TY  - THES
A1  - Porps, Patrick
T1  - Erhöhte Lebenserwartung und Resistenz gegenüber oxidativem Stress in Maus-Prion-Protein (PrP)-exprimierenden Drosophila melanogaster
T1  - Increased lifespan and resistance against oxidative stress in Drosophila melanogaster expressing the murine prion protein (PrP)
N2  - Übertragbare spongiforme Enzephalopathien (TSE) wie Scrapie beim Schaf, die bovine spongiforme Enzephalopathie (BSE) beim Rind oder die Creutzfeldt-Jakob-Krankheit (CJD) beim Menschen sind fortschreitende neurodegenerative Erkrankungen, die nach langer Inkubationszeit zum Tod führen. Die protein only-Hypothese besagt, dass das infektiöse Agens „Prion“ teilweise oder vollständig aus dem zellulären Prion-Protein (PrPC) besteht und nach Infektion des Organismus die Konversion von PrPC in die pathogene Isoform (PrPSc) verursacht. Die der Krankheit zugrunde liegenden neuropathologischen Mechanismen und die physiologische Funktion von PrPC sind bisher unbekannt. Es wurden jedoch eine neuroprotektive Funktion oder eine mögliche Rolle im Zusammenhang mit der oxidativen Stress Homöostase postuliert. In dieser Arbeit wurden transgene Drosophila melanogaster-Linien als Modell zur Untersuchung der Funktion von PrPC etabliert. Unter Verwendung des Expressionssystems UAS/GAL4 exprimierten die Fliegen entweder wildtypisches PrP (wt-PrP) oder eine trunkierte, krankheits-assoziierte Mutante PrPΔ32-134 (tr-PrP), der die potentielle neuroprotektive Octarepeat-Domäne entfernt wurde. Wt-PrP transgene Fliegen zeigten nach Vergleich mit Kontrolllinien eine signifikante, um 20% erhöhte allgemeine Lebenserwartung. Obwohl die Expression von tr-PrP in Drosophila zu keinen nachweisbaren neuropathologischen Veränderungen führte, wurde die Lebensspanne um 8% reduziert. Ko-Expression von wt-PrP und tr-PrP konnte diesen Effekt nicht komplementieren, was eine chronische Toxizität der trunkierten Form nahelegt, die in diesem Zusammenhang der Neuroprotektion übergeordnet ist. Da Lebenserwartung und Stressresistenz eng miteinander korrelieren, wurden die Fliegen den reaktiven Sauerstoffspezies Wasserstoffperoxid, Sauerstoff und Paraquat ausgesetzt, um auf drei unabhängigen Wegen oxidativen Stress zu induzieren. In der Tat vermittelt wt-PrP eine signifikante Stressresistenz, wohingegen tr-PrP-exprimierende Tiere eine normale Anfälligkeit offenbarten, die jedoch teilweise durch Ko-Expression beider PrP-Formen komplementiert werden konnte. Hier erscheint die protektive Funktion von wt-PrP der Toxizität der Deletionsmutante übergeordnet zu sein. Diese Daten belegen eine wichtige Funktion des Prion-Proteins bezüglich der Abwehr von oxidativem Stress. Essentiell ist dabei die Kupfer-bindende Octarepeat-Domäne, durch die möglicherweise Fenton-ähnliche Reaktionen, die bei der Sauerstoff-Radikalsynthese eine wichtige Rolle spielen, inhibiert werden könnten. Konsistent damit ist die Beobachtung des Verlusts der erworbenen Stressresistenz nach Expression der Octarepeat-losen Mutante tr-PrP und die signifikante Reduktion der Lebenserwartung über einen bislang unaufgeklärten Mechanismus. Das Drosophila PrP-Modell bietet die Möglichkeit, die physiologische Funktion von PrP detailliert zu untersuchen. Außerdem ist die Identifizierung unbekannter PrP-Interaktionspartner ermöglicht, um Signaltransduktionswege des PrP und die zugrunde liegenden neurodegenerativen Mechanismen aufzuklären.
N2  - Transmissible spongiforme encephalopathies (TSE) such as scrapie in sheep, bovine spongiform encephalopathy (BSE) in cattle or Creutzfeldt-Jakob disease (CJD) in humans are fatal progressive neurodegenerative disorders. The protein only hypothesis proposes that the infectious agent designated prion consists partly or entirely of the host cellular prion protein (PrPC) and, when the prion is introduced into the organism, causes the conversion of PrPC into the pathogenic isoform PrPSc. However, the disease underlying neuropathogenic mechanisms and the physiological function of PrPC still remain unknown, although a neuroprotective function or a role in oxidative stress homeostasis has been postulated previously. In this work transgenic Drosophila melanogaster lines were evaluated as a model for studying the function of PrPC. By using the bipartite expression system UAS/GAL4 either wild-type PrP (wt-PrP) or a truncated disease associated variant PrPΔ32-134 (tr-PrP) lacking the putative neuroprotective octarepeat domain were utilized. Wt-PrP transgenic flies displayed an approximately 20% increase in average lifespan compared to controls. Although expression of tr-PrP in Drosophila did not induce any obvious neuropathology, it significantly reduced the lifespan by 8%. Co-expression of wt-PrP and tr-PrP did not complement this phenotype, indicating a chronic toxicity of the truncated PrP that is overriding the neuroprotection. Since extended lifespan and stress resistance are closely associated, flies were exposed to the reactive oxygen species (ROS) hydrogen peroxide, oxygen and Paraquat as three independent treatments to provoke oxidative stress. Interestingly, wt-PrP confered resistance to ROS-induced stress, whereas tr-PrP transgenic flies showed normal susceptibility, which was partly rescued by co-expression of wt-PrP. In this regard PrP presence in its physiological compartment, the central nervous system, is sufficient to maintain the described beneficial effects. These findings suggest that PrP is involved in oxidative stress homeostasis by a mechanism that requires the copper binding octarepeat domain. This function might be responsible for the inhibition of Fenton-like reactions which are known to play an important role in oxygen radical synthesis. Consistent with this theory is the observation that ectopic expression of the octarepeat deletion mutant tr-PrP reduces both acquired stress resistance and lifespan by an unrelated, yet unknown mechanism. The Drosophila PrP model provides the possibility to investigate the physiological function of PrP in more detail. It is likewise considerable to identify unknown ligands of PrP in order to uncover PrP signal transduction pathways or neuropathogenic mechanisms.
KW  - Prion
KW  - Prionprotein
KW  - Oxidativer Stress
KW  - Taufliege
KW  - PrP
KW  - prion
KW  - prion protein
KW  - drosophila melanogster
KW  - oxidative stress
KW  - longevity
KW  - stress resistance
Y1  - 2008
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-36171
ER  - 
TY  - THES
A1  - Dittmar, Sandra
T1  - Masernvirus-induzierte Blockade der transendothelialen Migration von Leukozyten und infektionsvermittelte Virusausbreitung durch Endothelzellschichten
T1  - Measles virus-Induced Block of Transendothelial Migration of T Lymphocytes and Infection-Mediated virus Spread across Endothelial Cell Barriers
N2  - Neben dem bekannten Tropismus des Masernvirus für CD150-positive aktivierte Zellen des Immunsystems, spielt der Endothelzelltropismus für die akute Masernviruserkrankung einschließlich ihren nachfolgenden Komplikationen eine wichtige pathogene Rolle. Die Infektion der Endothelzellen steht in Zusammenhang mit dem Auftreten des MV-Exanthems. Es ist auch möglich, dass die „Akute Enzephalitits“ und der Viruseintritt ins zentrale Nervensystem wie im Falle der subakuten sklerosierenden Panenzephalitis (SSPE) durch Endothelzellinfektion vermittelt wird. Ziel der Arbeit war herauszufinden, wie und ob das MV Endothelzellbarrieren überwinden kann mittels Transport infizierter Leukozyten oder durch Infektion von EZs mit basolateraler Virusfreisetzung. Es wurde untersucht, ob die Fähigkeit von primären humanen T- Zellen durch polarisierte Zellschichten von „human brain microvascular endothelial cells“ (HBMECs) zu wandern durch die Infektion beeinflusst wird. Die Fähigkeit von infizierten Lymphozyten durch die Poren der Filter zu wandern war teilweise beeinträchtigt, jedoch war das Ergebnis statistisch nicht signifikant. Im Gegensatz dazu war die Fähigkeit der Zellen durch Endothelzellbarrieren zu wandern drastisch reduziert. Nach Infektion adhärierten die Leukozyten stärker auf den Endothelzellen. Bei dieser Adhäsion von PBMCs an Endothelzellen kam es trotz Infektion zur Ausbildung von sogenannten „transmigratory cups“ oder docking- Strukturen. Dieser enge Zell-Zell-Kontakt hatte zur Folge, dass die MV-Infektion vom Lymphozyten auf die Endothelzelle übertragen wurde. Die MV-Hüllproteine wurden auf der apikalen und basolateralen Seite infizierter Endothelzellen exprimiert wie anhand von Aufnahmen mit dem konfokalen Mikroskop am Beispiel des H-Proteins gezeigt werden konnte. Titrationen ergaben, dass das Virus auf beiden Seiten der Zellen freigesetzt wurde. Desweiteren wurde bestätigt, dass auch für polarisierte Endothelzellen die auf Tyrosin basierenden Transportsignale verantwortlich sind für die basolaterale Virusfreisetzung. Die Daten unterstützen die Hypothese, dass das Virus mit Hilfe der Infektion und der bipolaren Virusfreisetzung über Endothelzellbarrieren
N2  - In addition to the known tropism of measles virus (MV) for CD150-positive activated cells of the immune system, its endothelial cell tropism plays an important pathogenic role during acute measles and the following complications. The infection of endothelial cells is associated with the rash. It is also possible that endothelial infection mediates the acute encephalitis and viral entry in the central nervous system in cases of subacute sclerosing panencephalitis (SSPE). The aim of this investigation was to find out, how and if at all MV is able to overcome endothelial barriers via transport of infected leukocytes or infection of endothelial cells with basolateral virus release. We analysed if the capacity of primary human T cells to transmigrate through “human brain microvascular endothelial cells” (HBMECs) is influenced by the infection. The capacity of infected lymphocytes to migrated through filter pores was partially reduced but the results were statistacally not significant. In contrast the capacity to migrate through endothelial barriers was drastically reduced. The attachment of PBMCs to the endothelial monolayer was increased once the cells were infected. During this attachment normal so called “transmigratory cups” or docking-structures were formed, although the leukocytes were infected. As a consequence of this close cell-cell-contact the MV-infection was transferred to the endothelial cells. The MV envelope proteins were expressed on the apical and basolateral side as could be shown on pictures taken with the confocal microscope. Titrations showed that the virus was released on both sides of the cells. Moreover it could be demonstrated, that tyrosine-based sorting signals were responsible for basolateral virus release from polarized endothelial cells. These data support the hypothesis, that the virus can cross endothelial barriers by infection of the endothelium and by bipolar virus release.
KW  - Masernvirus
KW  - Encephalitis
KW  - Blut-Hirn-Schranke
KW  - Integrine
KW  - Lymphozyt
KW  - Zelladhäsion
KW  - measles virus
KW  - Encephalitis
KW  - Blood Brain Barrier
KW  - Integrine
KW  - Lymphocytes
KW  - cell adhesion
Y1  - 2008
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-35050
ER  - 
TY  - THES
A1  - Hoffmann, Tanja
T1  - Herstellung und Charakterisierung von Antikörpern gegen das Prion-Protein mit inhibitorischer Wirkung auf die Prionreplikation in Zellkultur
T1  - Generation and characterization of anti-PrP antibodies with inhibitory effect on prion replication in cell culture
N2  - Der Verlauf von Prionenerkrankungen wird durch die Akkumulation einer abnormal gefalteten Isoform des zellulären Prion-Proteins PrPC bestimmt. Diese infektiöse Isoform, die PrPSc genannt wird, entsteht, indem sie mit PrPC interagiert und dieses die Konformation von PrPSc übernimmt. Die Konversion des zellulären Prion-Proteins PrPC in seine pathogene Isoform PrPSc und die damit verbundene PrPSc-Akkumulation sind demnach die wesentlichen Merkmale von Prionenerkrankungen und bieten mögliche therapeutische Ansatzpunkte. Studien aus den letzten Jahren haben gezeigt, dass Antikörper, die gegen PrPC und/oder PrPSc gerichtet sind, in vitro und in vivo in den Konversionsprozess eingreifen können und so die PrPSc-Akkumulation inhibieren (Enari et al., 2001; Feraudet et al., 2005b; Kim et al., 2004; Miyamoto et al., 2005; Pankiewicz et al., 2006; White et al., 2003). Das Ziel der vorliegenden Arbeit war somit die Generation neuer Anti-PrP-Antikörper, welche die PrPSc-Konversion effizient hemmen können und somit die Auswahl an Anti-PrP-Antikörpern für therapeutische und diagnostische Zwecke zu erweitern. Insgesamt wurden sieben Anti-PrP-Antikörper mittels „Hybridom“-Technik hergestellt. Zwei der Antikörper (B2-31-166 und B2-43-133) resultierten aus einer Fusion mit Milzzellen von Prnp0/0-Mäusen, die zuvor mit fibrillärem PrP immunisiert wurden. Bei fünf Antikörpern (7-12-5, 12-29, 48-11-5, 103-8 und 110-10) wurde für die Immunisierung rekombinantes PrP verwendet. Alle Antikörper detektierten rekombinantes PrP sowie natives und denaturiertes PrPC und PrPSc. Die bestimmten Aviditäten und die relativ einheitlichen Dissoziationskonstanten (KD-Konstante) waren mit kommerziellen Referenzantikörpern vergleichbar. Das Epitop des Antikörpers B2-31-166 wurde im unstrukturierten N-Terminus von PrP lokalisiert (Reste 96-110), während die Antikörper 7-12-5, 12-29 und 48-11-5 PrP im globulären C-Terminus binden (Reste 158-176). Das Epitop der Antikörper 103-8, 110-10 und B2-43-133 wurde ebenfalls im C-Terminus bestimmt (Reste 142-157). Diese Antikörper binden PrP im Bereich der Helix 1 (Reste 144-152), einem Epitop, das bereits häufiger für inhibitorisch wirksame Antikörper bestimmt wurde. Drei der sieben Anti-PrP-Antikörper (7-12-5, 12-29 und B2-31-166) hemmten die PrPSc-Akkumulation in Prion-infizierten N2a-Zellen (ScN2a-Zellen) nicht. Der Antikörper 48-11-5 führte zu einer unvollständigen Reduktion des PrPSc-Gehalts, die sich auch durch die Verlängerung des Applikationszeitraums nicht verstärken ließ. Dagegen inhibierten die Antikörper 103-8, 110-10 und B2-43-133 die PrPSc-Akkumulation vollständig. Dieser Effekt wurde auf eine spezifische Interaktion der Antikörper mit PrP zurückgeführt, da ein zytotoxischer Effekt, der den PrPSc-Gehalt unspezifisch hätte verringern können, nicht beobachtet wurde. Bei der Analyse der Infektiosität von ScN2a-Zellen zeigte sich jedoch, dass der Antikörper 110-10 zwar die PrPSc-Akkumulation inhibierte, aber die Infektiosität der Zellen nicht reduzieren konnte. Die Behandlung mit dem Antikörper 103-8 reduzierte die Infektiosität der ScN2a-Zellen zwar, jedoch setzte 30 Tage nach Abschluss der Behandlung eine erneute PrPSc-Akkumulation in ScN2a-Zellen ein. Dagegen reduzierte die Behandlung mit dem Antikörper B2-43-133 die Infektiosität der ScN2a-Zellen vollständig. Des Weiteren wurde bei diesen Zellen auch nach 36 Tagen Kultivierung ohne Antikörper keine erneute PrPSc-Akkumulation detektiert. Die starke inhibitorische Wirkung dieses Antikörpers wird zusätzlich durch einen sehr niedrigen IC50-Wert (0,31 nM) unterstützt, der mit kommerziellen Referenzantikörpern vergleichbar ist. Zusammenfassend sprechen diese Ergebnisse dafür, dass von den sieben neu generierten Anti-PrP-Antikörpern der Antikörper B2-43-133 ein Kandidat für weiterführende Experimente mit therapeutischem Hintergrund ist. Welchen Mechanismus die Anti-PrP-Antikörper für die Inhibition nutzen, konnte nicht geklärt werden. Obwohl der Antikörper B2-43-133 die Verweildauer von PrPC auf der Zelloberfläche (Retention) verlängerte, wodurch hypothetisch die gebundenen PrPC-Moleküle der PrPSc-Konversion entzogen werden können, wurde dies für einen Referenzantikörper, welcher einen ähnlichen inhibitorischen Effekt besitzt, nicht beobachtet. Dies spricht entweder dafür, dass die Verlängerung der Retention nur ein weiteres Charakteristikum der Antikörper ist und ein anderer Mechanismus genutzt wird, oder dafür, dass verschiedene Antikörper verschiedene Mechanismen nutzen können. Auch die Hypothese, dass die inhibitorische Wirkung des Antikörpers durch eine Komplexbildung mit PrP vermittelt wird, konnte nicht bestätigt werden, da eine stabile Komplexbildung des Antikörpers B2-43-133 mit rekombinantem PrP zu einer Erhöhung des IC50-Werts im Vergleich zu freiem Antikörper führte.
N2  - The development of prion diseases is characterized by accumulation of an abnormal folded isoform of the cellular prion protein (PrPC). This infectious isoform, called PrPSc, emerges through interaction with PrPC adopting the conformation of PrPSc. Thus, conversion of PrPC to its pathogenic isoform and the resulting PrPSc accumulation are substantial hallmarks of prion diseases that provide possible therapeutical intervention points. Recent studies have shown that antibodies recognizing PrPC and/or PrPSc interfere with the conversion process in vitro and in vivo and inhibit PrPSc accumulation (Enari et al., 2001; Feraudet et al., 2005b; Kim et al., 2004; Miyamoto et al., 2005; Pankiewicz et al., 2006; White et al., 2003). This study was initiated to generate new anti-PrP antibodies that could efficiently inhibit the PrPSc conversion and thereby extend the repertoire of monoclonal antibodies (mAbs) for therapeutic and diagnostic use. Altogether, seven antibodies could be established by hybridoma-technique: two mAbs from immunisation of Prnp0/0 mice with fibrillar PrP (B2-31-166 and B2-43-133) and the remainder (7-12-5, 12-29, 48-11-5, 103-8 und 110-10) by using recombinant PrP as immunogen. All antibodies were able to detect recombinant PrP as well as native and denaturated PrPC and PrPSc. The avidities and similar dissociation constants were comparable to commercial reference antibodies. The epitope of mAb B2-31-166 was determined in the unstructured N-terminal domain (residues 96-110), whereas mAbs 7-12-5, 12-29 and 48-115 detected an epitope in the C-terminal globular domain (residues 158-176). The epitopes of mAbs 103-8, 110-10 and B2-43-133 are located in the C-terminus (residues 142-157) as well and correspond to the -helix 1 of PrPC (residues 144-152). This region was already determined as a potential epitope for other inhibitory effective antibodies. Three antibodies (7-12-5, 12-29 and B2-31-166) did not inhibit PrPSc accumulation in prion-infected cells (ScN2a cells). MAb 48-11-5 only led to an incomplete reduction of the PrPSc content. This effect could not be strengthened through extending the treatment period. In contrast, mAbs 103-8, 110-10 and B2-43-133 were able to completely inhibit the PrPSc accumulation in ScN2a cells. This effect was attributed to a specific interaction between antibodies and PrP as no cytotoxic effect was detectable that could lead to an unspecific reduction of the PrPSc content. Interestingly, analysis of the infectivity of antibody-treated ScN2a cells showed that mAb 110-10 was indeed able to inhibit PrPSc accumulation, although it did not affect the infectivity of ScN2a cells. MAb 103-8 reduced the infectivity level, but new PrPSc accumulation could be detected in ScN2a cells 30 days after the treatment had been finished. Only treatment with mAb B2-43-133 completely eliminated the infectivity of ScN2a cells and no PrPSc could be detected in ScN2a cells even 36 days after treatment. The strong inhibitory effect of this antibody is supported by a very low IC50 value (0,31 nM) which is also comparable with commercial anti-PrP antibodies. In summary, these results indicate that anti-PrP antibody B2-43-133 represents a good candidate for future immunotherapeutic approaches. Furthermore, it was impossible to clearly identify the underlying mechanisms of the antibodies for the inhibition of PrPSc accumulation. Although mAb B2-43-133 prolonged the retention of PrPC on the cell surface, whereby the bound PrPC molecules could hypothetical withdraw the PrPSc conversion, this could not be observed for commercial antibodies with similar inhibitory effect. These data imply that the prolongation of the PrP retention is only one feature of mAb B2-43-133. However, it is possible that different antibodies use different mechanisms to inhibit PrPSc conversion and that the retention is one of them. In addition, the inhibition of PrPSc accumulation is probably not mediated by the formation of an antibody-protein complex since the treatment of ScN2a cells with a stable complex consisting of B2-43-133 and recombinant PrP complex decreased the inhibitory effect compared to free antibody.
KW  - Monoklonaler Antikörper
KW  - Prionprotein
KW  - ScN2a Zellen
KW  - Immunisierung
KW  - Scrapie
KW  - Behandlung
KW  - monoclonal antibodies
KW  - prion protein
KW  - scrapie
KW  - treatment
KW  - ScN2a cells
Y1  - 2008
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-33998
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TY  - THES
A1  - Kretzschmar, Benedikt
T1  - AZT-Resistenz bei Foamyviren
T1  - AZT-resistant foamyvirus
N2  - Azidothymidin (AZT) ist ein nukleosidischer Reverse-Transkriptase-Inhibitor (NRTI), der bei HIV-Infektionen in Kombination mit anderen antiretroviralen Substanzen eingesetzt wird. AZT zeigt darüberhinaus auch eine gute Wirksamkeit gegen Foamyviren, eine Subfamilie der Retroviren mit charakteristischen Besonderheiten in ihrer Molekularbiologie und ihrem Replikationszyklus, deren Vertreter verschiedene Affenarten und andere Säugetiere infizieren, wobei sie sich sowohl im jeweils natürlichen Wirt als auch bei seltener zufälliger Infektion des Menschen apathogen zeigen. In der vorliegenden Arbeit wurde das AZT-resistente Foamyvirus SFVmacAZTres untersucht, das in Anwesenheit steigender AZT-Konzentrationen in Zellkultur selektiert worden war. Hierzu wurde SFVmacAZTres zunächst einer genotypischen Analyse unterzogen, wobei im Vergleich mit der wildtypischen Ausgangssequenz zwei Mutationen in gag und vier Mutationen in pol nachgewiesen wurden, die zu Änderungen auf Aminosäureebene führten. Mittels PCR wurden Fragmente, die alle sechs Mutationen oder nur die vier pol-Mutationen enthielten, aus der Sequenz von SFVmacAZTres amplifiziert und jeweils in einen SFVmac-Klon eingefügt. Im weiteren Verlauf zeigte sich dabei kein Unterschied zwischen diesen beiden Konstrukten bezüglich der Replikation in Abwesenheit oder Anwesenheit von AZT, so dass gefolgert werden konnte, dass die gag-Mutationen keinen Beitrag zur AZT-Resistenz leisten. Die pol-Mutationen befanden sich sämtlich im für die Reverse Transkriptase kodierenden Bereich und führten zu den Aminosäuresubstitutionen K211I, I224T, S345T und E350K. An Position 224 fand sich dabei in einer veröffentlichten Sequenz bereits ein Threonin, so dass hier unabhängig von der Selektion in Anwesenheit von AZT möglicherweise ein Polymorphismus vorliegt. Der Vergleich der vier Mutationen der RT von SFVmacAZTres mit den bei HIV bekannten Mustern an Mutationen wie den TAMs und dem Q151M-Komplex zeigte keine Übereinstimmungen. Um den jeweiligen Beitrag der vier nachgewiesenen pol-Mutationen zur AZT-Resistenz zu untersuchen, wurden sie einzeln und in Kombinationen mittels zielgerichteter Mutagenese in einen SFVmac-Klon eingefügt und die entsprechenden Konstrukte auf ihre Replikation in Abwesenheit und Anwesenheit von 0,5 µM, 5µM und 50 µM AZT untersucht. Hierfür wurden 293T-Zellen mit dem jeweiligen Plasmid transfiziert und nach Überprüfung der gleichmäßigen Expression von Gag und Pol mittels Western Blot der virushaltige Überstand auf Zielzellen gegeben und der Titer ausgezählt. Es konnte gezeigt werden, dass keines der Konstrukte mit Einzel , Doppel- und Dreifachmutationen eine ähnlich ausgeprägte AZT-Resistenz wie die Vierfachmutante aufwies, allerdings einige in unterschiedlichen Ausmaß teilresistent waren, während andere weder ohne noch mit AZT gut replizierten. S345T erwies sich vor E350K als die Mutation mit dem größten Beitrag zur AZT-Resistenz, I224T erhöhte den Titer in Abwesenheit und Anwesenheit um etwa den gleichen Faktor, wohingegen sich K211I in den meisten Kombinationen eher negativ auswirkte. Der Klon, in den alle vier Mutationen mittels zielgerichteter Mutagenese eingeführt worden waren, zeigte die gleiche AZT-Resistenz wie das in Zellkultur selektierte Virus. Damit war gezeigt, dass diese vier Mutationen sowohl notwendig als auch hinreichend für die AZT-Resistenz von SFVmacAZTres sind. Die pol-Mutationen von SFVmacAZTres wurden weiterhin soweit möglich an entsprechenden Stellen in Klon des prototypischen Foamyvirus PFV eingeführt, bei dem es zuvor nicht gelungen war, ein resistentes Isolat in Zellkultur zu generieren. Das PFV-Konstrukt mit den Mutationen aus SFVmacAZTres zeigte sich jedoch nicht AZT-resistent, sondern wies einen Replikationsdefekt auf. Einige HIV-Mutationen, die in den PFV-Klon eingefügt wurden, führten ebenfalls zu keiner AZT-Resistenz. Es bestehen also bezüglich AZT-Resistenz und damit gewisser Eigenschaften der Reversen Transkriptase deutliche Unterschiede zwischen PFV und SFVmac. Die durchgeführten Arbeiten stellen die Grundlage für weitere Untersuchungen dar, in denen beispielsweise dem biochemischen Mechanismus der AZT-Resistenz von SFVmacAZTres nachgegangen werden kann. Die gewonnenen Erkenntnisse können zum Verständnis allgemeiner Mechanismen der NRTI-Resistenz bei Retroviren ebenso beitragen wie zur weiteren Charakterisierung der foamyviralen Reversen Transkriptase an sich.
N2  - Zidovudine or azidothymidine (AZT) is a nucleoside analog reverse transcriptase inhibitor (NRTI) which is used together with other substances for therapy of HIV infections. AZT can also be used to suppress foamy virus replication, a subfamily of retroviruses with distinct molecular biology and replication. AZT resistant foamy virus (SFVmacAZTres) which was generated in cell culture in presence of increasing AZT concentrations was analyzed in this study. First, a genotypic analysis was conducted, which showed 2 mutations in gag and 4 mutations in pol of this resistant virus when compared to the wildtype sequence. Infectious clones harbouring all 6 mutations or only the pol-mutations were constructed by amplifying the corresponding sequence of the resistant virus and cloning them into the wildtype sequence. There was no difference regarding virus replication in absence or presence of AZT between the virus with gag- and pol-mutations and the virus only harbouring the pol-mutations. Using site directed mutagenesis, the four pol mutations, namely K211I, I224T, S345T and E350K and double and triple combinations thereof were inserted into the infectious clone of SFVmac. These mutants, as well as the wildtype clone and the clone with all 4 mutations were compared in absence of AZT and at AZT concentrations of 0,5, 5, and 50 µM, using these concentrations in the virusproducing 293T-cell as well as in the target cells, BHKLTRlacZ. By counting of blue, and thereby, virus infected cells, it was demonstrated that no single, double or triple mutant displayed the same AZT resistance as the original resistant virus with all 4 mutations. Some combinations displayed deleterious effects, others partial resistance. S345T was identified as the most important mutation regarding AZT-resistance, while E350K and K211I only showed effects in combinations with other mutations and at high AZT concentrations. I224T raised the viral titre, which is reduced in absence of AZT by the other mutations, in absence or presence of AZT by the same factor. The mutations identified in SFVmac were also cloned in PFV. However, a AZT resistant PFV could not be generated.
KW  - Spumaviren
KW  - Reverse Transkriptase
KW  - Zidovudin
KW  - Resistenz
KW  - SFVmac
KW  - azidothymidine
KW  - foamy virus
KW  - reverse transcriptase
KW  - resistance
KW  - SFVmac
Y1  - 2008
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-30272
ER  - 
TY  - THES
A1  - Gärtner, Kathleen
T1  - Abschätzung der Genauigkeit der foamyviralen Genomreplikation
T1  - Accuracy estimation of foamy virus genome copying
N2  - Foamyviren (FVs) sind die genetisch stabilsten Viren der Retrovirus-Familie. Dies steht im Gegensatz zur Fehlerrate, die für die rekombinante FV Reverse Transkriptase (RT) gefunden wurde. Um die Genauigkeit der FV Genomreplikation in vivo zu ermitteln, analysierten wir das Auftreten von Mutationen nach FV-Vektortransfer in einer einzigen Replikationsrunde. Die Sequenzanalyse von mehr als 90000 Nukleotiden ergab 39 Mutationen. Dies entspricht einer Fehlerrate von ungefähr 4 x 10-4 pro Base und Replikationszyklus, wobei alle Mutationen Transitionen von G zu A waren. Eine schwache Expression von APOBEC-Enzymen in den vektorproduzierenden Zellen konnte als wahrscheinlichste Ursache für diesen Typ an Mutationen nachgewiesen werden. Das akzessorische FV Bet Protein wirkt APOBEC entgegen. Kotransfektion von Zellen mit einem bet-Expressionsplasmid resultierte in einer signifikanten Reduktion an Mutationen bei über 170000 zusätzlich sequenzierten Basen. Zwei Mutationen konnten nicht der APOBEC-Aktivität zugeschrieben werden, deshalb postulieren wir eine idealisierte FV-Mutationsrate von angenähert 7,5 x 10-6 pro Base und Replikationszyklus. Im Gegensatz zu in vitro-Analysen wurde nur eine einzige Deletion und keine Insertion bei mehr als 260000 sequenzierten Basen identifiziert. Die Analyse der Rekombinationsrate von FV-Vektorgenomen ergab mehr als ein zusätzliches Template-Switching-Ereignis pro reverser Transkription. Wir konnten auch zeigen, dass ein bestimmtes FV-Partikel in der Lage zum Crosstransfer eines heterologen FV-Genoms ist, jedoch mit einer reduzierten Effizienz als bei Verwendung des homologen Vektors. Zusammenfassend zeigen unsere Ergebnisse einerseits, dass das Kopieren des FV-Genoms mit höherer Genauigkeit geschieht als bisher angenommen, auf der anderen Seite ist Rekombination bei FV-Genomen wahrscheinlich.
N2  - Foamy viruses (FVs) are the genetically most stable viruses of the retrovirus family. This contrasts to the error rate found for recombinant FV reverse transcriptase (RT). To investigate the accuracy of FV genome copying in vivo we analyzed the occurrence of mutations after a single round of FV vector transfer. Sequence analysis of more than 90,000 nts revealed 39 mutations. This corresponds to an error rate of approx. 4 x 10-4 per site and replication cycle. All mutations were transitions from G to A. A residual expression of APOBEC enzymes in vector producer cells was found to be likely responsible for this type of mutation. The accessory FV Bet protein is implicated to counteract APOBEC. Cotransfection of cells with a bet expression plasmid resulted in a significant drop of mutations among over 170,000 additional sequenced bases. Since two mutations were not correlated to APOBEC activity, we postulate an idealized FV mutation rate of close to 7.5 x 10-6 per site and replication cycle. In contrast to in vitro studies only one deletion and no insertion was identified among the more than 260,000 sequenced bases. Analysis of the recombination frequency of FV vector genomes revealed more than one additional template-switching event per reverse transcription. We also show that a given FV particle is able to cross-transfer a heterologous FV genome, although at reduced efficiency than the homologous vector. Taken together, our results indicate that FV genome copying is of higher accuracy than thought previously. On the other hand recombination among FV genomes appears to be likely.
KW  - Retroviren
KW  - Spumaviren
KW  - Reverse Transkriptase
KW  - Mutationsrate
KW  - Template Switching
KW  - Retroviruses
KW  - Spumaviruses
KW  - reverse transcriptase
KW  - mutationrate
KW  - template switching
Y1  - 2008
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-29252
ER  - 
TY  - THES
A1  - Vu Xuan, Nghia
T1  - Generation of tools to investigate Chikungunya virus
T1  - Entwicklung von Methoden zum Chikungunya-Nachweis
N2  - CHIKV is the prototype of Alphaviruses and it causes an acute febrile illness with rash, severely painful arthralgias, and sometimes arthritis. While CHIKV has first been identified in the 1950s in Africa, recent outbreaks of CHIKV in the islands of the Indian Ocean and particular in Italia have re-drawn attention to CHIKV. In the past CHIKV disease was considered self-limiting and non-fatal. However, a number of deaths on Reunion (Anonym, 2006) during the outbreak, which was affected directly or indirectly by CHIKV, have changed this view. To defeat CHIKV outbreaks diagnostic tools and anti CHIKV therapies are urgently needed. In this thesis, we generated tools to investigate CHIKV at the molecular level by serological tests. CHIKV was isolated from a German woman who was infected during her holidays on the Mauritius Island. To characterize this viral isolate the complete viral genome was amplified by PCR and molecular cloned. In order to analyse antibody responses of infected individuals some of the structural and non-structural genes were subcloned in bacterial expression vectors. The NSP2, proteinase, capsid, E1 and E2 were subsequently expressed in E.coli using purified successfully. In this thesis, the structural proteins were used to develop a screening test for anti-CHIKV antibodies in patient derived serum samples. These tests were evaluated with pre-characterized anti-CHIKV sera (30 samples) obtained from the BNI Hamburg and 100 serum samples from German blood donors used as negative controls. Immunoblotting analysis revealed that up to 77% of precharacterised positive sera could recognize the recombinant proteins and there were no detectable reactivity of CHIKV-negative German donor sera. The recombinant proteins were also recognized by 71.4% of positive sera in the newly established ELISA. In order to go further in analyses of the results, an in house IFA was performed. Positive sera (21 samples) were used. The results showed that all of them reacted positive, but this assay was less sensitive than the IFA from BNI. In comparison with the IFA result from BNI Hamburg, the results were not congruent in all test performed. This could be due to various drawbacks of the tests. A cross reaction in Alphaviruses and the different strains are mentioned as well as the denatured forms of the structural proteins. Besides the main structural proteins (E1, E2 and C), other proteins such as non-structural proteins, uncleaved precursor proteins could participate in the different outcomes of serological assays. In order to go further in the CHIKV diagnoses, the CHIKV recombinant proteins were applied to screen the anti-CHIKV antibodies in the Vietnamese population, who are considered to live in the high risk regions. In serological tests, 158 sera of Vietnamese donors were incubated with the recombinant proteins or the fixed CHIKV infected cells. The results showed that 24% of Vietnamese donor sera recognized the recombinant proteins in immunoblot assay, while 36% scored positive in the ELISA assay. In IFA, the sera considered positive were 11.4%. While some discrepancies in serological tests were found, these results showed that the ratio of CHIKV-positive sera seem to be equal to the other regions in the world, which are affected by CHIKV. It is suggested that CHIKV infection in Vietnam has been repeatedly misdiagnosed. This study cohort consisted only of samples originating from Hanoi area of Northern Vietnam, thus, future studies should expand to include samples from other Vietnam areas. To do this the various subtypes of the virus in the different regions should be isolated and the sequences of these viruses should be well characterized.
KW  - Viren
KW  - Enzyme-linked immunosorbent assay
KW  - Vietnam
KW  - RNS-Viren
KW  - chikungunya virus
KW  - Diagnostik
KW  - chikungunya virus
KW  - diagnostic
Y1  - 2008
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-28993
ER  - 
TY  - THES
A1  - Bahlo, Angela
T1  - Immunisierungsstrategien gegen Prionenerkrankungen und Untersuchungen zur Prionen-induzierten Neurodegeneration
T1  - Immunization strategies to prevent prion diseases and mechanisms of prion-induced neurodegeneration
N2  - Prionenerkrankungen oder Transmissible Spongiforme Enzephalopathien (TSEs) sind übertragbare Krankheiten, zu denen die Creutzfeldt-Jakob-Krankheit (CJD) beim Menschen, Scrapie bei Schafen und die Bovine Spongiforme Enzephalopathie (BSE) bei Rindern gehören. Der infektiöse Erreger (PrPSc) besteht dabei aus einer abnormalen Form des zellulären Prion-Proteins (PrPC) und unterscheidet sich von dieser nur in der Proteinstruktur. Ein Hauptproblem bei der Entwicklung von aktiven Immunisierungsstrategien gegen Prionenerkrankungen besteht in der fehlenden Reaktion des Immunsystems auf das ubiquitär exprimierte Selbst-Antigen PrPC, welche auf einer Immuntoleranz gegen das körpereigene Protein beruht. In dieser Arbeit wurde ein transgenes Mausmodell für aktive Immunisierungsexperimente verwendet. Diese transgenen Tiere exprimieren Hamster-PrPC (HaPrP) unter der Kontrolle des Neuronen-spezifischen Enolase-Promotors (NSE) ausschließlich im Nervensystem auf einem Prnpo/o-Hintergrund. Durch die Verwendung eines „artfremden“ Proteins (rekombinantes Maus-PrP) gegen endogenes Hamster-PrP als Vakzine sollte die Immunogenität des Proteins verstärkt werden. Zusätzlich wurde für die Immunisierungen ein Fusionsprotein aus Maus-PrP und einem T-Helferepitop des Tetanustoxins (P30) eingesetzt. Als Adjuvanz diente das bakterielle DNA-Motiv CpG-1826, welches die Fähigkeit besitzt T-und B-Lymphozyten direkt zu stimulieren und die Sekretion von Interleukinen zu induzieren. Die Immunisierungen erfolgten subkutan und wurden monatlich durchgeführt. Nach jedem Boost wurden die Blutseren auf Antikörper sowohl gegen Maus-PrP als auch gegen Hamster-PrP untersucht. Neben der Analyse der humoralen Immunantwort mittels ELISA, Westernblot und FACS, wurden die Seren der immunisierten Mäuse auf ihre Fähigkeit getestet, die Prionenreplikation in vitro zu inhibieren. Mit der gewählten Immunisierungsstrategie war es mit beiden Proteinen möglich, hohe Antikörperantworten sowohl gegen Maus- als auch gegen Hamster-Prion-Protein zu induzieren. In Zellkultur waren die Seren in der Lage, signifikant den PrPSc-Gehalt zu reduzieren. Die immunisierten Mäuse wurden mit Hamsterprionen infiziert, um den Einfluss der induzierten Antikörper auf den Verlauf der Krankheit zu untersuchen. Nach Immunisierung mit PrP-P30 zeigten die Mäuse gegenüber mit Ovalbumin-behandelten Kontrolltiere eine signifikant verlängerte Inkubationszeit von ca. 30%. Im Gegensatz dazu konnte nach Immunisierung mit PrP ohne das zusätzliche T-Helferepitop keine Verlängerung in den Inkubationszeiten beobachtet werden. Abschließend wurde die Immunantwort in den immunisierten Tieren auf zellulärer Ebene mittels Proliferationsanalyse von T-und B-Lymphozyten untersucht. Dafür wurden Lymphozyten aus Milz und Lymphknoten der immunisierten NSEHa-Prnpo/o_Mäusen isoliert, ex vivo mit Maus-PrP bzw. Hamster-PrP stimuliert und auf die Proliferation von CD4-positiven oder CD8-positiven T-Lymphozyten untersucht. Durch die Analyse wurde gezeigt, dass es nach Immunisierung mit rek.PrP oder PrP-P30 zu keiner spezifischen Proliferation von T-Lymphozyten kam. Die beobachtete humorale Immunantwort scheint also unabhängig von einer spezifischen T-Zell-Immunantwort zu wirken. Die vorliegenden Ergebnisse zeigen, dass es möglich ist, durch die Wahl von geeigneten Immunisierungsstrategien, die Toleranz gegen das Selbstprotein PrP zu brechen. Sie stellen eine Grundlage für weitere Forschungsansätze dar, um prophylaktische Immunisierungen gegen Prionenerkrankungen in Zukunft zu realisieren. In einem weiteren Teil der Arbeit wurde die Funktion der apoptotischen Faktoren BAX und BCL-2 in der Prionen-induzierten Neurodegeneration in vivo untersucht. Dazu wurde neuroektodermales Gewebe aus BAX-/- und BCL-2-/- -Embryonen in das Gehirn von PrP-Knockout-Mäusen (Prnpo/o) transplantiert. Diese PrPC-defizienten Tiere sind nicht mit Prionen infizierbar und können PrPSc nicht propagieren. Nach Langzeitinfektion mit Mausprionen wurden die Transplantate histochemisch auf Prionenpathologie untersucht. Die typischen neuropathologischen Veränderungen waren dabei strikt auf das PrPC-positive Transplantat begrenzt. Zusätzlich wurden die Transplantate auf apoptotische Veränderungen untersucht und dabei TUNEL-Färbungen und aktivierte-Caspase-3 Färbungen durchgeführt. Es zeigten sich hierbei hinsichtlich Ausprägung und Stärke der Pathologie keine Unterschiede zwischen den BAX-bzw. BCL-2-Knockout Transplantaten und wildtypischen Transplantaten. Daraus konnte gefolgert werden, dass in diesem Modell weder BAX noch BCL-2 eine signifikante Rolle bei der Prionenpathogenese spielen. Die Ergebnisse aus diesem Teil der Arbeit leisten einen wichtigen Beitrag für das bessere Verständnis der durch Prionen-induzierten Neurodegeneration und sind für die Entwicklung von potentiellen therapeutischen Strategien hilfreich.
N2  - Transmissible spongiform encephalopathies (TSEs) are a group of fatal neurodegenerative disorders that affect animals as well as humans (Prusiner, 1997). The most prominent are Creutzfeldt-Jacob disease (CJD) in humans, bovine spongiform encephalopathy (BSE) in cattle, scrapie in sheep and goats and chronic wasting disease (CWD) in cervids. These diseases are characterized by the conversion of the cellular prion protein (PrPC) into the abnormally folded isoform termed PrPSc, which accumulates and represents the major component of infectious prions (Aguzzi and Polymenidou, 2004). The development of an effective PrP vaccine has been hampered by immunotolerance to the ubiquitously expressed endogenous PrPC and the immunization with recombinant PrP led only to weak antibody-responses against the protein in wildtype mice. Here, we tried to circumvent this problem experimentally by generation of anti-PrP immunity in hamster transgenic mice. These mice (NSEHa-Prnpo/o) express Hamster-PrP under the control of the neuron-specific enolase Promotor (NSE) exclusively in the nervous system on a Prnpo/o background (Race et al., 1995). To further enhance the immunogenic feature of the mouse Prion-Protein, we fused a T-Helper epitope of the tetanus toxin (P30) to the C-terminal end of the protein (Panina-Bordignon et al., 1989). This epitope has been successfully in the development of several anti-tumour vaccines (Hertz et al., 2001; Steinaa et al., 2008). For the immunization the recombinant mouse Prion-Protein (PrP) as well as the fusion construct, called PrP-P30, was used. The bacterial DNA-Motif CpG-1826 was co-injected as an adjuvant, known as a direct stimulator of T-and B-cells and to have the ability to induce the secretion of interleukins (Krieg, 2002). The immunization was performed monthly and the sera were analysed after every boost for the presence of antibodies against Mouse- and Hamster-PrP. Beside the analysis of the humoral response via ELISA, Westernblot and FACS, the sera of the immunized mice were tested for their ability to inhibit prion replication in vitro. With the selected immunization strategy it was possible to induce a high antibody response both against Mouse-PrP as well as against Hamster-PrP. In the cell culture assay with prion-infected cells a significant decrease of the PrPSc level was observed. Furthermore the immunized animals were inoculated with Hamster prions to assess the efficiency of the induced antibodies to prolong the incubation time of the disease. With the introduction of the T-Helper epitope P30 it was possible to prolong the survival time of the treated animals about 30%, in comparison to the animals receiving only PrP without P30 or control animals, which were treated with Ovalbumin, respectively. A second group of transgenic mice was immunized to investigate the cellular immune response by proliferation assays. Towards this, lymphocytes of spleen and lymph nodes of the immunized animals were isolated and stimulated ex vivo with either mouse- or hamster-PrP. This analysis showed that the induced humoral immune response was independent of T-cells, because no specific proliferation of neither CD4- nor CD8-positive T-cells could be observed. In conclusion, the results clearly demonstrate that the possibility to break the self-tolerance against PrP by using appropriate vaccination strategies. It therefore might open a new avenue for the future development of prophylactic prion vaccines. In a second part of the work, the role of BAX and BCL-2 in prion-mediated neurodegeneration was characterized in vivo. BAX- and BCL-2- deficient neuroectodermal tissue was transplanted into the brain of Prnpo/o recipient mice. Mice devoid of PrPC (Prnpo/o) are resistant to prions and do not propagate the infectious agent (Bueler et al., 1993). After long-term infection with mouse scrapie prions, typical histopathological features of the disease, such as gliosis, spongiosis and PrPSc accumulation were examined with histochemical techniques in the engrafted brains and the pathological changes were restricted to the PrPC-expressing neurografts. Furthermore we perform TUNEL and active-Caspase 3 stainings for determination and detection of apoptotic changes in the neurografts. Regarding the strength and characteristics of prion pathology no differences were seen between BAX- and BCL-2-Knockout grafts in comparison to the wildtype tissue. In summary, these results demonstrate that neither BAX nor BCL-2, two major players of apoptosis, are necessary for prion-induced neurodegeneration. These results therefore contribute to a better understanding of the pathogenic mechanisms in prion diseases and are useful for the development of future therapeutical strategies.
KW  - Impfung
KW  - Apoptosis
KW  - Immuntoleranz
KW  - Prionen
KW  - Immunisierung
KW  - Neurografts
KW  - prions
KW  - immunization
KW  - tolerance
KW  - neurografts
KW  - apoptosis
Y1  - 2008
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-28443
ER  - 
TY  - THES
A1  - Shishkova, Yoana
T1  - Investigations of Measles virus regulation on activation and function of antigen presenting cells
T1  - Untersuchungen zur Regulation der Aktivierung und Funktion antigen-präsentiernder Zellen durch Masernvirus
N2  - Interaction with dendritic cells (DCs) is considered as central to immunosuppression induced by viruses, including measles virus (MV). Commonly, viral infection of DCs abrogates their ability to promote T cell expansion, yet underlying mechanisms at a cellular level are undefined. It appears that MV-WTF infection modulate DCs morphology and dynamic adhesion on extra cellular matrix proteins such as FN or ICAM-1. By morphological criteria, WTF-DCs resembled LPS-DCs, associated with their mature phenotype also adhered less efficiently to the FN or ICAM-1 support. Reduced adhesion could not be explained by a lack of 1-integrin expression or activation. Similarly, MV-DCs strongly resembled LPS-DCs in that levels of focal adhesion kinase phosphorylated at Y397 were high and not further enhanced upon FN ligation. Fascin, a downstream effector of integrin signaling was highly upregulated in LPS-DCs and moderately in WTF-DCs, and differences in its subcellular distribution were not observed between both cell cultures. Apparently, however, fascin associated less efficiently with PKC in WTF-DCs then in LPS-DCs. In line with findings for murine DCs, high motility of mature human DCs was found to require expression of Rac-GTPases. Human LPS-DCs and more so, DC transfected to express constitutively active Rac1 were the most motile DC-species analysed, confirming that migration of human DC also involved Rac activity. The velocity of WTF-DCs on FN is below that of LPS-DCs, indicating that maturation induced by WTF may be insufficient to completely promote integrin signaling which leads to Rac activation. The organisation of MV-DC/T cell interfaces was consistent with that of functional immune synapses with regard to CD3 clustering, MHC class II surface recruitment and MTOC location. These analyses are based in the selection of stable conjugates. Subsequently, however, neither contacts nor calcium flux can be stabilised and sustained in the majority of MV-DC/T cell conjugates and only promoted abortive T cell activation. Formation of spatially organised IS in T cells requites, prolonged contact durations. Therefore, aberrant distribution patterns of CD3 in these structures, if occurring, are not likely to contribute to the type of contacts predominating for WTF-DC/T cell interactions. It is also likely that transient interactions of less than 2 minutes may if at all, not efficiently support viral transmission to T cells. Transient interactions are typically observed with immature DCs in the absence of antigen, but this is not likely to be relevant in our allogenic system, which includes SA-loaded WTF-DCs. Thus, MV-infected DCs retain activities required for initiating, but not sustaining T cell conjugation and activation. This is partially rescued if surface expression of the MV glycoproteins on DCs is abolished by infection with a recombinant MV encoding VSV G protein instead, indicating that these contribute directly to synapse destabilisation and thereby act as effectors of T cell inhibition.
N2  - Die Interaktion mit Dentritischen Zellen (DCs) wird für die Immunsuppression, welche durch Viren einschließlich des Masernvirus (MV) hervorgerufen wird, als ein zentraler Mechanismus angesehen. Für gewöhnlich unterdrücken virale Infektionen von DCs deren Fähigkeit, die T-Zell Expansion zu vermitteln. Dies geschieht durch einen Mechanismus, welcher bisher nicht auf zellulärer Ebene definiert ist. Es scheint, dass eine MV-WTF Infektion die Morphologie der DCs und deren dynamische Adhäsion an extrazellulären Matrixproteinen wie FN oder ICAM-1 moduliert. Unter morphologischen Gesichtspunkten ähneln WTF-DCs den LPS-DCs. Entsprechend ihrem reifen Phänotyp adherieren erstgenannte ebenfalls weniger effektiv unter Einwirkung von FN und ICAM-1. Die reduzierte Adhäsion konnte nicht durch das Fehlen von ß1-Integrin Expression oder Aktivierung erklärt werden. Analog glichen MV-DCs den LPS-DCs in der Hinsicht sehr, dass deren Expressionslevel von Y397 phosphorylierter Fokaler-Adhäsions-Kinase hoch war und durch FN Ligation nicht weiter anstieg. Fascin, ein downstream Effektor des Integrin- Signalwegs, wurde in LPS-DCs stark und in WTF-DCs moderat hochreguliert. Differenzen in der subzellulären Verteilung des Fascin wurden zwischen den beiden Zellkulturen nicht beobachtet. Allerdings assoziierte Fascin in WTF-DCs weniger effizient mit PKCα, als in LPS-DCs. In Übereinstimmung mit Befunden bei murinen DCs wurde herausgefunden, dass eine hohe Motilität reifer humaner DCs die Expression von Rac-GTPasen voraussetzt. Humane LPS-DCs und mehr noch transfizierte DCs, welche konsitutiv aktive Rac1-GTPase exprimieren, waren die mobilsten unter den analysierten DC Typen. Dies bestätigt, dass die Migration humaner DCs unter Anderem von der Rac-Aktivität abhängt. Die Geschwindigkeit von WTF-DCs auf FN ist niedriger, als die von LPS-DCs, was darauf hinweist, dass die durch WTF induzierte Reifung unzureichend sein könnte, um die Integrin-Signalgebung auszulösen, welche zur Rac Aktivierung führt. Die Ausbildung der MV-DC / T-Zell-Verbindungen stimmte mit der einer funktionalen immunologischen Synapse in Hinsicht auf die Formung von CD3 Clustern, die Oberflächenrekrutierung von MHC-II-Molekülen und der MTOC-Lokalisierung überein. Diese Befunde fußen allerdings auf der Selektion stabiler Konjugate. Dagegen konnten bei der Mehrzahl der MV-DC / T-Zell-Konjugate weder Kontakte noch Calcium-Influx stabilisiert und aufrechterhalten und nur eine unvollständige T-Zell-Aktivierung hervorrufen werden. Die Ausbildung räumlich organisierter Synapsen in T-Zellen setzt länger anhaltende Kontakte voraus. Das abweichende Verteilungsmuster von CD3 in diesen Strukturen steuert deshalb, soweit vorhanden, wohl nicht zu der Art von Kontakten bei, welche die WTF-DC / T-Zell-Interaktion dominieren. Es ist außerdem wahrscheinlich, dass transiente Interaktionen von weniger als zwei Minuten die virale Transmission zu T-Zellen, wenn überhaupt, nicht effizient unterstützen. Transiente Interaktionen werden typischer Weise bei unreifen DCs in der Abwesenheit von Antigen beobachtet, doch dies ist wahrscheinlich nicht relevant in dem hier verwendeten allogenen System, welches SA-geladene WTF-DCs verwendet. MV-infizierte DCs besitzen folglich die Eigenschaften, welche für die Initialisierung, aber nicht solche die für die Aufrechterhaltung der T-Zellkonjugation und Aktivierung der T-Zellen nötig sind. Dieses Unvermögen wird teilweise kompensiert, wenn die Oberflächenexpression von MV Glykoproteinen auf DCs durch die Infektion mit rekombinatem MV, welches das VSV G Protein kodiert, verhindert wird. Aus diesem Befund kann man schließen, dass die MV Glykoproteine direkt zur Destabilisierung der Synapse beitragen und deshalb als Effektoren der T-Zell Inhibition agieren.
KW  - Masern
KW  - Dendritische Zelle
KW  - Priming
KW  - Zellkonjugation
KW  - Interaction
KW  - dendritic cells
Y1  - 2008
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-28283
ER  - 
TY  - THES
A1  - Dlaske, Henry
T1  - Funktionelle Analyse der Antigen- und Superantigenpräsentation durch MHC-Klasse-II-Moleküle der LEW-Ratte
T1  - Functional analysis of antigen and superantigen presentation by LEW rat MHC class II molecules
N2  - In der vorliegenden Arbeit wurde die Präsentationsfunktion der LEW-Ratten-MHC-Klasse-II-Moleküle RT1B und RT1D für verschiedene Super- und Peptidantigene sowie die Generierung gemischter MHC-Klasse-II-Isotypen in der LEW-Ratte untersucht. Sag sind Proteine bakterieller und viraler Herkunft und führen nach Bindung an MHC-Klasse-II-Moleküle durch Interaktion mit dem TZR-Vb-Teil zu einer von der TZR-Spezifität unabhängigen Aktivierung von T-Zellen, die bis zu 30 % der Gesamt-T-Zellpopulation eines Organismus erfassen kann. Die dadurch bedingte Mediatorenfreisetzung aus T- oder konsekutiv aktivierten Zellen ist einerseits für die Entwicklung bestimmter akuter Krankheitsbilder wie des toxischen Schocksyndroms, Gastroenteritiden u. a. verantwortlich, kann aber auch potentiell zu einer Aktivierung autoreaktiver T-Zellen und der Entstehung von Autoimmunkrankheiten beitragen. Zur Untersuchung der LEW-MHC-Klasse-II-Charakteristika wurden zunächst mittels retroviralen Gentransfers RT1B- und RT1D-Gene in L929-Zellen übertragen und die Oberflächenexpression durch die mAK Ox6 und 14-4-4S nachgewiesen. Anschließend erfolgte der Nachweis einer Sag-Präsentation durch Stimulation des LEW-Vb8.2-TZH 53/4 durch die bakteriellen Sag SEB, SEC1-3, MAS und YPM und von aus Lymphknoten isolierten LEW-T-Zellen durch SEC1, MAS und YPM, die beide mit der durch eine HLA-DR1-positive Zelllinie getragenen Aktivierung verglichen wurden. Beide Experimente ergaben für die Sag des primär humanpathogen Staph. aureus eine weitaus stärkere Reaktivität in Anwesenheit humaner gegenüber LEW-MHC-Klasse-II-Molekülen bei RT1B-dominierter Antwort innerhalb der präsentatorischen Rattenmoleküle. Für SEB ergaben sich zusätzlich Hinweise auf eine MHC-Klasse-II-unabhängige Aktivierung. Das von Yersinia pseudotuberculosis produzierte Sag YPM wurde ebenfalls wesentlich besser von humanen als LEW-MHC-Klasse-II-Molekülen präsentiert, zeigte allerdings nur geringe Unterschiede zwischen RT1B und RT1D. Für das aus Nagern isolierte Sag von Mykoplasma arthritidis MAS konnte eine präferentielle Bindung an RT1D mit HLA-DR1-ähnlicher Stimulationskapazität nachgewiesen werden. Darüber hinaus wurden die generierten Zelllinien auf Präsentation der definierten Antigene L.casein und gpMBP gegenüber reaktiven TZH getestet. Dabei konnte die RT1D-restringierte Antwort von Klon19 auf L.casein und die RT1B-restringierte Antwort von 53/4 auf gpMBP bestätigt werden. Ebenfalls wurden die erstellten Transfektanten mit einem viralen Sag der Maus, dem vSag7-Gen des mtv7, transfiziert und auf Stimulation des TZH RG17 und von LEW-Lymphozyten getestet. Dabei zeigte sich eine geringe Reaktivität gegenüber den erstellten Transfektanten, die RT1B-dominiert war. Gleichzeitig ergaben sich in der Auswertung Hinweise für einen vSag7-Transfer von MHC-Klasse-II-negativen Produzenten auf MHC-Klasse-II-positive Rattenzellen, die durch weitere Experimente inklusive eines In-vivo-Tests bestätigt werden konnten. In der Generierung gemischter Isotypen aus MHC-Klasse-II-Einzelkettengenen der LEW-Ratte konnte gezeigt werde, dass die Übertragung der RT1DaBb-Genkombination mit Hilfe eines retroviralen Gentransfers auf P80- und L929-Zellen nicht zu einer sicher detektierbaren Oberflächenexpression führte, auch nicht bei Koübertragung der invarianten Kette der Maus. Durch einen Western Blot unter reduzierenden Bedingungen konnte eine bezüglich Molekulargewicht und Quantität zu einem regulären RT1B-Molekül differente RT1Bb-Einzelkette in der Kombination RT1DaBb nachgewiesen werden.
N2  - In the work at hand the presenting function of LEW rat MHC class II molecules RT1B and RT1D for various superantigens and antigens as well as the generation of mixed MHC class II isotypes in the LEW rat have been investigated. Superantigens are proteins of bacterial and viral origin, which lead to a TCR-specificity-independent activation of up to 30 % of the individual's T-cell population by interacting with the Vb part of the T-cell receptor after having bound to an MHC class II molecule. The release of mediators by T- and consecutively activated cells causes on the one hand development of acute diseases like toxic shock syndrome, gastroenteritis and other, but can also potentially activate autoreactive T-cells and lead to autoimmune diseases. In order to examine characteristics of LEW MHC class II molecules, first RT1B and RT1D chain genes were transferred into L929 cells via a retroviral transfection system and surface expression was demonstrated by using the monoclonal antibodies Ox6 and 14-4-4S. Successively, superantigen presentation was verified by stimulation of the LEW Vb8.2+ T-cell hybridoma 53/4 by bacterial superantigens SEB, SEC1-3, MAS and YPM and of LEW T-cells isolated from lymph nodes by SEC1, MAS and YPM. Both results were compared to activation in context of an HLA-DR1+ cell line. Experiments showed a much higher reactivity for the superantigens of human pathogen staph. aureus in presence of human versus LEW MHC class II molecules and an RT1B dominated answer amongst LEW presentatory molecules. Additionally, clues for MHC class II independent activation were found in case of SEB. The superantigen of yersinia pseudotuberculosis YPM was also much better presented by human than LEW MHC class II molecules while showing little differences between RT1B and RT1D. MAS bound preferentially to RT1D and equal stimulative capacity compared to HLA-DR1 could be detected. Accessorily, generated cell lines were analysed for presentation of peptide antigens L.casein and gpMBP towards reactive T-cell hybridomas, in which RT1D-restricted answer of Klon19 to L.casein and RT1B-restricted answer of 53/4 to gpMBP could be confirmed. Also generated cell lines were transfected with a viral mouse superantigen, the vsag7 gene of mtv7, and tested for stimulation of the RG17 T-cell hybridoma and LEW lymphocytes. Low reactivity towards transfected cell lines was detected, which was dominated by RT1B. Additionally, evidence for a transfer of vsag7 from MHC class II- producers to MHC class II+ rat cells could be found, which was enhanced by additional experiments including in vivo testing. Attempting to create mixed isotypes consisting of LEW rat MHC class II chains, it was demonstrated, that transferring the gene combination RT1DaBb via retroviral gene transfer into P80 and L929 cell lines resulted in no certain surface expression, also not under cotransfection of these cells with mouse invariant chain. Using western blot method under reducing conditions, a RT1Bb single chain different to the one of the regular RT1B molecule concerning molecular weight and quantitiy could be detected in the combination RT1DaBb.
KW  - Superantigen
KW  - MHC Klasse II
KW  - MMTV
KW  - HLA-DR
KW  - RT1B
KW  - RT1D
KW  - LEW-Ratte
KW  - Isotyp
KW  - gemischt
KW  - RT1B
KW  - RT1D
KW  - LEW rat
KW  - isotype
KW  - mixed
Y1  - 2008
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-27735
ER  -