienz erreichen. Dies unterstreicht die Notwendigkeit der Gen-Editierung und des Transfers unstimulierter menschlicher T-Zellen während einer allo-HCT. In der Tat konnten wir ein hocheffizientes Ribonukleoprotein (RNP)-vermitteltes CRISPR/Cas9 gene-editing für NFATC1 und/oder NFATC2 nicht nur in vorstimulierten, sondern auch in unstimulierten primären menschlichen T-Zellen etablieren. Im Gegensatz zu T-Zellen von Mäusen wirkte sich der Mangel an NFATC2, nicht aber so sehr an NFATC1, in menschlichen T-Zellen überwiegend auf die Produktion proinflammatorischer Zytokine aus. Bei beiden NFAT-Single-Knockouts blieb jedoch die Zytotoxizität menschlicher CD3+ T-Zellen gegen Tumorzellen in vitro unangetastet. Darüber hinaus wurden die Treg von Maus und Mensch durch den Verlust eines einzelnen NFAT-Mitglieds nicht beeinträchtigt. Schließlich bestätigten NFATC1- oder NFATC2-defiziente Anti-CD19-CAR-T-Zellen, die mit unserer nicht-viralen "Ein-Schritt-Nukleofektionsmethode" erzeugt wurden, unsere Beobachtungen zu T-Zellen von Maus und Mensch. Die Produktion proinflammatorischer Zytokine hing hauptsächlich von der NFATC2-Expression ab, während die In-vitro-Zytotoxizität gegen CD19+-Tumorzellen in Abwesenheit eines der beiden NFAT-Mitglieder ungestört war. Unsere Ergebnisse unterstreichen, dass der Mangel eines einzelnen NFAT-Mitglieds in Spender-T-Zellen einer Therapie mit CN-Inhibitoren während einer allo-HCT überlegen ist. Hier könnten wir eine GvHD verhindern und gleichzeitig den GvL-Effekt in allo-HCT-Patienten erhalten. KW - Allogenic hematopoietic stem cell transplantation KW - CRISPR/Cas9 KW - Graft-versus-host-disease KW - Graft-versus-leukemia KW - allografts KW - CRISPR/Cas-Methode Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-293256 ER - TY - JOUR A1 - Chopra, Martin A1 - Biehl, Marlene A1 - Steinfatt, Tim A1 - Brandl, Andreas A1 - Kums, Juliane A1 - Amich, Jorge A1 - Vaeth, Martin A1 - Kuen, Janina A1 - Holtappels, Rafaela A1 - Podlech, Jürgen A1 - Mottok, Anja A1 - Kraus, Sabrina A1 - Jordán-Garotte, Ana-Laura A1 - Bäuerlein, Carina A. A1 - Brede, Christian A1 - Ribechini, Eliana A1 - Fick, Andrea A1 - Seher, Axel A1 - Polz, Johannes A1 - Ottmueller, Katja J. A1 - Baker, Jeannette A1 - Nishikii, Hidekazu A1 - Ritz, Miriam A1 - Mattenheimer, Katharina A1 - Schwinn, Stefanie A1 - Winter, Thorsten A1 - Schäfer, Viktoria A1 - Krappmann, Sven A1 - Einsele, Hermann A1 - Müller, Thomas D. A1 - Reddehase, Matthias J. A1 - Lutz, Manfred B. A1 - Männel, Daniela N. A1 - Berberich-Siebelt, Friederike A1 - Wajant, Harald A1 - Beilhack, Andreas T1 - Exogenous TNFR2 activation protects from acute GvHD via host T reg cell expansion JF - Journal of Experimental Medicine N2 - Donor CD4\(^+\)Foxp3\(^+\) regulatory T cells (T reg cells) suppress graft-versus-host disease (GvHD) after allogeneic hematopoietic stem cell transplantation (HCT allo-HCT]). Current clinical study protocols rely on the ex vivo expansion of donor T reg cells and their infusion in high numbers. In this study, we present a novel strategy for inhibiting GvHD that is based on the in vivo expansion of recipient T reg cells before allo-HCT, exploiting the crucial role of tumor necrosis factor receptor 2 (TNFR2) in T reg cell biology. Expanding radiation-resistant host T reg cells in recipient mice using a mouse TNFR2-selective agonist before allo-HCT significantly prolonged survival and reduced GvHD severity in a TNFR2-and T reg cell-dependent manner. The beneficial effects of transplanted T cells against leukemia cells and infectious pathogens remained unaffected. A corresponding human TNFR2-specific agonist expanded human T reg cells in vitro. These observations indicate the potential of our strategy to protect allo-HCT patients from acute GvHD by expanding T reg cells via selective TNFR2 activation in vivo. KW - Tumor-necrosis-factor KW - Regulatory-cells KW - Bone marrow transplantantation KW - Graft-versus-leukemia KW - Rheumatoid arthritis KW - Autoimmune diseases KW - Factor receptor KW - Alpha therapy KW - Expression KW - Suppression Y1 - 2016 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-187640 VL - 213 IS - 9 ER -