TY  - THES
A1  - Braasch, Ingo
T1  - Evolution by genome duplication: insights from vertebrate neural crest signaling and pigmentation pathways in teleost fishes
T1  - Evolution durch Genomverdoppelung: Erkenntnisse aus Analysen der Signalwege in der Neuralleiste der Vertebraten und in den Pigmentzellen im Fisch
N2  - Gene and genome duplications are major mechanisms of eukaryotic genome evolution. Three rounds of genome duplication have occurred in the vertebrate lineage, two rounds (1R, 2R) during early vertebrate evolution and a third round, the fish-specific genome duplication (FSGD), in ray-finned fishes at the base of the teleost lineage. Whole genome duplications (WGDs) are considered to facilitate speciation processes and to provide the genetic raw material for major evolutionary transitions and increases in morphological complexity. In the present study, I have used comparative genomic approaches combining molecular phylogenetic reconstructions, synteny analyses as well as gene function studies (expression analyses and knockdown experiments) to investigate the evolutionary consequences and significance of the three vertebrate WGDs. First, the evolutionary history of the endothelin signaling system consisting of endothelin ligands and receptors was reconstructed. The endothelin system is a key component for the development of a major vertebrate innovation, the neural crest. This analysis shows that the endothelin system emerged in an ancestor of the vertebrate lineage and that its members in extant vertebrate genomes are derived from the vertebrate WGDs. Each round of WGD was followed by co-evolution of the expanding endothelin ligand and receptor repertoires. This supports the importance of genome duplications for the origin and diversification of the neural crest, but also underlines a major role for the co-option of new genes into the neural crest regulatory network. Next, I have studied the impact of the FSGD on the evolution of teleost pigment cell development and differentiation. The investigation of 128 genes showed that pigmentation genes have been preferentially retained in duplicate after the FSGD so that extant teleost genomes contain around 30% more putative pigmentation genes than tetrapods. Large parts of pigment cell regulatory pathways are present in duplicate being potentially involved in teleost pigmentary innovations. There are also important differences in the retention of duplicated pigmentation genes among divergent teleost lineages. Functional studies of pigment synthesis enzymes in zebrafish and medaka, particularly of the tyrosinase family, revealed lineage-specific functional evolution of duplicated pigmentation genes in teleosts, but also pointed to anciently conserved gene functions in vertebrates. These results suggest that the FSGD has facilitated the evolution of the teleost pigmentary system, which is the most complex and diverse among vertebrates. In conclusion, the present study supports a major role of WGDs for phenotypic evolution and biodiversity in vertebrates, particularly in fish.
N2  - Gen- und Genomverdopplungen sind wichtige Mechanismen der Genomevolution in Eukaryonten. Im Verlauf der Evolution der Wirbeltiere gab es drei wichtige Genomduplikationen. Zwei Genomverdopplungen (1R, 2R) fanden während der sehr frühen Vertebratenevolution statt. In der Linie der Fische kam es an der Basis der Teleostier zu einer weiteren, fischspezifischen Genomduplikation (FSGD). Man nimmt an, dass Genomduplizierungen Artbildungsprozesse begünstigen und dass sie zusätzliches genetisches Material für wichtige evolutionäre Übergänge und für die Steigerung morphologischer Komplexität erzeugen. In der vorliegenden Arbeit wurden Methoden der vergleichenden und funktionellen Genomik gewählt, um die Auswirkungen und die Bedeutung der drei Genomverdopplungen bei Vertebraten zu untersuchen. Dazu wurden molekularphylogenetische Stammbaumanalysen und Synteniedaten mit Genexpressionsstudien und Knockdown-Experimenten kombiniert. Zunächst wurde die Evolution des Endothelin-Signalsystems rekonstruiert. Dieses besteht aus Endothelin-Liganden und -Rezeptoren und hat eine Schlüsselrolle in die Entwicklung der Neuralleiste. Die Neuralleiste und die von ihr abgeleiteten Zelltypen sind wirbeltierspezifische Innovationen. Die Analyse zeigt, dass das Endothelin-System in einem gemeinsamen Vorfahren der Vertebraten entstanden ist. Die in den Genomen rezenter Vertebraten vorkommenden Komponenten des Endothelin-Systems sind durch die drei Genomverdoppelungen entstanden. Nach jeder der Duplizierungen kam es zur Ko-Evolution der Liganden- und Rezeptorenfamilien. Die Evolution des Endothelin-System unterstreicht daher die Bedeutung der Genomduplizierungen für den Ursprung und die Diversifizierung der Neuralleiste. Sie weist aber auch auf eine wichtige Rolle für die Integrierung neuer Gene in das regulatorische Netzwerk der Neuralleiste hin. Im Weiteren wurde der Einfluss der FSGD auf die Evolution der Pigmentzellentwicklung und differenzierung in Teleostiern untersucht. Die evolutionäre Analyse von 128 Genen zeigte, dass Pigmentierungsgene nach der FSGD bevorzugt in zwei Kopien erhalten geblieben sind. Daher besitzen rezente Teleostier im Vergleich zu Landwirbeltieren zusätzlich ca. 30% mehr Gene mit potentiellen Funktionen für die Pigmentierung. Große Teile der regulatorischen Signalwege in den Pigmentzellen liegen daher als zwei Kopien vor. Diese waren möglicherweise an der Evolution von Innovationen in der Körperfärbung von Teleostiern beteiligt. In der vorliegenden Arbeit wurden auch wichtige Unterschiede zwischen verschiedenen Fischgruppen im Erhalt duplizierter Pigmentierungsgene gefunden. Funktionelle Studien bei Zebrafish und bei Medaka an Enzymen der Pigmentsynthese, insbesondere der Tyrosinase-Familie, gaben Hinweise darauf, dass die funktionelle Evolution duplizierter Pigmentierungsgene in Fischen linienspezifisch verlaufen kann. Die Studien ergaben außerdem, dass bestimmte Funktionen der Pigmentsyntheseenzyme innerhalb der Vertebraten konserviert sind. Die Evolution des Pigmentierungssystems der Fische, welches das vielfältigste und komplexeste innerhalb der Wirbeltiere ist, wurde somit maßgeblich durch die FSGD beeinflusst. Zusammenfassend weisen die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit darauf hin, dass die Verdopplung ganzer Genome ein wichtiger Mechanismus der phänotypische Evolution bei Vertebraten ist und damit in besonderem Maße zur ihrer Biodiversität beiträgt.
KW  - Molekulare Evolution
KW  - Fische
KW  - Entwicklungsbiologie
KW  - Evolutionsbiologie
KW  - Genanalyse
KW  - Pigmentierung
KW  - Melanin
KW  - Vertebrat
KW  - Neuralleiste
KW  - Gen-/Genomverdoppelung
KW  - gene/genome duplication
KW  - fish
KW  - vertebrate
KW  - neural crest
KW  - pigmentation
Y1  - 2009
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-35702
ER  - 
TY  - THES
A1  - Liedtke, Daniel
T1  - Functional divergence of Midkine growth factors : Non-redundant roles during neural crest induction, brain patterning and somitogenesis
T1  - Funktionelle Divergenz von Midkine Wachstumsfaktoren: Nicht-redundante Funktionen während der Neuralleisteninduktion, der Gehirnenmusterbildung und der Somitogenese
N2  - Neural crest cells and sensory neurons are two prominent cell populations which are induced at the border between neural and non-neural ectoderm during early vertebrate development. The neural crest cells are multipotent and highly migratory precursors that give rise to face cartilage, peripheral neurons, glia cells, pigment cells and many other cell types unique to vertebrates. Sensory neurons are located dorsally in the neural tube and are essential for sensing and converting environmental stimuli into electrical motor reflexes. In my PhD thesis, I obtained novel insights into the complex processes of cell induction at the neural plate border by investigating the regulation and function of mdkb in zebrafish. First, it was possible to demonstrate that mdkb expression is spatiotemporally correlated with the induction of neural crest cells and primary sensory neurons at the neural plate border. Second, it became evident that the expression of mdkb is activated by known neural crest cell inducing signals, like Wnts, FGFs and RA, but that it is independent of Delta-Notch signals essential for lateral inhibition. Knockdown experiments showed that mdkb function is necessary for induction of neural crest cells and sensory neurons at the neural plate border, probably through determination of a common pool of progenitor cells during gastrulation. The present study also used the advantages of the zebrafish model system to investigate the in vivo function of all midkine gene family members during early brain development. In contrast to the situation in mouse, all three zebrafish genes show distinct expression patterns throughout CNS development. mdka, mdkb and ptn expression is detected in mostly non-overlapping patterns during embryonic brain development in the telencephalon, the mid-hindbrain boundary and the rhombencephalon. The possibility of simultaneously knocking down two or even three mRNAs by injection of morpholino mixtures allowed the investigation of functional redundancy of midkine factors during brain formation. Knockdown of Midkine proteins revealed characteristic defects in brain patterning indicating their association with the establishment of prominent signaling centers such as the mid-hindbrain boundary and rhombomere 4. Interestingly, combined knockdown of mdka, mdkb and ptn or single knockdown of ptn alone prevented correct formation of somites, either by interfering with the shifting of the somite maturation front or interferance with cell adhesion in the PSM. Thus, Ptn was identified as a novel secreted regulator of segmentation in zebrafish.
N2  - Neuralleistenzellen und sensorische Neuronen werden während der frühen Wirbeltierentwicklung an der Grenze zwischen dem neuralen und epidermalen Ektoderm gebildet. Neuralleistenzellen sind multipotente Vorläufer von verschiedenen Geweben, wie der Knorpelanteile des Kopfskeletts, peripherer Neurone, Gliazellen, Pigmentzellen und vieler weiterer Derivate. Sensorische Neurone befinden sich im dorsalen Rückenmark und sind wichtig für die Wahrnehmung von Hautreizen. Durch Untersuchung der Regulation und Funktion von mdkb im Zebrafisch konnte ich in meiner Doktorarbeit neue Einsichten in den komplexen Prozess der Zellinduzierung an der Grenze der Neuralplatte erlangen. Es zeigte sich, dass die Expression von mdkb zeitlich und räumlich mit der Induktion von Neuralleistenzellen und primären Neuronen an der Neuralplattengrenze korreliert. Weiterhin konnte ich nachweisen, dass die mdkb Expression durch Signalwege reguliert wird, die für die Induktion von Neuralleistenzellen wichtig sind, wie Wnt, FGF und Retinolsäure. Signale der Delta-Notch Familie, welche essentiell für laterale Inhibition sind, werden dagegen nicht für die mdkb Expression benötigt. Weitere knockdown Experimente zur Reduktion der mdkb-Funktion bewiesen, dass mdkb notwendig für die Induktion von Neuralleistenzellen und der sensorischen Neuronen an der Neuralplattengrenze ist. Des Weiteren konnten im Verlauf dieser Doktorarbeit die in vivo Funktionen aller Mitglieder der midkine Genfamilie während der frühen Gehirnentwicklung untersucht werden. Im Unterschied zu höheren Vertebraten, wie z. B. der Maus, wiesen alle drei midkine Gene des Zebrafisches unterschiedliche Expressionsmuster während der Entwicklung auf. mdka, mdkb und ptn zeigten in Regionen hoher Zellproliferation, wie dem Telencephalon, der Mittel-Nachhirngrenze und dem Nachhirn in der Regel keine Überlappung während der embryonalen Gehirnentwicklung. Die Möglichkeit der simultanen Reduktion zweier oder dreier Proteine durch Injektion von Morpholinogemischen erlaubte die Untersuchung einer eventuellen funktionellen Redundanz während der Gehirnentwicklung. Die Reduktion der Midkine Proteine resultierte in charakteristischen Defekten während der Regionalisierung des Gehirns, was auf eine Rolle während der Bildung essentieller Signalzentren im Gehirn hindeutet. Auffallend waren auch Defekte in der Somitenbildung, die nach gleichzeitiger Reduktion von mdka, mdkb und ptn auftraten. Diese Defekte beruhen entweder auf einer Positionsveränderung der Somiten-Reifungszone oder auf einer Störung der Zelladhäsion im präsomitischen Mesoderm durch Ptn. Somit zeigen die Daten eine neue Funktion von Ptn als sekretiertem Regulator der Somitogenese im Zebrafisch.
KW  - Zebrabärbling
KW  - Neuralleiste
KW  - Hirnforschung
KW  - Entwicklungsbiologie
KW  - Mikroevolution
KW  - Midkine
KW  - Wachstumsfaktoren
KW  - Somitogenese
KW  - Neuralrohr
KW  - Midkine
KW  - growth factor
KW  - neural tube
KW  - somitogenesis
Y1  - 2007
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-25707
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TY  - THES
A1  - Klüver, Nils
T1  - Molecular analysis of gonad development in medaka (Oryzias latipes) and Oryzias celebensis
T1  - Molekulare Analyse der Gonadenentwicklung im Medaka (Oryzias latipes) und Oryzias celebensis
N2  - The process of sex-determination can be better understood through examinations of developing organs and cells, which are involved in the formation of undifferentiated gonad. This mechanisms show in fish a broad variety, ranging from hermaphroditism to gonochorism and environmental to genetic sex determination. Hormones and abiotic factors such as temperature and pH can influence teleost development and reproductive traits. These factors are vulnerable to pollutants and climate changes. Therefore, it is important to examine gonad development and sex-determination/differentiation in teleost fish. Teleost fish are the largest known group of vertebrates with approximately 25,000 species and are used for such kind of examinations as model organisms. Recently, in Oryzias latipes (medaka), dmrt1bY (or dmy), a member of the Dmrt gene family, has been described as testis-determining gene. However, this gene is not the universal master sex-determining gene in teleost fish. Although dmrt1bY is present in the most closely related species of the genus, namely Oryzias curvinotous, it is absent from other Oryzias species, like Oryzias celebensis, and other fish. During my thesis, I studied gonad development in medaka and in the closely related species Oryzias celebensis. Germ cell specification in medaka seems to be dependent on maternally provided cytoplasmatic determinants, so called germ plasm. Nanos and vasa are such germ cell specific genes. In zebrafish they are asymmetrically localized in the early embryo. I have shown that nanos mRNA is evenly distributed in the early embryo of medaka. A similar pattern has been already described for the medaka vasa homolog, olvas. This suggests differences in PGC specification in zebrafish and medaka. Further, the vasa homolog was isolated and the expression pattern examined in O. celebensis. The results show that it can be used as a germ cell specific marker. Additionally, the primordial germ cell migration in O. celebensis was followed, which is similar to medaka PGC migration. Primordial germ cell migration in vertebrates is dependent on the chemokine stromal cell-derived factor 1 (Sdf-1). Medaka has two different sdf-1 genes, sdf-1a and sdf-1b. Both genes are expressed in the lateral plate mesoderm (LPM). During late embryonic development, I could show that sdf-1a is expressed in newly formed somites and not longer in the LPM. Sdf-1b expression persisted in the posterior part of the lateral plate mesoderm in the developing gonad. In terms of early and late functions, this suggests subfunctionalization of sdf-1a and sdf-1b. In “higher” vertebrates, genes that are involved in the process of gonad development have been studied in detail, e.g. Wt1, Sox9, and Amh. I have analyzed the expression pattern of wt1 and sox9 co-orthologs and amh. In both, the medaka and O. celebensis, wt1a transcripts were localized in the LPM and its expression was similar to sdf-1a gene expression in medaka. Wt1b expression was restricted to the developing pronephric region. During later embryonic development, wt1a is specifically expressed in the somatic cells of the gonad primordium in both sexes. This is the first time that in fish wt1 gene expression in developing gonads has been described. Therefore, this result suggests that wt1a is involved in the formation of the bipotential gonad. Furthermore, I have analyzed the gonad specific function of the wt1 co-orthologs in medaka. I could show that a conditional co-regulation mechanism between Wt1a and Wt1b ensures PGC maintenance and/or survival. The expression of sox9 genes in medaka and sox9b in O. celebensis were detected in the somatic cells of the gonad primordium of both sexes. Additionally, I have shown that amh and amhrII in medaka are expressed in somatic cells of the gonad primordium of both sexes. This suggests that sox9b, amh and amhrII are involved in gonad development and have specific functions in the adult gonad. In O. celebensis I could detect an expression of dmrt1 already six days after fertilization in half of the embryos, which is similar to the dmrt1bY expression in medaka. Whether the expression of dmrt1 is male specific in O. celebensis is currently under investigation. Altogether, the obtained results provide new insights into gene expression patterns during the processes of gonad development. Furthermore, no differences in the expression pattern of wt1a and sox9b during gonad development between the medaka and O. celebensis could be detected. This might indicate that the genetic mechanisms during gonad development are similar in both species.
N2  - Die Untersuchung der Keimzellwanderung in O. celebensis zeigte hohe Ähnlichkeiten zu der bereits Beschriebenen im Medaka. Die Keimzellwanderung in Wirbeltieren ist abhängig von stromal cell-derived factor 1 (Sdf-1), einem chemotaktisch wirkendem Zytokinin. Im Medaka existieren zwei sdf-1 Gene, sdf-1a und sdf-1b, die während der embryonalen Entwicklung im Seitenplattenmesoderm (LPM) exprimiert werden. Die Expression der beiden Gene unterscheiden sich jedoch zeitlich und auch örtlich im LPM. Dies lässt vermuten, dass sich im Verlauf der Evolution eine frühe und eine späte keimzellspezifische Funktion zwischen sdf-1a und sdf-1b aufgeteilt hat. In „höheren“ Wirbeltieren wurden schon verschiedene Gene, z.B. Wt1, Sox9 und Amh, in dem Prozess der Gonadenentwicklung beschrieben. Die Expressionsmuster von wt1 und sox9 Co-Orthologen und amh habe ich während meiner Arbeit untersucht. Im Medaka und in O. celebensis wird wt1a im LPM transkribiert und ähnelt der von sdf-1a im Medaka. Die Expression von wt1b erfolgt hingegen nur in der Region der Vorläufer-Niere. Im weiteren Verlauf der Embryogenese ließen sich wt1a Transkripte erstmalig in somatischen Zellen des Gonaden-Vorläufers nachweisen. Wt1a spielt vermutlich eine Rolle in der Entwicklung der bipotentialen Gonade. Die funktionelle Analyse von wt1 Genen im Medaka zeigte, dass durch eine konditionale Co-Regulation zwischen wt1a und wt1b die Keimzellen überleben bzw. erhalten bleiben. Die Expression von sox9b im Medaka und in O. celebensis ließ sich in somatischen Zellen des Gonaden-Vorläufers nachweisen. Zusätzlich werden amh und amhrII ebenfalls in somatischen Zellen beider Geschlechter exprimiert, daher kann man eine wichtige Rolle dieser Gene während der Gonadenentwicklung und in der adulten Gonade annehmen. Die Expression von dmrt1 in O. celebensis konnte ich, in etwa der Hälfte der beobachteten Embryonen, bereits schon früh in der embryonalen Entwicklung (6 Tage nach der Befruchtung) nachweisen. Das Transkriptionsmuster von dmrt1 in O. celebensis ist ähnlich der Expression von dmrt1bY im Medaka. Inwieweit diese Expression in O. celebensis spezifisch für Männchen ist wird zurzeit noch untersucht. Die erhaltenen Ergebnisse zeigen neue Einblicke in die Genexpressionsmuster der Gonadenentwicklung von Medaka und O. celebensis und weisen neue Möglichkeiten für weitere Forschungen auf. Des Weiteren konnte ich im Verlauf der Gonadenentwicklung keine Unterschiede in der Genexpression von wt1a und sox9b zwischen Medaka und O. celebensis nachweisen. Dies deutet an, dass die genetischen Mechanismen der Gonadenentwicklung zwischen den beiden nahverwandten Arten sehr ähnlich sind.
KW  - Japankärpfling
KW  - Gonade
KW  - Geschlechtsbestimmung
KW  - Entwicklungsbiologie
KW  - medaka
KW  - sex determination
KW  - sox9
KW  - amh
KW  - wt1
KW  - gonad development
Y1  - 2007
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-25105
ER  - 
TY  - THES
A1  - Müller, Sophia
T1  - Molekulare Untersuchungen zur Rolle von Homeobox-Genen bei der Entwicklung von Echinococcus multilocularis
T1  - Molecular analysis of the impact of homeoboxgenes in the development of Echinococcus multilocularis
N2  - Die alveoläre Echinokokkose ist eine, vorrangig in der nördlichen Hemisphäre verbreitete, parasitäre Erkrankung. Verursacht wird sie beim Menschen durch das Larvenstadium des Fuchsbandwurms. Homeoboxgene sind hochkonservierte Gene, die die Morphogenese von Lebewesen steuern. Die Anzahl und die Bedeutung von Homeoboxgenen in der Entwicklung von E.multilocularis waren bislang unbekannt. Im Rahmen dieser Arbeit konnten mit Hilfe von Sequenzanalysen im Genom des Fuchsbandwurms erstmals Homeoboxgene identifiziert und deren Expressionsmuster mittels PCR in verschiedenen Larvenstadien charakterisiert werden. Von insgesamt 23 gefundenen Homeoboxgenen wurden 15 Gene auf ihre larvenstadienspezifische Expression untersucht. Neun der untersuchten Gene zeigten in dem gewählten Versuchsaufbau eine Expression in den untersuchten Larvenstadien, fünf davon zeigten eine verstärkte Expression in den späten Larvenstadien. Für acht dieser neun Gene ließen sich darüber hinaus Hinweise auf eine Prozessierung ihrer mRNA über den Mechanismus des Trans-Spleißens finden. Vorangehende Versuche der Arbeitsgruppe von Prof. Brehm hatten einen Zusammenhang zwischen einer Stimulation früher Entwicklungsstadien der Parasitenlarven mit dem Zytokin BMP-2 und dessen rascherer Entwicklung in spätere Entwicklungsstadien nahegelegt. Die Auswirkung einer Behandlung früher Entwicklungsstadien mit dem Zytokin BMP-2 auf die jeweilige Genexpression wurde daher für die ausgewählten 15 Gene überprüft. Fünf Gene zeigten unter dessen Einfluss eine verstärkte Expression. Zwei darunter waren solche, die eine stärkere Expression in späten Larvenstadien aufwiesen. Diese zwei Gene stellen nun Kandidaten dar, die an der Entwicklung von E.multilocularis maßgeblich beteiligt sein könnten. Durch die Untersuchungen dieser Arbeit ergaben sich wichtige Hinweise auf die Entwicklung und die Regulationsmechanismen der Genexpression von E. multilocularis. Sie bilden eine Grundlage, die Rolle der Homeoboxgene für den Fuchsbandwurm näher zu beschreiben und die hormonelle Kreuzregulation zwischen Parasit und Wirt weiter zu studieren.
N2  - Alveolar Echinococcosis is a rather rare parasitic disease, mainly occuring in the northern hemisphere. It is caused by the larval stage of the flatworm Echinococcus multilocularis. Homeoboxgenes are highly conserved genes, that play a crucial role in the development of organism. Until now neither the number in nor the importance of these genes for E.multilocularis was known. Within this study we could identify the homeoboxgenes in the genome of E.multilocularis and analyse the expression pattern in different larval stages. All together we found a number of 23 homeoboxgenes, the expression pattern in different larval stages was analysed for 15 genes. Within the chosen experimental setup nine of the genes were expressed, five showed higher expression in later larval stages. Furthermore there was a strong hint for the processing of mRNA through trans-splicing for eight genes. Previous experiments of the working group Brehm had shown a relation between a stimulation of young metacestodes with the cytokine BMP-2 and a faster development towards later larval stages. Therefore we anaylsed the effect of the cytokine BMP-2 on the geneexpression pattern of fifteen genes. Under its influence five genes showed higher expression rates. Two belonged to the group of genes that had shown higher expression in later larval stages. These two genes could potentially be candidates with a high significance in the development of E.multilocularis. Due to this work we could elucidate important hints for the development of E.multilocularis and the regulation of its gene expression. Based on these findings it will be possible to study the role of homeoboxgenes and the host-parasite cross-regulation in E.multilocularis in more detail.
KW  - Fuchsbandwurm
KW  - Knochen-Morphogenese-Proteine
KW  - Entwicklungsbiologie
KW  - Genexpression
KW  - Bandwürmer
KW  - Eucestoda
KW  - Parasit
KW  - Homeobox-Gene
KW  - Hox-Gene
KW  - Trans-Spleißen
KW  - BMP
KW  - Echinococcus multilocularis
KW  - BMP
KW  - trans-splicing
KW  - homeoboxgenes
KW  - hoxgenes
Y1  - 2009
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-35616
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TY  - THES
A1  - Dinger, Timo Christoph
T1  - Neural Differentiation Potential of Murine Androgenetic Embryonic Stem Cells
T1  - Das Neurale Differenzierungspotential Muriner Androgenetischer Embryonaler Stammzellen
N2  - Uniparental zygotes with two genomes from the same sex can be established from fertilised oocytes after pronuclear exchange. They contain two maternal (gynogenetic; GG) or paternal (androgenetic; AG) pronuclei and are not competent to develop into viable offspring but they can form blastocysts from which embryonic stem cells (ES cells) can be derived. The developmental potential of uniparental ES cells is not fully investigated. The restricted developmental potential of uniparental cells is cell-intrinsic and probably reflects the different roles maternal and paternal genomes play during development. Following blastocyst injection, both GG and AG ES cells show biased and parent-of-origin-specific chimaera formation. While the in vitro and in vivo neural differentiation potential of GG ES cells is well characterised the neural developmental potential of AG ES cells is less clear. In an earlier study the group of K. John McLaughlin reported that AG and GG ES cell-derived hematopoietic stem cells conveyed long-term, multi-lineage hematopoietic engraftment with no associated pathologies (Eckardt et al., 2007). The aim of this study was to investigate the potential of AG uniparental murine ES cells to differentiate in vitro and in vivo into neural progenitor / stem cells and further into neurons, astro- and oligodendroglia in comparison to GG and biparental (normal fertilised; N) ES cells. Uniparental and biparental ES cells were obtained from K. John McLaughlin’s group and a cell culture system was established to expand uniparental (AG, GG) and biparental N ES cells on murine embryonic fibroblasts (MEF). A multistep-protocol was used to differentiate ES cells towards pan-neural progenitor cells and neuronal and glial cell types (Brüstle et al., 1997). The ability of terminal neural differentiation in vitro was analysed by fluorescence microscopy using neuronal and glial lineage markers. In parallel, eGFP+ AG or N ES cells were injected into blastocysts prior to their transfer into foster mothers. At E12.5 and E14.5, embryos were isolated, forebrains were dissected and by means of fluorescence activated cell sorting (FACS) eGFP+ donor cells were isolated from chimeric brains. Both eGFP+ donor and corresponding eGFP- blastocyst-derived brain cells were expanded and analyses of differentiation potential and self-renewal capacity were performed. Also, cryosections of E12.5 chimeric brains were analysed for donor contribution to the neuronal lineage by immunofluorescence microscopy. Here it is described that following in vitro differentiation, AG pan-neural progenitor cells have similar abilities to differentiate into neuronal and glial lineages as GG and N pan-neural progenitor cells. In cryosections of E12.5 chimeric brains no differences in brain engraftment and formation of immature neuronal cells between uniparental AG and N donor cells were detected. AG and N ES cell-derived cells isolated from chimeric foetal brains by FACS exhibited similar neurosphere initiating cell frequencies and neural multi-lineage differentiation potential. Therefore, the data of this study suggest that the previously described differences in the in vivo engraftment pattern of uniparental inner cell mass (ICM) cells in foetal brains (Keverne et al., 1996) are not primarily due to limitations in the proliferation or differentiation properties of uniparental neural progenitor cells. The results presented here indicate that AG ES cell-derived neural progenitor / stem cells did not differ from N neural progenitor / stem cells in their self-renewal and their neural multi-lineage differentiation potential. Also AG ES cell-derived cells contributed to developing brains at early foetal developmental stages showing a widespread and balanced distribution in chimeric brains. AG brain cells form neurospheres with self-renewal and neural differentiation capacity similar to N ES cell-derived brain cells. Thus, the data of this study together indicate that the neural developmental potential in vivo and in vitro of AG and N ES cells does not differ.
N2  - Uniparentale Zygoten mit zwei Allel-Sätzen des gleichen Geschlechtes entstehen aus befruchteten Eizellen nach dem Austauschen von einem der Pronuclei, so dass sie entweder zwei maternale Pronuclei (gynogenetisch; GG) oder zwei paternale Pronuclei (androgenetisch, AG) enthalten. Diese uniparentalen Zygoten sind nicht in der Lage, sich zu lebensfähigen Organismen zu entwickeln, aber sie erreichen das Entwicklungsstadium der Blastozyste, aus denen uniparentale embryonale Stammzellen (ES Zellen) gewonnen werden können. Das Entwicklungspotential uniparentaler ES Zellen ist bisher nicht vollständig verstanden. Das begrenzte Entwicklungspotential uniparentaler Zellen ist zell-intrinsisch und spiegelt die möglichen unterschiedlichen Rollen wieder, die maternales und paternales Genom während der Entwicklung eines Organismus spielen. Nach der Injektion in wildtypische Blastozysten zeigen sowohl AG- als auch GG-Zellen unausgewogene und spezifisch für den parentalen Ursprung der injizierten Zellen typische Entwicklungen in den chimären Embryonen. Während das neurale Entwicklungspotential von GG ES Zellen gut charakterisiert ist, ist dies für AG ES Zellen weit weniger untersucht. In einer früheren Studie zeigte die Arbeitsgruppe von K. John McLaughlin, dass AG- und GG-Zellen langzeitrepopulierende hämatopoetische Zellen mit der Fähigkeit zur Multiliniendifferenzierung sind, deren Transplantation zu keinen pathologischen Veränderungen im hämatopoetischen System führten (Eckardt et al., 2007). Das Ziel dieser Arbeit war es, das Potential muriner AG ES Zellen zur Differenzierung in neurale Stamm- und Vorläuferzellen und weiter in neurale, astro- und oligodendrogliale Zellen im Vergleich zu GG und biparentalen (normal befruchteten; N) ES Zellen in vivo und in vitro zu untersuchen. Für uniparentale und biparentale ES Zellen, die von der Arbeitsgruppe von K. John McLaughlin zur Verfügung gestellt wurden, wurde ein Zellkultursystem etabliert, um uniparentale (AG, GG) und N ES Zellen auf murinen embryonalen Fibroblasten (MEFs) zu kultivieren. Ein mehrstufiges Differenzierungsprotokoll wurde angewandt, um aus ES Zellen pan-neurale Vorläuferzellen und neuronale und gliale Zelltypen zu generieren (Brüstle et al., 1997). Die Fähigkeit zur terminalen neuronalen Differenzierung wurde mit Fluoreszenzmikroskopie unter der Verwendung von linienspezifischen neuronalen und glialen Markermolekülen analysiert. Parallel dazu wurden eGFP+ uniparentale AG oder biparentale N ES Zellen in Blastozysten injiziert, die in Ammentiere transferiert wurden. An den Tagen E12.5 und E14.5 wurden die Embryonen isoliert, die fötalen Vorderhirne wurden präpariert, und aus den daraus resultierenden Einzelzellsuspensionen wurden durch fluoreszenzaktivierte Zellsortierung aus AG ES Zellen entstandene GFP+ Zellen isoliert. Sowohl von AG ES Zellen abstammende eGFP+ Zellen als auch von den korrespondierenden, von den Blastozysten abstammende, eGFP- Zellpopulationen wurden als Kulturen expandiert. Analysen des neuronalen Differenzierungspotenzials und der Selbsterneuerungsfähigkeit wurden durchgeführt. Außerdem wurde in Kryosektionen von E12.5 chimären Gehirnen die Verteilung der von AG ES Zellen abstammenden eGFP+ Zellen durch Immunfluoreszenzmikroskopie untersucht. AG pan-neurale Vorläuferzellen zeigten in der in vitro Differenzierung ähnliche Fähigkeiten zur Differenzierung in neurale und gliale Zelllinien wie GG und N pan-neurale Vorläuferzellen. In Kryosektionen von E12.5 chimären Gehirnen wurden keine signifikanten Unterschiede in der Besiedlung von Gehirngeweben und der Bildung unreifer neuronaler Zellen zwischen AG und N Zellen festgestellt. Die von AG und N ES Zellen abstammenden Zellen, die durch fluoreszenzaktivierte Zellsortierung aus den chimären fötalen Gehirnen isoliert wurden, zeigten gleiche Frequenzen von Neurosphären initiierenden Zellen und ein gleiches neurales Multilinien-Differenzierungspotenzial. Zusammenfassend deuten die Daten in der hier vorliegenden Studie darauf hin, dass die Unterschiede im in vivo Besiedlungsmuster fötaler chimärer Gehirne durch uniparentale Zellen (Keverne et al., 1996) nicht auf Limitierungen in den Proliferations- oder Differenzierungseigenschaften von uniparentalen neuralen Vorläuferzellen zurückzuführen sind. Die Ergebnisse zeigen vielmehr, dass neurale Vorläufer- / Stammzellen, die von AG ES Zellen abstammen, sich nicht in ihrem Selbsterneuerungs- und Multilinien-Differenzierungspotenzial von N Vorläufer- / Stammzellen unterscheiden. Ebenso zeigen AG ES Zellen nach Blastocysten-Injektion in frühen fötalen Entwicklungsstufen eine ausgewogene Verteilung im gesamten chimären Gehirn. AG Gehirnzellen bilden Neurosphären mit dem gleichen Selbsterneuerungs- und neuralen Differenzierungspotenzial wie N Gehirnzellen. Zusammen genommen zeigen die Daten dieser Studie, dass sich die Fähigkeit von AG ES Zellen zur frühen neuralen Entwicklung in vitro und in vivo nicht von N ES Zellen unterscheiden.
KW  - Stammzelle
KW  - Entwicklungsbiologie
KW  - Embryionale Stammzellen
KW  - Androgenetisch
KW  - Neurale Differenzierung
KW  - Neurale Vorläuferzellen
KW  - Chimaere Embryonen
KW  - Embryonic Stem Cells
KW  - Androgenetic
KW  - Neural Differentiation
KW  - Neural Progenitor Cells
KW  - Chimeric Embryos
Y1  - 2008
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-36215
ER  -