TY - JOUR A1 - Mammadova-Bach, Elmina A1 - Braun, Attila T1 - Zinc homeostasis in platelet-related diseases JF - International Journal of Molecular Sciences N2 - Zn\(^{2+}\) deficiency in the human population is frequent in underdeveloped countries. Worldwide, approximatively 2 billion people consume Zn\(^{2+}\)-deficient diets, accounting for 1–4% of deaths each year, mainly in infants with a compromised immune system. Depending on the severity of Zn\(^{2+}\) deficiency, clinical symptoms are associated with impaired wound healing, alopecia, diarrhea, poor growth, dysfunction of the immune and nervous system with congenital abnormalities and bleeding disorders. Poor nutritional Zn\(^{2+}\) status in patients with metastatic squamous cell carcinoma or with advanced non-Hodgkin lymphoma, was accompanied by cutaneous bleeding and platelet dysfunction. Forcing Zn\(^{2+}\) uptake in the gut using different nutritional supplementation of Zn\(^{2+}\) could ameliorate many of these pathological symptoms in humans. Feeding adult rodents with a low Zn\(^{2+}\) diet caused poor platelet aggregation and increased bleeding tendency, thereby attracting great scientific interest in investigating the role of Zn\(^{2+}\) in hemostasis. Storage protein metallothionein maintains or releases Zn\(^{2+}\) in the cytoplasm, and the dynamic change of this cytoplasmic Zn\(^{2+}\) pool is regulated by the redox status of the cell. An increase of labile Zn\(^{2+}\) pool can be toxic for the cells, and therefore cytoplasmic Zn\(^{2+}\) levels are tightly regulated by several Zn\(^{2+}\) transporters located on the cell surface and also on the intracellular membrane of Zn\(^{2+}\) storage organelles, such as secretory vesicles, endoplasmic reticulum or Golgi apparatus. Although Zn\(^{2+}\) is a critical cofactor for more than 2000 transcription factors and 300 enzymes, regulating cell differentiation, proliferation, and basic metabolic functions of the cells, the molecular mechanisms of Zn\(^{2+}\) transport and the physiological role of Zn\(^{2+}\) store in megakaryocyte and platelet function remain elusive. In this review, we summarize the contribution of extracellular or intracellular Zn\(^{2+}\) to megakaryocyte and platelet function and discuss the consequences of dysregulated Zn\(^{2+}\) homeostasis in platelet-related diseases by focusing on thrombosis, ischemic stroke and storage pool diseases. KW - Zinc KW - platelets KW - hemostasis KW - thrombosis KW - ischemic stroke KW - storage-pool diseases Y1 - 2019 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-285554 SN - 1422-0067 VL - 20 IS - 21 ER - TY - JOUR A1 - Kraft, Peter A1 - Drechsler, Christiane A1 - Gunreben, Ignaz A1 - Nieswandt, Bernhard A1 - Stoll, Guido A1 - Heuschmann, Peter Ulrich A1 - Kleinschnitz, Christoph T1 - Von Willebrand Factor Regulation in Patients with Acute and Chronic Cerebrovascular Disease: A Pilot, Case-Control Study JF - PLoS ONE N2 - Background and Purpose In animal models, von Willebrand factor (VWF) is involved in thrombus formation and propagation of ischemic stroke. However, the pathophysiological relevance of this molecule in humans, and its potential use as a biomarker for the risk and severity of ischemic stroke remains unclear. This study had two aims: to identify predictors of altered VWF levels and to examine whether VWF levels differ between acute cerebrovascular events and chronic cerebrovascular disease (CCD). Methods A case–control study was undertaken between 2010 and 2013 at our University clinic. In total, 116 patients with acute ischemic stroke (AIS) or transitory ischemic attack (TIA), 117 patients with CCD, and 104 healthy volunteers (HV) were included. Blood was taken at days 0, 1, and 3 in patients with AIS or TIA, and once in CCD patients and HV. VWF serum levels were measured and correlated with demographic and clinical parameters by multivariate linear regression and ANOVA. Results Patients with CCD (158±46%) had significantly higher VWF levels than HV (113±36%, P<0.001), but lower levels than AIS/TIA patients (200±95%, P<0.001). Age, sex, and stroke severity influenced VWF levels (P<0.05). Conclusions VWF levels differed across disease subtypes and patient characteristics. Our study confirms increased VWF levels as a risk factor for cerebrovascular disease and, moreover, suggests that it may represent a potential biomarker for stroke severity, warranting further investigation. KW - cerebrovascular diseases KW - sex addiction KW - biomarkers KW - ischemic stroke KW - blood KW - stroke KW - platelets KW - demography Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-119588 SN - 1932-6203 VL - 9 IS - 6 ER - TY - THES A1 - Gromova, Kira V. T1 - Visualization of the Smad direct signaling response to Bone Morphogenetic Protein 4 activation with FRET-based biosensors T1 - Visualisierung der Smad-vermittelten Signaltransduktion nach Aktivierung mit "Bone Morphogenetic Protein" 4 mittels FRET-basierter Biosensoren N2 - The Transforming Growth Factor (TGF) superfamily of cytokines and their serine/threonine kinase receptors play an important role in the regulation of cell division, differentiation, adhesion, migration, organization, and death. Smad proteins are the major intracellular signal transducers for the TGF receptor superfamily that mediate the signal from the membrane into the nucleus. Bone Morphogenetic Protein-4 (BMP-4) is a representative of the TGF superfamily, which regulates the formation of teeth, limbs and bone, and also plays a role in fracture repair. Binding of BMP-4 to its receptor stimulates phosphorylation of Smad1, which subsequently recruits Smad4. A hetero-oligomeric complex consisting of Smad1 and Smad4 then translocates into the nucleus and regulates transcription of target genes by interacting with transcription factors. Although the individual steps of the signaling cascade from the receptor to the nucleus have been identified, the exact kinetics and the rate limiting step(s) have remained elusive. Standard biochemical techniques are not suitable for resolving these issues, as they do not offer sufficiently high sensitivity and temporal resolution. In this study, advanced optical techniques were used for direct visualization of Smad signaling in live mammalian cells. Novel fluorescent biosensors were developed by fusing cyan and yellow fluorescent proteins to the signaling molecules Smad1 and Smad4. By measuring Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) between the two fluorescent proteins, the kinetics of BMP/Smad signaling was unraveled. A rate-limiting delay of 2 - 5 minutes occurred between BMP receptor stimulation and Smad1 activation. A similar delay was observed in the complex formation between Smad1 and Smad4. Further experimentation indicated that the delay is dependent on the Mad homology 1 (MH1) domain of Smad1. These results give new insights into the dynamics of the BMP receptor – Smad1/4 signaling process and provide a new tool for studying Smads and for testing inhibitory drugs. N2 - Die Transforming Growth Factor" (TGF)-Superfamilie der Cytokine und ihrer Serin/Threonin-Kinase-Rezeptoren spielt eine bedeutende Rolle bei der Regulierung der Zellteilung, -differenzierung, -adhäsion, -migration, -organisation, und beim Zelltod. Die Smad-Proteine sind die wichtigsten intrazellulären Signalüberträger für die TGF-Rezeptor-Familie, da sie das Signal von der Zellmembran zum Kern übermitteln. Das ,,Bone Morphogenetic Protein4" (BMP-4) ist ein Vertreter der TGF-Familie, der die Bildung von Zähnen, Gliedmaßen und Knochen reguliert und darüber hinaus eine Rolle bei der Frakturheilung spielt. Das Binden von BMP-4 an seinen Rezeptor stimuliert die Phosphorylierung von Smad1, welches in der Folge Smad4 rekrutiert. Ein hetero-oligomerer Komplex bestehend aus Smad1 und Smad4 verlagert sich dann in den Zellkern, wo er durch Interaktion mit Transkriptionsfaktoren die Transkription von Zielgenen reguliert. Obwohl die einzelnen Schritte der Signalkaskade vom Rezeptor bis in den Zellkern bereits identifiziert wurden, blieben die Kinetik und die geschwindigkeitsbegrenzenden Schritte bisher unbekannt. Gängige biochemische Methoden eignen sich nicht um diese Fragen zu lösen, da sie nicht über ausreichende Empfindlichkeit und zeitliches Auflösungsvermögen verfügen. In der vorliegenden Arbeit wurden hochentwickelte optische Techniken angewandt, um die Smad-vermittelte Signaltransduktion direkt in lebenden Zellen sichtbar zu machen. Neue fluoreszierende Biosensoren wurden konstruiert, indem gelb- und cyan-fluoreszierende Proteine mit den Signalmoleküle Smad1 und Smad4 fusioniert wurden. Durch Messung des "Fluorescent Resonance Energy Transfer" (FRET) zwischen den zwei fluoreszierenden Proteinen konnte die Kinetik der BMP-Smad-Signalkaskade bestimmt werden. Zwischen der Stimulation des Rezeptors und der Aktivierung von Smad1 trat eine geschwindigkeitsbegrenzende Verzögerung von 2-5 Minuten auf. Eine ähnliche Verzögerung wurde bei der Bildung des Komplexes aus Smad1 und Smad4 beobachtet. Weitere Experimente zeigten, dass die Verzögerung von der Mad-Homologie-Domäne 1 (MH1) von Smad1 abhängt. Die Ergebnisse dieser Arbeit geben neue Einblicke in die Dynamik der BMP-Rezeptor-Smad1/4 Signaltransduktion und stellen neue Werkzeuge zur Untersuchung von Smads und zur Austestung inhibitorischer Wirkstoffe zur Verfügung. KW - FRET KW - Mikroskopie KW - Signaltransduktion KW - Smad KW - BMP KW - FRET KW - microscopy KW - signaling KW - Smad KW - bone morphogenetic protein KW - fluorescent protein Y1 - 2007 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-25855 ER - TY - THES A1 - Blachutzik, Jörg O. T1 - Visualisierung von Plasmamembran-Domänen in Arabidopsis thaliana T1 - Visualization of plasma membrane domains in Arabidopsis thaliana N2 - Unter Verwendung fluoreszenzmarkierter Remorine der taxonomischen Gruppe 1b wurden Nanodomänen in Arabidopsis Plasmamembranen (PM) unter Verwendung hoch auflösender Laser Scanning-Systeme sichtbar gemacht. In diesen kompartimentierten Membranbereichen lagerten sich Sterol-abhängige Remorine aus verschiedenen Pflanzen-familien zusammen und zeigten dort Kolokalisation. Dies wurde statistisch belegt durch hohe Pearson und Spearman Korrelationskoeffizienten. Remorine konnten schließlich als pflanzliche Markerproteine für kompartimentierte Membranbereiche etabliert werden. Die Nanodomänen zeigten zu keinem Zeitpunkt laterale Bewegungen in der PM und scheinen sowohl von zytoskelettären Strukturen als auch von Komponenten der Zellwand stabilisiert zu werden. Möglicherweise spielen transmembrane Tetraspanine sowie GPI-verankerte SKU5-Proteine eine Rolle bei der stabilen Verankerung. Für zwei native Arabidopsis Remorine wurden posttranslationale Modifikationsstellen aufgedeckt, die der Anheftung dieser hydrophilen Proteine an die PM dienen. Weiterhin scheinen gleichartige Remorine miteinander zu interagieren. Beispielsweise waren im Zytosol lokalisierte Remorin-Mutanten bei einer gleichzeitigen Expression der entsprechenden Vollängenproteine erneut an der PM zu finden. Für die Remorine wurde postuliert, dass sie mit anderen Proteinen interagieren und dabei makromolekulare Strukturen ausbilden. Den Remorinen könnte daher eine Aufgabe bei der molekularen Organisation pflanzlicher Membrandomänen zukommen, indem sie ein filamentartiges Netzwerk innerhalb distinkter Domänen ausbilden, das möglicherweise zur Stabilität und Aufrechterhaltung dieser spezialisierten Bereiche beiträgt. Unter Einbeziehung der STED-Mikroskopie wurde eine empirische Größenverteilung von 97±4nm Durchmesser für PM-ständige Domänen in Arabidopsis ermittelt. Hinsichtlich der physiologischen Relevanz konnte gezeigt werden, dass die Domänen eine Rolle bei der ABA-vermittelten, kalziumabhängigen Regulation des Anionenkanals SLAH3 einnehmen. SLAH3 wird durch kalziumabhängige Kinasen aus der CDPK-Familie aktiviert, im Speziellen durch CPK21 und CPK23. Beide Kinasen werden durch die ABA-sensitiven Phosphatasen ABI1 und ABI2 reguliert. Die spezifisch stattfindenden Interaktionen zwischen SLAH3 und CPK21, sowie zwischen CPK21 und ABI1 waren auf Nanodomänen beschränkt und wurden durch die Methodik der bimolekularen Fluoreszenzkomplementation erstmals in planta nachgewiesen, mit Remorinen der taxonomischen Gruppe 1b als etablierte Markerproteine für Membrandomänen. N2 - In this work, membrane nanodomains have been visualized in planta via confocal microscopy of group 1b Remorin proteins fused to fluorescent proteins. Within these nanodomains, sterol-dependent Remorins originating from different plant species accumulated as shown by multiple color colocalization microscopy, and through which it was statistically verified by high Spearman and Pearson correlation coefficients. Thus, group 1b Remorins were established here as reliable marker proteins for plasma membrane (PM) nanodomains in plants. Since individual domains did not exhibit any kind of lateral movement within the plane of the membrane, a stabilization of them from cytoskeletal components as well as from components of the cell wall was presumed. Other proteins such as trans-membrane Tetraspanins and GPI-anchored proteins like SKU5 were ruled out as possible candidates being involved in the maintenance of domains´ lateral stability. For two Remorins originating from Arabidopsis thaliana, sites of posttranslational lipid modifications, which allow the proteins to anchor to the plasma membrane, were revealed. In experiments using truncated Remorins with these modification sites deleted, the mutant Remorins appeared to be no longer located at the PM but rather within the cytosol. Truncated Remorins re-appeared at the PM as soon as the full length Remorin proteins were co-expressed. In close proximity to the sites of lipid modifications a highly conserved C-terminal region, whose likely role is to facilitate homo-Remorin protein interactions, was uncovered. Therefore Remorins could possibly be involved in the molecular organization of a filamentous protein structure that could help mediate the stability and maintenance of individual domains. As well, the sizes of individual nanodomains were empirically measured in Arabidopsis thaliana mesophyll cells with STED microscopy, which allowed for optical measurements of domains with 60nm resolution, and were narrowly distributed in a histogram of domain diameters with an average diameter of 97 ± 4nm. One possible physiological role of PM-based nanodomains was demonstrated to be the ABA-mediated, calcium-dependent regulation of the SLAH3 anion channel. At the inception of the regulation, SLAH3 becomes activated upon phosphorylation by calcium-dependent protein kinases of the CDPK-family, CPK21 and CPK23. Both CPK´s in turn are regulated by the ABA-dependent phosphatases ABI1 and ABI2. As visualized by fluorescence colocalization microscopy for the first time, the interactions between SLAH3 and CPK21, as well as interactions between CPK21 and ABI1 were restricted to PM compartments. As well, these protein interactions were corroborated by also imaging them in planta using the bimolecular fluorescence complementation technique - involving group 1b Remorins as the established marker proteins for PM nanodomains. KW - Plasmamembran KW - Fluoreszmikroskopie KW - Ackerschmalwand KW - plasma membrane KW - fluorescence microscopy KW - Remorin KW - protoplasts KW - Protoplasten Y1 - 2012 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-71925 ER - TY - JOUR A1 - Koenig, Sebastian A1 - Wolf, Reinhard A1 - Heisenberg, Martin T1 - Visual Attention in Flies-Dopamine in the Mushroom Bodies Mediates the After-Effect of Cueing JF - PLoS ONE N2 - Visual environments may simultaneously comprise stimuli of different significance. Often such stimuli require incompatible responses. Selective visual attention allows an animal to respond exclusively to the stimuli at a certain location in the visual field. In the process of establishing its focus of attention the animal can be influenced by external cues. Here we characterize the behavioral properties and neural mechanism of cueing in the fly Drosophila melanogaster. A cue can be attractive, repulsive or ineffective depending upon (e.g.) its visual properties and location in the visual field. Dopamine signaling in the brain is required to maintain the effect of cueing once the cue has disappeared. Raising or lowering dopamine at the synapse abolishes this after-effect. Specifically, dopamine is necessary and sufficient in the αβ-lobes of the mushroom bodies. Evidence is provided for an involvement of the αβ\(_{posterior}\) Kenyon cells. KW - dopamine transporters KW - Drosophila melanogaster KW - synapses KW - dopaminergics KW - dopamine KW - sensory cues KW - RNA interference KW - vision Y1 - 2016 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-179564 VL - 11 IS - 8 ER - TY - THES A1 - Sareen, Preeti T1 - Visual attention in Drosophila melanogaster T1 - Visuelle Aufmerksamkeit bei Drosophila melanogaster N2 - There is such vast amount of visual information in our surroundings at any time that filtering out the important information for further processing is a basic requirement for any visual system. This is accomplished by deploying attention to focus on one source of sensory inputs to the exclusion of others (Luck and Mangun 2009). Attention has been studied extensively in humans and non human primates (NHPs). In Drosophila, visual attention was first demonstrated in 1980 (Wolf and Heisenberg 1980) but this field remained largely unexplored until recently. Lately, however, studies have emerged that hypothesize the role of attention in several behaviors but do not specify the characteristic properties of attention. So, the aim of this research was to characterize the phenomenon of visual attention in wild-type Drosophila, including both externally cued and covert attention using tethered flight at a torque meter. Development of systematic quantifiable behavioral tests was a key aspect for this which was not only important for analyzing the behavior of a population of wild-type flies but also for comparing the wild-type flies with mutant flies. The latter would help understand the molecular, genetic, and neuronal bases of attention. Since Drosophila provides handy genetic tools, a model of attention in Drosophila will serve to the greater questions about the neuronal circuitry and mechanisms involved which might be analogous to those in primates. Such a model might later be used in research involving disorders of attention. Attention can be guided to a certain location in the visual field by the use of external cues. Here, using visual cues the attention of the fly was directed to one or the other of the two visual half-fields. A simple yet robust paradigm was designed with which the results were easily quantifiable. This paradigm helped discover several interesting properties of the cued attention, the most substantial one being that this kind of external guidance of attention is restricted to the lower part of the fly’s visual field. The guiding cue had an after-effect, i.e. it could occur at least up to 2 seconds before the test and still bias it. The cue could also be spatially separated from the test by at least 20° and yet attract the attention although the extent of the focus of attention (FoA) was smaller than one lower visual half-field. These observations excluded the possibility of any kind of interference between the test and the cue stimuli. Another interesting observation was the essentiality of continuous visibility of the test stimulus but not the cue for effective cuing. When the contrast of the visual scene was inverted, differences in response frequencies and cuing effects were observed. Syndirectional yaw torque responses became more frequent than the antidirectional responses and cuing was no longer effective in the lower visual field with inverted contrast. Interestingly, the test stimulus with simultaneous displacement of two stripes not only effectuated a phasic yaw torque response but also a landing response. A 50 landing response was produced in more than half of the cases whenever a yaw torque response was produced. Elucidation of the neuronal correlates of the cued attention was commenced. Pilot experiments with hydroxyurea (HU) treated flies showed that mushroom bodies were not required for the kind of guidance of attention tested in this study. Dopamine mutants were also tested for the guidance of attention in the lower visual field. Surprisingly, TH-Gal4/UAS-shits1 flies flew like wild-type flies and also showed normal optomotor response during the initial calibration phase of the experiment but did not show any phasic yaw torque or landing response at 18 °C, 25 °C or 30 °C. dumb2 flies that have almost no D1 dopamine receptor dDA1 expression in the mushroom bodies and the central complex (Kim et al. 2007) were also tested and like THGal4/ UAS-shits1 flies did not show any phasic yaw torque or landing response. Since the dopamine mutants did not show the basic yaw torque response for the test the role of dopamine in attention could not be deduced. A different paradigm would be needed to test these mutants. Not only can attention be guided through external cues, it can also be shifted endogenously (covert attention). Experiments with the windows having oscillating stripes nicely demonstrated the phenomenon of covert attention due to the production of a characteristic yaw torque pattern by the flies. However, the results were not easily quantifiable and reproducible thereby calling for a more systematic approach. Experiments with simultaneous opposing displacements of two stripes provide a promising avenue as the results from these experiments showed that the flies had a higher tendency to deliver one type of response than when the responses would be produced stochastically suggesting that attention increased this tendency. Further experiments and analysis of such experiments could shed more light on the mechanisms of covert attention in flies. N2 - Zu jedem Zeitpunkt stellt unsere Umgebung eine so große Menge an visueller Information zur Verfügung, dass das Herausfiltern der wichtigen Informationen für eine weitere Verarbeitung eine grundlegende Herausforderung für jedes komplexe visuelle System darstellt. Bewerkstelligt wird dies u.a. mittels der selektiven Aufmerksamkeit, die die sensorischen Inputs einer Quelle, unter Ausschluss aller anderen, hervorhebt (Luck und Mangun 2009). Aufmerksamkeit wurde an Menschen und nichtmenschlichen Primaten bereits ausgiebig untersucht. Visuelle Aufmerksamkeit bei Drosophila konnte 1980 zum ersten Mal nachgewiesen werden (Wolf und Heisenberg 1980), jedoch blieb dieses Feld bis heute großen Teils unerforscht. In jüngster Zeit tauchten Studien auf, die der Aufmerksamkeit eine Rolle bei verschiedenen Verhaltensleistungen zuweisen, ohne jedoch die charakteristischen Eigenschaften von Aufmerksamkeit zu spezifizieren. Es ist das Ziel dieser Arbeit, das Phänomen der sowohl durch externe Reize ausgelösten, als auch endogen erzeugten (covert attention) visuellen Aufmerksamkeit bei wildtypischen Drosophila im stationären Flug am Drehmoment-Messgerät zu charakterisieren. Hierbei ist ein wesentlicher Aspekt durch die Entwicklung von quantitativen Tests das Verhalten von wildtypischen Fliegen so zu analysieren, dass es mit dem Verhalten genetischer Varianten verglichen werden kann. Ein solcher Vergleich würde helfen, die molekularen, genetischen und neuronalen Grundlagen der Aufmerksamkeit zu verstehen, da bei Drosophila für solche Untersuchungen einfach anwendbare genetische Werkzeuge zur Verfügung stehen. Ein Modell der Aufmerksamkeit bei Drosophila könnte auch für die visuelle Aufmerksamkeit bei Primaten relevant sein, falls diese Systeme homolog sind, d.h. in der Stammesgeschichte einen gemeinsamen Ursprung haben. Mittels äußerer Reize lässt sich die Aufmerksamkeit auf einen bestimmten Ort im visuellen Feld führen. In dieser Arbeit wird die Aufmerksamkeit einer Fliege durch visuelle Reize auf jeweils eines der beiden visuellen Halbfelder gelenkt. Es wird ein einfaches und robustes Paradigma entwickelt, dessen Ergebnisse ohne viel Aufwand quantifizierbar sind. Eine wesentliche Eigenschaft der exogen gelenkten visuellen Aufmerksamkeit, zu deren Entdeckung dieses Paradigma unter anderen beigetragen hat, ist, dass diese Art der Lenkung der Aufmerksamkeit auf den unteren Teil des visuellen Feldes der Fliege beschränkt ist. Der lenkende Reiz hat einen Nacheffekt, das heißt, er kann bis zu zwei Sekunden vor dem Test auftreten und dessen Ergebnis trotzdem beeinflussen. Auch bei einer räumlichen Trennung des Reizes vom Test um mindestens 20° kann er noch die Aufmerksamkeit auf diesen ziehen, wobei hier dann die Ausdehnung des Aufmerksamkeitsfeldes kleiner als ein unteres visuelles Halbfeld 52 ist. Durch diese Beobachtungen wird eine mögliche Interferenz zwischen Reiz und Test ausgeschlossen. Eine weitere interessante Beobachtung ist, dass für ein effektives Lenken der Aufmerksamkeit der Teststimulus aber nicht der lenkende Reiz durchgehend sichtbar sein muss. Eine Invertierung des Kontrastes der visuellen Reizgebung führt zu veränderten Antwortfrequenzen und Effekten der Aufmerksamkeitslenkung. So treten syndirektionale Drehmoment-Antworten häufiger auf als antidirektionale und die Lenkung der Aufmerksamkeit im unteren visuellen Feld durch einen vorhergehenden Reiz tritt nicht auf. Interessanterweise kann der Teststimulus, die simultane Verschiebung zweier Streifen nicht nur eine phasische Drehmoment-Antwort, sondern auch einen Landeversuch auslösen. Dieser wird in mehr als der Hälfte aller Fälle, in denen eine Drehmomentantwort gezeigt wird, beobachtet. Eine Untersuchung der neuronalen Korrelate der reizgelenkten Aufmerksamkeit wurde begonnen. In Pilotexperimenten mit Fliegen, die mit Hydroxyharnstoff (HU) behandelt worden waren, zeigte sich, dass die adulten Pilzkörper nicht für diese Art der Lenkung der Aufmerksamkeit, wie sie in der vorliegenden Arbeit untersucht wird, benötigt werden. Des weiteren wurden auch Fliegenmutanten mit Defekten im Dopamin-System getestet. Überraschenderweise flogen TH-Gal4/UAS-shits1 Fliegen wie wildtypische Fliegen und zeigten auch ein normales optomotorisches Verhalten während der anfänglichen Kalibrierungsphase des Experimentes. Sie zeigten jedoch weder phasische Drehmoment-Antworten noch Landeversuche bei 18°C, 25°C oder 30°C. Auch dumb2 Fliegen, die so gut wie keine D1 Dopaminrezeptoren in den Pilzkörpern und im Zentralkomplex exprimieren (Kim et al. 2007), zeigten die gleichen Verhaltensdefekte wie TH-Gal4/UAS-shits1 -Fliegen. Da bei den Dopaminmutanten die phasische Drehmomentantwort fehlte, konnte die Bedeutung von Dopamin für Aufmerksamkeit aus diesem Test nicht abgeleitet werden. Um diese Mutanten zu testen, bedarf es eines anderen Paradigmas. Die Richtung der Aufmerksamkeit kann nicht nur durch äußere Reize gelenkt, sondern auch endogen verändert werden (covert attention). Experimente mit zwei oszillierenden Streifenmustern in der rechten und linken Sehfeld-Hälfte verdeutlichen das Phänomen der endogen gesteuerten Aufmerksamkeit anschaulich, da die Fliegen hierbei charakteristische Drehmomentmuster für das eine oder andere Muster erzeugen. Weil diese Einzelbeobachtungen aber nicht leicht quantifizierbar sind, ist hier ein neuer Ansatz notwendig. Die obigen Experimente mit zwei einzelnen Streifen, die gleichzeitig nach rechts und links versetzt werden, versprechen systematischere Ergebnisse. Die Fliegen neigen stärker dazu einen bestimmten Antwort-Typ (Drehmoment nach links bzw. nach rechts) beizubehalten, als eine statistische Verteilung annehmen ließe. Es ist zu vermuten, dass dieser Effekt durch die Aufmerksamkeit hervorgerufen wird. Die Analyse solcher Experimente könnte also die endogene Steuerung der Aufmerksamkeit beleuchten. KW - Visuelle Aufmerksamkeit KW - Taufliege KW - Visuelle Aufmerksamkeit KW - Drosophila melanogaster KW - Visual attention KW - Drosophila melanogaster KW - torque meter Y1 - 2011 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-69616 ER - TY - JOUR A1 - Koenig, Sebastian A1 - Wolf, Reinhard A1 - Heisenberg, Martin T1 - Vision in Flies: Measuring the Attention Span JF - PLoS ONE N2 - A visual stimulus at a particular location of the visual field may elicit a behavior while at the same time equally salient stimuli in other parts do not. This property of visual systems is known as selective visual attention (SVA). The animal is said to have a focus of attention (FoA) which it has shifted to a particular location. Visual attention normally involves an attention span at the location to which the FoA has been shifted. Here the attention span is measured in Drosophila. The fly is tethered and hence has its eyes fixed in space. It can shift its FoA internally. This shift is revealed using two simultaneous test stimuli with characteristic responses at their particular locations. In tethered flight a wild type fly keeps its FoA at a certain location for up to 4s. Flies with a mutation in the radish gene, that has been suggested to be involved in attention-like mechanisms, display a reduced attention span of only 1s. KW - eye movements KW - attention KW - Drosophila melanogaster KW - torque KW - motion KW - insect flight KW - eyes KW - vision Y1 - 2016 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-179947 VL - 11 IS - 2 ER - TY - JOUR A1 - Patil, Sandeep S. A1 - Gentschev, Ivaylo A1 - Adelfinger, Marion A1 - Donat, Ulrike A1 - Hess, Michael A1 - Weibel, Stephanie A1 - Nolte, Ingo A1 - Frentzen, Alexa A1 - Szalay, Aladar A. T1 - Virotherapy of Canine Tumors with Oncolytic Vaccinia Virus GLV-1h109 Expressing an Anti-VEGF Single-Chain Antibody JF - PLoS One N2 - Virotherapy using oncolytic vaccinia virus (VACV) strains is one promising new strategy for cancer therapy. We have previously reported that oncolytic vaccinia virus strains expressing an anti-VEGF (Vascular Endothelial Growth Factor) single-chain antibody (scAb) GLAF-1 exhibited significant therapeutic efficacy for treatment of human tumor xenografts. Here, we describe the use of oncolytic vaccinia virus GLV-1h109 encoding GLAF-1 for canine cancer therapy. In this study we analyzed the virus-mediated delivery and production of scAb GLAF-1 and the oncolytic and immunological effects of the GLV-1h109 vaccinia virus strain against canine soft tissue sarcoma and canine prostate carcinoma in xenograft models. Cell culture data demonstrated that the GLV-1h109 virus efficiently infect, replicate in and destroy both tested canine cancer cell lines. In addition, successful expression of GLAF-1 was demonstrated in virus-infected canine cancer cells and the antibody specifically recognized canine VEGF. In two different xenograft models, the systemic administration of the GLV-1h109 virus was found to be safe and led to anti-tumor and immunological effects resulting in the significant reduction of tumor growth in comparison to untreated control mice. Furthermore, tumor-specific virus infection led to a continued production of functional scAb GLAF-1, resulting in inhibition of angiogenesis. Overall, the GLV-1h109-mediated cancer therapy and production of immunotherapeutic anti-VEGF scAb may open the way for combination therapy concept i.e. vaccinia virus mediated oncolysis and intratumoral production of therapeutic drugs in canine cancer patients. KW - angiogenesis KW - microenvironment KW - model KW - cancer KW - therapy KW - pet dogs KW - nude-mice KW - breast-tumors KW - microvascular density KW - endothelial growth-factor Y1 - 2012 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-130039 VL - 7 IS - 10 ER - TY - JOUR A1 - Gholami, Sepideh A1 - Chen, Chun-Hao A1 - Belin, Laurence J. A1 - Lou, Emil A1 - Fujisawa, Sho A1 - Antonacci, Caroline A1 - Carew, Amanda A1 - Chen, Nanhai G. A1 - De Brot, Marina A1 - Zanzonico, Pat B. A1 - Szalay, Aladar A. A1 - Fong, Yuman T1 - Vaccinia virus GLV-1h153 is a novel agent for detection and effective local control of positive surgical margins for breast cancer JF - Breast Cancer Research N2 - Introduction: Surgery is currently the definitive treatment for early-stage breast cancer. However, the rate of positive surgical margins remains unacceptably high. The human sodium iodide symporter (hNIS) is a naturally occurring protein in human thyroid tissue, which enables cells to concentrate radionuclides. The hNIS has been exploited to image and treat thyroid cancer. We therefore investigated the potential of a novel oncolytic vaccinia virus GLV1h-153 engineered to express the hNIS gene for identifying positive surgical margins after tumor resection via positron emission tomography (PET). Furthermore, we studied its role as an adjuvant therapeutic agent in achieving local control of remaining tumors in an orthotopic breast cancer model. Methods: GLV-1h153, a replication-competent vaccinia virus, was tested against breast cancer cell lines at various multiplicities of infection (MOIs). Cytotoxicity and viral replication were determined. Mammary fat pad tumors were generated in athymic nude mice. To determine the utility of GLV-1h153 in identifying positive surgical margins, 90% of the mammary fat pad tumors were surgically resected and subsequently injected with GLV-1h153 or phosphate buffered saline (PBS) in the surgical wound. Serial Focus 120 microPET images were obtained six hours post-tail vein injection of approximately 600 mu Ci of I-124-iodide. Results: Viral infectivity, measured by green fluorescent protein (GFP) expression, was time-and concentrationdependent. All cell lines showed less than 10% of cell survival five days after treatment at an MOI of 5. GLV-1h153 replicated efficiently in all cell lines with a peak titer of 27 million viral plaque forming units (PFU) ( < 10,000-fold increase from the initial viral dose) by Day 4. Administration of GLV-1h153 into the surgical wound allowed positive surgical margins to be identified via PET scanning. In vivo, mean volume of infected surgically resected residual tumors four weeks after treatment was 14 mm(3) versus 168 mm(3) in untreated controls (P < 0.05). Conclusions: This is the first study to our knowledge to demonstrate a novel vaccinia virus carrying hNIS as an imaging tool in identifying positive surgical margins of breast cancers in an orthotopic murine model. Moreover, our results suggest that GLV-1h153 is a promising therapeutic agent in achieving local control for positive surgical margins in resected breast tumors. KW - conservation KW - carcinoma KW - mastectomy KW - metastases KW - stage-i KW - thyroid-cancer KW - radiation-therapy KW - conserving surgery KW - sodium-iodide symporter Y1 - 2013 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-122140 VL - 15 IS - R26 ER - TY - JOUR A1 - Bárcena-Uribarri, Iván A1 - Thein, Marcus A1 - Maier, Elke A1 - Bonde, Mari A1 - Bergström, Sven A1 - Benz, Roland T1 - Use of Nonelectrolytes Reveals the Channel Size and Oligomeric Constitution of the Borrelia burgdorferi P66 Porin JF - PLoS ONE N2 - In the Lyme disease spirochete Borrelia burgdorferi, the outer membrane protein P66 is capable of pore formation with an atypical high single-channel conductance of 11 nS in 1 M KCl, which suggested that it could have a larger diameter than ‘normal’ Gram-negative bacterial porins. We studied the diameter of the P66 channel by analyzing its single-channel conductance in black lipid bilayers in the presence of different nonelectrolytes with known hydrodynamic radii. We calculated the filling of the channel with these nonelectrolytes and the results suggested that nonelectrolytes (NEs) with hydrodynamic radii of 0.34 nm or smaller pass through the pore, whereas neutral molecules with greater radii only partially filled the channel or were not able to enter it at all. The diameter of the entrance of the P66 channel was determined to be \(\leq\)1.9 nm and the channel has a central constriction of about 0.8 nm. The size of the channel appeared to be symmetrical as judged from one-sidedness of addition of NEs. Furthermore, the P66-induced membrane conductance could be blocked by 80–90% by the addition of the nonelectrolytes PEG 400, PEG 600 and maltohexaose to the aqueous phase in the low millimolar range. The analysis of the power density spectra of ion current through P66 after blockage with these NEs revealed no chemical reaction responsible for channel block. Interestingly, the blockage of the single-channel conductance of P66 by these NEs occurred in about eight subconductance states, indicating that the P66 channel could be an oligomer of about eight individual channels. The organization of P66 as a possible octamer was confirmed by Blue Native PAGE and immunoblot analysis, which both demonstrated that P66 forms a complex with a mass of approximately 460 kDa. Two dimension SDS PAGE revealed that P66 is the only polypeptide in the complex. KW - radii KW - hydrodynamics KW - SDS polyacrylamide gel electrophoresis KW - molecular mass KW - outer membrane proteins KW - single channel recording KW - blue native polyacrylamide gel electrophoresis KW - borrelia burgdorferi Y1 - 2013 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-129965 VL - 8 IS - 11 ER - TY - THES A1 - Karus, Christine T1 - Untersuchung der Architektur von Proteinstrukturen des Ranvier-Schnürrings mittels der super-hochauflösenden Mikroskopiemethode dSTORM T1 - Investigation of the architecture of protein structures of the Node of Ranvier using the super-high resolution microscopy method dSTORM N2 - Ranvier-Schnürringe spielen eine entscheidende Rolle bei der schnellen Weiterleitung von elektrischen Impulsen in Nervenzellen. Bei bestimmten neurologischen Erkrankungen, den Neuropathien, kann es zu Störungen in der ultrastrukturellen Organisation verschiedener Schnürring-Proteine kommen (Doppler et al., 2018, Doppler et al., 2016). Eine detailliertere Kenntnis der genauen Anordnung dieser Schnürring-Proteine und eventueller Abweichungen von dieser Anordnung im Krankheitsfall, könnte der Schlüssel zu einer vereinfachten Diagnostik von bestimmten Neuropathie- Formen sein. Ziel meiner Arbeit war es daher, die Untersuchung der ultrastrukturellen Architektur der (para-)nodalen Adhäsionsproteine Neurofascin-155 und Caspr1 unter Verwendung der super-hochauflösenden Mikroskopiemethode dSTORM (direct Stochastic Optical Reconstruction Microscopy) an murinen Zupfnervenpräparaten zu etablieren. Nach erster Optimierung der Probenpräparation für die 2-Farben-dSTORM sowie der korrelationsbasierten Bildanalyse, konnte ich mittels modellbasierter Simulation die zugrundeliegende Molekülorganisation identifizieren und mit Hilfe der Ergebnisse aus früheren Untersuchungen validieren. In einem translationalen Ansatz habe ich anschließend humane Zupfnervenpräparate von 14 Probanden mit unterschiedlichen Formen einer Neuropathie mikroskopiert und ausgewertet, um die Anwendbarkeit dieses Ansatzes in der Diagnostik zu testen. Obgleich keine signifikanten Unterschiede zwischen physiologischem und pathologischem neurologischem Gewebe hinsichtlich Neurofascin-155 und Caspr1 festgestellt werden konnten, scheint der Ansatz grundsätzlich dennoch vielversprechend zu sein, bedarf jedoch noch weiteren Anstrengungen hinsichtlich Probenpräparation, Auswertungs- und Versuchsprotokollen und einer größeren Anzahl an humanen Biopsien mit homogenerem Krankheitsbild. N2 - Nodes of Ranvier play a critical role in the rapid transmission of electrical impulses in neurons. In certain neurological diseases, the neuropathies, there may be disturbances in the ultrastructural organization of various nodal and paranodal proteins (Doppler et al., 2018, Doppler et al., 2016). A more detailed knowledge of the exact arrangement of these nodal and paranodal proteins and possible deviations from this arrangement in disease, could be the key to a simplified diagnosis of certain neuropathy forms. Therefore, the aim of my work was to establish the investigation of the ultrastructural architecture of the (para-)nodal adhesion proteins Neurofascin-155 and Caspr1 using the super-high resolution microscopy method dSTORM (direct Stochastic Optical Reconstruction Microscopy) on murine teased fibers. After initial optimization of sample preparation for 2-color dSTORM as well as correlation-based image analysis, I was able to identify the underlying molecular organization using model-based simulation and validate it using results from previous studies. In a translational approach, I then microscoped and evaluated human teased fibers from 14 subjects with different forms of neuropathy to test the applicability of this approach in diagnostics. Although no significant differences were found between physiological and pathological neurological tissue with respect to Neurofascin-155 and Caspr1, the approach still seems promising in principle, but requires further efforts with respect to sample preparation, evaluation and experimental protocols, and a larger number of human biopsies with more homogeneous disease patterns. KW - dSTORM KW - Ranvier-Schnürring Y1 - 2022 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-274568 N1 - die Dissertation ist ein Kooperationsprojekt dieser beiden Fakultäten ER - TY - JOUR A1 - Balakrishnan, Ashwin A1 - Hemmen, Katherina A1 - Choudhury, Susobhan A1 - Krohn, Jan-Hagen A1 - Jansen, Kerstin A1 - Friedrich, Mike A1 - Beliu, Gerti A1 - Sauer, Markus A1 - Lohse, Martin J. A1 - Heinze, Katrin G. T1 - Unraveling the hidden temporal range of fast β2-adrenergic receptor mobility by time-resolved fluorescence JF - Communications Biology N2 - G-protein-coupled receptors (GPCRs) are hypothesized to possess molecular mobility over a wide temporal range. Until now the temporal range has not been fully accessible due to the crucially limited temporal range of available methods. This in turn, may lead relevant dynamic constants to remain masked. Here, we expand this dynamic range by combining fluorescent techniques using a spot confocal setup. We decipher mobility constants of β\(_{2}\)-adrenergic receptor over a wide time range (nanosecond to second). Particularly, a translational mobility (10 µm\(^{2}\)/s), one order of magnitude faster than membrane associated lateral mobility that explains membrane protein turnover and suggests a wider picture of the GPCR availability on the plasma membrane. And a so far elusive rotational mobility (1-200 µs) which depicts a previously overlooked dynamic component that, despite all complexity, behaves largely as predicted by the Saffman-Delbrück model. KW - G-protein-coupled receptors KW - molecular mobility KW - temporal range Y1 - 2022 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-301140 VL - 5 IS - 1 ER - TY - JOUR A1 - Wölfel, Angela A1 - Sättele, Mathias A1 - Zechmeister, Christina A1 - Nikolaev, Viacheslov O. A1 - Lohse, Martin J. A1 - Boege, Fritz A1 - Jahns, Roland A1 - Boivin-Jahns, Valérie T1 - Unmasking features of the auto-epitope essential for β\(_1\)-adrenoceptor activation by autoantibodies in chronic heart failure JF - ESC Heart Failure N2 - Aims Chronic heart failure (CHF) can be caused by autoantibodies stimulating the heart via binding to first and/or second extracellular loops of cardiac β1-adrenoceptors. Allosteric receptor activation depends on conformational features of the autoantibody binding site. Elucidating these features will pave the way for the development of specific diagnostics and therapeutics. Our aim was (i) to fine-map the conformational epitope within the second extracellular loop of the human β\(_1\)-adrenoceptor (β1ECII) that is targeted by stimulating β\(_1\)-receptor (auto)antibodies and (ii) to generate competitive cyclopeptide inhibitors of allosteric receptor activation, which faithfully conserve the conformational auto-epitope. Methods and results Non-conserved amino acids within the β\(_1\)EC\(_{II}\) loop (compared with the amino acids constituting the ECII loop of the β\(_2\)-adrenoceptor) were one by one replaced with alanine; potential intra-loop disulfide bridges were probed by cysteine–serine exchanges. Effects on antibody binding and allosteric receptor activation were assessed (i) by (auto)antibody neutralization using cyclopeptides mimicking β1ECII ± the above replacements, and (ii) by (auto)antibody stimulation of human β\(_1\)-adrenoceptors bearing corresponding point mutations. With the use of stimulating β\(_1\)-receptor (auto)antibodies raised in mice, rats, or rabbits and isolated from exemplary dilated cardiomyopathy patients, our series of experiments unmasked two features of the β\(_1\)EC\(_{II}\) loop essential for (auto)antibody binding and allosteric receptor activation: (i) the NDPK\(^{211–214}\) motif and (ii) the intra-loop disulfide bond C\(^{209}\)↔C\(^{215}\). Of note, aberrant intra-loop disulfide bond C\(^{209}\)↔C\(^{216}\) almost fully disrupted the functional auto-epitope in cyclopeptides. Conclusions The conformational auto-epitope targeted by cardio-pathogenic β\(_1\)-receptor autoantibodies is faithfully conserved in cyclopeptide homologues of the β\(_1\)EC\(_{II}\) loop bearing the NDPK\(^{211–214}\) motif and the C\(^{209}\)↔C\(^{215}\) bridge while lacking cysteine C216. Such molecules provide promising tools for novel diagnostic and therapeutic approaches in β\(_1\)-autoantibodypositive CHF. KW - antibody/autoantibody KW - β1-adrenoceptor/β1-adrenergic receptor KW - chronic heart failure KW - conformational auto-epitope KW - cyclic peptides/cyclopeptides KW - cyclopeptide therapy Y1 - 2020 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-235974 VL - 7 IS - 4 ER - TY - THES A1 - Liess [née Eller], Anna Katharina Luise T1 - Understanding the regulation of the ubiquitin-conjugating enzyme UBE2S T1 - Die Regulation des Ubiquitin-konjugierenden Enzyms UBE2S N2 - The ubiquitination of proteins serves as molecular signal to control an enormous number of physiological processes and its dysregulation is connected to human diseases like cancer. The versatility of this signal stems from the diverse ways by which ubiquitin can be attached to its targets. Thus, specificity and tight regulation of the ubiquitination are pivotal requirements of ubiquitin signaling. Ubiquitin-conjugating enzymes (E2s) act at the heart of the ubiquitination cascade, transferring ubiquitin from a ubiquitin-activating enzyme (E1) to a ubiquitin ligase (E3) or substrate. When cooperating with a RING-type E3, ubiquitin-conjugating enzymes can determine linkage specificity in ubiquitin chain formation. Our understanding of the regulation of E2 activities is still limited at a structural level. The work described here identifies two regulation mechanisms in UBE2S, a cognate E2 of the human RING-type E3 anaphase-promoting complex/cyclosome (APC/C). UBE2S elongates ubiquitin chains on APC/C substrates in a Lys11 linkage-specific manner, thereby targeting these substrates for degradation and driving mitotic progression. In addition, UBE2S was found to have a role in DNA repair by enhancing non-homologous end-joining (NHEJ) and causing transcriptional arrest at DNA damage sites in homologous recombination (HR). Furthermore, UBE2S overexpression is a characteristic feature of many cancer types and is connected to poor prognosis and diminished response to therapy. The first regulatory mechanism uncovered in this thesis involves the intramolecular auto-ubiquitination of a particular lysine residue (Lys+5) close to the active site cysteine, presumably through conformational flexibility of the active site region. The Lys+5-linked ubiquitin molecule adopts a donor-like, ‘closed’ orientation towards UBE2S, thereby conferring auto-inhibition. Notably, Lys+5 is a major physiological ubiquitination site in ~25% of the human E2 enzymes, thus providing regulatory opportunities beyond UBE2S. Besides the active, monomeric state and the auto-inhibited state caused by auto-ubiquitination, I discovered that UBE2S can adopt a dimeric state. The latter also provides an auto-inhibited state, in which ubiquitin transfer is blocked via the obstruction of donor binding. UBE2S dimerization is promoted by its unique C-terminal extension, suppresses auto-ubiquitination and thereby the proteasomal degradation of UBE2S. Taken together, the data provided in this thesis illustrate the intricate ways by which UBE2S activity is fine-tuned and the notion that structurally diverse mechanisms have evolved to restrict the first step in the catalytic cycle of E2 enzymes. N2 - Die Ubiquitinierung von Proteinen fungiert als molekulares Signal zur Kontrolle einer Vielzahl physiologischer Prozesse, wobei eine gestörte Regulation der Ubiquitinierung eng mit zahlreichen Erkrankungen, wie beispielsweise Krebs, verbunden ist. Aufgrund der verschiedenen Verknüpfungsmöglichkeiten von Ubiquitin, die das zelluläre Schicksal des Zielproteins bestimmen, sind Spezifität und stringente Regulation unabkömmliche Voraussetzungen im Ubiquitinierungsprozess. Ubiquitin-konjugierende Enzyme (E2s) fungieren in der Mitte der Ubiquitinierungskaskade. Sie übernehmen ein Ubiquitinmolekül vom Ubiquitin-aktivierenden Enzym (E1) und übertragen es auf eine Ubiquitin-Ligase (E3) oder direkt auf das Zielprotein. Arbeiten Ubiquitin-konjugierende Enzyme mit E3s des RING-Typus zusammen, so bestimmen E2s die Art der Verknüpfung. Die Regulation der Aktivität Ubiquitin-konjugierender Enzyme auf struktureller Ebene ist jedoch bisher nur bedingt verstanden. Die hier dargelegte Arbeit umfasst die Identifizierung zweier Regulationsmechanismen des Ubiquitin-konjugierenden Enzyms UBE2S. UBE2S arbeitet mit einem humanen E3 des RING-Typus‚ dem ‚Anaphase Promoting Complex/Cyclosome‘ (APC/C) zusammen und bildet Lys11-spezifische Ubiquitinketten auf Substraten des APC/Cs. Hierdurch werden die Substrate für den Abbau durch das Proteasom markiert, was das Fortschreiten der Mitose bedingt. Zusätzlich wird UBE2S eine Rolle in der DNS-Reparatur zugeschrieben. Hierbei verstärkt UBE2S die nicht-homologe Rekombination (NHEJ) und verhindert außerdem die Transkription an DNS-Bruchstellen, die durch Homologe Rekombination (HR) repariert werden. Die Überexpression von UBE2S ist ein Charakteristikum verschiedenster Krebsarten, vermindert den Erfolg herkömmlicher Krebstherapien, und führt somit zu schlechten Prognosen für betroffenen Patienten. Der erste hier beschriebene Regulationsmechanismus beinhaltet die intramolekulare Ubiquitinierung eines Lysins (Lys+5) nahe des katalytischen Cysteins, mutmaßlich durch strukturelle Flexibilität der Region des aktiven Zentrums. Das Lys+5-verknüpfte Ubiquitin nimmt eine Donorubiquitin-ähnliche Position auf UBE2S ein, wodurch UBE2S gehemmt wird. Da ein Lysin an der Position +5 in ~25% der humanen E2-Enzyme vorhanden und eine physiologische Ubiquitinierungsstelle ist, birgt dieser Mechanismus Regulationsmöglichkeiten über UBE2S hinaus. Zusätzlich zum aktiven monomeren Zustand und dem durch Autoubiquitinierung ausgelösten inhibierten Zustand, kann UBE2S auch als Dimer vorliegen. In diesem Zustand ist es ebenfalls inaktiv, da die Donorubiquitin-Bindestelle auf UBE2S durch ein zweites Molekül des E2s blockiert wird. Begünstigt wird die Dimerisierung durch die C-terminale Verlängerung von UBE2S und verhindert so deren Autoubiquitinierung, und folglich den proteasomalen Abbau von UBE2S. Es handelt sich hierbei somit um einen zweiten Regulationsmechanismus von UBE2S. Zusammenfassend veranschaulichen die in dieser Arbeit dargelegten Daten die komplexen Möglichkeiten, durch die die Aktivität von UBE2S reguliert werden kann, sowie die Erkenntnis, dass strukturell unterschiedliche Mechanismen existieren, um den ersten Schritt der von Ubiquitin-konjugierenden Enzymen katalysierten Reaktion zu hemmen. KW - E2 KW - Regulation KW - Ubiquitin KW - Mechanismus KW - UBE2S KW - structural mechanism KW - Ubiquitin-conjugating enzyme KW - regulation Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-204190 ER - TY - THES A1 - Truongvan, Ngoc T1 - Understanding the dual specificity of UBA6 T1 - Einblick in die duale Spezifität von UBA6 N2 - Ubiquitylation is a protein post translational modification, in which ubiquitin is covalently attached to target protein substrates resulting in diverse cellular outcomes. Besides ubiquitin, various ubiquitin-like proteins including FAT10 exist, which are also conjugated to target proteins. The underlying modification mechanisms are conserved. In the initial step, ubiquitin or a ubiquitin-like protein is thioester-linked to a catalytic cysteine in the E1activating enzyme in an ATP-dependent manner. The respective protein modifier is then transferred to an E2 conjugating enzyme in a transthioesterification reaction. Finally, an E3 ubiquitin ligase E3 catalyzes the covalent attachment of the protein modifier to a substrate. In the case of ubiquitin, multiple ubiquitin molecules can be attached to a substrate in the form of either linear or branched polyubiquitin chains but also as single ubiquitin modifications. Depending on the nature of the ubiquitin chain, the substrates are destined to various cellular processes such as their targeted destruction by the proteasome but also non-degradative outcomes may occur. As stated above FAT10 is a ubiquitin-like protein modifier which typically targets proteins for proteasomal degradation. It consists of two ubiquitin-like domains and is mainly expressed in cells of the human immune system. The reported involvement of FAT10 modifications in cancers and other diseases has caught the attention of the scientific community as an inhibition of the FAT10ylation process may provide avenues for novel therapeutic approaches. UBA6 is the E1 activating enzyme that resides at the apex of the FAT10 proteasomal degradation pathway. UBA6 not only recognizes FAT10 but can also activate ubiquitin as efficiently as the ubiquitin specific E1 UBA1. The dual specificity of UBA6 may complicate the inhibition FAT10ylation since targeting the active site of UBA6 will also inhibit the UBA6-catalyzed ubiquitin activation. Therefore, it is important to understand the underlying principles for the dual specificity of UBA6 prior to the development of compounds interfering with FAT10ylation. In this thesis important novel insights into the structure and function of UBA6 were derived by X-ray crystallography and biochemical methods. The first crystal structure of UBA6 reveals the multidomain architecture of this enzyme in atomic detail. The enzyme is composed of a rigid core including its active and inactive adenylation domains as well as a 4 helix bundle. Overall, the molecule adopts a “Y” shape architecture with the core at the base and the first and second catalytic half domains forming one arm of the “Y” and the ubiquitin fold domain constituting the other arm. While UBA6 shares the same domain architecture as UBA1, substantial differences were revealed by the crystal structure. In particular, the first catalytic half domain undergoes a significant shift to a position more distal from the core. This rigid body movement is assumed to generate room to accommodate the second ubiquitin-like domain of FAT10. Differences are also observed in a hydrophobic platform between the core and the first catalytic half domain and the adenylation active site in the core, which together from the binding sites for ubiquitin and FAT10. Site directed mutagenesis of key residues in these areas altered the UBA6-catalyzed activation of ubiquitin and FAT10. UBA6 variants were generated with the goal of trying to block the activation of FAT10 while still maintaining that of ubiquitin activation, in order to fully explain the dual specificity of UBA6. However, none of these mutations could block the activation of FAT10, while some of these UBA6 variants blocked ubiquitin activation. Preliminary inhibition assays with a group of E1 inhibitors belonging to the adenosyl sulfamate family demonstrated potent inhibition of FAT10ylation for two compounds. The dual specificity of UBA6 hence needs to be further examined by biochemical and structural methods. In particular, the structure of a complex between UBA6 and ubiquitin or FAT10 would provide key insights for further biochemical studies, ultimately allowing the targeted inhibition of the FAT10ylation machinery. N2 - Der Prozess der Ubiquitinierung stellt eine posttranslationale Modifikation dar, bei der das kleine Protein Ubiquitin kovalent an ein Zielprotein angehängt wird, was zu verschiedenen zellulären Effekten führt. Neben Ubiquitin existieren verschiedene ubiquitinähnliche Proteine, wie z.B. FAT10, die an Zielproteine angehängt werden können. Die der Modifikation zugrunde liegenenden Mechanismen der Proteinmodifikation sind konserviert. Im ersten Schritt wird Ubiquitin oder das ubiquitinähnliche Protein in einer ATP-abhängigen Reaktion kovalent an das katalytische Cystein des aktivierenden Enzyms (E1) gebunden. Danach wird es durch Transthioestherifizierung an ein konjugierendes Enzym (E2) übertagen und schließlich durch eine Ligase (E3) kovalent an das Substrat gehängt. Ubiquitin kann entweder einzeln oder in Form linearer oder verzweigter Ketten an ein Substrat angehängt werden, was wiederum zu verschiedenen funktionalen Konsequenzen wie dem Abbau das Proteins durch das Proteasom führen kann. Wie schon erwähnt ist FAT10 ein ubiquitinähliches Protein, das üblicherweise Zielproteine für den Abbau durch das Proteasom markiert. Es besteht aus zwei ubiquitinähnlichen Domänen und wird im Menschen hauptsächlich in Zellen des Immunsystems exprimiert. Die Beteiligung von FAT10 an der Entstehung von Krebs and anderen Krankheiten hat die Aufmerksamkeit der wissenschaftlichen Gemeinschaft erregt, da Inhibition des ‚FAT10ylation‘ Prozesses einen neuen therapeutischen Ansatz zur Behandlung dieser Krankheiten darstellen könnte. UBA6 fungiert hierbei als E1 s Enzym, das am Anfang des FAT10-abhängigen proteasomalen Abbaus steht. UBA6 aktiviert neben FAT10 auch Ubiquitin mit ähnlicher Effizienz wie das ubiquitinspezifische E1 UBA1. Diese Bispezifität von UBA6 könnte die Inhibition der FAT10ylierung erschweren, da die Inhibition der katalytischen UBA6 Aktivität gleichzeitig UBA6-abhängige Ubiquitinaktivierung behindern würde. Daher ist für die zukünfitge Entwicklung FAT10-spezifischer UBA6 Inhibitoren ein grundlegendes Verständnis der UBA6 Bispezifität unerlässlich. In dieser Dissertation wurden wichtige, neue Einsichten in die Struktur und Funktion von UBA6 durch Röntgenkristallographie und biochemische Methoden gewonnen. Die erste Kristallstruktur von UBA6 zeigt die Multidomänenarchitektur des Enzyms bei atomarer Auflösung. Das Protein besteht aus einem starren Kern, der sowohl seine aktive als auch inaktive Adenylierungsdomäne sowie ein 4-Helix Bündel enthält. Das Molekül nimmt eine an ein Y erinnnernde Form ein, in der der Kern die Basis, die erste und zweite katalytischen Halbdomänen einen Arm und die ubiquitinähnliche gefaltete Domäne den zweiten Arm darstellen. Zwar ähneln sich der Domänenaufbau von UBA6 und UBA1, jedoch zeigte die Kristallstruktur bedeutende Unterschiede zwischen den beiden auf. Speziell die erste katalytische Halbdomäne ist in UBA6 im Vergleich zu UBA1weiter vom Enzymkern entfernt. Diese ‚Bewegung‘ erlaubt wahrscheinlich die Platzierung der zweiten UBL-Domäne von FAT10. Weitere Unterschiede konnten auch in der hydrophoben Oberfläche zwischen Kern, erster katalytischer Halbdomäne und dem aktiven Zentrum für die Adenylierung im Kern beobachtet werden, die zusammen die Bindestelle für Ubiquitin und FAT10 bilden. Durch ortsgerichtete Mutagenese von Schlüsselpositionen in dieser Region kontte die UBA6-katalysierte Aktivierung von entweder Ubiquitin oder FAT10 unterbunden werden. Um die Bispezifität von UBA6 zu entschlüsseln wurden UBA6 Varianten mit dem Ziel erzeugt, die Aktivierung von FAT10 unter Aufrechterhaltung der von Ubiquitin zu blockieren. Obwohl keine dieser Mutationen die FAT10-Aktivierung unterband, verhinderten einige jedoch die Aktivierung von Ubiquitin. Vorläufige Inhibitionsexperimente mit E1-Inhibitoren aus der Adenosylsulfamat Klasse zeigten starke Inhibition der FAT10ylierung durch zwei Verbindungen. Die Bispezifität von UBA6 bedarf weiterer strukturbiologischer und biochemischer Untersuchungen. Vor allem Kristallstrukturen von UBA6 in FAT10 und Ubiquitin-gebundener Form würden wichtige Erkenntnisse für weiteregehende biochemische Untersuchungen und schließlich die gezielte Unterdrückung der FAT10ylierungsmaschinerie liefern. KW - Ubiquitylation KW - FAT10ylation KW - UBA6 KW - UBE2Z Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-244579 ER - TY - JOUR A1 - Goos, Carina A1 - Dejung, Mario A1 - Wehman, Ann M. A1 - M-Natus, Elisabeth A1 - Schmidt, Johannes A1 - Sunter, Jack A1 - Engstler, Markus A1 - Butter, Falk A1 - Kramer, Susanne T1 - Trypanosomes can initiate nuclear export co-transcriptionally JF - Nucleic Acids Research N2 - The nuclear envelope serves as important messenger RNA (mRNA) surveillance system. In yeast and human, several control systems act in parallel to prevent nuclear export of unprocessed mRNAs. Trypanosomes lack homologues to most of the involved proteins and their nuclear mRNA metabolism is non-conventional exemplified by polycistronic transcription and mRNA processing by trans-splicing. We here visualized nuclear export in trypanosomes by intra- and intermolecular multi-colour single molecule FISH. We found that, in striking contrast to other eukaryotes, the initiation of nuclear export requires neither the completion of transcription nor splicing. Nevertheless, we show that unspliced mRNAs are mostly prevented from reaching the nucleus-distant cytoplasm and instead accumulate at the nuclear periphery in cytoplasmic nuclear periphery granules (NPGs). Further characterization of NPGs by electron microscopy and proteomics revealed that the granules are located at the cytoplasmic site of the nuclear pores and contain most cytoplasmic RNA-binding proteins but none of the major translation initiation factors, consistent with a function in preventing faulty mRNAs from reaching translation. Our data indicate that trypanosomes regulate the completion of nuclear export, rather than the initiation. Nuclear export control remains poorly understood, in any organism, and the described way of control may not be restricted to trypanosomes. KW - molecular biology KW - nuclear export KW - trypanosomes KW - mRNA KW - nuclear envelope Y1 - 2019 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-177709 VL - 47 IS - 1 ER - TY - JOUR A1 - Szalay, Aladar A A1 - Weibel, Stephanie A1 - Hofmann, Elisabeth A1 - Basse-Luesebrink, Thomas Christian A1 - Donat, Ulrike A1 - Seubert, Carolin A1 - Adelfinger, Marion A1 - Gnamlin, Prisca A1 - Kober, Christina A1 - Frentzen, Alexa A1 - Gentschev, Ivaylo A1 - Jakob, Peter Michael T1 - Treatment of malignant effusion by oncolytic virotherapy in an experimental subcutaneous xenograft model of lung cancer JF - Journal of Translational Medicine N2 - Background Malignant pleural effusion (MPE) is associated with advanced stages of lung cancer and is mainly dependent on invasion of the pleura and expression of vascular endothelial growth factor (VEGF) by cancer cells. As MPE indicates an incurable disease with limited palliative treatment options and poor outcome, there is an urgent need for new and efficient treatment options. Methods In this study, we used subcutaneously generated PC14PE6 lung adenocarcinoma xenografts in athymic mice that developed subcutaneous malignant effusions (ME) which mimic pleural effusions of the orthotopic model. Using this approach monitoring of therapeutic intervention was facilitated by direct observation of subcutaneous ME formation without the need of sacrificing mice or special imaging equipment as in case of MPE. Further, we tested oncolytic virotherapy using Vaccinia virus as a novel treatment modality against ME in this subcutaneous PC14PE6 xenograft model of advanced lung adenocarcinoma. Results We demonstrated significant therapeutic efficacy of Vaccinia virus treatment of both advanced lung adenocarcinoma and tumor-associated ME. We attribute the efficacy to the virus-mediated reduction of tumor cell-derived VEGF levels in tumors, decreased invasion of tumor cells into the peritumoral tissue, and to viral infection of the blood vessel-invading tumor cells. Moreover, we showed that the use of oncolytic Vaccinia virus encoding for a single-chain antibody (scAb) against VEGF (GLAF-1) significantly enhanced mono-therapy of oncolytic treatment. Conclusions Here, we demonstrate for the first time that oncolytic virotherapy using tumor-specific Vaccinia virus represents a novel and promising treatment modality for therapy of ME associated with advanced lung cancer. KW - Oncolytic virotherapy KW - Malignant effusion KW - Lung cancer KW - VEGF KW - Lungenkrebs KW - Vascular endothelial Growth Factor Y1 - 2013 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-96016 UR - http://www.translational-medicine.com/content/11/1/106 ER - TY - THES A1 - Luckner, Sylvia T1 - Towards the development of high affinity InhA and KasA inhibitors with activity against drug-resistant strains of Mycobacterium tuberculosis T1 - Entwicklung von hoch-affinen InhA und KasA Inhibitoren gegen resistente Stämme von Mycobacterium tuberculosis N2 - Mycobacterium tuberculosis is the causative agent of tuberculosis and responsible for more than eight million new infections and about two million deaths each year. Novel chemotherapeutics are urgently needed to treat the emerging threat of multi drug resistant and extensively drug resistant strains. Cell wall biosynthesis is a widely used target for chemotherapeutic intervention in bacterial infections. In mycobacteria, the cell wall is comprised of mycolic acids, very long chain fatty acids that provide protection and allow the bacteria to persist in the human macrophage. The type II fatty acid biosynthesis pathway in Mycobacterium tuberculosis synthesizes fatty acids with a length of up to 56 carbon atoms that are the precursors of the critical mycobacterial cell wall components mycolic acids. KasA, the mycobacterial ß-ketoacyl synthase and InhA, the mycobacterial enoyl reductase, are essential enzymes in the fatty acid biosynthesis pathway and validated drug targets. In this work, KasA was expressed in Mycobacterium smegmatis, purified and co-crystallized in complex with the natural thiolactone antibiotic thiolactomycin (TLM). High-resolution crystal structures of KasA and the C171Q KasA variant, which mimics the acyl enzyme intermediate of the enzyme, were solved in absence and presence of bound TLM. The crystal structures reveal how the inhibitor is coordinated by the enzyme and thus specifically pinpoint towards possible modifications to increase the affinity of the compound and develop potent new drugs against tuberculosis. Comparisons between the TLM bound crystal structures explain the preferential binding of TLM to the acylated form of KasA. Furthermore, long polyethylene glycol molecules are bound to KasA that mimic a fatty acid substrate of approximately 40 carbon atoms length. These structures thus provide the first insights into the molecular mechanism of substrate recognition and reveal how a wax-like substance can be accommodated in a cytosolic environment. InhA was purified and co-crystallized in complex with the slow, tight binding inhibitor 2-(o-tolyloxy)-5-hexylphenol (PT70). Two crystal structures of the ternary InhA-NAD+-PT70 were solved and reveal how the inhibitor is bound to the substrate binding pocket. Both structures display an ordered substrate binding loop and corroborate the hypothesis that slow onset inhibition is coupled to loop ordering. Upon loop ordering, the active site entrance is more restricted and the inhibitor is kept inside more tightly. These studies provide additional information on the mechanistic imperatives for slow onset inhibition of enoyl ACP reductases. N2 - Mycobacterium tuberculosis, der Erreger der Tuberkulose ist für mehr als acht Millionen Neu-Infektionen und ungefähr zwei Millionen Todesfälle jedes Jahr verantwortlich. Besonders die Entwicklung von multiresistenten und extrem resistenten Stämmen macht die Entwicklung neuer Medikamente gegen Tuberkulose dringend erforderlich. Die Zellwandbiosynthese ist ein validiertes Ziel für die Chemotherapie bei bakteriellen Infektionen. Bei Mycobakterien besteht die Zellwand zum Großteil aus Mykolsäuren, sehr langkettigen Fettsäuren, die den Bakterien Schutz bieten und ihnen ermöglichen, in Makrophagen zu überleben. Mycobakterien synthetisieren in der Fettsäurebiosynthese II (FAS-II) Fettsäuren bis zu einer Länge von 56 Kohlenstoffatomen, die Bestandteile der Mykolsäuren sind. KasA, die mycobakterielle ß-ketoacyl Synthase und InhA, die mycobakterielle enoyl Reductase, sind essentielle Enzyme der FAS-II und geeignete Ziele für die Entwicklung neuer Antibiotika. In dieser Arbeit wurde KasA in Mycobacterium smegmatis exprimiert und aufgereinigt. Das Protein wurde im Komplex mit dem natürlich vorkommenden Thiolacton-Antibiotikum Thiolactomycin (TLM) co-kristallisiert. Kristallstrukturen von KasA und der C171Q KasA Variante, die das acylierte Enzym-Intermediat darstellt, wurden als apo-Strukturen und im Komplex mit gebundenem TLM aufgeklärt. Die Kristallstrukturen zeigen, wie der Inhibitor an das Enzym gebunden ist und deuten darauf hin, wie das TLM Molekül verändert werden könnte, um seine Affinität für das Protein zu erhöhen und damit ein wirksames Medikament gegen Tuberkulose zu entwickeln. Vergleiche zwischen den TLM gebundenen Kristallstrukturen erklären, warum TLM bevorzugt an die acylierte Form des Enzyms bindet. Des Weiteren sind lange Polyethylenglykol-Moleküle an KasA gebunden, die ein Fettsäuresubstrat einer Länge von etwa 40 Kohlenstoff-Atomen nachahmen. Die Strukturen geben damit zum ersten Mal einen Einblick in den molekularen Mechanismus der Substrat-Erkennung und zeigen, wie eine wachsartige Substanz in einem cytosolischen Umfeld aufgenommen werden kann. InhA wurde aufgereinigt und im Komplex mit dem „slow binding“ Inhibitor 2-(o-tolyloxy)-5-hexylphenol (PT70) co-kristallisiert. Zwei Kristallstrukturen des ternären InhA-NAD+-PT70 Komplexes wurden gelöst und zeigen wie der Inhibitor in der Substratbindetasche gebunden ist. Beide Strukturen, weisen geordnete Substrat-Binde-Loops auf, die den Eingang zur „Active Site“ schließen und damit den gebundenen Inhibitor in der Tasche festhalten. Die Strukturen bestätigen damit die Hypothese, dass „Slow Binding Inhibition“ mit der Ordnung des Loops zusammenhängt. Diese Studien können als Basis für die Entwicklung weiterer „Slow Binding“ Inhibitoren verwendet werden. KW - Tuberkelbakterium KW - Multidrug-Resistenz KW - Arzneimitteldesign KW - Fettsäure-Synthase KW - Zellwand KW - Kristallstruktur KW - tuberculosis KW - multi-drug-resistance KW - drug development KW - fatty acid synthesis KW - cell wall KW - crystal structure KW - structure based drug design Y1 - 2009 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-43621 ER - TY - THES A1 - Chouhan, Nitin Singh T1 - Time-odor learning in \(Drosophila\) \(melanogaster\) T1 - Olfaktorisches Zeitgedächtnis bei \(Drosophila\) \(melanogaster\) N2 - Endogenous clocks help animals to anticipate the daily environmental changes. These internal clocks rely on environmental cues, called Zeitgeber, for synchronization. The molecular clock consists of transcription-translation feedback loops and is located in about 150 neurons (Helfrich-Förster and Homberg, 1993; Helfrich-Förster, 2005). The core clock has the proteins Clock (CLK) and Cycle (CYC) that together act as a transcription activator for period (per) and timeless (tim) which then, via PER and TIM block their own transcription by inhibiting CLK/CYC activity (Darlington et al., 1998; Hardin, 2005; Dubruille and Emery, 2008). Light signals trigger the degradation of TIM through a blue-light sensing protein Cryptochrome (CRY) and thus, allows CLK/CYC to resume per and tim transcription (Emery et al., 1998; Stanewsky et al., 1998). Therefore, light acts as an important Zeitgeber for the clock entrainment. The mammalian clock consists of similarly intertwined feedback loops. Endogenous clocks facilitate appropriate alterations in a variety of behaviors according to the time of day. Also, these clocks can provide the phase information to the memory centers of the brain to form the time of day related associations (TOD). TOD memories promote appropriate usage of resources and concurrently better the survival success of an animal. For instance, animals can form time-place associations related to the availability of a biologically significant stimulus like food or mate. Such memories will help the animal to obtain resources at different locations at the appropriate time of day. The significance of these memories is supported by the fact that many organisms including bees, ants, rats and mice demonstrate time-place learning (Biebach et al. 1991; Mistlberger et al. 1997; Van der Zee et al. 2008; Wenger et al. 1991). Previous studies have shown that TOD related memories rely on an internal clock, but the identity of the clock and the underlying mechanism remain less well understood. The present study demonstrates that flies can also form TOD associated odor memories and further seeks to identify the appropriate mechanism. Hungry flies were trained in the morning to associate odor A with the sucrose reward and subsequently were exposed to odor B without reward. The same flies were exposed in the afternoon to odor B with and odor A without reward. Two cycles of the 65 reversal training on two subsequent days resulted in the significant retrieval of specific odor memories in the morning and afternoon tests. Therefore, flies were able to modulate their odor preference according to the time of day. In contrast, flies trained in a non-reversal manner were unable to form TOD related memories. The study also demonstrates that flies are only able to form time-odor memories when the two reciprocal training cycles occur at a minimum 6 h interval. This work also highlights the role of the internal state of flies in establishing timeodor memories. Prolonged starvation motivates flies to appropriate their search for the food. It increases the cost associated with a wrong choice in the T-maze test as it precludes the food discovery. Accordingly, an extended starvation promotes the TOD related changes in the odor preference in flies already with a single cycle of reversal training. Intriguingly, prolonged starvation is required for the time-odor memory acquisition but is dispensable during the memory retrieval. Endogenous oscillators promote time-odor associations in flies. Flies in constant darkness have functional rhythms and can form time-odor memories. In contrast, flies kept in constant light become arrhythmic and demonstrated no change in their odor preference through the day. Also, clock mutant flies per01 and clkAR, show compromised performance compared to CS flies when trained in the time-odor conditioning assay. These results suggest that flies need a per and clk dependent oscillator for establishing TOD related memories. Also, the clock governed rhythms are necessary for the timeodor memory acquisition but not for the retrieval. Pigment-Dispersing Factor (PDF) neuropeptide is a clock output factor (Park and Hall, 1998; Park et al., 2000; Helfrich-Förster, 2009). pdf01 mutant flies are unable to form significant time-odor memories. PDF is released by 8 neurons per hemisphere in the fly brain. This cluster includes the small (s-LNvs) and large (l-LNvs) ventral lateral neurons. Restoring PDF in these 16 neurons in the pdf01 mutant background rescues the time-odor learning defect. The PDF neuropeptide activates a seven transmembrane G-protein coupled receptor (PDFR) which is broadly expressed in the fly brain (Hyun et al., 2005). The present study shows that the expression of PDFR in about 10 dorsal neurons (DN1p) is sufficient for robust time-odor associations in flies. 66 In conclusion, flies use distinct endogenous oscillators to acquire and retrieve time-odor memories. The first oscillator is light dependent and likely signals through the PDF neuropeptide to promote the usage of the time as an associative cue during appetitive conditioning. In contrast, the second clock is light independent and specifically signals the time information for the memory retrieval. The identity of this clock and the underlying mechanism are open to investigation. N2 - Die endogenen circadianen Uhren helfen Tieren, die täglichen Veränderungen der Umwelt zu antizipieren. Diese internen Uhren stützen sich auf externe Umweltreize, sogenannte Zeitgeber, die den Tagesrhythmus vorgeben. Im Fliegengehirn bilden etwa 150 Neuronen die zentrale innere Uhr (Helfrich-Förster and Homberg, 1993; Helfrich- Förster, 2005). Diese Neuronen exprimieren die molekulare Uhr, die aus Transkriptions- Translations-Feedback-Schleifen besteht. Die Uhr besitzt die Proteine Clock (CLK) und Cycle (CYC), die zusammen die Transkription von period (per) und timeless (tim) aktivieren. PER und TIM bilden dann ein Heterodimer um die Transkription von clk und cyc zu blockieren (Darlington et al., 1998; Hardin, 2005; Dubruille and Emery, 2008). Lichtsignale lösen den Abbau von TIM durch das für blaues Licht sensitive‚ 'Sensing Protein Cryptochrome‘ (CRY) aus, daß wiederum CLK und CYC freisetzt um die per und tim Transkription wieder aufzunehmen (Emery et al., 1998; Stanewsky et al., 1998). Daher wirkt Licht als wichtiger Zeitgeber. Die innere Uhr der Säuger besteht aus ähnlich miteinander verflochtenen Rückkopplungsschleifen. Die internen Uhren ermöglichen und erleichtern Verhaltensveränderungen in einer Vielzahl von Situation, entsprechend der Tageszeit. Zudem wird die Information den jeweiligen Speicherorten im Gehirn bereit gestellt, um zeitbezogene Gedächtnisbildung zu ermöglichen. Zeitabhängige Gedächtnisbildung sorgt für eine angemessene Nutzung der Ressourcen und sichert gleichzeitig das Überleben des Tieres. Zum Beispiel können Tiere Zeit-Ort-Assoziationen im Zusammenhang mit der Verfügbarkeit einer biologisch wichtigen Ressource, wie Nahrung oder Paarungspartnern bilden. Solche Assoziationen helfen dem Tier Ressourcen an verschiedenen Orten, abhängig von der Tageszeit, zu erschließen. Die Wichtigkeit dieser Fähigkeit wird durch die Tatsache gestützt, daß zum Beispiel Bienen, Ameisen, Ratten und Mäuse ein zeitlich abhängiges Ortgedächtnis bilden können (Biebach et al. 1991; Mistlberger et al. 1997; Van der Zee et al. 2008; Wenger et al. 1991). Frühere Studien haben gezeigt, daß zeitbezogene Erinnerungen auf einer internen Uhr beruhen. Die genaue Identität dieser Uhr und die zugrunde liegenden Mechanismen sind jedoch nicht ausreichend bekannt. In der vorliegenden Studie wird gezeigt, daß Fliegen in der Lage sind ein zeitabhängiges olfaktorisches Gedächtnis zu bilden. Zudem wird versucht die zugrunde liegenden molekularen Mechanismen zu identifizieren. Hungrige Fliegen werden zu verschiedenen Tageszeiten konditioniert verschiedene Gerüche mit einer Saccharose-Belohnung zu assoziieren. Morgens ist Geruch A mit Zucker gepaart während Geruch B ohne Zucker präsentiert wird, am Nachmittag ist Geruch B belohnt, Geruch A nicht. Dieses reziproke Training wird an zwei aufeinander folgenden Tagen durchgeführt. Am dritten Tag werden die Fliegen entweder am Morgen oder Nachmittag auf ihre Geruchspräferenz zwischen A und B getestet. Die Fliegen modulieren ihre Geruchspräferenz abhängig von der Tageszeit. Im Gegensatz dazu sind Fliegen, die nicht mittels eines reziproken Trainings konditioniert wurden, nicht in der Lage, ein zeitabhängiges olfaktorisches Gedächtnis zu bilden. Die Ergebnisse zeigen auch, daß Fliegen nur dann in der Lage sind zeitbezogene Erinnerungen zu bilden, wenn die beiden reziproken Trainingszyklen mindestens 6 h voneinander getrennt durchgeführt werden. Die Arbeit ebeleuchtet zudem die Rolle des internen Zustands der Fliegen im Kontext des zeitabhängigen olfaktorischen Gedächtnisses. Länger andauernder Hunger motiviert die Fliegen stärker ihre Suche nach Nahrung zeitlich anzupassen. Schon ein Zyklus reziproken Trainings reicht für die Bildung Zeit-spezifischen Geruchsgedächtnisses aus. Die Erhöhung der Kosten, die mit einer falschen Wahl in einem T-maze-Test verbunden ist, kann offenbar zeitabhängige Änderungen der Geruchspräferenzen in Fliegen begünstigen. Erstaunlicherweise begünstigt der Hunger speziell die Gedächtnisbildung, ist jedoch für den Test nicht erforderlich. Endogene circadiane Oszillatoren werden für das zeitabhängige olfaktorische Gedächtnis der Fliegen gebraucht. Fliegen, die im Dauerdunkel gehalten wurden, zeigen rhythmisches Verhalten so wie zeitbezogenes olfaktorisches Gedächtnis. Im Gegensatz dazu sind im Dauerlicht aufgezogene Fliegen arrhythmisch und zeigen kein Zeit-spezifisches Geruchsgedächtnis. Zudem sind auch die arrhythmischen Mutanten per01 und clkAR in der Zeit-Geruchskonditionierung gestört. Diese Ergebnisse legen nahe, daß Fliegen einen per- und clk-abhängigen Oszillator benötigen, der von externen Lichtsignalen abhängig ist, um ein zeitabhängiges olfaktorisches Gedächtnis zu bilden. Außerdem wird der durch die innere Uhr vorgegebene Rhythmus nur während der Gedächtnisbildung und nicht für das Abrufen des Gelernten benötigt. Pigment dispersing factor (PDF) ist ein Neuropeptid, das von Neuronen der inneren Uhr gebildet wird (Park and Hall, 1998; Park et al., 2000; Helfrich-Förster, 2009). Die pdf01-Mutante ist nicht in der Lage ein signifikantes zeitbezogenes olfaktorisches Gedächtnis zu bilden. PDF wird von jeweils einer Gruppe von 8 Neuronen pro Hemisphäre, die die kleinen und großen ventral-lateralen Neuronen umfaßt, sezerniert. Die Wiederherstellung der Expression von PDF in diesen 16 Neuronen im pdf01 Mutanten Hintergrund, rettet das zeitabhängige olfaktorische Gedächtnis. Das PDF-Neuropeptid aktiviert einen sieben-Transmembran-G-Protein- gekoppelten Rezeptor (PDFR), der weit verbreitet im Fliegenhirn exprimiert wird (Hyun et al., 2005). Diese Studie zeigt, daß die Expression von PDFR in ~ 10 dorsalen Neuronen (DN1p) für eine robuste zeitabhängige olfaktorische Gedächtnisbildung in Fliegen ausreicht. Zusammenfassend läßt sich sagen, daß Fliegen verschiedene endogene Oszillatoren benutzen um ein zeitabhängiges olfaktorische Gedächtnis zu bilden und abzurufen. Der erste Oszillator ist lichtabhängig und wahrscheinlich durch das PDF- Neuropeptid vermittelt. Es ermöglicht die Verwendung der Information 'Zeit' als assoziatives Signal während der appetitiven Konditionierung. Im Gegensatz dazu ist die zweite Uhr lichtunabhängig und vermittelt speziell die Zeitinformation für die Gedächtnisabfrage. Die Identität der zweiten Uhr und der zugrunde liegende Mechanismus sowie die zugrunde liegende Kommunikation zwischen den Neuronen, bedarf weiterer Untersuchungen. KW - Learning and memory KW - Circadian rhythms KW - Odor-feeding-time memory KW - Taufliege KW - Tagesrhythmus KW - Geruchswahrnehmung KW - Konditionierung KW - Molekulargenetik Y1 - 2017 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-145675 ER - TY - THES A1 - Weigel [verh. Hoffmann], Mathis Leonard T1 - Thrombozytenfunktionsanalyse als potenzielles Instrument zur Früherkennung von Sepsis T1 - Platelet function analysis as a potential tool for early sepsis diagnosis N2 - Sepsis ist ein häufiges und akut lebensbedrohliches Syndrom, das eine Organfunktionsstörung in Folge einer dysregulierten Immunantwort auf eine Infektion beschreibt. Eine frühzeitige Diagnosestellung und Therapieeinleitung sind von zentraler Bedeutung für das Überleben der Patient:innen. In einer Pilotstudie konnte unsere Forschungsgruppe mittels Durchflusszytometrie eine ausgeprägte Hyporeaktivität der Thrombozyten bei Sepsis nachweisen, die einen potenziell neuen Biomarker zur Sepsis-Früherkennung darstellt. Zur Evaluation des Ausmaßes und Entstehungszeitpunktes der detektierten Thrombozytenfunktionsstörung wurden im Rahmen der vorliegenden Arbeit zusätzlich zu Patient:innen mit Sepsis (SOFA-Score ≥ 2; n=13) auch hospitalisierte Patient:innen mit einer Infektion ohne Sepsis (SOFA-Score < 2; n=12) rekrutiert. Beide Kohorten wurden zu zwei Zeitpunkten (t1: <24h; t2: Tag 5-7) im Krankheitsverlauf mittels Durchflusszytometrie und PFA-200 untersucht und mit einer gesunden Kontrollgruppe (n=28) verglichen. Phänotypische Auffälligkeiten der Thrombozyten bei Sepsis umfassten: (i) eine veränderte Expression verschiedener Untereinheiten des GPIb-IX-V-Rezeptorkomplexes, die auf ein verstärktes Rezeptor-Shedding hindeutet; (ii) ein ausgeprägtes Mepacrin-Beladungsdefizit, das auf eine zunehmend reduzierte Anzahl von δ-Granula entlang des Infektion-Sepsis Kontinuums hinweist; (iii) eine Reduktion endständig gebundener Sialinsäure im Sinne einer verstärkten Desialylierung. Die funktionelle Analyse der Thrombozyten bei Sepsis ergab bei durchflusszytometrischer Messung der Integrin αIIbβ3-Aktivierung (PAC-1-Bindung) eine ausgeprägte generalisierte Hyporeaktivität gegenüber multiplen Agonisten, die abgeschwächt bereits bei Infektion nachweisbar war und gemäß ROC-Analysen gut zwischen Infektion und Sepsis diskriminierte (AUC >0.80 für alle Agonisten). Im Gegensatz dazu zeigten Thrombozyten bei Sepsis und Analyse mittels PFA-200 unter Einfluss physiologischer Scherkräfte eine normale bis gar beschleunigte Aggregation. Die Reaktivitätsmessung von Thrombozyten mittels Durchflusszytometrie stellt weiterhin einen vielversprechenden Biomarker für die Sepsis-Früherkennung dar. Für weitere Schlussfolgerungen ist jedoch eine größere Kohorte erforderlich. In nachfolgenden Untersuchungen sollten zudem mechanistische Ursachen der beschriebenen phänotypischen und funktionellen Auffälligkeiten von Thrombozyten bei Infektion und Sepsis z.B. mittels Koinkubationsexperimenten untersucht werden. N2 - Sepsis is a frequent and life-threatening condition that describes organ dysfunction resulting from a dysregulated host immune response to infection. Early diagnosis and treatment are essential to improve patient survival. In a previous pilot study with sepsis patients, our research identified a severe platelet hyporeactivity using flow cytometry which could become a potential new biomarker for early sepsis diagnosis. To evaluate onset and extend of the detected platelet dysfunction in this study, we extended our patient cohort in addition to sepsis (SOFA-score ≥2; n=13) also to hospitalized patients with infection without sepsis (SOFA-score <2; n=12). Both cohorts were assessed at two time points during the disease (t1: <24h; t2: day 5-7) by flow cytometry and PFA-200 and compared with a healthy control group (n=28). Platelet phenotypic abnormalities during sepsis included: (i) altered expression of subunits of the GPIb-IX-V receptor complex, pointing to increased receptor shedding; (ii) a severe mepacrine loading deficit, indicating an increasingly reduced number of δ-granules along the infection-sepsis continuum; (iii) a reduction of terminally bound sialic acid, suggesting increased desialylation. Functional analysis of platelets in sepsis revealed a marked and generalized hyporeactivity toward multiple agonists when integrin αIIbβ3 activation (PAC-1 binding) was measured by flow cytometry, which was already to a lesser extend present in patients with infection and discriminated well between infection and sepsis according to ROC analysis (AUC >0.80 for all agonists). In contrast, platelets from septic patients showed normal to even accelerated aggregation when measured under flow condition and physiological shear forces by PFA-200. Analysis of platelet reactivity by flow cytometry remains a promising biomarker for early sepsis detection, but a larger cohort is needed for further conclusions. In subsequent studies, mechanistic causes of the described alterations in platelet phenotype and function during infection and sepsis should be investigated, e.g. by means of co-incubation experiments. KW - Sepsis KW - Thrombozyt KW - Biomarker KW - Frühdiagnostik KW - Durchflusscytometrie KW - Thrombozytenfunktionsanalyse Y1 - 2024 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-358193 ER - TY - JOUR A1 - Stegner, David A1 - van Eeuwijk, Judith M.M. A1 - Angay, Oğuzhan A1 - Gorelashvili, Maximilian G. A1 - Semeniak, Daniela A1 - Pinnecker, Jürgen A1 - Schmithausen, Patrick A1 - Meyer, Imke A1 - Friedrich, Mike A1 - Dütting, Sebastian A1 - Brede, Christian A1 - Beilhack, Andreas A1 - Schulze, Harald A1 - Nieswandt, Bernhard A1 - Heinze, Katrin G. T1 - Thrombopoiesis is spatially regulated by the bone marrow vasculature JF - Nature Communications N2 - In mammals, megakaryocytes (MKs) in the bone marrow (BM) produce blood platelets, required for hemostasis and thrombosis. MKs originate from hematopoietic stem cells and are thought to migrate from an endosteal niche towards the vascular sinusoids during their maturation. Through imaging of MKs in the intact BM, here we show that MKs can be found within the entire BM, without a bias towards bone-distant regions. By combining in vivo two-photon microscopy and in situ light-sheet fluorescence microscopy with computational simulations, we reveal surprisingly slow MK migration, limited intervascular space, and a vessel-biased MK pool. These data challenge the current thrombopoiesis model of MK migration and support a modified model, where MKs at sinusoids are replenished by sinusoidal precursors rather than cells from a distant periostic niche. As MKs do not need to migrate to reach the vessel, therapies to increase MK numbers might be sufficient to raise platelet counts. KW - bone marrow KW - megakaryocytes KW - thrombopoiesis Y1 - 2017 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-170591 VL - 8 IS - 127 ER - TY - THES A1 - Schmithausen, Patrick Alexander Gerhard T1 - Three-dimensional fluorescence image analysis of megakaryocytes and vascular structures in intact bone T1 - Dreidimensionale Fluoreszenzbildanalyse von Megakaryozyten und Gefäßstrukturen in intaktem Knochen N2 - The thesis provides insights in reconstruction and analysis pipelines for processing of three-dimensional cell and vessel images of megakaryopoiesis in intact murine bone. The images were captured in a Light Sheet Fluorescence Microscope. The work presented here is part of Collaborative Research Centre (CRC) 688 (project B07) of the University of Würzburg, performed at the Rudolf-Virchow Center. Despite ongoing research within the field of megakaryopoiesis, its spatio-temporal pattern of megakaryopoiesis is largely unknown. Deeper insight to this field is highly desirable to promote development of new therapeutic strategies for conditions related to thrombocytopathy as well as thrombocytopenia. The current concept of megakaryopoiesis is largely based on data from cryosectioning or in vitro studies indicating the existence of spatial niches within the bone marrow where specific stages of megakaryopoiesis take place. Since classic imaging of bone sections is typically limited to selective two-dimensional views and prone to cutting artefacts, imaging of intact murine bone is highly desired. However, this has its own challenges to meet, particularly in image reconstruction. Here, I worked on processing pipelines to account for irregular specimen staining or attenuation as well as the extreme heterogeneity of megakaryocyte morphology. Specific challenges for imaging and image reconstruction are tackled and solution strategies as well as remaining limitations are presented and discussed. Fortunately, modern image processing and segmentation strongly benefits from continuous advances in hardware as well as software-development. This thesis exemplifies how a combined effort in biomedicine, computer vision, data processing and image technology leads to deeper understanding of megakaryopoiesis. Tailored imaging pipelines significantly helped elucidating that the large megakaryocytes are broadly distributed throughout the bone marrow facing a surprisingly dense vessel network. No evidence was found for spatial niches in the bone marrow, eventually resulting in a revised model of megakaryopoiesis. N2 - Im Rahmen dieses Dissertationsvorhabens wurden Segmentierungs- und Auswertepipelines dreidimensionaler Bilder von Zellen und Gefäßen im intakten Mausknochen erarbeitet. Die Bilder entstanden durch Fluoreszenzaufnahmen eines Lichtblattmikroskops. Das Dissertationsvorhaben war Teil des Sonderforschungsbereichs 688 (Teilprojekts B07) der Universität Würzburg und es wurde am Rudolf-Virchow-Zentrum durchgeführt. Trotz einer Vielzahl aktueller Forschungsprojekte auf dem Gebiet der Megakaryopoese sind Erkenntnisse über deren räumlich-zeitliche Zusammenhänge größtenteils unbekannt. Neuere wissenschaftliche Erkenntnisse auf diesem Gebiet wären insbesondere hilfreich für die Weiterentwicklung von Behandlungsstrategien für Patienten, die an Thrombozytopenien oder Thrombozytopathien leiden. Das aktuell vorherrschende Modell zur Erklärung der Megakaryopoese geht von der Existenz räumlicher Nischen im Knochenmark aus, in denen sich die einzelnen Schritte der Megakaryopoese vollziehen. Dieses Modell basiert hauptsächlich auf Auswertungen von Gefrierschnitten sowie in-vitro Experimenten. Da die klassische Bildgebung von Knochenschnitten nur auf eine bestimmte Anzahl zweidimensionaler Schnitte begrenzt ist und deren Qualität unter Schnittartefakten leidet, ist die Bildgebung des intakten Knochens von besonderem Interesse. Dennoch führt dies zu neuen Herausforderungen im Bereich der Bilddatenauswertung. Im vorliegenden Dissertationsvorhaben beschäftige ich mich in diesem Bereich mit der Erarbeitung von Auswerteprotokollen, welche beispielsweise den Einfluss unregelmäßiger Färbungen oder Signalabschwächungen sowie die extreme Heterogenität der Megakaryozytenmorphologie berücksichtigen. Spezifische Herausforderungen für die Bildgebung und Bildrekonstruktion werden in Angriff genommen und Lösungsstrategien sowie verbleibende Einschränkungen werden vorgestellt und diskutiert. Erfreulicherweise profitieren insbesondere die moderne Bildbearbeitung sowie die Objekterkennung in großem Ausmaß von fortlaufenden Entwicklungen aus dem Hard- sowie Softwarebereich. Dieses Dissertationsvorhaben zeigt auf exemplarische Art und Weise auf, wie gemeinsame Forschungsanstrengungen im Bereich der Biomedizin, des Maschinellen Sehens, der Datenverarbeitung sowie der Bildtechnologie zu einem tieferen Verständnis der Megakaryopoese führen. Die maßgeschneiderten Pipelines zur Bilddatenauswertung stützten letztlich die These, dass größere Megakaryozyten im Knochenmark breit verteilt sind und von einem überraschend dichten Gefäßnetz umgeben sind. Beweise für die Existenz räumlicher Nischen im Knochenmark konnten nicht gefunden warden. Dieses führte schließlich zur Vorstellung eines überarbeiteten Modells der Megakaryopoese. KW - Megakaryozytopoese KW - Fluoreszenzmikroskopie KW - Megakaryozyt KW - Lichtscheibenmikroskopie KW - Bildverarbeitung KW - lightsheet microscopy KW - megakaryopoiesis KW - fluorescence microscopy KW - intact bone imaging KW - object segmentation KW - Lichtblattmikroskopie KW - Bildbearbeitung KW - Megakaryopoese KW - Bildgebung intakten Knochens Y1 - 2019 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-178541 ER - TY - JOUR A1 - Meinert, Madlen A1 - Jessen, Christina A1 - Hufnagel, Anita A1 - Kreß, Julia Katharina Charlotte A1 - Burnworth, Mychal A1 - Däubler, Theo A1 - Gallasch, Till A1 - Da Xavier Silva, Thamara Nishida A1 - Dos Santos, Ancély Ferreira A1 - Ade, Carsten Patrick A1 - Schmitz, Werner A1 - Kneitz, Susanne A1 - Friedmann Angeli, José Pedro A1 - Meierjohann, Svenja T1 - Thiol starvation triggers melanoma state switching in an ATF4 and NRF2-dependent manner JF - Redox Biology N2 - The cystine/glutamate antiporter xCT is an important source of cysteine for cancer cells. Once taken up, cystine is reduced to cysteine and serves as a building block for the synthesis of glutathione, which efficiently protects cells from oxidative damage and prevents ferroptosis. As melanomas are particularly exposed to several sources of oxidative stress, we investigated the biological role of cysteine and glutathione supply by xCT in melanoma. xCT activity was abolished by genetic depletion in the Tyr::CreER; Braf\(^{CA}\); Pten\(^{lox/+}\) melanoma model and by acute cystine withdrawal in melanoma cell lines. Both interventions profoundly impacted melanoma glutathione levels, but they were surprisingly well tolerated by murine melanomas in vivo and by most human melanoma cell lines in vitro. RNA sequencing of human melanoma cells revealed a strong adaptive upregulation of NRF2 and ATF4 pathways, which orchestrated the compensatory upregulation of genes involved in antioxidant defence and de novo cysteine biosynthesis. In addition, the joint activation of ATF4 and NRF2 triggered a phenotypic switch characterized by a reduction of differentiation genes and induction of pro-invasive features, which was also observed after erastin treatment or the inhibition of glutathione synthesis. NRF2 alone was capable of inducing the phenotypic switch in a transient manner. Together, our data show that cystine or glutathione levels regulate the phenotypic plasticity of melanoma cells by elevating ATF4 and NRF2. KW - thiol starvation KW - ATF4 KW - NRF2 KW - melanoma Y1 - 2024 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-350328 VL - 70 ER - TY - JOUR A1 - Jessen, Christina A1 - Kreß, Julia K. C. A1 - Baluapuri, Apoorva A1 - Hufnagel, Anita A1 - Schmitz, Werner A1 - Kneitz, Susanne A1 - Roth, Sabine A1 - Marquardt, André A1 - Appenzeller, Silke A1 - Ade, Casten P. A1 - Glutsch, Valerie A1 - Wobser, Marion A1 - Friedmann-Angeli, José Pedro A1 - Mosteo, Laura A1 - Goding, Colin R. A1 - Schilling, Bastian A1 - Geissinger, Eva A1 - Wolf, Elmar A1 - Meierjohann, Svenja T1 - The transcription factor NRF2 enhances melanoma malignancy by blocking differentiation and inducing COX2 expression JF - Oncogene N2 - The transcription factor NRF2 is the major mediator of oxidative stress responses and is closely connected to therapy resistance in tumors harboring activating mutations in the NRF2 pathway. In melanoma, such mutations are rare, and it is unclear to what extent melanomas rely on NRF2. Here we show that NRF2 suppresses the activity of the melanocyte lineage marker MITF in melanoma, thereby reducing the expression of pigmentation markers. Intriguingly, we furthermore identified NRF2 as key regulator of immune-modulating genes, linking oxidative stress with the induction of cyclooxygenase 2 (COX2) in an ATF4-dependent manner. COX2 is critical for the secretion of prostaglandin E2 and was strongly induced by H\(_2\)O\(_2\) or TNFα only in presence of NRF2. Induction of MITF and depletion of COX2 and PGE2 were also observed in NRF2-deleted melanoma cells in vivo. Furthermore, genes corresponding to the innate immune response such as RSAD2 and IFIH1 were strongly elevated in absence of NRF2 and coincided with immune evasion parameters in human melanoma datasets. Even in vitro, NRF2 activation or prostaglandin E2 supplementation blunted the induction of the innate immune response in melanoma cells. Transcriptome analyses from lung adenocarcinomas indicate that the observed link between NRF2 and the innate immune response is not restricted to melanoma. KW - NRF2 KW - melanoma malignancy KW - COX2 expression Y1 - 2020 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-235064 SN - 0950-9232 VL - 39 ER - TY - JOUR A1 - Kaiser, Sebastian A1 - Sauer, Florian A1 - Kisker, Caroline T1 - The structural and functional characterization of human RecQ4 reveals insights into its helicase mechanism JF - Nature Communications N2 - RecQ4 is a member of the RecQ helicase family, an evolutionarily conserved class of enzymes, dedicated to preserving genomic integrity by operating in telomere maintenance, DNA repair and replication. While reduced RecQ4 activity is associated with cancer predisposition and premature aging, RecQ4 upregulation is related to carcinogenesis and metastasis. Within the RecQ family, RecQ4 assumes an exceptional position, lacking several characteristic RecQ domains. Here we present the crystal structure of human RecQ4, encompassing the conserved ATPase core and a novel C-terminal domain that lacks resemblance to the RQC domain observed in other RecQ helicases. The new domain features a zinc-binding site and two distinct types of winged-helix domains, which are not involved in canonical DNA binding or helicase activity. Based on our structural and functional analysis, we propose that RecQ4 exerts a helicase mechanism, which may be more closely related to bacterial RecQ helicases than to its human family members. KW - x-ray crystallography KW - enzymes KW - RecQ4 KW - humans Y1 - 2017 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-170769 VL - 8 IS - 15907 ER - TY - THES A1 - Pleines, Irina T1 - The role of the Rho GTPases Rac1 and Cdc42 for platelet function and formation T1 - Die Rolle der Rho GTPasen Rac1 und Cdc42 in Thrombozytenfunktion und -bildung N2 - Platelet activation induces cytoskeletal rearrangements involving a change from discoid to spheric shape, secretion, and eventually adhesion and spreading on immobilized ligands. Small GTPases of the Rho family, such as Rac1 and Cdc42, are known to be involved in these processes by facilitating the formation of lamellipodia and filopodia, respectively. This thesis focuses on the role Rac1 and Cdc42 for platelet function and formation from their precursor cells, the megakaryocytes (MKs), using conditional knock-out mice. In the first part of the work, the involvement of Rac1 in the activation of the enzyme phospholipase (PL) C2 in the signaling pathway of the major platelet collagen receptor glycoprotein (GP) VI was investigated. It was found that Rac1 is essential for PLC2 activation independently of tyrosine phosphorylation of the enzyme, resulting in a specific platelet activation defect downstream of GPVI, whereas signaling of other activating receptors remains unaffected. Since Rac1-deficient mice were protected from arterial thrombosis in two different in vivo models, the GTPase might serve as a potential target for the development of new drugs for the treatment and prophylaxis of cardio- and cerebrovascular diseases. The second part of the thesis deals with the first characterization of MK- and platelet-specific Cdc42 knock-out mice. Cdc42-deficient mice displayed mild thrombo-cytopenia and platelet production from mutant MKs was markedly reduced. Unexpectedly, Cdc42-deficient platelets showed increased granule content and release upon activation, leading to accelerated thrombus formation in vitro and in vivo. Furthermore, Cdc42 was not generally required for filopodia formation upon platelet activation. Thus, these results indicate that Cdc42, unlike Rac1, is involved in multiple signaling pathways essential for proper platelet formation and function. Finally, the outcome of combined deletion of Rac1 and Cdc42 was studied. In contrast to single deficiency of either GTPase, platelet production from double-deficient MKs was virtually abrogated, resulting in dramatic macrothrombocytopenia in the animals. Formed platelets were largely non-functional leading to a severe hemostatic defect and defective thrombus formation in double-deficient mice in vivo. These results demonstrate for the first time a functional redundancy of Rac1 and Cdc42 in the hematopoietic system. N2 - Umstrukturierungen des Zytoskeletts spielen eine bedeutende Rolle bei der Aktivierung von Thrombozyten und sind in diesem Zusammenhang unerlässlich für Formänderung, Sekretion, sowie für Adhäsion und Ausbreitung auf immobilisierten Adhäsionsproteinen. Es wird vermutet, dass kleine GTPasen der Rho-Proteinfamilie, wie z.B. Rac1 und Cdc42, maßgeblich an diesen Prozessen beteiligt sind, indem sie die Bildung von Lamellipodien bzw. Filopodien bewirken. Die hier vorliegende Dissertation beschäftigt sich mit der Funktion von Rac1 und Cdc42 sowohl für die Aktivierung von Thrombozyten, als auch für deren Neubildung aus ihren Vorläuferzellen, den Megakaryozyten (MKs). Zu diesem Zweck wurden konditionale Knock-out-Mäuse generiert und in vitro und in vivo analysiert. Der erste Teil der Arbeit beinhaltete die Untersuchung der Rolle von Rac1 im Signalweg des wichtigsten Thrombozyten-Kollagen-Rezeptors, Glykoprotein (GP) VI, dessen Stimulation zur Aktivierung des Enzyms Phospholipase 2 (PLC2) führt. Es konnte gezeigt werden, dass Rac1 notwendig für PLC2-Aktivierung ist, und zwar unabhängig von der simultan stattfindenden Tyrosin-Phosphorylierung des Enzyms. Dies führte dazu, dass in Rac1-defizienten Thrombozyten spezifisch der GPVI-Signalweg blockiert war, während die Aktivierung durch andere Rezeptoren unverändert funktionierte. Da Rac1-defiziente Mäuse vor arteriellem Gefäßverschluss (Thrombose) in zwei verschiedenen in vivo Modellen geschützt waren, könnte Rac1 einen potenziellen Angriffspunkt für die Entwicklung neuer antithrombotisch wirksamer Medikamente darstellen. Im zweiten Teil der Dissertation wurden erstmals die Auswirkungen eines MK- und Thrombozyten-spezifischen Cdc42-Knock-outs charakterisiert. Cdc42-defiziente Mäuse zeigten eine leichte Thrombozytopenie und die Neubildung von Thrombozyten aus defizienten MKs war merklich beeinträchtigt. Entgegen aller Erwartungen waren sowohl Inhalt, als auch Freisetzung von Granula aus Cdc42-defizienten Thrombozyten stark erhöht, was zu beschleunigter Thrombusbildung in vitro und Gefäßverschluss in vivo führte. Überdies war Cdc42 generell nicht essentiell für die Ausbildung von Filopodien nach Thrombozytenaktivierung. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass Cdc42 an einer Vielzahl von Signalwegen beteiligt ist, welche für die korrekte Bildung und Funktion von Thrombozyten unabdingbar sind. Der letzte Teil der Arbeit beschäftigte sich mit den Auswirkungen einer Doppel-defizienz von Rac1 und Cdc42. Im Gegensatz zur jeweiligen Einfachdefizienz war die Bildung von Thrombozyten aus doppeldefizienten MKs fast komplett blockiert, was eine stark ausgeprägte Makrothrombozytopenie in den betroffenen Tieren zur Folge hatte. Die wenigen gebildeten Thrombozyten waren in ihrer Funktion stark beeinträchtigt. Dies führte zusammen mit den extrem niedrigen Thrombozytenzahlen dazu, dass in doppeldefizienten Mäusen sowohl Hämostase als auch Thrombusbildung defekt waren. Diese Resultate zeigen erstmals eine funktionelle Redundanz von Rac1 und Cdc42 im hämatopoetischen System. KW - Thrombose KW - Rho GTPasen KW - Thrombozyt KW - platelet KW - Rho GTPase KW - platelet KW - Rho GTPase KW - Thrombosis Y1 - 2009 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-48572 ER - TY - THES A1 - Stritt, Simon T1 - The role of the cytoskeleton in platelet production and the pathogenesis of platelet disorders in humans and mice T1 - Die Rolle des Zytoskeletts in der Thrombopoese und der Pathogenese von Thrombozytopathien im Menschen und der Maus N2 - Platelets are continuously produced from megakaryocytes (MK) in the bone marrow by a cytoskeleton-driven process of which the molecular regulation is not fully understood. As revealed in this thesis, MK/ platelet-specific Profilin1 (Pfn1) deficiency results in micro- thrombocytopenia, a hallmark of the Wiskott-Aldrich syndrome (WAS) in humans, due to accelerated platelet turnover and premature platelet release into the bone marrow. Both Pfn1-deficient mouse platelets and platelets isolated from WAS patients contained abnormally organized and hyper-stable microtubules. These results reveal an unexpected function of Pfn1 as a regulator of microtubule organization and point to a previously unrecognized mechanism underlying the platelet formation defect in WAS patients. In contrast, Twinfilin2a (Twf2a) was established as a central regulator of platelet reactivity and turnover. Twf2a-deficient mice revealed an age-dependent macrothrombocytopenia that could be explained by a markedly decreased platelet half-life, likely due to the pronounced hyper-reactivity of \(Twf2a^{-/-}\) platelets. The latter was characterized by sustained integrin acti- vation and thrombin generation in vitro that translated into accelerated thrombus formation in vivo. To further elucidate mechanisms of integrin activation, Rap1-GTP-interacting adaptor molecule (RIAM)-null mice were generated. Despite the proposed critical role of RIAM for platelet integrin activation, no alterations in this process could be found and it was concluded that RIAM is dispensable for the activation of β1 and β3 integrins, at least in platelets. These findings change the current mechanistic understanding of platelet integrin activation. Outside-in signaling by integrins and other surface receptors was supposed to regulate MK migration, but also the temporal and spatial formation of proplatelet protrusions. In this the- sis, phospholipase D (PLD) was revealed as critical regulator of actin dynamics and podo- some formation in MKs. Hence, the unaltered platelet counts and production in \(Pld1/2^{-/-}\) mice and the absence of a premature platelet release in the bone marrow of \(Itga2^{-/-}\) mice question the role of podosomes in platelet production and raise the need to reconsider the proposed inhibitory signaling by α2β1 integrins on proplatelet formation. Non-muscle myosin IIA (NMMIIA) has been implicated as a downstream effector of the in- hibitory signals transmitted via α2β1 integrins. Besides Rho-GTPase signaling, also \(Mg^{2+}\) and transient receptor potential melastatin-like 7 (TRPM7) channel α-kinase are known regulators of NMMIIA activity. In this thesis, TRPM7 was identified as major regulator of \(Mg^{2+}\) homeostasis in MKs and platelets. Furthermore, decreased \([Mg^{2+}]_i\) led to deregulated NMMIIA activity and altered cytoskeletal dynamics that impaired thrombopoiesis and resulted in macrothrombocytopenia in humans and mice. N2 - Thrombozyten werden kontinuierlich durch einen Zytoskelett-getriebenen Prozess von Megakaryozyten (MK) im Knochenmark gebildet. Die zugrunde liegenden molekularen Me- chanismen sind jedoch weitestgehend unverstanden. In dieser Thesis konnte gezeigt werden, dass eine MK/ Thrombozyten-spezifische Profilin1 (Pfn1) Defizienz eine Mikrothrombozytopenie verursacht, die das Hauptmerkmal des Wiskott- Aldrich Syndroms (WAS) im Menschen ist. Die reduzierte Thrombozytenzahl konnte auf eine beschleunigte Entfernung der Thrombozyten aus der Zirkulation sowie deren vorzeitige Freisetzung im Knochenmark zurückgeführt werden. Sowohl Thrombozyten von Pfn1- defizienten Mäusen, als auch von Patienten mit WAS wiesen abnormal organisierte und hyper-stabile Mikrotubuli auf. Die im Rahmen dieser Thesis gewonnenen Ergebnisse zeigen eine unerwartete Funktion von Pfn1 als Regulator der Mikrotubuliorganisation und weisen auf einen bisher nicht erkannten Mechanismus hin, welcher dem Thrombozytenproduktionsde- fekt in Patienten mit WAS zugrunde liegt. Im Gegensatz hierzu konnte Twinfilin2a (Twf2a) als zentraler Regulator der Thrombozyten- reaktivität und Lebenspanne etabliert werden. Mäuse mit einer Twf2a Defizienz zeigten eine progressive Makrothrombozytopenie, die durch eine stark reduzierte Lebenspanne der Thrombozyten erklärt werden konnte. Letzteres war höchstwahrscheinlich durch eine erhöhte Empfindlichkeit von Twf2a-defizienten Thrombozyten gegenüber von aktivierenden Stimuli bedingt. Die Hyperreaktivität von Twf2a-defizienten Thrombozyten zeigte sich durch eine verlängerte Aktivierung der Integrine und erhöhter Thrombingenerierung in vitro sowie be- schleunigter Thrombusbildung in vivo. Um die Mechanismen der Integrinaktivierung besser zu charakterisieren, wurden Rap1-GTP- interacting adaptor molecule (RIAM)-null Mäuse generiert. Obwohl RIAM eine zentrale Rolle in der thrombozytären Integrinaktivierung zugeschriebenen wurde, konnten keine Defekte in diesem Prozess in RIAM-null Thrombozyten identifiziert werden. Dies führte zu der Schluss- folgerung, dass RIAM für die Aktivierung von β1 und β3 Integrinen in Thrombozyten nicht benötigt wird. Diese Erkenntnisse verändern das gegenwärtige mechanistische Verständnis der Integrinaktivierung in Thrombozyten. Die outside-in Signalgebung durch Integrine und andere Oberflächenrezeptoren reguliert die Migration sowie die zeitliche und räumliche Bildung von proplatelets durch MKs. In dieser Thesis konnte gezeigt werden, dass Phospholipase D (PLD) ein zentraler Regulator der Aktindynamik und Podosomenbildung in MKs ist. Die normale Thrombozytenzahl und -Produktion in \(Pld1/2^{-/-}\) Mäusen sowie die fehlende vorzeitige Freisetzung von Thrombozytenim Knochenmark von \(Itga2^{-/-}\) Mäusen, stellen die Funktion von Podosomen in der Throm- bozytenproduktion in Frage. Ferner zeigen diese Ergebnisse, dass die Rolle der inhibitori- schen Signalgebung durch α2β1 Integrine in der proplatelet-Bildung noch einmal überdacht werden muss. Non-muscle myosin IIA (NMMIIA) wird als Effektorprotein im α2β1 Integrinsignalweg ange- sehen. Neben Signalen, die durch Rho-GTPasen vermittelt werden, regulieren auch \(Mg^{2+}\) und die α-Kinase des transient receptor potential melastatin-like 7 (TRPM7) Kanals die Akti- vität von NMMIIA. Im Rahmen dieser Thesis wurde TRPM7 als Hauptregulator der \(Mg^{2+}\) Homöostase in MKs und Thrombozyten identifiziert. Darüber hinaus führten erniedrigte intra- zelluläre \(Mg^{2+}\) Konzentrationen zu einer veränderten NMMIIA Aktivität und Zytoskelettdyna- mik. Diese Defekte beeinträchtigten die Thrombopoese und verursachten eine Makrothrom- bozytopenie im Menschen und der Maus. KW - Thrombozytopoese KW - Thrombozytopathie KW - Megakaryopoese KW - Zellskelett KW - Thrombozyt KW - Zytoskelett Y1 - 2017 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-122662 ER - TY - THES A1 - May, Frauke T1 - The role of the (hem)ITAM-coupled receptors C-type lectin-like receptor 2 (CLEC-2) and Glycoprotein (GP) VI for platelet function: in vitro and in vivo studies in mice T1 - Die Rolle der (hem)ITAM-gekoppelten Rezeptoren C-type lectin-like receptor 2 (CLEC-2) und Glykoprotein (GP) VI in der Thrombozytenfunktion: in vitro- und in vivo-Studien in Mäusen N2 - Die Thrombozytenaktivierung und –adhäsion sowie die nachfolgende Thrombusbildung ist ein essentieller Prozess in der primären Hämostase, der aber auch irreversible Gefäßverschlüsse und damit Herzinfarkt oder Schlaganfall verursachen kann. Erst kürzlich wurde beschrieben, dass der C-type lectin-like receptor 2 (CLEC-2) auf der Thrombozytenoberfläche exprimiert wird, jedoch wurde für diesen Rezeptor noch keine Funktion in den Prozessen der Hämostase und Thrombose gezeigt. In der vorliegenden Arbeit wurde die Rolle von CLEC-2 in der Thrombozytenfunktion und Thrombusbildung im Mausmodel untersucht. In dem ersten Teil dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass die Behandlung von Mäusen mit dem neu generierten monoklonalen Antikörper INU1, der gegen murines CLEC-2 gerichtet ist, zu dem vollständigen und hochspezifischen Verlust des Rezeptors in zirkulierenden Thrombozyten führte, ein Prozess, der als „Immundepletion“ bezeichnet wird. Die CLEC-2-defizienten Thrombozyten waren nicht mehr durch den CLEC-2-spezifischen Agonisten Rhodozytin aktivierbar, während die Aktivierung durch alle anderen getesteten Agonisten nicht beeinträchtigt war. Dieser selektive Defekt führte unter Flussbedingungen ex vivo zu stark verminderter Aggregatbildung der Thrombozyten. Außerdem zeigten in vivo-Thrombosestudien, dass die gebildeten Thromben instabil waren und vermehrt embolisierten. Infolgedessen war die CLEC-2 Defizienz mit einem deutlichen Schutz vor arterieller Thrombose verbunden. Außerdem ließ die in INU1-behandelten Mäusen beobachtete variable Verlängerung der Blutungszeit auf einen moderaten hämostatischen Defekt schließen. Diese Ergebnisse zeigen zum ersten Mal, dass CLEC-2 in vitro und in vivo signifikant zur Thrombusstabilität beiträgt und eine essentielle Rolle in der Hämostase und arteriellen Thrombose spielt. Daher stellt CLEC-2 eine potentiell neue antithrombotische Zielstruktur dar, die in vivo inaktiviert werden kann. Diese in vivo-Herabregulierung von Thrombozytenoberflächenrezeptoren könnte einen vielversprechenden Ansatz für zukünftige antithrombotische Therapien darstellen. Der zweite Teil dieser Arbeit behandelte den Effekt einer Doppelimmundepletion der immunoreceptor tyrosine-based activation motiv (ITAM)- und hemITAM-gekoppelten Rezeptoren Glykoprotein (GP) VI und CLEC-2 auf Hämostase und Thrombose mittels einer Kombination der GPVI- beziehungsweise CLEC-2-spezifischen Antikörper JAQ1 und INU1. Eine Einzeldepletion von GPVI oder CLEC-2 in vivo beeinträchtigte nicht die Expression und Funktion des jeweils anderen Rezeptors. Eine gleichzeitige Behandlung mit beiden Antikörpern führte jedoch zu dem nachhaltigen Verlust der GPVI- und CLEC-2-vermittelten Signale in Thrombozyten, während andere Signalwege nicht betroffen waren. Im Gegensatz zu den Einzeldefizienzen, wiesen die GPVI/CLEC-2 doppeldefizienten Mäuse einen schwerwiegenden Blutungsphänotyp auf. Außerdem führte die Behandlung zu einer starken Beeinträchtigung der arteriellen Thrombusbildung, die die Effekte der Einzeldefizienzen weit übertraf. Von Bedeutung ist auch, dass gleiche Ergebnisse in Gp6-/- Mäusen gefunden wurden, die mittels INU1-Behandlung CLEC-2-depletiert wurden. Dies veranschaulicht, dass der Blutungsphänotyp nicht durch Sekundäreffekte der kombinierten Antikörperbehandlung hervorgerufen wurde. Diese Daten deuten darauf hin, dass GPVI und CLEC-2 sowohl unabhängig voneinander als auch gleichzeitig in vivo von der Thrombozytenoberfläche herabreguliert werden können und lassen unerwartete redundante Funktionen der beiden Rezeptoren in Hämostase und Thrombose erkennen. Da beide Rezeptoren, GPVI und CLEC-2, als neue antithrombotische Zielstrukturen diskutiert werden, könnten diese Ergebnisse wichtige Auswirkungen auf die Entwicklung von anti-GPVI oder anti-CLEC-2-basierenden Antithrombotika haben. N2 - Platelet activation and adhesion results in thrombus formation that is essential for normal hemostasis, but can also cause irreversible vessel occlusion leading to myocardial infarction or stroke. The C-type lectin-like receptor 2 (CLEC-2) was recently identified to be expressed on the platelet surface, however, a role for this receptor in hemostasis and thrombosis had not been demonstrated. In the current study, the involvement of CLEC-2 in platelet function and thrombus formation was investigated using mice as a model system. In the first part of the thesis, it was found that treatment of mice with a newly generated monoclonal antibody against murine CLEC-2 (INU1) led to the complete and highly specific loss of the receptor in circulating platelets (a process termed “immunodepletion”). CLEC-2-deficient platelets were completely unresponsive to the CLEC-2-specific agonist rhodocytin, whereas activation induced by all other tested agonists was unaltered. This selective defect translated into severely decreased platelet aggregate formation under flow ex vivo; and in vivo thrombosis models revealed impaired stabilization of formed thrombi with enhanced embolization. Consequently, CLEC-2 deficiency profoundly protected mice from occlusive arterial thrombus formation. Furthermore, variable bleeding times in INU1-treated mice indicated a moderate hemostatic defect. This reveals for the first time that CLEC-2 significantly contributes to thrombus stability in vitro and in vivo and plays a crucial role in hemostasis and arterial thrombosis. Thus, CLEC-2 represents a potential novel anti-thrombotic target that can be functionally inactivated in vivo. This in vivo down-regulation of platelet surface receptors might be a promising approach for future anti-thrombotic therapy. The second part of the work investigated the effect of double-immunodepletion of the immunoreceptor tyrosine-based activation motif (ITAM)- and hemITAM-coupled receptors, platelet glycoprotein (GP) VI and CLEC-2, on hemostasis and thrombosis using a combination of the GPVI- and CLEC-2-specific antibodies, JAQ1 and INU1, respectively. Isolated targeting of either GPVI or CLEC-2 in vivo did not affect expression or function of the respective other receptor. However, simultaneous treatment with both antibodies resulted in the sustained loss of GPVI and CLEC-2 signaling in platelets, while leaving other activation pathways intact. In contrast to single deficiency of either receptor, GPVI/CLEC-2 double-deficient mice displayed a dramatic hemostatic defect. Furthermore, this treatment resulted in profound impairment of arterial thrombus formation that far exceeded the effects seen in single-depleted animals. Importantly, similar results were obtained in Gp6-/- mice that were depleted of CLEC-2 by INU1-treatment, demonstrating that this severe bleeding phenotype was not caused by secondary effects of combined antibody treatment. These data suggest that GPVI and CLEC-2 can be independently or simultaneously down-regulated in platelets in vivo and reveal an unexpected functional redundancy of the two receptors in hemostasis and thrombosis. Since GPVI and CLEC-2 have intensively been discussed as potential anti-thrombotic targets, these results may have important implications for the development of novel, yet save anti-GPVI or anti-CLEC-2-based therapies. KW - Thrombozyt KW - Rezeptor KW - Thrombose KW - Biologie KW - Zelle KW - Biology KW - Cell Y1 - 2011 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-65383 ER - TY - THES A1 - Slotta, Anja Maria T1 - The Role of Protein Kinase D 1 in the regulation of murine adipose tissue function under physiological and pathophysiological conditions T1 - Die Bedeutung von Protein Kinase D 1 in der Funktion von murinem Fettgewebe unter physiologischen und pathophysiologischen Bedingungen N2 - Adipocytes are specialized cells found in vertebrates to ensure survival in terms of adaption to food deficit and abundance. However, their dysfunction accounts for the pathophysiology of metabolic diseases such as T2DM. Preliminary data generated by Mona Löffler suggested that PKD1 is involved in adipocyte function. Here, I show that PKD1 expression and activity is linked to lipid metabolism of murine adipocytes. PKD1 gene expression and activity was reduced in murine white adipose tissue upon fasting, a physiological condition which induces lipolysis. Isoproterenol-stimulated lipolysis in adipose tissue and 3T3-L1 adipocytes reduced PKD1 gene expression. Silencing ATGL in adipocytes inhibited isoproterenol-stimulated lipolysis, however, the β-adrenergic stimulation of ATGL-silenced adipocytes lowered PKD1 expression levels as well. Adipose tissue of obese mice exhibited high PKD1 RNA levels but paradoxically lower protein levels of phosphorylated PKD1-Ser916. However, HFD generated a second PKD1 protein product of low molecular weight in mouse adipose tissue. Furthermore, constitutively active PKD1 predominantly displayed nuclear localization in 3T3-L1 adipocytes containing many fat vacuoles. However, adipocytes overexpressing non-functional PKD1 contained fewer lipid droplets and PKD1-KD was distributed in cytoplasm. Most importantly, deficiency of PKD1 in mouse adipose tissue caused expression of genes involved in adaptive thermogenesis such as UCP-1 and thus generated brown-like phenotype adipocytes. Thus, PKD1 is implicated in adipose tissue function and presents an interesting target for therapeutic approaches in the prevention of obesity and associated diseases. N2 - Adipozyten sind spezialisierte Zellen der Wirbeltiere, die das Überleben durch Anpassung an Nahrungsmangel und Nahrungsüberfluss gewährleisten. Eine Dysfunktion von Adipozyten bedingt jedoch die Pathophysiologie von Stoffwechselerkrankungen wie dem T2DM. Vorläufige Ergebnisse von Mona Löfflers Versuchen zeigten, dass PKD1 in der Funktion von Adipozyten involviert ist. Innerhalb dieser Arbeit konnte dargestellt werden, dass die Expression und Aktivität von PKD1 in murinen Adipozyten an den Lipidmetabolismus gekoppelt ist. Beim Hungern von murinem weißen Fettgewebe, einem physiologischen Zustand, der Lipolyse induziert, war die Genexpression von PKD1 reduziert. Isoproterenol-stimulierte Lipolyse führte ebenfalls zu verminderter Expression von PKD1 in murinen weißen Fettgewebe und 3T3-L1 Adipozyten. In ATGL-silenced Adipozyten war die Isoproterenol-stimulierte Lipolyse zwar inhibiert, allerdings wurde die Genexpression von PKD1 durch die β-adrenerge Stimulation ebenfalls vermindert. Fettgewebe von adipösen Mäusen hingegen wiesen hohe PKD1 RNA Level sowie einen niedrigen Proteingehalt der phosphorylierten Form PKD1-Ser916 auf. Fettreiche Ernährung von Mäusen generierte in Fettgewebe jedoch ein weiteres Produkt von PKD1 mit niedrigem Molekulargewicht im Western Blot. Des Weiteren wurde dargestellt, dass konstitutiv aktives PKD1 in 3T3-L1 Adipozyten vorwiegend nuklear lokalisiert war und diese Adipozyten einen hohen Gehalt von Fettvakuolen aufwiesen. Adipozyten, die funktionsloses PKD1 exprimierten, enthielten wenige Lipidtropfen und PKD1-KD war im Cytoplasma verteilt. Vor allem zeigte diese Arbeit, dass die Deletion von PKD1 spezifisch in murinem Fettgewebe die Expression von Genen wie UCP-1 verursachte, die eine Rolle in adaptiver Thermogenese spielen, und dadurch einen brown-like Phänotypen generierte. Zusammenfassend ist PKD1 in die Funktionen von Adipozyten verwickelt und stellt ein attraktives Ziel für therapeutische Ansätze in der Prävention von Übergewicht und damit assoziierten Erkrankungen dar. KW - adipocyte KW - murine KW - pkd KW - Protein Kinase D KW - adipose KW - Protein Kinase D 1 KW - PKD1 Y1 - 2019 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-179112 ER - TY - THES A1 - Cam, Hakan T1 - The role of p53 family members in myogenic differentiation and rhabdomyosarcoma development N2 - Krebserkrankungen zeichnen sich häufig durch Störungen zellulärer Differenzierungsprozesse aus. So weisen Rhabdomyosarkome, die aus Muskelvorläuferzellen hervorgehen, Differenzierungsdefekte auf, die zur unkontrollierten Proliferation der Tumorzellen führen. Bislang ist ungeklärt, ob die Differenzierungsdefekte auf der verstärkten Expression von Inhibitoren, der defekten Funktion von Aktivatoren oder einer Kombination von beidem beruht. In dieser Arbeit wird gezeigt, dass im Unterschied zu normalen Muskelzellen RMS-Zellen verstärkt DeltaNp73, einen Pan-Inhibitor der p53-Tumorsuppressorfamilie, exprimieren. Die experimentelle Überexpression von DeltaNp73 in normalen Myoblasten blockierte die Muskeldifferenzierung und förderte in Kombination mit klassischen RMS-Onkogenen wie IGF2 oder PAX3/FKHR die maligne Transformation. Umgekehrt führte die Hemmung von DeltaNp73 durch RNAi zur Reduktion der Tumorigenität von RMS-Tumorzellen. Da DeltaNp73 als dominant-negativer Inhibitor der p53-Familie wirkt, lies die Hemmung von Differenzierungsprozessen durch DeltaNp73 vermuten, dass die p53-Familienmitglieder (p53, p63, und p73) an der Regulation der Muskeldifferenzierung beteiligt sind. Tatsächlich konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, dass die drei p53-Familienmitglieder bei der Induktion später Differenzierungsstadien kooperieren, indem sie die Aktivität des Retinoblastoma-Proteins RB regulieren. Die Funktion von RB ist bekanntermassen sowohl für den permanenten Zellzyklusarrest als auch für die Aktivierung Muskel-spezifischer Gene notwendig. Während p53 die Proteinspiegel von RB reguliert, kontrollieren p63 und p73 den Aktivierungsgrad von RB, indem sie dessen Phoshphorylierungszustand über den Zyklin-abhängigen Kinaseinhibitor p57KIP2 modifizieren. Eine Hemmung dieser Funktionen blockiert das Differenzierungsprogramm und fördert die Tumorentstehung. Die Aktivierung zellulärer Differenzierungsprozesse stellt somit einen entscheidenden Bestandteil der Tumorsuppressoraktivität der p53-Familie dar und liefert eine Erklärung für die Häufigkeit von Mutationen im p53-Signalweg bei Rhabdomyosarkom-Patienten. N2 - Disruption of differentiation pathways is one of the hallmarks of cancer. In rhabdomyosarcoma (RMS), a human tumor arising from myogenic precursors, the muscle differentiation program is disabled resulting in uncontrolled proliferation. Whether the differentiation block is due to overexpression of inhibitors, deficient function of activators, or both remained unknown. This study shows that RMS cells but not non-neoplastic muscle cells overexpress DeltaNp73, a pan-inhibitor of the p53 family of tumor suppressor genes. Experimental overexpression of DeltaNp73 in normal muscle precursor cells inhibited myogenic differentiation and promoted malignant transformation in cooperation with the RMS oncogenes IGF2 and PAX3/FKHR. Vice versa, RNAi knockdown of DeltaNp73 reduced the tumorigenicity of established RMS tumor cells. As DeltaNp73 is a dominant-negative inhibitor of the p53 family, inhibition of differentiation by DeltaNp73 suggests that the p53 family members (p53, p63 and p73) are critically involved in myogenic differentiation control. Indeed, this study demonstrates that all three p53 family members cooperate to activate the late stages of the differentiation process by regulating the activity of the retinoblastoma protein RB. The function of RB is known to be required for both the permanent cell cycle exit and the activation of muscle-specific genes. Whereas p53 regulates RB protein levels, p63 and p73 control the activation state of RB by modifying its phosphorylation via the cyclin-dependent kinase inhibitor p57KIP2. Ablation of these p53 family functions blocks the differentiation program and promotes malignant transformation. Induction of cellular differentiation therefore contributes to the tumor suppressor activities of the p53 family and provides an explanation for the high frequency of p53 pathway alterations in rhabdomyosarcoma patients. KW - Rhabdomyosarkom KW - Muskelzelle KW - Zelldifferenzierung KW - Genexpression KW - p53 KW - p63 KW - p73 KW - myogenic differentiation KW - rhabdomyosarcoma development KW - p53 KW - p63 KW - p73 KW - myogenic differentiation KW - rhabdomyosarcoma development Y1 - 2006 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-20240 ER - TY - THES A1 - Becker, Isabelle Carlotta T1 - The role of megakaryocytes and platelets in vascular and osteogenic development T1 - Die Rolle von Megakaryozyten und Thrombozyten in vaskulärer und osteogener Entwicklung N2 - Platelets, small anucleate cell fragments in the blood stream, derive from large precursor cells, so-called megakaryocytes (MK) residing in the bone marrow (BM). In addition to their role in wound healing, platelets have been shown to play a significant role during inflammatory bleeding. Above all, the immunoreceptor tyrosine-based activation motif (ITAM) receptors GPVI as well as CLEC-2 have been identified as main regulators of vascular integrity. In addition to ITAM-bearing receptors, our group identified GPV as another potent regulator of hemostasis and thrombosis. Surprisingly, concomitant lack of GPV and CLEC-2 deteriorated blood-lymphatic misconnections observed in Clec2-/- mice resulting in severe edema formation and intestinal inflammation. Analysis of lymphatic and vascular development in embryonic mesenteries revealed severely defective blood-lymph-vessel separation, which translated into thrombocytopenia and increased vascular permeability due to reduced tight junction density in mesenteric blood vessels and consequent leakage of blood into the peritoneal cavity. Recently, platelet granule release has been proposed to ameliorate the progression of retinopathy of prematurity (ROP), a fatal disease in newborns leading to retinal degradation. The mechanisms governing platelet activation in this process remained elusive nonetheless, which prompted us to investigate a possible role of ITAM signaling. In the second part of this thesis, granule release during ROP was shown to be GPVI- and partly CLEC-2-triggered since blockade or loss of these receptors markedly deteriorated ROP progression. Proplatelet formation from MKs is highly dependent on a functional microtubule and actin cytoskeleton, the latter of which is regulated by several actin-monomer binding proteins including Cofilin1 and Twinfilin1 that have been associated with actin-severing at pointed ends. In the present study, a redundancy between both proteins especially important for the guided release of proplatelets into the bloodstream was identified, since deficiency in both proteins markedly impaired MK functionality mainly due to altered actin-microtubule crosstalk. Besides ITAM-triggered activation, platelets and MKs are dependent on inhibitory receptors, which prevent overshooting activation. We here identified macrothrombocytopenic mice with a mutation within Mpig6b encoding the ITIM-bearing receptor G6b-B. G6b-B-mutant mice developed a severe myelofibrosis associated with sex-specific bone remodeling defects resulting in osteosclerosis and -porosis in female mice. Moreover, G6b-B was shown to be indispensable for MK maturation as verified by a significant reduction in MK-specific gene expression in G6b-B-mutant MKs due to reduced GATA-1 activity. N2 - Blutplättchen, die kleinsten Zellen des hämatopoetischen Systems, werden von großen Vorläuferzellen, den Megakaryozyten (MKs), im Knochenmark gebildet. Neben ihrer Rolle bei der Blutstillung und Wundheilung sind Thrombozyten außerdem maßgeblich daran beteiligt, Blutungen in Entzündungsprozessen zu verhindern. Insbesondere den immuno- receptor tyrosine-based activation motif (ITAM) Rezeptoren GPVI und CLEC-2 wird eine tragende Rolle in der Aufrechterhaltung der vaskulären Integrität zugeschrieben. Neben den ITAM-Rezeptoren konnten wir auch für den Thrombozytenrezeptor GPV eine Funktion in Hämostase und Thrombose identifizieren. Erstaunlicherweise führte ein gleichzeitiger Verlust von GPV und CLEC-2 zu einer dramatischen Verstärkung der Blut- Lymphgefäß-Fehlbildungen, die bereits in CLEC-2-defizienten Mäusen beschrieben wurde, sodass die Tiere eine starke Ödembildung in den Extremitäten sowie Entzündungen des Dünndarms aufwiesen. Eine vertiefte Analyse der vaskulären Strukturen in Mesenterien während der Embryonalentwicklung offenbarte zusätzliche Defekte in der Blut- und Lymphgefäßtrennung in CLEC-2/GPV-defizienten Mäusen. Diese Deformationen führten zu Thrombozytopenie, Anämie und einer erhöhten vaskulären Permeabilität in adulten Mäusen, was sich auf eine reduzierte tight-junction-Dichte in Mesenterien und Darmgewebe zurückführen ließ, die zu einem Austritt von Blut in die Peritonealhöhle führte. In einer kürzlich veröffentlichten Publikation wurde Plättchengranula eine Rolle in der Auflösung retinopathischer Gefäßmissbildungen zugeschrieben. Retinopathia praema- turorum (ROP) ist eine Krankheit in Frühgeborenen, die aufgrund von Sauerstoffunter- schieden vor und nach Geburt zu Netzhautablösung und Blindheit führen kann. Die exakten Mechanismen, die hierbei zu Thrombozytenaktivierung und nachfolgender Degranulierung beitragen, sind bisher allerdings nicht bekannt. Da eine tragende Rolle von ITAM Rezeptoren in der Aufrechterhaltung vaskulärer Integrität insbesondere in krankhaftem Gewebe zuvor bereits aufgezeigt wurde, untersuchten wir die Entwicklung von Vaso-obliteration und Neovaskularisierung in CLEC-2 und GPVI-depletierten oder defizienten Mäusen und konnten einen Beitrag beider Rezeptoren zur Progression von ROP nachweisen. Die Produktion von Thrombozyten aus MKs ist stark von einem funktionalen Mikrotubuli- und Aktin-Zytoskelett abhängig. Aktinpolymerisation wird substanziell von unterschiedlichen Aktin-bindenden Proteinen reguliert, von denen Cofilin1 und Twinflin1 ein Abtrennen der Filamente induzieren. Wir konnten nun eine funktionale Redundanz beider Proteine in murinen MKs aufzeigen, die insbesondere für ein geregeltes Abschnüren von Thrombozyten in die Blutbahn essentiell ist und von einem Crosstalk zwischen Aktin- und Mikrotubuli- Zytoskeletts abhängig ist, der durch Twinfilin1 und Cofilin1 aufrechterhalten wird. Neben ITAM-induzierter Thrombozytenaktivierung spielt auch die Inhibition derselbigen durch immunoreceptor tyrosine-based inhibition motif (ITIM)-Rezeptoren eine große Rolle in MKs und Plättchen, da diese eine überschießende Aktivierung verhindern. Wir konnten in der vorliegenden Arbeit eine Spontanmutation in Mpig6b, das für den ITIM-Rezeptor G6b-B codiert, in stark makrothrombozytopenen, wildtypischen Mäusen identifizieren. Außer in der stark reduzierten Thrombozytenzahl manifestierte sich die Mutation des Weiteren in einer massiven Myelofibrose, die mit einer geschlechtsspezifischen Osteosklerose und -porose in weiblichen Mäusen einherging. Überraschenderweise konnten wir zudem einen dramatischen Reifungsblock in G6b-B-mutierten MKs feststellen, der insbesondere in einer reduzierten Expression des Transkriptionsfaktors GATA-1 begründet lag. KW - Megakaryozyt KW - Thrombozyt KW - Megakaryocyte KW - platelets KW - bone marrow KW - hematopoiesis Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-210241 ER - TY - JOUR A1 - Rasmussen, Tim T1 - The potassium efflux system Kef: bacterial protection against toxic electrophilic compounds JF - Membranes N2 - Kef couples the potassium efflux with proton influx in gram-negative bacteria. The resulting acidification of the cytosol efficiently prevents the killing of the bacteria by reactive electrophilic compounds. While other degradation pathways for electrophiles exist, Kef is a short-term response that is crucial for survival. It requires tight regulation since its activation comes with the burden of disturbed homeostasis. Electrophiles, entering the cell, react spontaneously or catalytically with glutathione, which is present at high concentrations in the cytosol. The resulting glutathione conjugates bind to the cytosolic regulatory domain of Kef and trigger activation while the binding of glutathione keeps the system closed. Furthermore, nucleotides can bind to this domain for stabilization or inhibition. The binding of an additional ancillary subunit, called KefF or KefG, to the cytosolic domain is required for full activation. The regulatory domain is termed K+ transport–nucleotide binding (KTN) or regulator of potassium conductance (RCK) domain, and it is also found in potassium uptake systems or channels in other oligomeric arrangements. Bacterial RosB-like transporters and K+ efflux antiporters (KEA) of plants are homologs of Kef but fulfill different functions. In summary, Kef provides an interesting and well-studied example of a highly regulated bacterial transport system. KW - potassium homeostasis KW - monovalent cation:proton antiporter-2 (CPA2) family KW - gram-negative bacteria KW - stress response KW - RCK domain KW - KEA Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-313686 SN - 2077-0375 VL - 13 IS - 5 ER - TY - JOUR A1 - Koo, Chek Ziu A1 - Matthews, Alexandra L. A1 - Harrison, Neale A1 - Szyroka, Justyna A1 - Nieswandt, Bernhard A1 - Gardiner, Elizabeth E. A1 - Poulter, Natalie S. A1 - Tomlinson, Michael G. T1 - The platelet collagen receptor GPVI is cleaved by Tspan15/ADAM10 and Tspan33/ADAM10 molecular scissors JF - International Journal of Molecular Sciences N2 - The platelet-activating collagen receptor GPVI represents the focus of clinical trials as an antiplatelet target for arterial thrombosis, and soluble GPVI is a plasma biomarker for several human diseases. A disintegrin and metalloproteinase 10 (ADAM10) acts as a ‘molecular scissor’ that cleaves the extracellular region from GPVI and many other substrates. ADAM10 interacts with six regulatory tetraspanin membrane proteins, Tspan5, Tspan10, Tspan14, Tspan15, Tspan17 and Tspan33, which are collectively termed the TspanC8s. These are emerging as regulators of ADAM10 substrate specificity. Human platelets express Tspan14, Tspan15 and Tspan33, but which of these regulates GPVI cleavage remains unknown. To address this, CRISPR/Cas9 knockout human cell lines were generated to show that Tspan15 and Tspan33 enact compensatory roles in GPVI cleavage, with Tspan15 bearing the more important role. To investigate this mechanism, a series of Tspan15 and GPVI mutant expression constructs were designed. The Tspan15 extracellular region was found to be critical in promoting GPVI cleavage, and appeared to achieve this by enabling ADAM10 to access the cleavage site at a particular distance above the membrane. These findings bear implications for the regulation of cleavage of other ADAM10 substrates, and provide new insights into post-translational regulation of the clinically relevant GPVI protein. KW - ADAM10 KW - GPVI KW - tetraspanin KW - platelet KW - shedding KW - TspanC8 KW - metalloproteinase Y1 - 2022 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-284468 SN - 1422-0067 VL - 23 IS - 5 ER - TY - JOUR A1 - Kitzenmaier, Alexandra A1 - Schaefer, Natascha A1 - Kasaragod, Vikram Babu A1 - Polster, Tilman A1 - Hantschmann, Ralph A1 - Schindelin, Hermann A1 - Villmann, Carmen T1 - The P429L loss of function mutation of the human glycine transporter 2 associated with hyperekplexia JF - European Journal of Neuroscience N2 - Glycine transporter 2 (GlyT2) mutations across the entire sequence have been shown to represent the presynaptic component of the neurological disease hyperekplexia. Dominant, recessive and compound heterozygous mutations have been identified, most of them leading to impaired glycine uptake. Here, we identified a novel loss of function mutation of the GlyT2 resulting from an amino acid exchange of proline 429 to leucine in a family with both parents being heterozygous carriers. A homozygous child suffered from severe neuromotor deficits. We characterised the GlyT2P429L variant at the molecular, cellular and protein level. Functionality was determined by glycine uptake assays. Homology modelling revealed that the mutation localises to α‐helix 5, presumably disrupting the integrity of this α‐helix. GlyT2P429L shows protein trafficking through various intracellular compartments to the cellular surface. However, the protein expression at the whole cell level was significantly reduced. Although present at the cellular surface, GlyT2P429L demonstrated a loss of protein function. Coexpression of the mutant with the wild‐type protein, reflecting the situation in the parents, did not affect transporter function, thus explaining their non‐symptomatic phenotype. Nevertheless, when the mutant was expressed in excess compared with the wild‐type protein, glycine uptake was significantly reduced. Thus, these data demonstrate that the proline residue at position 429 is structurally important for the correct formation of α‐helix 5. The failure in functionality of the mutated GlyT2 is most probably due to structural changes localised in close proximity to the sodium‐binding site of the transporter. KW - glycine transporter 2 KW - glyvine uptake KW - loss of function KW - presynaptic hyperekplexia KW - protein transport KW - structural disruption Y1 - 2019 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-206158 VL - 50 IS - 12 ER - TY - JOUR A1 - Meir, Michael A1 - Maurus, Katja A1 - Kuper, Jochen A1 - Hankir, Mohammed A1 - Wardelmann, Eva A1 - Rosenwald, Andreas A1 - Germer, Christoph-Thomas A1 - Wiegering, Armin T1 - The novel KIT exon 11 germline mutation K558N is associated with gastrointestinal stromal tumor, mastocytosis, and seminoma development JF - Genes, Chromosomes & Cancer N2 - Familial gastrointestinal stromal tumors (GIST) are dominant genetic disorders that are caused by germline mutations of the type III receptor tyrosine kinase KIT. While sporadic mutations are frequently found in mastocytosis and GISTs, germline mutations of KIT have only been described in 39 families until now. We detected a novel germline mutation of KIT in exon 11 (p.Lys-558-Asn; K558N) in a patient from a kindred with several GISTs harboring different secondary somatic KIT mutations. Structural analysis suggests that the primary germline mutation alone is not sufficient to release the autoinhibitory region of KIT located in the transmembrane domain. Instead, the KIT kinase module becomes constitutively activated when K558N combines with different secondary somatic mutations. The identical germline mutation in combination with an additional somatic KIT mutation was detected in a second patient of the kindred with seminoma while a third patient within the family had a cutaneous mastocytosis. These findings suggest that the K558N mutation interferes with the juxtamembranous part of KIT, since seminoma and mastocystosis are usually not associated with exon 11 mutations. KW - germline mutation KW - GIST KW - KIT KW - mastocytosis KW - seminoma Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-257476 VL - 60 IS - 12 ER - TY - JOUR A1 - Eisenberg, Philip A1 - Albert, Leon A1 - Teuffel, Jonathan A1 - Zitzow, Eric A1 - Michaelis, Claudia A1 - Jarick, Jane A1 - Sehlke, Clemens A1 - Große, Lisa A1 - Bader, Nicole A1 - Nunes-Alves, Ariane A1 - Kreikemeyer, Bernd A1 - Schindelin, Hermann A1 - Wade, Rebecca C. A1 - Fiedler, Tomas T1 - The Non-phosphorylating Glyceraldehyde-3-Phosphate Dehydrogenase GapN Is a Potential New Drug Target in Streptococcus pyogenes JF - Frontiers in Microbiology N2 - The strict human pathogen Streptococcus pyogenes causes infections of varying severity, ranging from self-limiting suppurative infections to life-threatening diseases like necrotizing fasciitis or streptococcal toxic shock syndrome. Here, we show that the non-phosphorylating glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase GapN is an essential enzyme for S. pyogenes. GapN converts glyceraldehyde 3-phosphate into 3-phosphoglycerate coupled to the reduction of NADP to NADPH. The knock-down of gapN by antisense peptide nucleic acids (asPNA) significantly reduces viable bacterial counts of S. pyogenes laboratory and macrolide-resistant clinical strains in vitro. As S. pyogenes lacks the oxidative part of the pentose phosphate pathway, GapN appears to be the major NADPH source for the bacterium. Accordingly, other streptococci that carry a complete pentose phosphate pathway are not prone to asPNA-based gapN knock-down. Determination of the crystal structure of the S. pyogenes GapN apo-enzyme revealed an unusual cis-peptide in proximity to the catalytic binding site. Furthermore, using a structural modeling approach, we correctly predicted competitive inhibition of S. pyogenes GapN by erythrose 4-phosphate, indicating that our structural model can be used for in silico screening of specific GapN inhibitors. In conclusion, the data provided here reveal that GapN is a potential target for antimicrobial substances that selectively kill S. pyogenes and other streptococci that lack the oxidative part of the pentose phosphate pathway. KW - X-ray crystallography KW - homology modeling KW - computational docking KW - PNA (peptide nucleic acid) KW - NADPH KW - drug target KW - GapN Y1 - 2022 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-262869 SN - 1664-302X VL - 13 ER - TY - JOUR A1 - El-Mesery, Mohamed A1 - Rosenthal, Tina A1 - Rauert-Wunderlich, Hilka A1 - Schreder, Martin A1 - Stühmer, Thorsten A1 - Leich, Ellen A1 - Schlosser, Andreas A1 - Ehrenschwender, Martin A1 - Wajant, Harald A1 - Siegmund, Daniela T1 - The NEDD8-activating enzyme inhibitor MLN4924 sensitizes a TNFR1+ subgroup of multiple myeloma cells for TNF-induced cell death JF - Cell Death & Disease N2 - The NEDD8-activating enzyme (NAE) inhibitor MLN4924 inhibits cullin-RING ubiquitin ligase complexes including the SKP1-cullin-F-box E3 ligase βTrCP. MLN4924 therefore inhibits also the βTrCP-dependent activation of the classical and the alternative NFĸB pathway. In this work, we found that a subgroup of multiple myeloma cell lines (e.g., RPMI-8226, MM.1S, KMS-12BM) and about half of the primary myeloma samples tested are sensitized to TNF-induced cell death by MLN4924. This correlated with MLN4924-mediated inhibition of TNF-induced activation of the classical NFκB pathway and reduced the efficacy of TNF-induced TNFR1 signaling complex formation. Interestingly, binding studies revealed a straightforward correlation between cell surface TNFR1 expression in multiple myeloma cell lines and their sensitivity for MLN4924/TNF-induced cell death. The cell surface expression levels of TNFR1 in the investigated MM cell lines largely correlated with TNFR1 mRNA expression. This suggests that the variable levels of cell surface expression of TNFR1 in myeloma cell lines are decisive for TNF/MLN4924 sensitivity. Indeed, introduction of TNFR1 into TNFR1-negative TNF/MLN4924-resistant KMS-11BM cells, was sufficient to sensitize this cell line for TNF/MLN4924-induced cell death. Thus, MLN4924 might be especially effective in myeloma patients with TNFR1+ myeloma cells and a TNFhigh tumor microenvironment. KW - cancer therapy KW - tumour-necrosis factors Y1 - 2019 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-226666 VL - 10 ER - TY - THES A1 - Jurak, Igor T1 - The molecular mechanism of the Cytomegalovirus species specificity T1 - Molekulare Mechanismen der Cytomegaloviren Arten Spezifizierung N2 - Viruses have undergone a coevolution with their hosts, resulting in a specific adaptation to them. Consequently, many viruses have a limited host range. Occasionally, viruses acquire an adaptive mutation, which allows infection and replication in a different species as shown recently for the human immunodeficiency virus and influenza virus. Cross-species infections are responsible for the majority of emerging and re-emerging viral diseases. However, little is known about the mechanisms that restrict viruses to a certain host species, and the factors viruses need to cross the species barrier and replicate in a different host. Cytomegaloviruses are prototypes of the beta-herpesvirus subfamily and are highly species specific. They replicate only in cells of their own or a closely related species. The molecular mechanism underlying their species specificity is poorly understood and was investigated in this study. An initial observation showed that murine cytomegalovirus (MCMV) can replicate in human 293 and 911 cells, but not in any other human cells tested. Both cell lines are transformed with adenoviral E1 genes that encode a transcriptional transactivator (E1A) and two suppressors of apoptosis (E1B-55k and E1B-19k). This has led to the hypothesis that these functions are required for MCMV replication in human cells. Further analysis revealed that normal human cells died rapidly after infection of caspase-9-mediated apoptosis. Apoptosis induced by MCMV can be suppressed by broad-spectrum caspase inhibitors, and virus replication can be rescued, indicating a major role of caspases in this process. Furthermore, over-expression of a mitochondria-localized inhibitor of apoptosis, a Bcl-2-like protein, prevented apoptosis induced by this virus. Human cells resistant to apoptosis allowed also an efficient MCMV replication. The important role of Bcl-2-like proteins for cytomegalovirus cross-species infections was subsequently confirmed by inserting the corresponding genes, and other inhibitors of apoptosis and control genes into the MCMV genome. Only recombinant viruses expressing a Bcl-2-like protein were able to replicate in human cells. A single gene of human cytomegalovirus encoding a mitochondrial inhibitor of apoptosis was sufficient to allow MCMV replication in human cells. Moreover, the same principle facilitated replication of the rat cytomegalovirus in human cells. Thus, induction of apoptosis limits rodent cytomegalovirus cross-species infection. N2 - Viren durchliefen eine gemeinsame Evolution mit ihren Wirtsorganismen, die zu einer spezifischen Anpassung der Viren an ihren jeweiligen Wirt führte. Als Folge dessen verfügen viele Viren über ein eng begrenztes Wirtsspektrum. Gelegentlich machen Viren Veränderungen durch, die es ihnen erlauben, einen neuen Wirt zu infizieren und in ihm zu replizieren, wie dies in jüngster Vergangenheit beim humanen Immundefizienz-Virus oder beim Grippevirus geschehen ist. Spezies-übergreifende Infektionen sind für die meisten neuen und wiederauftauchenden Viruserkrankungen verantwortlich. Allerdings ist bisher wenig über die Mechanismen bekannt, die Viren auf einen bestimmten Wirt beschränken, und welche Faktoren Viren zur Überwindung der Spezies-Barriere und zur Vermehrung in einer neuen Wirtsspezies benötigen. Cytomegaloviren sind Prototypen der beta-Herpesvirus Unterfamilie und verfügen über eine ausgeprägte Spezies-Spezifität. Sie vermehren sich nur in Zellen der eigenen oder einer eng verwandten Wirtsspezies. Der molekulare Mechanismus, der dieser Spezies-Spezifität zugrunde liegt, ist noch weitgehend unbekannt und stellt deshalb das Thema dieser Arbeit dar. Initiale Beobachtungen zeigten, dass sich das Maus-Cytomegalovirus (MCMV) ausschließlich in menschlichen 293 und 911 Zellen, aber keiner anderen getesteten menschlichen Zelle vermehren ließ. Diese beiden Zelllinien sind mit Adenovirus E1-Genen transformiert, die den Transkriptions-Transaktivator E1A sowie zwei Apoptose-Inhibitoren (E1B-55k und E1B-19k) kodieren. Daher lag die Hypothese nahe, dass diese Funktionen benötigt werden, um eine MCMV-Replikation in menschlichen Zellen zu ermöglichen. Außerdem konnte gezeigt werden, dass normale menschliche Zellen nach Infektion rapide absterben, und zwar durch eine Caspase-9-vermittelte Apoptose. Die Induktion der Apoptose durch MCMV lässt sich durch Caspase-Inhibitoren unterdrücken, wodurch die virale Replikation wiederhergestellt wird. Dies deutet auf eine Schlüsselfunktion der Caspasen für diesen Prozess hin. Durch Überexpression eines mitochondrialen Apoptose-Inhibitors, d.h. eines Bcl-2-ähnlichen Proteins, in menschlichen Zellen ließ sich die Virus-induzierte Apoptose verhindern. Diese Zellen erlaubten ebenfalls eine effiziente MCMV-Replikation. Die Bedeutung Bcl-2-ähnlicher Proteine für die Spezies-übergreifende Cytomegalovirus-Infektion wurde sowohl durch die Integration korrespondierender Gene, alsauch durch die Integration anderer Inhibitioren der Apoptose oder von Kontroll-Genen in das MCMV Genom bestätigt. Nur rekombinante Viren, die ein Bcl-2-ähnliches Protein kodieren, konnten in menschlichen Zellen vermehrt werden. Ein einziges Gen des humanen Cytomegalovirus, das einen mitochondrialen Apoptose-Inhibitor kodiert, reichte aus, um eine MCMV-Replikation in menschlichen Zellen zu ermöglichen. Zusätzlich konnte gezeigt werden, dass dieselben Prinzipien für eine Replikation des Ratten-Cytomegalovirus in menschlichen Zellen gelten. Zusammenfassend kann festgestellt werden, dass die Induktion der Apoptose eine Spezies-übergreifende Infektion bei den Nagetier-Cytomegaloviren einschränkt. KW - Cytomegalie-Virus KW - Art KW - Spezifität KW - Molekularbiologie KW - cytomegaloviren KW - Bcl-2 KW - apoptose KW - cytomegalovirus KW - Bcl-2 KW - apoptosis KW - species specificity Y1 - 2006 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-19233 ER - TY - JOUR A1 - Mayer, Alexander E. A1 - Löffler, Mona C. A1 - Loza Valdés, Angel E. A1 - Schmitz, Werner A1 - El-Merahbi, Rabih A1 - Trujillo-Viera, Jonathan A1 - Erk, Manuela A1 - Zhang, Thianzhou A1 - Braun, Ursula A1 - Heikenwalder, Mathias A1 - Leitges, Michael A1 - Schulze, Almut A1 - Sumara, Grzegorz T1 - The kinase PKD3 provides negative feedback on cholesterol and triglyceride synthesis by suppressing insulin signaling JF - Science Signaling N2 - Hepatic activation of protein kinase C (PKC) isoforms by diacylglycerol (DAG) promotes insulin resistance and contributes to the development of type 2 diabetes (T2D). The closely related protein kinase D (PKD) isoforms act as effectors for DAG and PKC. Here, we showed that PKD3 was the predominant PKD isoform expressed in hepatocytes and was activated by lipid overload. PKD3 suppressed the activity of downstream insulin effectors including the kinase AKT and mechanistic target of rapamycin complex 1 and 2 (mTORC1 and mTORC2). Hepatic deletion of PKD3 in mice improved insulin-induced glucose tolerance. However, increased insulin signaling in the absence of PKD3 promoted lipogenesis mediated by SREBP (sterol regulatory element-binding protein) and consequently increased triglyceride and cholesterol content in the livers of PKD3-deficient mice fed a high-fat diet. Conversely, hepatic-specific overexpression of a constitutively active PKD3 mutant suppressed insulin-induced signaling and caused insulin resistance. Our results indicate that PKD3 provides feedback on hepatic lipid production and suppresses insulin signaling. Therefore, manipulation of PKD3 activity could be used to decrease hepatic lipid content or improve hepatic insulin sensitivity. KW - Protein kinase D3 (PKD3) KW - cholesterol KW - diacylglycerol (DAG) KW - liver KW - metabolism Y1 - 2019 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-250025 ET - accepted manuscript ER - TY - JOUR A1 - Radu, Laura A1 - Schoenwetter, Elisabeth A1 - Braun, Cathy A1 - Marcoux, Julien A1 - Koelmel, Wolfgang A1 - Schmitt, Dominik R. A1 - Kuper, Jochen A1 - Cianférani, Sarah A1 - Egly, Jean M. A1 - Poterszman, Arnaud A1 - Kisker, Caroline T1 - The intricate network between the p34 and p44 subunits is central to the activity of the transcription/DNA repair factor TFIIH JF - Nucleic Acids Research N2 - The general transcription factor IIH (TFIIH) is a multi-protein complex and its 10 subunits are engaged in an intricate protein–protein interaction network critical for the regulation of its transcription and DNA repair activities that are so far little understood on a molecular level. In this study, we focused on the p44 and the p34 subunits, which are central for the structural integrity of core-TFIIH. We solved crystal structures of a complex formed by the p34 N-terminal vWA and p44 C-terminal zinc binding domains from Chaetomium thermophilum and from Homo sapiens. Intriguingly, our functional analyses clearly revealed the presence of a second interface located in the C-terminal zinc binding region of p34, which can rescue a disrupted interaction between the p34 vWA and the p44 RING domain. In addition, we demonstrate that the C-terminal zinc binding domain of p34 assumes a central role with respect to the stability and function of TFIIH. Our data reveal a redundant interaction network within core-TFIIH, which may serve to minimize the susceptibility to mutational impairment. This provides first insights why so far no mutations in the p34 or p44 TFIIH-core subunits have been identified that would lead to the hallmark nucleotide excision repair syndromes xeroderma pigmentosum or trichothiodystrophy. KW - general transcription factor IIH (TFIIH) KW - DNA repair KW - protein–protein interaction KW - p44 KW - p34 Y1 - 2017 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-170173 VL - 45 IS - 18 ER - TY - JOUR A1 - Petruseva, Irina A1 - Naumenko, Natalia A1 - Kuper, Jochen A1 - Anarbaev, Rashid A1 - Kappenberger, Jeannette A1 - Kisker, Caroline A1 - Lavrik, Olga T1 - The Interaction Efficiency of XPD-p44 With Bulky DNA Damages Depends on the Structure of the Damage JF - Frontiers in Cell and Developmental Biology N2 - The successful elimination of bulky DNA damages via the nucleotide excision repair (NER) system is largely determined by the damage recognition step. This step consists of primary recognition and verification of the damage. The TFIIH helicase XPD plays a key role in the verification step during NER. To date, the mechanism of damage verification is not sufficiently understood and requires further detailed research. This study is a systematic investigation of the interaction of ctXPD (Chaetomium thermophilum) as well as ctXPD-ctp44 with model DNAs, which contain structurally different bulky lesions with previously estimated NER repair efficiencies. We have used ATPase and DNA binding studies to assess the interaction of ctXPD with damaged DNA. The result of the analysis of ctXPD-ctp44 binding to DNA containing fluorescent and photoactivatable lesions demonstrates the relationship between the affinity of XPD for DNAs containing bulky damages and the ability of the NER system to eliminate the damage. Photo-cross-linking of ctXPD with DNA probes containing repairable and unrepairable photoactivatable damages reveals differences in the DNA interaction efficiency in the presence and absence of ctp44. In general, the results obtained indicate the ability of ctXPD-ctp44 to interact with a damage and suggest a significant role for ctp44 subunit in the verification process. KW - nucleotide excision repair KW - XPD helicase KW - DNA damage KW - protein-DNA interaction KW - bulky damages recognition KW - photo-cross-linking Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-231806 SN - 2296-634X VL - 9 ER - TY - JOUR A1 - Kreß, Julia Katharina Charlotte A1 - Jessen, Christina A1 - Hufnagel, Anita A1 - Schmitz, Werner A1 - Da Xavier Silva, Thamara Nishida A1 - Ferreira Dos Santos, Ancély A1 - Mosteo, Laura A1 - Goding, Colin R. A1 - Friedmann Angeli, José Pedro A1 - Meierjohann, Svenja T1 - The integrated stress response effector ATF4 is an obligatory metabolic activator of NRF2 JF - Cell Reports N2 - Highlights • The integrated stress response leads to a general ATF4-dependent activation of NRF2 • ATF4 causes a CHAC1-dependent GSH depletion, resulting in NRF2 stabilization • An elevation of NRF2 transcript levels fosters this effect • NRF2 supports the ISR/ATF4 pathway by improving cystine and antioxidant supply Summary The redox regulator NRF2 becomes activated upon oxidative and electrophilic stress and orchestrates a response program associated with redox regulation, metabolism, tumor therapy resistance, and immune suppression. Here, we describe an unrecognized link between the integrated stress response (ISR) and NRF2 mediated by the ISR effector ATF4. The ISR is commonly activated after starvation or ER stress and plays a central role in tissue homeostasis and cancer plasticity. ATF4 increases NRF2 transcription and induces the glutathione-degrading enzyme CHAC1, which we now show to be critically important for maintaining NRF2 activation. In-depth analyses reveal that NRF2 supports ATF4-induced cells by increasing cystine uptake via the glutamate-cystine antiporter xCT. In addition, NRF2 upregulates genes mediating thioredoxin usage and regeneration, thus balancing the glutathione decrease. In conclusion, we demonstrate that the NRF2 response serves as second layer of the ISR, an observation highly relevant for the understanding of cellular resilience in health and disease. KW - NRF2 KW - ATF4 KW - integrated stress response KW - CHAC1 KW - melanoma KW - SLC7A11 KW - GSH Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-350312 VL - 42 IS - 7 ER - TY - JOUR A1 - Young, Joanna C. A1 - Clements, Abigail A1 - Lang, Alexander E. A1 - Garnett, James A. A1 - Munera, Diana A1 - Arbeloa, Ana A1 - Pearson, Jaclyn A1 - Hartland, Elizabeth L. A1 - Matthews, Stephen J. A1 - Mousnier, Aurelie A1 - Barry, David J. A1 - Way, Michael A1 - Schlosser, Andreas A1 - Aktories, Klaus A1 - Frankel, Gad T1 - The Escherichia coli effector EspJ blocks Src kinase activity via amidation and ADP ribosylation JF - Nature Communications N2 - The hallmark of enteropathogenic Escherichia coli (EPEC) infection is the formation of actin-rich pedestal-like structures, which are generated following phosphorylation of the bacterial effector Tir by cellular Src and Abl family tyrosine kinases. This leads to recruitment of the Nck-WIP-N-WASP complex that triggers Arp2/3-dependent actin polymerization in the host cell. The same phosphorylation-mediated signalling network is also assembled downstream of the Vaccinia virus protein A36 and the phagocytic Fc-gamma receptor FcγRIIa. Here we report that the EPEC type-III secretion system effector EspJ inhibits autophosphorylation of Src and phosphorylation of the Src substrates Tir and FcγRIIa. Consistent with this, EspJ inhibits actin polymerization downstream of EPEC, Vaccinia virus and opsonized red blood cells. We identify EspJ as a unique adenosine diphosphate (ADP) ribosyltransferase that directly inhibits Src kinase by simultaneous amidation and ADP ribosylation of the conserved kinase-domain residue, Src E310, resulting in glutamine-ADP ribose. Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-121157 VL - 5 IS - 5887 ER - TY - JOUR A1 - Tessmer, Ingrid A1 - Margison, Geoffrey P. T1 - The DNA alkyltransferase family of DNA repair proteins: common mechanisms, diverse functions JF - International Journal of Molecular Sciences N2 - DNA alkyltransferase and alkyltransferase-like family proteins are responsible for the repair of highly mutagenic and cytotoxic O\(^6\)-alkylguanine and O\(^4\)-alkylthymine bases in DNA. Their mechanism involves binding to the damaged DNA and flipping the base out of the DNA helix into the active site pocket in the protein. Alkyltransferases then directly and irreversibly transfer the alkyl group from the base to the active site cysteine residue. In contrast, alkyltransferase-like proteins recruit nucleotide excision repair components for O\(^6\)-alkylguanine elimination. One or more of these proteins are found in all kingdoms of life, and where this has been determined, their overall DNA repair mechanism is strictly conserved between organisms. Nevertheless, between species, subtle as well as more extensive differences that affect target lesion preferences and/or introduce additional protein functions have evolved. Examining these differences and their functional consequences is intricately entwined with understanding the details of their DNA repair mechanism(s) and their biological roles. In this review, we will present and discuss various aspects of the current status of knowledge on this intriguing protein family. KW - DNA repair KW - O6-alkylguanine-DNA alkyltransferase KW - alkylation damage Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-355790 SN - 1422-0067 VL - 25 IS - 1 ER - TY - JOUR A1 - Nieswandt, Bernhard A1 - Morowski, Martina A1 - Brachs, Sebastian A1 - Mielenz, Dirk A1 - Dütting, Sebastian T1 - The Adaptor Protein Swiprosin-1/EFhd2 Is Dispensable for Platelet Function in Mice N2 - Background Platelets are anuclear cell fragments derived from bone marrow megakaryocytes that safeguard vascular integrity, but may also cause pathological vessel occlusion. Reorganizations of the platelet cytoskeleton and agonist-induced intracellular Ca2+-mobilization are crucial for platelet hemostatic function. EF-hand domain containing 2 (EFhd2, Swiprosin-1) is a Ca2+-binding cytoskeletal adaptor protein involved in actin remodeling in different cell types, but its function in platelets is unknown. Objective Based on the described functions of EFhd2 in immune cells, we tested the hypothesis that EFhd2 is a crucial adaptor protein for platelet function acting as a regulator of Ca2+-mobilization and cytoskeletal rearrangements. Methods and Results We generated EFhd2-deficient mice and analyzed their platelets in vitro and in vivo. Efhd2-/- mice displayed normal platelet count and size, exhibited an unaltered in vivo life span and showed normal Ca2+-mobilization and activation/aggregation responses to classic agonists. Interestingly, upon stimulation of the immunoreceptor tyrosine-based activation motif-coupled receptor glycoprotein (GP) VI, Efhd2-/- platelets showed a slightly increased coagulant activity. Furthermore, absence of EFhd2 had no significant impact on integrin-mediated clot retraction, actomyosin rearrangements and spreading of activated platelets on fibrinogen. In vivo EFhd2-deficiency resulted in unaltered hemostatic function and unaffected arterial thrombus formation. Conclusion These results show that EFhd2 is not essential for platelet function in mice indicating that other cytoskeletal adaptors may functionally compensate its loss. KW - adaptor protein Swiprosin-1/EFhd2 KW - platelets KW - platelet activation KW - platelet aggregation KW - cytoskeleton KW - thrombin KW - blood KW - actins KW - collagens Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-113316 ER - TY - JOUR A1 - Navarro, Stefano A1 - Stegner, David A1 - Nieswandt, Bernhard A1 - Heemskerk, Johan W. M. A1 - Kuijpers, Marijke J. E. T1 - Temporal roles of platelet and coagulation pathways in collagen- and tissue factor-induced thrombus formation JF - International Journal of Molecular Sciences N2 - In hemostasis and thrombosis, the complex process of thrombus formation involves different molecular pathways of platelet and coagulation activation. These pathways are considered as operating together at the same time, but this has not been investigated. The objective of our study was to elucidate the time-dependency of key pathways of thrombus and clot formation, initiated by collagen and tissue factor surfaces, where coagulation is triggered via the extrinsic route. Therefore, we adapted a microfluidics whole-blood assay with the Maastricht flow chamber to acutely block molecular pathways by pharmacological intervention at desired time points. Application of the technique revealed crucial roles of glycoprotein VI (GPVI)-induced platelet signaling via Syk kinase as well as factor VIIa-induced thrombin generation, which were confined to the first minutes of thrombus buildup. A novel anti-GPVI Fab EMF-1 was used for this purpose. In addition, platelet activation with the protease-activating receptors 1/4 (PAR1/4) and integrin αIIbβ3 appeared to be prolongedly active and extended to later stages of thrombus and clot formation. This work thereby revealed a more persistent contribution of thrombin receptor-induced platelet activation than of collagen receptor-induced platelet activation to the thrombotic process. KW - coagulation KW - fibrin KW - glycoprotein VI KW - platelet receptors KW - spatiotemporal thrombus KW - thrombin Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-284219 SN - 1422-0067 VL - 23 IS - 1 ER - TY - THES A1 - Eltschkner, Sandra T1 - Targeting the Bacterial Fatty-Acid Synthesis Pathway: Towards the Development of Slow-Onset Inhibitors and the Characterisation of Protein-Protein Interactions T1 - Die bakterielle Fettsäurebiosynthese als Zielobjekt zur Entwicklung langsam bindender Inhibitoren und zur Charakterisierung von Protein-Protein-Wechselwirkungen N2 - A continuous arms race between the development of novel antibiotics and the evolution of corresponding resistance mechanisms in bacteria has been observed, since antibiotic agents like arsphenamines (e.g. Salvarsan, developed by Paul Ehrlich [1]), sulphonamides (e.g. Prontosil, Gerhard Domagk [2]) and penicillin (Alexander Fleming [3]) were first applied to effectively cure bacterial infections in the early 20th century. The rapid emergence of resistances in contrast to the currently lagging discovery of antibiotics displays a severe threat to human health. Some serious infectious diseases, such as tuberculosis or melioidosis, which were either thought to be an issue only in Third-World countries in case of tuberculosis, or regionally restricted with respect to melioidosis, are now on the rise to expand to other areas. In contrast, methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) is already present in clinical setups all over the world and causes severe infections in immunocompromised patients. Thus, there is an urgent need for new and effective antimicrobial agents, which impair vital functions of the pathogen’s metabolism. One central metabolic pathway is represented by the bacterial fatty-acid synthesis pathway (FAS II), which is essential for the synthesis of long and branched-chain fatty acids, as well as mycolic acids. These substances play a major role as modulating components of the properties of the most important protective barrier – the cell envelope. The integrity of the bacterial cell wall and the associated membrane(s) is crucial for cell growth and for protection against physical strain, intrusion of antibiotic agents and regulation of uptake of ions and other small molecules. Thus, this central pathway represents a promising target for antibiotic action against pathogens to combat infectious diseases. The last and rate-limiting step is catalysed by the trans-2-enoyl-ACP reductase (ENR) FabI or InhA (in mycobacteria), which has been demonstrated to be a valuable target for drug design and can be addressed, amongst others, by diphenyl ether (DPE) compounds, derived from triclosan (TCL) – the first one of this class which was discovered to bind to ENR enzymes [4, 5]. Based on this scaffold, inhibitors containing different combinations of substituents at crucial positions, as well as a novel type of substituent at position five were investigated regarding their binding behaviour towards the Burkholderia pseudomallei and Mycobacterium tuberculosis ENR enzymes bpFabI and InhA, respectively, by structural, kinetic and in-vivo experiments. Generally, substitution patterns modulate the association and dissociation velocities of the different ENR inhibitors in the context of the two-step slow-onset binding mechanism, which is observed for both enzymes. These alterations in the rapidity of complex formation and decomposition have a crucial impact on the residence time of a compound and hence, on the pharmacokinetic properties of potential drug candidates. For example, the substituents at the 2’-position of the DPE scaffold influence the ground- and transition state stability during the binding process to bpFabI, whereas 4’-substituents primarily alter the transition state [6]. The novel triazole group attached to the 5-position of the scaffold, targeting the hydrophobic part of the substrate-binding pocket in InhA, significantly enhances the energy barrier of the transition state of inhibitor binding [7] and decelerates the association- as well as the dissociation processes. Combinations with different substituents at the 2’-position can enhance or diminish this effect, e.g. by ground-state stabilisation, which will result in an increased residence time of the respective inhibitor on InhA. Further structural investigations carried out in this work, confirm the proposed binding mode of a customised saFabI inhibitor [8], carrying a pyridone moiety on the DPE scaffold to expand interactions with the protein environment. Structural and preliminary kinetic data confirm the binding of the same inhibitor to InhA in a related fashion. Comparisons with structures of the ENR inhibitor AFN-1252 [9] bound to ENR enzymes from other organisms, addressing a similar region as the pyridone-moiety of the DPE inhibitor, suggest that also the DPE inhibitor bears the potential to display binding to homologues of saFabI and InhA and may be optimised accordingly. Both of the newly investigated substituents, the pyridone moiety at the 4’-position as well as the 5-triazole substituent, provide a good starting point to modify the DPE scaffold also towards improved kinetic properties against ENR enzymes other than the herein studied and combining both groups on the DPE scaffold may have beneficial effects. The understanding of the underlying binding mechanism is a crucial factor to promote the dedicated design of inhibitors with superior pharmacokinetic characteristics. A second target for a structure-based drug-design approach is the interaction surface between ENR enzymes and the acyl-carrier protein (ACP), which delivers the growing acyl chain to each distinct enzyme of the dissociated FAS-II system and presumably recognises its respective interaction partner via electrostatic contacts. The interface between saACP and saFabI was investigated using different approaches including crosslinking experiments and the design of fusion constructs connecting the ACP and the FabI subunits via a flexible linker region of varying lengths and compositions. The crosslinking studies confirmed a set of residues to be part of the contact interface of a previously proposed complex model [10] and displayed high crosslinking efficiency of saACP to saFabI when mutated to cysteine residues. However, crystals of the complex obtained from either the single components, or of the fusion constructs usually displayed weak diffraction, which supports the assumption that complex formation is highly transient. To obtain ordered crystals for structural characterisation of the complex it is necessary to trap the complex in a fixed state, e.g. by a high-affinity substrate attached to ACP [11], which abolishes rapid complex dissociation. For this purpose, acyl-coupled long-residence time inhibitors might be a valuable tool to elucidate the detailed architecture of the ACP-FabI interface. This may provide a novel basis for the development of inhibitors that specifically target the FAS-II biosynthesis pathway. N2 - Seit Beginn der Anwendung antibiotischer Substanzen wie Arsphenaminen, z.B. Salvarsan, entwickelt von Paul Ehrlich [1], Sulfonamiden, z.B. Prontosil, dessen antibakterielle Wirksamkeit durch Gerhard Domagk nachgewiesen wurde [2], oder des von Alexander Fleming entdeckten Penicillins [3] zur effektiven Bekämpfung von Infektionskrankheiten Anfang des 20. Jahrhunderts findet ein kontinuierliches Wettrüsten zwischen der Entstehung von Antibiotikaresistenzen in Bakterien und der Entwicklung neuer Antibiotika statt. Vor allem die zügige Entstehung von Resistenzen im Gegensatz zum eher stockenden Fortschritt der Entdeckung neuer Antibiotika stellt ein ernstzunehmendes Risiko für die menschliche Gesundheit dar. Einige stark lebensbedrohliche Infektionskrankheiten, darunter Tuberkulose und Melioidose, erfahren dadurch eine erhöhte Verbreitung. Ein Anstieg der Zahl der Tuberkuloseerkrankungen in Gebieten, in denen die Krankheit bereits als ausgerottet galt, beispielsweise in Europa; oder im Falle der Melioidose, eine Verbreitung in Gebiete, in denen die Krankheitserreger natürlicherweise nicht vorkommen; sind u.a. die Folgen fehlender Wirkstoffe zur Bekämpfung resistenter Stämme. Methicillinresistente Staphylococcus-aureus- (MRSA-) Stämme sind hingegen bereits fast weltweit in Krankenhäusern verbreitet und gelten dort als Quelle schwerer Infektionen, die vor allem für Patienten mit geschwächtem Immunsystem eine ernsthafte Bedrohung darstellen. Die mannigfaltigen Vorkommen resistenter Erreger und die eingeschränkten Behandlungsmöglichkeiten dadurch verursachter Infektionen machen die Entwicklung neuer, wirksamer Antibiotika dringend notwendig. Ein zentraler Stoffwechselweg der Bakterien ist die Fettsäurebiosynthese II, die im Hinblick auf die Herstellung lang- und verzweigtkettiger Fettsäuren sowie von Mykolsäuren essentiell ist. Die Zusammensetzung der Fettsäuren trägt maßgeblich zur Funktionsfähigkeit der unentbehrlichen Schutzbarriere der Zelle – nämlich der Zellhülle – bei. Eine intakte Zellwand und deren assoziierte Membranen schützen die Zelle vor physikalischem Stress, vor dem Eindringen antibiotischer Substanzen und regulieren die Aufnahme anderer Kleinmoleküle und Ionen. Genau aus diesem Grunde stellt die Fettsäurebiosynthese ein attraktives Ziel für die Entwicklung von Antibiotika dar. Die Enoyl-ACP-Reduktase (ENR), welche den letzten und geschwindigkeitsbestimmenden Schritt des Synthesezyklus katalysiert, wurde als hervorragendes Zielmolekül identifiziert und wird unter anderem von Diphenylethern gehemmt. Diese Verbindungen sind von Triclosan abgeleitet, dessen Bindung an ENR-Enzyme als erstem Vertreter dieser Stoffklasse nachgewiesen werden konnte [4, 5]. Basierend auf dem Diphenylethergrundgerüst von Triclosan wurden Inhibitoren mit unterschiedlichen Substitutionsmustern bezüglich ihrer Bindungseigenschaften an die ENR-Enzyme von Burkholderia pseudomallei (bpFabI) und Mycobacterium tuberculosis (InhA) untersucht. Kritische Positionen dieses Grundgerüstes wurden mit verschiedenen, chemischen Gruppen versehen und die Bindung an diese beiden Enzyme anschließend strukturell, kinetisch und am lebenden Organismus charakterisiert. In beiden Fällen üben die Substitutionsmuster einen beträchtlichen Einfluss auf die Assoziations- und Dissoziationsgeschwindigkeiten der verschiedenen Inhibitoren im Rahmen des verlangsamten Zweischrittassoziationsmechanismus aus, welche wiederum die Verweildauer des Inhibitors am Enzym und dessen pharmakokinetische Eigenschaften bestimmen. Die Beschaffenheit der 2‘-Substituenten beeinflusst beispielsweise die Stabilität des Grund- sowie des Übergangszustandes im Bindungsgeschehen an bpFabI, wohingegen 4‘-Substituenten hauptsächlich zu Stabilitätsänderungen im Übergangszustand beitragen [6]. Die Einführung des Triazolsubstituenten an der 5-Position des Diphenylethergerüsts führt zu einer signifikanten Erhöhung der Energiebarriere des Übergangszustandes im Bindungsprozess an InhA [7], was im Rückschluss zu einer ebenfalls verlangsamten Dissoziation des Enzym-Inhibitor-Komplexes führt. Zusätzlich wird dieser Effekt durch die Beschaffenheit des entsprechenden Substituenten an der 2‘-Position noch verstärkt oder abgeschwächt. Dies erfolgt beispielsweise durch eine Stabilisierung des Grundzustandes und eine daraus resultierende, verlängerte Verweildauer des Inhibitors am Enzym. Weitere, strukturelle Untersuchungen im Rahmen dieser Arbeit konnten den vorgeschlagenen Bindungsmodus [8] des neuartigen, speziell auf das ENR-Enzym von Staphylococcus aureus (saFabI) zugeschnittenen Inhibitors „55JS“ (auch „SKTS1“) bestätigen. Dieser Diphenyletherinhibitor besitzt an der 4‘-Position einen Pyridonring, welcher die Wechselwirkungen mit dem Enzym verstärken soll. Aus den strukturellen und vorläufigen, kinetischen Daten geht hervor, dass dieser Inhibitor ebenfalls und in ähnlicher Weise an InhA bindet. Außerdem legt ein Vergleich mit Komplexstrukturen verschiedener ENRs in Verbindung mit AFN-1252 [9] die Vermutung nahe, dass auch 55JS an weitere ENR-Homologe binden könnte; denn jener Teil des AFN-1252-Inhibitors, der sich räumlich mit dem Pyridonring von 55JS überlagert, geht mit derselben Region im Protein ähnliche Wechselwirkungen ein. Es ist daher möglich, dass dieser Inhibitor das Potential birgt, durch entsprechende Optimierung als Wirkstoff gegen andere Pathogene zum Einsatz zu gelangen. Beide dieser neuartigen, funktionellen Gruppen, die Triazol- und die Pyridongruppe, stellen einen guten Ansatzpunkt für die Weiterentwicklung von Diphenylethern bezüglich verbesserter kinetischer Eigenschaften gegenüber ENR-Enzymen dar. Ein weiterer, interessanter Ansatz für die strukturbasierte Wirkstoffentwicklung ist durch die Interaktionsfläche zwischen ENR-Enzymen und dem Acyl-Carrier-Protein (ACP) gegeben. ACP transportiert die naszierende Acylkette von einem zum nächsten Enzym des dissoziierten Fettsäurebiosynthesezyklus, welche es wahrscheinlich anhand elektrostatischer Interaktionen erkennt. Die Kontaktfläche zwischen saACP und saFabI wurde hier mittels verschiedener Ansätze untersucht, die sowohl Crosslinking-Experimente als auch die Generierung von Fusionsproteinen umfassten. In den verschiedenen Fusionskonstrukten wurden das ACP- und das ENR-Protein durch eine flexible Aminosäurekette unterschiedlicher Längen und Zusammensetzungen miteinander verbunden. Durch die Crosslinking-Experimente konnten Aminosäuren identifiziert werden, welche einen Teil einer vorgeschlagenen Interaktionsfläche [10] ausmachen und tatsächlich eine hohe Vernetzungseffizienz aufwiesen. Proteinkristalle des Komplexes, die entweder beide Einzelkomponenten oder das Fusionsprotein enthielten, zeigten jedoch nur schwache Beugungsmuster. Diese Beobachtung deckt sich mit der Annahme, dass die Komplexbildung äußerst kurzlebig ist. Die intrinsische Flexibilität beider Proteine erhöht zusätzlich die Schwierigkeit, wohlgeordnete Kristalle zu erhalten. Es wird deshalb notwendig sein, den Komplex in einem fixierten Zustand einzufangen. Die Verwendung eines hochaffinen Substrates, welches die Dissoziation des Komplexes unterbindet, beispielsweise ein acylgekoppelter Inhibitor [11] mit langer Verweildauer am Enzym, könnte hier von großem Nutzen sein und es damit erlauben eine detaillierte Kenntnis der ACP-FabI-Interaktionsfläche zu erhalten, die neue Perspektiven für eine gezielte Entwicklung von Inhibitoren der Fettsäurebiosynthese II eröffnen könnten. KW - Fettsäurestoffwechsel KW - Diphenylether KW - Arzneimitteldesign KW - Verweildauer KW - bacterial fatty-acid biosynthesis KW - enoyl-ACP reductase KW - structure-based drug design KW - inhibitor residence time Y1 - 2020 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-156643 ER - TY - JOUR A1 - Schuhmann, Michael K. A1 - Kraft, Peter A1 - Bieber, Michael A1 - Kollikowski, Alexander M. A1 - Schulze, Harald A1 - Nieswandt, Bernhard A1 - Pham, Mirko A1 - Stegner, David A1 - Stoll, Guido T1 - Targeting platelet GPVI plus rt-PA administration but not α2β1-mediated collagen binding protects against ischemic brain damage in mice JF - International Journal of Molecular Science N2 - Platelet collagen interactions at sites of vascular injuries predominantly involve glycoprotein VI (GPVI) and the integrin α2β1. Both proteins are primarily expressed on platelets and megakaryocytes whereas GPVI expression is also shown on endothelial and integrin α2β1 expression on epithelial cells. We recently showed that depletion of GPVI improves stroke outcome without increasing the risk of cerebral hemorrhage. Genetic variants associated with higher platelet surface integrin α2 (ITGA2) receptor levels have frequently been found to correlate with an increased risk of ischemic stroke in patients. However until now, no preclinical stroke study has addressed whether platelet integrin α2β1 contributes to the pathophysiology of ischemia/reperfusion (I/R) injury. Focal cerebral ischemia was induced in C57BL/6 and Itga2\(^{−/−}\) mice by a 60 min transient middle cerebral artery occlusion (tMCAO). Additionally, wild-type animals were pretreated with anti-GPVI antibody (JAQ1) or Fab fragments of a function blocking antibody against integrin α2β1 (LEN/B). In anti-GPVI treated animals, intravenous (IV) recombinant tissue plasminogen activator (rt-PA) treatment was applied immediately prior to reperfusion. Stroke outcome, including infarct size and neurological scoring was determined on day 1 after tMCAO. We demonstrate that targeting the integrin α2β1 (pharmacologic; genetic) did neither reduce stroke size nor improve functional outcome on day 1 after tMCAO. In contrast, depletion of platelet GPVI prior to stroke was safe and effective, even when combined with rt-PA treatment. Our results underscore that GPVI, but not ITGA2, is a promising and safe target in the setting of ischemic stroke. KW - ischemic stroke KW - integrin α2 KW - glycoprotein VI KW - recombinant tissue-type plasminogen activator KW - intracranial bleeding KW - transient middle cerebral artery occlusion Y1 - 2019 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-201700 SN - 1422-0067 VL - 20 IS - 8 ER - TY - JOUR A1 - Navarro, Stefano A1 - Starke, Andreas A1 - Heemskerk, Johan W. M. A1 - Kuijpers, Marijke J. E. A1 - Stegner, David A1 - Nieswandt, Bernhard T1 - Targeting of a conserved epitope in mouse and human GPVI differently affects receptor function JF - International Journal of Molecular Sciences N2 - Glycoprotein (GP) VI is the major platelet collagen receptor and a promising anti-thrombotic target. This was first demonstrated in mice using the rat monoclonal antibody JAQ1, which completely blocks the Collagen-Related Peptide (CRP)-binding site on mouse GPVI and efficiently inhibits mouse platelet adhesion, activation and aggregation on collagen. Here, we show for the first time that JAQ1 cross-reacts with human GPVI (huGPVI), but not with GPVI in other tested species, including rat, rabbit, guinea pig, swine, and dog. We further demonstrate that JAQ1 differently modulates mouse and human GPVI function. Similar to its effects on mouse GPVI (mGPVI), JAQ1 inhibits CRP-induced activation in human platelets, whereas, in stark contrast to mouse GPVI, it does not inhibit the adhesion, activation or aggregate formation of human platelets on collagen, but causes instead an increased response. This effect was also seen with platelets from newly generated human GPVI knockin mice (hGP6\(^{tg/tg\)). These results indicate that the binding of JAQ1 to a structurally conserved epitope in GPVI differently affects its function in human and mouse platelets. KW - glycoprotein VI KW - JAQ1 KW - platelet receptors KW - platelet activation KW - platelet inhibition Y1 - 2022 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-286227 SN - 1422-0067 VL - 23 IS - 15 ER - TY - JOUR A1 - Khayenko, Vladimir A1 - Maric, Hans Michael T1 - Targeting GABA\(_A\)R-associated proteins: new modulators, labels and concepts JF - Frontiers in Molecular Neuroscience N2 - γ-aminobutyric acid type A receptors (GABA\(_A\)Rs) are the major mediators of synaptic inhibition in the brain. Aberrant GABA\(_A\)R activity or regulation is observed in various neurodevelopmental disorders, neurodegenerative diseases and mental illnesses, including epilepsy, Alzheimer’s and schizophrenia. Benzodiazepines, anesthetics and other pharmaceutics targeting these receptors find broad clinical use, but their inherent lack of receptor subtype specificity causes unavoidable side effects, raising a need for new or adjuvant medications. In this review article, we introduce a new strategy to modulate GABAeric signaling: targeting the intracellular protein interactors of GABA\(_A\)Rs. Of special interest are scaffolding, anchoring and supporting proteins that display high GABA\(_A\)R subtype specificity. Recent efforts to target gephyrin, the major intracellular integrator of GABAergic signaling, confirm that GABA\(_A\)R-associated proteins can be successfully targeted through diverse molecules, including recombinant proteins, intrabodies, peptide-based probes and small molecules. Small-molecule artemisinins and peptides derived from endogenous interactors, that specifically target the universal receptor binding site of gephyrin, acutely affect synaptic GABA\(_A\)R numbers and clustering, modifying neuronal transmission. Interference with GABA\(_A\)R trafficking provides another way to modulate inhibitory signaling. Peptides blocking the binding site of GABA\(_A\)R to AP2 increase the surface concentration of GABA\(_A\)R clusters and enhance GABAergic signaling. Engineering of gephyrin binding peptides delivered superior means to interrogate neuronal structure and function. Fluorescent peptides, designed from gephyrin binders, enable live neuronal staining and visualization of gephyrin in the post synaptic sites with submicron resolution. We anticipate that in the future, novel fluorescent probes, with improved size and binding efficiency, may find wide application in super resolution microscopy studies, enlightening the nanoscale architecture of the inhibitory synapse. Broader studies on GABA\(_A\)R accessory proteins and the identification of the exact molecular binding interfaces and affinities will advance the development of novel GABA\(_A\)R modulators and following in vivo studies will reveal their clinical potential as adjuvant or stand-alone drugs. KW - GABAA receptors KW - gephyrin KW - collybistin KW - protein-protein interaction (PPI) KW - super resolution microscopy KW - fluorescent probes KW - dimeric peptide KW - peptide inhibitor design Y1 - 2019 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-201876 VL - 12 IS - 162 ER -