TY - THES A1 - Arndt, Petra T1 - Klonierung und funktionelle Charakterisierung von organischen Kationentransportern aus der Rattenniere T1 - Cloning and functional characterization of organic cation transporters from rat kidney N2 - Der organische Kationentransport im proximalen Tubulus der Niere spielt eine wichtige Rolle bei der Aufrechterhaltung der Homöostase der Körperflüssigkeiten und der Ausschleusung von toxischen organischen Kationen. Der Transport von organischen Kationen wird an der Bürstensaummembran durch den H+/organische Kationen-Austauscher vermittelt, während bei dem Transport von organischen Kationen an der basolateralen Membran das nach innen gerichtete negative Membranpotential eine treibende Kraft darstellt. Durch Expressionsklonierung wurde der erste organische Kationentransporter, rOCT1, aus der Rattenniere isoliert. Kurz darauf wurde im Rahmen dieser Arbeit ein zweiter organischer Kationentransporter ebenfalls aus der Ratenniere kloniert. rOCT2 besteht aus 593 Aminosäuren und besitzt 12 putative Transmembrandomänen. Zum funktionellen Vergleich zwischen rOCT1 und rOCT2 wurde das Oozytenexpressionssystem verwendet. In der vorliegenden Arbeit wurde ein pharmakologisches Profil von rOCT2 erstellt. Das Substratsprektrum von rOCT2 ist dem von rOCT1 sehr ähnlich. Die Affinitäten von rOCT2 gegenüber verschiedenen Substanzen wurden direkt mit denen von rOCT1 verglichen. Einerseits fanden wir bei einigen Substraten Unterschiede in den Km- und Vmax-Werten, aber andererseits auch viele Ähnlichkeiten zwischen beiden Transportern. Anionen (z. B. p-Aminohippurat) wurden als neue Gruppe von Inhibitoren für den durch rOCT1- und rOCT2-vermittelten Transport identifiziert. Die Potentialdifferenz ist die treibende Kraft des rOCT1- und rOCT2-vermittelten Transportes. Wir konnten potentialabhängige Veränderungen der Km-Werte von Cholin-induzierten Einwärtsströmen zeigen. Bei dem Austausch von Na+-Ionen gegen K+-Ionen im Reaktionspuffer wurde die Aufnahme von Cholin und MPP durch rOCT2 erniedrigt. Der bidirektionale Transport von MPP wurde gezeigt und trans-Stimulationsexperimente für MPP-Influx und MPP-Efflux durchgeführt, um die Asymmetrie des Transporters zu studieren. Darüberhinaus wurde in der vorliegenden Arbeit die Interaktion von verschiedenen Substraten mit rOCT1 und rOCT2 untersucht und ein kompetitver und nicht-kompetitiver Hemmtyp bei der TEA-Aufnahme gefunden. N2 - Organic cation transport in the renal tubule is an important physiological function for the maintenance of body fluid homeostasis and detoxification of harmful organic cations. In general, transport of organic cations in brush-border membranes is mediated by the H+/organic cation antiporter, whereas transport of organic cations in basolateral membranes is stimulated by the inside-negative membrane potential. By the expression cloning method, the organic cation transporter rOCT1, which is expressed in rat liver and kidney, was isolated. In 1996 another organic cation transporter from rat kidney, rOCT2, was isolated by homology cloning. rOCT2 was deduced to be a glycoprotein comprised of 593 amino acid residues with 12 putative transmembrane domains. To analyse the functional characteristics of rOCT2 in comparison with rOCT1 we utilized the Xenopus expression system. During this dissertation a pharmacological profile was made for rOCT2. The apparent substrate spectrum of rOCT2 was similar to that of rOCT1. Affinities of rOCT2 against several compounds were directly compared with those of rOCT1. We found differences in Km- and IC50-values for distinct substrates but also a lot of similarities between both transporters. Anions like p-aminohippuric acid were identified as a new group of inhibitors for rOCT1- and rOCT2-mediated transport. The potential difference is the driving force of transport mediated by rOCT1 and rOCT2. We showed the potential-dependent changes of Km-values of choline induced inward currents. Further when extracellular Na+ ions were replaced with K+ ions, the uptake of MPP and choline by rOCT2 was decreased. The bidirectional transport of MPP was shown and trans-sitmulation experiments for MPP influx and efflux were performed to study asymmetry of the transporter. The mechanism of interaction of several substrates with rOCT1 and rOCT2 were investigated and we found competitive and non-competitive inhibition of TEA uptake. KW - Ratte KW - Niere KW - Kation KW - Stofftransport KW - Molekularbiologie KW - rOCT1 KW - rOCT2 KW - proximaler Tubulus KW - Niere KW - Sekretion KW - Xenopus laevis KW - Oozyte KW - Transport KW - Inhibition KW - Homologieklonierung KW - rOCT1 KW - rOCT2 KW - proximal tubule KW - kidney KW - secretion KW - Xenopus laevis KW - oocyte KW - transport KW - inhibition KW - homology cloning Y1 - 2000 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-793 ER - TY - THES A1 - Popp, Christian T1 - Identifizierung von Aminosäuren als Teile der Substratbindungstasche des Kationentransporters 1 der Ratte (rOCT1) und Interaktion des rOCT2 mit der schwachen Base Chinin T1 - Aminoacids critical for substrate transport of rat organic cation transporter 1 and interaction of rOCT2 with the weak base quinine N2 - Zusammenfassungen 83 5 Zusammenfassungen 5.1 Zusammenfassung Durch Expressionsklonierung wurde 1994 der erste organische Kationentransporter, rOCT1, aus der Ratte isoliert (Gründemann et al., 1994). 1999 wurde eine Aminosäure in der 11. Transmembrandomäne von rOCT1 entdeckt, welche Teil der Substratbindungstasche dieses Transporters war (Gorboulev et al., 1999). Zielsetzung der vorliegenden Arbeit war es weitere funktionell relevante Aminosäuren zu identifizieren. Ein Vergleich der „Helical Wheels“ aller 12 hypothetischen Transmembrandomänen zeigte eine Akkumulation von 5 OCT und OCTN spezifischen Aminosäuren in der vierten Transmembrandomäne auf einer Seite. Bei diesen Aminosäuren handelte es sich um K215, W218, Y222, T226 und V229. Es wurden verschiedene Punktmutationen an diesen Positionen eingeführt. Es zeigte sich mit Hilfe radioaktiv markierter Substrate von rOCT1, dass selbst Substitutionen durch strukturell verwandte Aminosäuren bei den flankieren Aminosäuren zu einem Ausfall des rOCT1 vermittelten Substrattransport führte. Weiterhin schien an Position 218 für den rOCT1- vermittelten Transport von TEA eine aromatische Aminosäure von großer funktioneller Relevanz zu sein. Wir vermuten hier eine Kationen p-Elektronen Interaktion des aromatischen Ringsystems des Tryptophans mit der positiven Ladung des TEA. Versuche mit den Mutanten des Tyrosins 222 zeigten ebenfalls Änderungen bei den Transportraten und Affinitäten verschiedener Substrate. Eine Kationen-p Interaktion konnte ausgeschlossen werden, jedoch war die Affinität der Mutante Y222F zum TPeA um einen Faktor 20 gegenüber dem Wildtyp erhöht. Weiterführende Untersuchungen mit der Zwei- Elektrodenspannungsklemme zeigten unterschiedliche Affinitäten des TPeA zum Wildtyp im Vergleich zum mutierten Protein in seiner nach außen bzw. nach innen gerichteten Konformation. War die Form der Inhibierung des TEA-induzierten Stromes durch TPeA beim Wildtyp kompetitiv, so zeigte sie bei der Mutante einen nicht-kompetitiven Charakter. Die Mutante T226A zeigte ebenfalls Änderungen in Affinität und Selektivität. Bei allen transportierenden Mutanten zeigte sich, dass der Transport von MPP nicht oder kaum verändert war, hingegen wurden sehr starke Änderungen der Transportcharakteristika von TEA gefunden, was auf verschiedene Substratbindungsstellen in rOCT1 hinweist. Diese Versuche zeigen deutlich die funktionelle Relevanz und die Beteiligung der mutierten Aminosäurepositionen an der Substratbindetasche von rOCT1. In Versuchen, in welchen Chinin als Inhibitor des rOCT2 vermittelten Transports genutzt wurde, passierte Chinin mittels Diffusion in seiner ungeladenen Form die Oozytenmembran und hemmte rOCT2 von der Innenseite. Dies könnte der Grund für die nicht-kompetitive Form der Inhibition der TEA-Aufnahme durch Chinin sein. Diese Versuche wurden dadurch bestätigt, dass die protonierte Form des Chinins eine kompetitive Form der Inhibition zeigte und den Transporter von außen hemmte. N2 - The first organic cation transporter was cloned from rat (rOCT1) in 1994 by using the expression cloning technique (Gründemann et al., 1994). In 1999 it was found that one of the aminoacids in the 11th transmembranedomain of rOCT1, is part of it’s substrate binding pocket (Gorboulev et al., 1999). It was the aim of this thesis to identify more aminoacids of functional relevance for this transport protein. A comparison of all 12 helical wheels of the transporter showed, that there is an accumulation of 5 OCT and OCTN specific aminoacids at one side of the a-helix. These aminoacids were K215, W218, Y222, T226 and V229. Different single point mutations have been generated at these positions. Using radiolabeled substrates for rOCT1, the experiments showed, that even a substitution by a structural related aminoacid at the flanking aminoacids resulted in a failure of substrate transport. For TEA transport it has been suggested that the aminoacid at position 218 should have aromatic properties. We therefor suggest a cation-p interaction between the aromatic ringsystem of W218 and the positive charge of TEA. Experiments with mutations in position Y222 also showed differences in transport rates and affinities referring to the wildtype using different substrates. A cation-p interaction could be excluded, but it was shown, that there was a 20fold increased affinity of TPeA for the mutant Y222F. Further experiments utilizing the two electrode voltage clamp technique showed different affinities for wildtype rOCT1 in comparison to the mutated protein in its outward and inward conformation. The wildtype showed a competitive type of inhibition for TPeA inhibited TEA current, the mutant showed a non-competitive type of inhibition. The mutant T226A also showed changes in affinity and selectivity. In all transporting mutants we found no or lowest changes in the transport characteristics of MPP, but very big changes in the transport characteristics of TEA, an indication for different binding sites for these substrates. The experiment clearly showed, that these five aminoacids are of functional relevance for rOCT1 transport. In experiments using quinine as inhibitor of rOCT2 mediated transport quinine in it’s uncharged form passed the oocyte membrane by diffusion and inhibited rOCT2 from the inside. This might be the reason for the non-competitive type of inhibition, using quinine as the inhibitor for TEA uptake. This hypothesis was confirmed when we showed that the type of inhibition changed into the competitive type, when we used the protonated form of quinine. KW - Ratte KW - Kation KW - Carrier-Proteine KW - Chinin KW - Substratspezifität KW - rOCT KW - organischer KW - Kationentransporter KW - Chinin KW - Mutationsanalyse KW - rOCT KW - organic KW - Cationentransporter KW - Quinine KW - Mutationanalysis Y1 - 2004 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-12349 ER - TY - THES A1 - Shatskaya, Natalia T1 - Identification of amino acids within the substrate binding region of organic cation transporters (OCTZs) that are involved in binding of corticosterone T1 - Identifizierung der Aminosaüren in der Substratbindungstelle der organischen Kationentransporter, die in Kortikosteronbindung involviert sind N2 - The polyspecific organic cation transporters (OCT) are involved in the elimination and distribution of drugs, environmental toxins, and endogenous organic cations including monoamine neurotransmitters. Steroid hormones inhibit organic cation transport by the three OCT subtypes with different affinities showing distinct species difference; for example, the IC50 values for corticosterone inhibition of cation uptake by transporters rOCT1 and rOCT2 are ~150μM and ~4 μM, respectively. By introducing domains and amino acids from rOCT2 into rOCT1, we identified three amino acids in the presumed 10th TMD of rOCT2 which are responsible for the higher affinity of corticosterone in comparison to rOCT1. This is the first study which revealed the components of the binding site for corticosterone in OCTs. The evidence is presented that these amino acids (alanine 443, leucine 447, and glutamine 448 in rOCT1 and isoleucine 443, tyrosine 447, and glutamate 448 in rOCT2) are probably located within the substrate binding region of OCTs since the affinity of transported cations was increased together with the affinity of corticosterone. In the double mutant rOCT1(L447Y/Q448E) the IC50 value for the inhibition of [3H]MPP (0.1 μM) uptake by corticosterone (24 ± 4 μM) was significantly higher compared to the IC50 value for inhibition of [14C]TEA (10 μM) uptake (5.3 ± 1.7 μM), indicating an allosteric interaction between transported substrate and corticosterone. The data suggest that more than one compound can bind simultaneously to the substrate binding region. These results confirm previous suggestion that binding of substrates and inhibitors to OCTs involves interaction with a comparatively large surface that may include multiple binding domains rather than with a structurally restricted single binding site. N2 - Die polyspezifischen Transporter für organische Kationen (OCT) spielen eine wichtige Rolle bei der Ausscheidung von Medikamenten, Toxinen und endogenen organischen Kationen, zu denen auch monoamine Neurotransmitter gehören. Der durch OCT vermittelte Transport von organischen Kationen kann von Steroidhormonen gehemmt werden, die für drei OCT Subtypen deutlich unterschiedliche Affinität aufweisen: Zum Beispiel, IC50 Werte der Hemmung des Transportes von organischen Kationen durch Corticosteron betragen ~ 150 μM für rOCT1 und ~ 4 μM für rOCT2. Mithilfe des Austausches von rOCT1 Domänen und einzelnen Aminosäuren gegen die entsprechenden Elemente des rOCT2 Moleküls haben wir in der 10th TMD von rOCT2 drei Aminosäuren identifiziert, die für die höhere Affinität des rOCT2 Transporters zu Corticosteron verantwortlich sind. In dieser Arbeit wurden zum ersten Mal die Aminosäuren identifiziert, die zu der Bindungsstelle eines OCT Transporters für Corticosteron gehören. Die Ergebnisse der Untersuchungen deuten darauf hin, dass diese drei Aminosäuren (Alanin 443, Leucin 447 und Glutamin 448 in rOCT1 und Isoleucin 443, Tyrosin 447 und Glutamat 448 in rOCT2) hochwahrscheinlich in der ubstratbindungstasche von OCT liegen, da zusammen mit der Erhöhung der Affinität zu Corticosteron stieg auch die Affinität zu transportierenden Substraten. Für die doppelte Mutante rOCT1(L447Y/Q448E) unterscheiden sich die IC50 Werte für die Hemmung des [3H]MPP (0,1 μM) und des [14C]TEA (10 μM) Transportes durch Corticosteron um Faktor 4 (24 ± 4 μM bzw. 5,3 ± 1,7 μM), was eine allosterische Interaktion zwischen transportierenden Substraten und Corticosteron vermuten lässt. Die Daten deuten darauf hin, dass mehr als eine Substanz sich gleichzeitig an die Substratbindungsregion binden kann. Die gewonnenen Erkenntnisse bestätigen unsere vorigen Vorstellungen, dass die Bindung von Substraten und Hemmstoffen zu OCT die Interaktion mit der relativ großen Oberfläche des Proteins vorsieht, die vermutlich nicht auf eine einzige Bindungsstelle beschränkt ist, sondern eher mehrere Bindungsdomäne. KW - Kation KW - Ionentransport KW - Bindestelle KW - Corticosteroide KW - Aminosäuren KW - OCT KW - corticosterone KW - mutationen KW - OCT KW - corticosterone KW - mutation analysis Y1 - 2006 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-20430 ER - TY - THES A1 - Rehman, Saba T1 - Identification of accessible and closed substrate binding sites in the outward open cleft of rat Organic Cation Transporter 1 (rOCT1) T1 - Identifizierung von zugänglichen und unzugänglichen Substratbindungsstellen in der nach außen offenen Konformation des organischen Kationentransporters rOCT1 N2 - The present study was conducted on the rOCT1, a member of SLC22 family. Structurally, it consists of 12 membrane spanning α-helices with both N- and C-termini intracellular. Studies done so far, through tracer uptake and inhibition, reconstitution of rOCT1 in nanodiscs and proteoliposomes and voltage-clamp fluorometry, have identified the main amino acids in the cleft of rOCT1 that interact in a critical manner with the substrates/inhibitors either directly or indirectly. Homology modeling studies have also supported these observations. In the present study we aimed at measuring the binding of substrates MPP+ and TEA+ to rOCT1 at 0oC in order to establish the amino acids in the cleft region that interact with the substrate when the transporter is frozen in the outward-open conformation. Previously identified crucial amino acids (Asp475, Phe160, Leu447, Arg440, Trp218 and Tyr222) were selected for the study. rOCT1 wild-type and its mutants were stably expressed in HEK293 cells and these cells were used for the binding measurements with the radioactive substrate (MPP+ or TEA+) at 0°C in Mg-Ca-PBS buffer as described in “Materials and Methods” section in detail. rOCT1 wild-type revealed for MPP+-binding a KD which was not significantly different from the corresponding Km value. Also, after addition of 10 nM non-radioactive MPP+, an initial increase of about 20% in bound MPP+ was observed. The results indicate that the Km for transport is dependent on the binding of MPP+ to the outward-open conformation and hints at the possibility of allosteric interaction between the binding sites. Mutations at position Trp218, Phe160 and Asp475 resulted in a change in the KD value. Trp218 mutations also showed an allosteric increase similar to the rOCT1 wild-type. This study suggests that these amino acids are located at a critical position in the outward-open conformation for MPP+ transport. TEA+-binding could not be observed in rOCT1 wild-type, indicating that the binding site is perhaps inaccessible for TEA+ in frozen outward-open state. The mutants D475E, F160A, L447F, R440K and Y222F showed a very low affinity binding with a very high KD value as compared to the corresponding Km values indicating that the transporter might have different affinities for extra-cellular binding alone and for the complete transport process especially if temperature is the limiting factor. Substrate inhibition studies done using both MPP+ and TEA+ have confirmed the existence of overlapping binding sites for these two ligands. This study has confirmed the direct interaction of Trp218, Phe160, Asp475 with MPP+ and Phe160, Asp475, Leu447, Arg440 and Tyr222 with TEA+ in the outward-open conformation. N2 - In der vorgelegten Arbeit werden Untersuchungen am organischen Transporter rOCT1, einem Mitglied der SLC22 Familie, berichtet. Frühere Untersuchungen beinhalteten Transportmessungen mit radioaktiven Substanzen und Hemmstoffen, Transport- und Bindungsmessungen nach Rekonstitution in Nanodisken und Proteo¬liposomen und Voltage-Clamp-Fluorimetrie-Analysen an rOCT1 und rOCT1 Mutanten. Sie führten zur Identifizierung wichtiger Aminosäuren im Bindungsspalt von rOCT1, welche für die Interaktion mit Substraten oder Hemmstoffen wichtig sind. Homologiemodelle wurden zur Interpretationen der Ergebnisse herangezogen. In der vorgelegten Arbeit haben wir die Binding der Substrate MPP+ und TEA+ an rOCT1 bei 0°C gemessen um herauszufinden welche Aminosäuren in der Spaltregion von rOCT1 mit diesen Substraten interagieren, wenn der Transporter in der nach außen offenen Konfor¬mation „eingefroren“ ist. Für die Untersuchungen wurden Aminosäuren ausgewählt, deren Relevanz für den Transport von MPP+ und TEA+ in früheren Untersuchungen erkannt worden war. Es handelt sich um die Aminosäuren Asp475, Phe160, Leu447, Arg440, Trp218 und Tyr222. rOCT1 Wildtyp und rOCT1 Mutanten wurden stabil in HEK293 Zellen exprimiert. Mit diesen Zellen wurden bei 0oC Bindungsmessungen mit radioaktiv markiertem MPP+ und TEA+ unter Verwendung eines Magnesium und Calcium erhaltenen Puffers. Für die MPP+-Bindung an den rOCT1 Wildtyp ergab sich eine µmolare Dissoziationskonstante (KD), die keinen signifikanten Unterschied zum früher gemessenen Km Wert aufweist. Dieses Ergebnis zeigt, dass der Km von der MPP+-Bindung an die nach außen offene Konformation abhängig ist. Bei der Zugabe von 10 nM nicht-radioaktivem MPP+ war beim rOCT1 Wildtyp die Bindung von radioaktiv markiertem MPP+ um 20% erhöht. Dies deutet auf einen allosterischen Effekt einer hochaffinen MPP+ Bindungsstelle auf die direkt am Transport beteiligte µmolare Bindungsstelle hin. Mutationen der Aminosäuren Trp218, Phe160 und Asp475 führten zu Änderungen des KD Wertes für die MPP+ Bindung. Für die Mutanten von Trp218 wurde ein ähnlicher allosterischer MPP+ Effekt wie beim rOCT1 Wildtyp beobachtet. Die Unter¬suchungen weisen darauf hin, dass diese drei Aminosäuren in kritischen Positionen für die MPP+-Bindung von außen befinden. Bei 00C konnte beim rOCT1 Wildtyp keine TEA+-Bindung nachgewiesen werden. Dies legt den Schluss nahe, dass die TEA+-Bindungsstelle in der „eingefrorenen“ nach außen gerichteten Konformation unzugänglich ist. In Gegensatz dazu zeigen die Mutanten D475E, F160A, L447F, R440K und Y222F eine sehr niederaffine TEA+-Bindung mit hohen KD Werten, die sich stark von den entsprechenden Km Werten unterscheiden. Durch Experimente, bei denen die Bindung von MPP+ durch TEA+ bzw. die Bindung von TEA+ durch MPP+ gehemmt wurde, wurde die Hypothese bestätigt, dass sich die Bindungsstellen für MPP+ und TEA+ überlappen. Unsere Untersuchungen deuten darauf hin, dass in der nach außen gerichteten Konformation von rOCT1 Trp218, Phe160 und Asp475 direkt mit MPP+ und Phe160, Asp475, Leu447, Arg440 und Tyr222 direkt mit TEA+ interagieren. KW - Kation KW - Transporters KW - Stofftransport KW - OCT1 Y1 - 2018 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-169992 ER -