TY - THES A1 - Salehi, Saeede T1 - Axonal hnRNP R: regulation by Ptbp2 and functions in neurodegenerative disorders T1 - Axonales hnRNP R: Regulation durch Ptbp2 und Funktionen bei neurodegenerativen Erkrankungen N2 - Axon growth, a fundamental process of neuron development, is regulated by both intrinsic and external guidance signals. Impairment of axon growth and maintenance is implicated in the pathogenesis of neurodegenerative disorders such as Amyotrophic Lateral Sclerosis and Alzheimer’s disease (AD). Axon growth is driven by several post-transcriptional RNA processing mechanisms, including alternative splicing, polyadenylation, subcellular localization, and translation. These mechanisms are controlled by RNA-binding proteins (RBPs) through interacting with their target RNAs in a sequence-dependent manner. In this study, we investigate the cytosolic functions of two neuronal RBPs, Ptbp2 and hnRNP R, which are essential for axon growth in motoneurons. Polypyrimidine tract binding protein 2 (Ptbp2) contributes to neuronal differentiation and axonogenesis by modulating different splicing programs to adjust the level of proteins involved in these processes. While the nuclear functions of Ptbp2 in alternative splicing have been studied in more detail, the cytosolic roles of Ptbp2 associated with axon growth have remained elusive. In the first part of the study, we show that Ptbp2 is present in cytosolic fractions of motoneurons including axons and axon terminals. Depletion of Ptbp2 impairs axon growth and growth cone maturation in cultured embryonic mouse motoneurons. Moreover, Ptbp2 knockdown affects the level of piccolo protein in the growth cone of cultured motoneurons. We detect Ptbp2 as a top interactor of the 3' UTR of the Hnrnpr transcript encoding the RBP hnRNP R. This interaction results in axonal localization of and thereby local translation of Hnrnpr mRNA in motoneurons. Consequently, axonal synthesis of hnRNP R was diminished upon depletion of Ptbp2 in motoneurons. We present evidence that Ptbp2 through cooperation with translation factor eIF5A2 controls hnRNP R synthesis. Additionally, we observe that re-expression of hnRNP R in Ptbp2-deficient motoneurons rescued axon growth defect while Ptbp2 overexpression failed to normalize the axon elongation defect observed in hnRNP R-deficient motoneurons. Our findings pinpoint axonal synthesized hnRNP R as a mediator of Ptbp2 functions in axon growth. In the second part of this study, we identify hnRNP R binds to the 3' UTR of microtubule-associated tau (Mapt) transcript encoding tau protein and regulates the axonal translocation and translation of Mapt mRNA. Tau protein has a central role in neuronal microtubule assembly and stability. However, in AD, the accumulation of abnormally hyperphosphorylated tau protein leads to axon outgrowth defects. Loss of hnRNP R reduces axonal tau protein but not the total level of tau. We observe that the brains of 5xFAD mice, as a mouse model of AD, deficient for hnRNP R contain lower phospho-tau and amyloid-β plaques. Likewise, Neurons treated with blocking antisense oligonucleotides (ASO) to prevent binding of hnRNP R to Mapt mRNA show reduced axonal Mapt mRNA and consequently newly synthesized tau protein levels. We show that blocking Mapt mRNA transport to axons impairs axon elongation. Our data thus suggest that reducing tau levels selectively in axons, a major subcellular site of tangle formation, might represent a novel therapeutic approach for the treatment of AD. N2 - Axonwachstum ist ein grundlegender Prozess der Neuronenentwicklung und wird sowohl durch intrinsische als auch externe Leitsignale reguliert. Eine Beeinträchtigung des Axonwachstums und der Aufrechterhaltung von Axonen ist mit der Pathogenese neurodegenerativer Erkrankungen wie der Amyotrophen Lateralsklerose und der AlzheimerKrankheit (AD) verbunden. Mehrere posttranskriptionelle RNA-Verarbeitungsmechanismen, darunter alternatives Spleißen, Polyadenylierung, subzelluläre Lokalisierung und Translation, steuern das Axonwachstum. RNA-bindende Proteine (RBPs) steuern diese Mechanismen, indem sie sequenzabhängig mit ihren Ziel-RNAs interagieren. In dieser Studie untersuchen wir die zytosolischen Funktionen von zwei neuronalen RBPs, Ptbp2 und hnRNP R, die für das Axonwachstum in Motoneuronen essentiell sind. Das Polypyrimidin-Trakt-Bindungsprotein 2 (Ptbp2) trägt zur neuronalen Differenzierung und Axonogenese bei, indem es verschiedene Spleißprogramme moduliert, um die Menge der an diesen Prozessen beteiligten Proteine anzupassen. Während die nukleären Funktionen von Ptbp2 beim alternativen Spleißen detaillierter untersucht wurden, sind die zytosolischen Rollen von Ptbp2 im Zusammenhang mit dem Axonwachstum noch unklar. Im ersten Teil der Studie zeigen wir, dass Ptbp2 in zytosolischen Fraktionen von Motoneuronen einschließlich Axonen und Axonterminals vorhanden ist. Die Reduktion von Ptbp2 beeinträchtigt das Axonwachstum und die Reifung der Wachstumskegel in kultivierten embryonalen Motoneuronen von Mäusen. Darüber hinaus beeinflusst der Ptbp2-Knockdown den Gehalt an Piccolo-Protein im Wachstumskegel kultivierter Motoneuronen. Wir identifizierten Ptbp2 als Top-Interaktor der 3'-UTR des Hnrnpr-Transkripts, welches das RBP hnRNP R kodiert. Diese Interaktion führt zur axonalen Lokalisierung und damit zur lokalen Translation der Hnrnpr-mRNA in Motoneuronen. Folglich wurde die axonale Synthese von hnRNP R durch Depletion von Ptbp2 in Motoneuronen verringert. Wir legen Beweise dafür vor, dass Ptbp2 durch die Zusammenarbeit mit dem Translationsfaktor eIF5A2 die hnRNP R-Synthese steuert. Darüber hinaus beobachten wir, dass die erneute Expression von hnRNP R in Motoneuronen mit Ptbp2-Mangel den Axonwachstumsdefekt rettete, während die Überexpression von Ptbp2 den auch bei Motoneuronen mit hnRNP R-Mangel beobachteten Axonwachstumsdefekt nicht normalisieren konnte. Unsere Ergebnisse zeigen, dass axonal synthetisiertes hnRNP R ein Vermittler der Ptbp2-Funktionen beim Axonwachstum ist. Im zweiten Teil dieser Studie beobachteten wir, dass hnRNP R an die 3'-UTR des Mikrotubuliassoziierten Tau-Transkripts (Mapt) bindet, welches das Protein tau kodiert. Die hnRNP RMapt Interaktion bewirkt die axonale Translokation und Translation der Mapt-mRNA. Tau spielt eine zentrale Rolle beim Aufbau und der Stabilität neuronaler Mikrotubuli. Bei AD führt die Anhäufung von abnormal hyperphosphoryliertem tau-Protein jedoch zu neuronaler Degeneration. Der Verlust von hnRNP R verringert das axonale tau-Protein, jedoch nicht den Gesamtspiegel von tau. Wir beobachten, dass die Gehirne von 5xFAD-Mäusen, einem AD Mausmodell, durch Reduktion von hnRNP R geringere Mengen an Phospho-tau- und Amyloidβ-Plaques aufweisen. Ebenso zeigen Neuronen, die mit blockierenden ntisenseOligonukleotiden (ASO) behandelt wurden, um die Bindung von hnRNP R an Mapt-mRNA zu verhindern, verringerte axonale Mapt-mRNA Mengen und reduzierte Mengen an neu synthetisiertem tau-Protein. Unsere Daten legen daher nahe, dass die selektive Reduzierung des tau-Spiegels in Axonen, einem wichtigen subzellulären Ort der Neurofibrillenbildung, einen neuen therapeutischen Ansatz für die Behandlung der AD darstellen könnte. KW - Motoneuron KW - Axonal RNA localization KW - Axonal translation KW - Axon growth KW - Ptbp2 KW - Axonaler Transport KW - axonal transport KW - Nervendegeneration Y1 - 2024 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-371039 ER - TY - THES A1 - Reß-Müller, Lea T1 - Investigating Dynamics of Biradicals and Chiral Excitons Using Transient Absorption and Time-Resolved Circular Dichroism Spectroscopy T1 - Untersuchung der Dynamiken von Biradikalen und chiralen Exzitonen durch die Verwendung von transienter Absorptions- und Zeitaufgelöster Zirkulardichroismus-Spektroskopie N2 - In this work, two techniques, based on the established method of pump--probe spectroscopy were used to investigate the properties of molecular systems in the liquid phase within the visible spectral wavelength range. The first technique is standard transient absorption (TA) spectroscopy which was applied to a diazo-precursor to identify the formation of a biradical in an inert solvent after UV excitation. With the combination of EPR spectroscopy and quantum chemical calculations, the formation of a biradical in an unpolar and non-protic solvent was proven. Besides, in the presence of air or a polar and protic solvent, the biradical reacts ultrafast to various side products. The second technique is time-resolved circular dichroism (TRCD) spectroscopy, which was performed in two different ways. The first approach based on a pulse-enantiomer (PE) setup, where an initially circularly polarized pulse was split into two pulses, of which one was mirrored under normal incidence, to flip its polarization. The result was two pulses with mirrored polarization states that propagate collinearly to the sample as left and right circularly polarized probe pulses. The alignment procedure as well as the drawbacks of this setup are described in detail. However, a new TRCD setup was built that used a polarization grating to get left and right circularly polarized pulses. With the experiences of working with the PE setup, the new TRCD setup could be optimized so that TRCD spectra of a chiral squaraine polymer could be measured. With the help of quantum chemical calculations, the signals were assigned to exciton dynamics that describe spatial and energetic rearrangements of the excitation energy. The alignment and the measurement procedures to perform TRCD spectroscopy with the new setup are described in detail for future experiments. N2 - In dieser Arbeit wurden zwei Techniken, die auf der etablierten Methode der Anrege-Abfrage-Spektroskopie beruhen, zur Untersuchung der Eigenschaften molekularer Systeme in der Flüssigphase im sichtbaren Wellenlängenbereich eingesetzt. Die erste Technik ist die standardmäßige transiente Absorptionsspektroskopie, die auf einen Diazovorläufer angewendet wurde, um die Bildung eines Biradikals in einem inerten Lösungsmittel nach UV-Anregung zu identifizieren. Durch die Kombination von EPR-Spektroskopie und quantenchemischen Berechnungen konnte die Bildung eines Biradikals in einem unpolaren und nicht-protischen Lösungsmittel nachgewiesen werden. Außerdem reagiert das Biradikal in Gegenwart von Luft oder einem polaren und protischen Lösungsmittel ultraschnell zu verschiedenen Nebenprodukten. Die zweite Technik ist die zeitaufgelöste Zirkulardichroismus (TRCD)-Spektroskopie , die auf zwei verschiedene Arten durchgeführt wurde. Der erste Ansatz basiert auf einem Puls-Enantiomer (PE)-Aufbau, bei dem ein ursprünglich zirkular polarisierter Puls in zwei Pulse aufgespalten wurde, von denen einer unter nach einer Reflexion von 90$^\circ$ zur Piegeloberfläche gespiegelt wurde, um seine Polarisation umzukehren. Das Ergebnis waren zwei Pulse mit gespiegelten Polarisationszuständen, die sich kollinear als links- und rechtszirkular polarisierte Abfragepulse ausbreiten. Das Justageverfahren sowie die Nachteile dieses Aufbaus sind ausführlich beschrieben. Außerdem wurde ein neuer TRCD-Aufbau verwirklicht, der ein Polarisationsgitter verwendet, um links- und rechtszirkular polarisierte Pulse zu erhalten. Mit den Erfahrungen aus der Arbeit mit dem PE-Aufbau konnte der neue TRCD-Aufbau so optimiert werden, dass TRCD-Spektren eines chiralen Squaraine-Polymers gemessen werden konnten. Mit Hilfe von quantenchemischen Berechnungen wurden die Signale der Exzitonendynamik zugeordnet, die räumliche und energetische Umlagerungen der Anregungsenergie beschreiben. Die Justage und das Messverfahren zur Durchführung der TRCD-Spektroskopie mit dem neuen Aufbau werden für zukünftige Experimente detailliert beschrieben. KW - Zirkulardichroismus KW - Ultrakurzzeitspektroskopie KW - Biradikal KW - Exziton KW - Transiente Absorption KW - Zeitaufgelöste Zirkulardichroismus Spektroskopie KW - zirkulare Polarisation KW - Angeregte Zustände KW - transient absorption KW - time-resolved circular dichroism spectroscopy KW - circular polarization KW - chirality KW - excited states KW - Chiralität Y1 - 2024 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-370333 ER - TY - THES A1 - Reichelt, Niklas T1 - Exploring the natural variation of heat-dependent metabolic rearrangements in \(Arabidopsis\) \(thaliana\) to identify genes involved in thermotolerance T1 - Untersuchung der natürlichen Variation des hitzeregulierten Metaboloms in \(Arabidopsis\) \(thaliana\), um Gene der pflanzlichen Thermotoleranz zu identifizieren N2 - Climate change and associated extreme weather events are a threat not only for agricultural yields but the plant kingdom in general. Therefore, there is a great necessity to better understand the plants' intrinsic mechanisms to combat heat stress. The plant heat stress response already has been investigated in many studies, including the role of HSFA1 transcription factors as the central regulators. Other aspects such as the initial perception of heat and the role of heat-induced changes in plant metabolism are rather unknown. In this thesis, the natural variation of 250 different accessions of Arabidopsis thaliana was investigated regarding the temperature-dependent accumulation of raffinose and triacylglycerols. A connection between these phenotypes and respective genotypes was established using genome-wide association studies. As a result, the candidate gene TREHALOSE-6-PHOSPHATE SYNTHASE 1 (TPS1), was identified. Enzymatic TPS1 is responsible for the synthesis of trehalose 6-phosphate (T6P), which serves as an indicator and regulator of sucrose homeostasis. Subsequent analyses using tps1 tilling mutants demonstrated a link between T6P metabolism and an increased accumulation of various soluble carbohydrates and starch, including raffinose both under control conditions and during heat exposure. Furthermore, the mutant lines displayed enhanced thermotolerance and survival rates following long-term heat stress. Transcriptome analyses, however, did not show any difference in the regulation of canonical heat stress-associated genes. Instead, genes related to photosynthesis were overrepresented among the differentially upregulated genes in tps1 tilling lines during heat exposure. In this work, a direct connection of T6P signaling, sucrose homeostasis, and thermotolerance is shown for the first time. In a second project, two Arabidopsis thaliana accessions (Oberursel-0, accession ID: 7276; Nieps-0, accession ID: 7268) showing distinct capacities to acquire short-term thermotolerance were compared to identify the putative causative regulators or mechanisms that lead to the different levels of thermotolerance. An examination of the transcriptomes of 7268 and 7276 showed that several hundreds of genes were already differentially regulated within 10 minutes of exposure to 32 °C or 34 °C. Among these, several genes associated with sulfur metabolism were more highly induced in the more thermotolerant accession 7268. However, experimental as well as genetic manipulation of sulfur availability and metabolism did not result in altered thermotolerance. In addition to sulfur-related genes, most of the canonical heat stress-associated genes were more highly expressed in 7268 than in 7276. While we could not identify a causative regulator or mechanism of differential thermotolerances, the data strongly suggests that 7268 either has a higher overall sensitivity, i.e., the heat stress response is initiated at lower temperatures, or stronger overall heat stress response when exposed to a certain elevated temperature. N2 - Der Klimawandel und die damit einhergehenden extremen Wetterereignisse stellen eine große Bedrohung für den Ertrag der Landwirtschaft aber auch das Reich der Pflanzen im Allgemeinen dar. Es ist daher von großer Notwendigkeit, die der Pflanzen intrinsischen Mechanismen zur Bekämpfung von Hitzestress besser zu verstehen. Die hierbei zugrundeliegende Hitzestressantwort der Pflanzen ist bereits durch viele Studien untersucht worden, unter anderem die Rolle von HSFA1 Transkriptionsfaktoren als zentrale Regulatoren. Andere Aspekte wie die initiale Wahrnehmung von Hitze sowie die Rolle von hitzeinduzierten Veränderungen des Pflanzenmetabolismus sind eher unbekannt. In dieser Thesis wurde die natürliche Variation von 250 Populationen von Arabidopsis thaliana hinsichtlich der temperatur-abhängigen Akkumulation von Raffinose und Triacylglycerolen untersucht. Ein statistischer Zusammenhang dieser Phänotypen sowie zugrundeliegender Genotypen wurde mittels Genomweiter Assoziationsstudien erstellt. Als Ergebnis konnte das Kandidatengen Trehalose-6-Phosphate Synthase 1 (TPS1) identifiziert werden. Das Enzym TPS1 ist verantwortlich für die Synthese von T6P, welches als Indikator sowie Regulator der Homöostase von Saccharose fungiert. Folgestudien an tps1 tilling lines konnten sowohl unter Kontrollbedingungen als auch bei Hitzestress einen Zusammenhang zwischen dem T6P Metabolismus und einer erhöhten Akkumulation von Raffinose, weiterer löslicher Zucker, sowie Stärke nachweisen. Des Weiteren zeigten die tps1 tilling lines eine erhöhte Thermotoleranz und Überlebensrate gegenüber Langzeit-Hitzestress. Eine Analyse der Transkriptome zeigte keinen Unterschied in der Regulation klassischer Hitzestress-assoziierter Gene. In beiden tps1 tilling lines war in Folge von Hitzestress eine Überrepräsentation von signifikant hochregulierten Genen vorzufinden, welche mit der Photosynthese der Pflanze assoziiert sind. In dieser Arbeit konnte erstmalig ein direkter Zusammenhang von T6P Signaling, Zucker-Homöostase und Thermotoleranz gezeigt werden. In einem zweiten Projekt wurden zwei Arabidopsis thaliana Populationen (Oberursel-0, Populations-ID: 7276; Nieps-0, Populations-ID: 7268) verglichen, welche deutliche Unterschiede in ihrer Fähigkeit der kurzzeitig akquirierten Thermotoleranz aufweisen. Ziel war hierbei die Identifikation etwaiger kausaler Regulatoren oder Mechanismen, welche zu den unterschiedlich ausgeprägten Thermotoleranzen führen. Eine Untersuchung der Transkriptome von 7268 und 7276 konnte zeigen, dass bereits nach 10 Minuten einer 32 °C oder auch 37 °C Hitzebehandlung hunderte von Genen differentiell reguliert sind. Hierbei waren in der hitzetoleranteren Population 7268 mehrere Gene, welche mit dem Schwefel-Metabolismus assoziiert sind, im Vergleich zu 7276 höher exprimiert. Jedoch hatten sowohl die experimentelle Schwefelverfügbarkeit als auch die genetische Manipulation des Schwefelmetabolismus keinen Effekt auf die Thermotoleranz. Neben den Schwefel-assoziierten Genen waren auch die meisten der klassischen Hitzestress-assoziierten Gene in 7268 höher exprimiert als in 7276. Zwar konnte kein kausaler Regulator oder Mechanismus für die unterschiedlichen Thermotoleranzen identifiziert werden, jedoch weisen die generierten Daten auf eine allgemein stärkere Hitzestressantwort oder aber eine höhere Hitzesensitivität von 7268 gegenüber 7276 hin. KW - Schmalwand KW - Hitzestress KW - Stärke KW - Raffinose KW - Genomweite-Assoziationsstudien KW - Genome-wide association studies KW - RNA-Seq KW - Natürliche Variation KW - Natural Variation KW - Trehalose-6-Phosphate Synthase 1 (TPS1) KW - Triacylglycerole Y1 - 2024 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-371324 ER - TY - THES A1 - Köhler, Jonas T1 - Predicting Future Snow Line Elevation Dynamics in the Alps - The Potential of Long Earth Observation Time Series T1 - Prognose zukünftiger Schneeliniendynamiken in den Alpen - Das Potential langer Zeitreihen aus Erdbeobachtungsdaten N2 - The seasonal snow cover in the European Alps plays a crucial role in the region's climate, ecology, and economy. It affects the local climate through its high albedo, protects permafrost, provides habitats, and acts as a water reservoir that feeds European rivers. However, these functions are threatened by climate change. Analyzing snow cover dynamics is essential to predict future developments and assess related ecological and economic impacts. This study explores the potential of long Earth Observation (EO) time series for modeling and predicting the snow line elevation (SLE) in the Alps. Based on approximately 15,000 Landsat satellite images, SLE time series were generated for the years 1985 to 2022. Various univariate forecasting models were evaluated, with the best results achieved by Random Forests, Telescope, and Seasonal ARIMA. A newly developed approach combines the best models into a robust ensemble, achieving an average Nash-Sutcliffe efficiency (NSE) of 0.8 in catchments with strong seasonal signals. Forecasts for 2030 indicate significant upward shifts in the SLE, particularly in the Western and Southern Alps. Given the variability in results, a multivariate modeling approach using climate variables is recommended to improve prediction accuracy. This study lays the groundwork for future models that could potentially project SLE dynamics through the end of the 21st century under various climate scenarios, which is highly relevant for climate policy in the Alpine region. N2 - Die saisonale Schneedecke in den europäischen Alpen spielt eine zentrale Rolle für das Klima, die Ökologie und die Wirtschaft der Region. Sie beeinflusst das lokale Klima durch ihre Albedo, beeinflusst den Permafrost, bildet Lebensräume und fungiert als Wasserspeicher, der große europäische Flüsse speist. Diese Funktionen sind jedoch durch den Klimawandel bedroht. Um zukünftige Entwicklungen der Schneedecke vorherzusagen und die damit verbundenen ökologischen und wirtschaftlichen Auswirkungen abzuschätzen, ist die Analyse vergangener und Prognose zukünftiger Schneedeckendynamiken essenziell. Diese Arbeit untersucht das Potenzial langer Zeitreihen aus der Satellitenfernerkundung (Earth Observation, EO) zur Modellierung und Vorhersage der Schneelinienhöhe (SLE) in den Alpen. Auf Basis von etwa 15.000 Landsat-Satellitenbildern wurden SLE-Zeitreihen für die Jahre 1985 bis 2022 erstellt. Verschiedene univariate Prognosemodelle wurden evaluiert, wobei die besten Ergebnisse mit Random Forests, Telescope und Seasonal ARIMA erzielt wurden. Ein neu entwickelter Ansatz kombiniert die besten Modelle zu einer Ensemble-Prognose und erreicht einen mittleren Nash-Sutcliffe-Effizienz-Wert (NSE) von 0,8 in Einzugsgebieten mit starkem saisonalem Signal. Die Prognosen bis 2030 zeigen signifikante Verschiebungen der SLE in höhere Lagen, besonders in den West- und Südalpen. Angesichts der Varianz in den Ergebnissen wird eine multivariate Modellierung mit Klimavariablen vorgeschlagen, um die Vorhersagegenauigkeit zu verbessern. Diese Ergebnisse legen den Grundstein für zukünftige Ansätze, die SLE-Dynamiken bis zum Ende des 21. Jahrhunderts unter verschiedenen Klimaszenarien auf Basis von EO-Daten projizieren können, was für die Klimapolitik im Alpenraum potenziell von hoher Relevanz ist. KW - Fernerkundung KW - Schnee KW - Prognose KW - Zeitreihe KW - Alps KW - remote sensing KW - snow KW - prediction KW - time series KW - Alpen Y1 - 2024 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-371392 ER - TY - THES A1 - Hesen, Nienke Aiyuan T1 - The importance of antibody isotype and idiotype in FcγR-dependent agonism induced by anti-CD40 antibodies T1 - Die Bedeutung des Antikörper-Isotyps und des Idiotyps beim FcγR-abhängigen Agonismus, der durch Anti-CD40-Antikörper induziert wird N2 - The TRAF-binding receptor CD40 belongs to the TNFR superfamily and is broadly expressed on healthy cells, mainly on antigen-presenting cells, but also on other immune cells and non-immune cells. CD40 is bound by its ligand CD40L, which is essential for a wide range of immunological responses by inducing or inhibiting different pathways that are essential for a variety of cellular processes, including immune activation and maturation. (1,2) Dysregulated CD40 signalling has been implicated in inflammatory diseases, such as hyper-IgM syndrome, psoriasis, and cancer. (3–6) Due to its broad expression across various tumour types, it can serve as a tumour-associated antigen and has therefore been proposed as a target for antibodies for cancer treatment. (2,7,8) Agonistic anti-CD40 antibodies have been demonstrated to induce anti-tumoural immune responses as well as therapeutic immunity. (2) Furthermore, prolonged stimulation of CD40 in tumour cells in vitro has been shown to decrease proliferation, increase expression of cytotoxic TNFSFLs and induce apoptosis. (9,10) Their effect on anti-tumoral responses has been well studied and anti-tumoral responses by DC maturation and suppression of malignant growth of B-cells have been confirmed and were found to induce cell death in tumours in vitro. (11–14) Many agonistic anti-CD40 antibodies specifically have been reported to require secondary crosslinking by binding to either activating or inhibitory FcγRs to be agonistic in vitro, while in vivo studies have indicated inhibitory FcƴR2B expression as critical factor. (15–17) However, FcƴR independent agonism has also been reported for anti-CD40 antibodies. (18,19) While agonistic anti-CD40 IgG1, IgG3 and IgG4 antibodies have been shown to display FcƴR dependent agonism, agonistic anti-CD40 IgG2 antibodies have shown to display FcƴR independent agonism. Conversion of anti-CD40 IgG1 antibodies into IgG2 has also been shown to convert the antibody’s agonism into FcƴR independent agonism. (20) To overcome FcƴR dependency, bispecific antibody fusion proteins containing a scFv as anchoring domain allowing for crosslink independent of FcƴR binding have been designed before. This approach has been found to display strong agonism for other antibody fusion proteins when bound to both targets, with response levels resembling that of FcƴR bound antibodies. (21,22) The relevance of antibody isotype and idiotype for FcƴR-dependent agonism as well as the relevance of valency and antibody oligomerization for FcƴR-independent agonism were investigated in this study on a panel of different anti-CD40 antibodies. Several clinically investigated anti-CD40 antibodies (ADC-1013(23), APX005M(24), ChiLob7.4(25) and CP-870,893(26)) and one preclinical antibody (G28.5(27,28)) were considered. Selected antibodies were then cloned onto an IgG1, IgG1(N297A), IgG2 and IgG4 backbone. The IgG1(N297A) isotype is an IgG1 antibody with a point mutation (N297A) that is known to strongly reduce binding to FcƴR1, while reducing the binding affinity to FcƴR2B to undetectable levels. (29,30) In this work it is demonstrated that the investigated anti-CD40 antibody variants across different isotypes activate both the classical and alternative NFκB pathway by stimulating U2OS cells in an FcƴR dependent manner. Stimulation in the presence of both human FcƴRs as well as murine FcƴRs resulted in CD40 stimulation. A difference in binding competition was observed for the various anti-CD40 IgG1 antibodies, but no indication of a CRD-dependent mechanism responsible for their agonistic activity was found. Moreover, this FcƴR dependency could be overcome by creation of tetravalent antibody fusion proteins. N2 - Zusammenfassung Der TRAF-bindende Rezeptor CD40 ist Teil der TNFR-Superfamilie. CD40 wird auf gesunden Zellen, vor allem auf Antigen-präsentierenden Zellen, aber auch auf anderen Immunzellen und Nicht-Immunzellen in großem Umfang exprimiert. Die Aktivierung von CD40 durch seinen Liganden CD40L ist für zahlreiche immunologische Reaktionen von entscheidender Bedeutung, da sie verschiedene Signalwege induziert oder hemmt, die für zahlreiche zelluläre Prozesse, einschließlich Immunaktivierung und -reifung, wichtig sind. (1,2) Defekte CD40-Signalwege werden mit Entzündungskrankheiten wie dem Hyper-IgM-Syndrom, Psoriasis und Krebs in Verbindung gebracht. (3–6) Da CD40 auf verschiedenen Tumorarten weit verbreitet ist, kann es als tumorassoziiertes Antigen verwendet werden, das dann von zytotoxischen Antikörpern angegriffen werden kann, und wurde als Ziel für Antikörper zur Krebsbehandlung vorgeschlagen. (2,7,8) Es hat sich gezeigt, dass agonistische Anti-CD40-Antikörper antitumorale Immunreaktionen und therapeutische Immunität auslösen können. (2) Es hat sich gezeigt, dass die kontinuierliche Stimulation von CD40 in Tumorzellen in vitro die Proliferation reduziert, die Expression zytotoxischer TNFSFLs hochreguliert und Apoptose induziert. (9,10) Ihre Wirkung auf antitumorale Reaktionen wurde gut untersucht, und antitumorale Reaktionen durch DCReifung und Unterdrückung des malignen Wachstums von B-Zellen wurden bestätigt und es wurde festgestellt, dass sie in vitro den Zelltod in Tumoren induzieren. (11–14) Viele agonistische Anti-CD40-Antikörper erfordern Berichten zufolge eine sekundäre Vernetzung durch Bindung an entweder aktivierende oder hemmende FcγRs, um in vitro agonistisch zu wirken, während In-vivo-Studien auf eine hemmende FcƴR2B-Expression als kritischen Faktor hinwiesen. (15–17) Allerdings wurde auch für Anti-CD40-Antikörper ein FcƴR-unabhängiger Agonismus festgestellt. (18,19) Während agonistische Anti-CD40-IgG1-, IgG3- und IgG4-Antikörper nachweislich einen FcƴR-abhängigen Agonismus aufweisen, haben agonistische Anti-CD40-IgG2-Antikörper einen FcƴR-unabhängigen Agonismus gezeigt. Die Umwandlung von Anti-CD40-IgG1-Antikörpern in IgG2-Antikörper hat ebenfalls gezeigt, dass der Agonismus des Antikörpers in einen FcƴR-unabhängigen Agonismus umgewandelt wird. (20) Um die FcƴR-Abhängigkeit zu überwinden, wurden bereits bispezifische AntikörperFusionsproteine entwickelt, die ein scFv als Verankerungsdomäne enthalten und eine von der FcƴR-Bindung unabhängige Vernetzung ermöglichen. Es hat sich gezeigt, dass dieser Ansatz einen starken Agonismus für andere Antikörper-Fusionsproteine aufweist, wenn sie an beide Zielmoleküle gebunden sind, wobei die Ansprechraten denen von FcƴRgebundenen Antikörpern ähneln. (21,22) Die Bedeutung des Antikörper-Isotyps und des Idiotyps für den FcƴR-abhängigen Agonismus sowie die Bedeutung der Valenz und der Antikörper-Oligomerisierung für den FcƴRunabhängigen Agonismus wurden in dieser Studie an einem Panel verschiedener Anti-CD40-Antikörper untersucht. Es wurden mehrere klinisch untersuchte Anti-CD40-Antikörper (ADC1013(23), APX005M(24), ChiLob7.4(25) und CP-870,893(26)) und ein präklinischer Antikörper (G28.5(27,28)) berücksichtigt. Die ausgewählten Antikörper wurden dann auf ein IgG1-, IgG1(N297A)-, IgG2- und IgG4-Backbone kloniert. Beim Isotyp gG1(N297A) handelt es sich um einen IgG1-Antikörper mit einer Punktmutation (N297A), von der bekannt ist, dass sie die Bindung an FcƴR1 stark reduziert, während sie die Bindungsaffinität zu FcƴR2B auf ein nicht nachweisbares Niveau verringert. (29,30)In dieser Arbeit wird gezeigt, dass die Anti-CD40-Antikörper-Varianten verschiedener Isotypen sowohl den klassischen als auch den alternativen NFκB-Signalweg aktivieren, indem sie U2OS-Zellen in einer FcƴR-abhängigen Weise stimulieren. Die Stimulierung in Anwesenheit sowohl von humanen FcƴRs als auch von murinen FcƴRs führte zu einer CD40-Stimulierung. Während für die verschiedenen Anti-CD40-IgG1-Antikörper ein Unterschied in der Bindungskonkurrenz beobachtet wurde, konnten die CRD-Bindungsprofile keine Erkenntnisse über die zugrunde liegenden Mechanismen liefern. Darüber hinaus konnte diese FcƴR-Abhängigkeit durch die Herstellung von tetravalenten AntikörperFusionsproteinen überwunden werden. KW - Antigen CD40 KW - FcƴR Y1 - 2024 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-371872 ER - TY - THES A1 - Vialetto, Elena T1 - Outcomes of genome targeting with CRISPR-Cas systems in bacteria T1 - Folgen des Genom-Targeting mit CRISPR-Cas-Systemen in Bakterien N2 - CRISPR-Cas systems are a versatile tool in genetic engineering because they can be easily reprogrammed to cut a specific chromosomal region or RNA transcript. The choice of nuclease, gRNA design, and target region all influence targeting efficiency, so the appropriate CRISPR components should be chosen depending on the desired application. This thesis examines factors that influence targeting in both DNA- and RNA-targeting CRISPR systems. Chapter 1 discusses the importance of target RNA abundance in shaping the immunity of type VI CRISPR systems. In bacteria, the Cas13 nuclease is known to degrade RNA specifically and non-specifically, leading to cell growth arrest, also known as dormancy. In this chapter, the factors that determine dormancy are investigated by targeting genome- and plasmid-encoded transcripts in E. coli. The observations are extended to a gRNA library targeting the entire coding genome and gRNA design rules are extrapolated. Finally, the role of Cas13 in defense is investigated by testing how the system behaves during viral infection or plasmid transformation. Chapter 2 also looks at the factors that characterize targeting efficiency, but focuses on the Cas12a DNA-targeting system in K. pneumoniae. The ultimate goal is to develop CRISPR antimicrobials as alternatives to antibiotics to eliminate multidrug-resistant and hypervirulent bacteria. Several nucleases are tested for antimicrobial activity, the Cas12a nuclease is selected and the same gRNAs are used against different strains to understand the robustness of the method. Rules for gRNA design are also investigated by looking at secondary structure and testing a gRNA library across several genomic regions in two different strains. This information is used to develop a machine-learning algorithm to predict gRNA activity. In addition, the CRISPR-Cas systems are also packaged in a T7-like phage with engineered tail fibers and delivered to K. pneumoniae. While Chapter 2 uncovers various factors that improve targeting efficiency, Chapter 3 aims to reduce targeting by the Cas9 and Cas12a nucleases to favor homology-directed repair for genome editing in E. coli. Targeting is slowed down so that some copies of the chromosomes remain intact, allowing the bacterium to survive and integrate the desired edit. To reduce targeting, different gRNA formats or nuclease variations are used, gRNA expression is modulated, or gRNAs with attenuated targeting are designed. Attenuated gRNAs are tested to introduce point mutations as well as whole gene deletions and substitutions, and the method is extended to Klebsiella oxytoca and Klebsiella pneumoniae, where it is applied to block transcription of an antibiotic resistance gene in the genome, restoring sensitivity to ampicillin. Overall, this work discusses how changing the CRISPR components alters the outcome of targeting and highlights strategies to achieve efficient or attenuated targeting depending on the desired application. N2 - CRISPR-Cas-Systeme sind ein vielseitiges Werkzeug in der Gentechnik, da sie leicht umprogrammiert werden können, um eine bestimmte chromosomale Region oder ein RNA-Transkript zu schneiden. Die Wahl der Nuklease, das Design der gRNA und die Zielregion beeinflussen alle die Effizienz des Targetings, so dass die richtigen CRISPR-Komponenten je nach gewünschter Anwendung ausgewählt werden sollten. In dieser Arbeit werden die Faktoren untersucht, die das Targeting sowohl bei DNA-targeting als auch bei RNA-targeting CRISPR-Systemen beeinflussen. In Kapitel 1 wird erörtert, wie die Häufigkeit der Ziel-RNA die Immunität von Typ VI CRISPR-Systemen ausprägt. In Bakterien ist von der Cas13-Nuklease bekannt, dass sie RNA spezifisch und unspezifisch abbaut, was zu einem Stillstand des Zellwachstums führt, der auch als Dormanz bezeichnet wird. In diesem Kapitel werden die Faktoren untersucht, die Dormanz determinieren, indem genom- und plasmidkodierte Transkripte in E. coli ins Visier genommen werden. Die Beobachtungen werden auf eine gRNA-Bibliothek ausgeweitet, die auf das gesamte kodierende Genom abzielt, und es werden gRNA-Designregeln extrapoliert. Schließlich wird die Rolle von Cas13 bei der Verteidigung untersucht, indem getestet wird, wie sich das System während einer Virusinfektion oder Plasmidtransformation verhält. Kapitel 2 befasst sich ebenfalls mit den Faktoren, die die Targeteffizienz charakterisieren, konzentriert sich jedoch auf das Cas12a-DNA-Targeting-System in K. pneumoniae. Das Endziel ist die Entwicklung von CRISPR-Antimikroben als Alternative zu Antibiotika, um multiresistente und hypervirulente Bakterien zu eliminieren. Mehrere Nukleasen werden auf ihre antimikrobielle Aktivität getestet, die Cas12a-Nuklease wird ausgewählt und dieselben gRNAs werden gegen verschiedene Stämme eingesetzt, um die Robustheit der Methode zu verstehen. Außerdem werden die Regeln für das Design von gRNAs untersucht, indem die Sekundärstruktur betrachtet und eine gRNA-Bibliothek, die verschiedenen genomische Regionen in zwei verschiedenen Stämmen umfasst, getestet wird. Diese Informationen werden zur Entwicklung eines Algorithmus für maschinelles Lernen verwendet, um die gRNA-Aktivität vorherzusagen. Darüber hinaus werden die CRISPR-Cas-Systeme auch in einen T7-ähnlichen Phagen mit manipulierten Schwanzfasern verpackt und an K. pneumoniae übertragen. Während in Kapitel 2 verschiedene Faktoren aufgedeckt werden, die die Effizienz des Targetings verbessern, zielt Kapitel 3 darauf ab, das Targeting durch die Cas9- und Cas12a-Nukleasen zu reduzieren, um homology directed repair für Genom-Editierung in E. coli zu begünstigen. Das Targeting wird verlangsamt, so dass einige Kopien der Chromosomen intakt bleiben und das Bakterium überleben und die gewünschte Veränderung integrieren kann. Um das Targeting zu reduzieren, werden verschiedene gRNA-Formate oder Nuklease-Variationen verwendet, die gRNA-Expression wird moduliert, oder es werden gRNAs mit abgeschwächten Targeting entwickelt. Abgeschwächte gRNAs werden getestet, um Punktmutationen, Deletionen und Substitutionen ganzer Gene einzuführen, und die Methode wird auf Klebsiella oxytoca und Klebsiella pneumoniae ausgeweitet, wo sie zur Blockierung der Transkription eines Antibiotikaresistenzgens im Genom eingesetzt wird, um die Empfindlichkeit gegenüber Ampicillin wiederherzustellen. Insgesamt wird in dieser Arbeit erörtert, wie die Veränderung der CRISPR-Komponenten die Folgen des Targetings verändert und es werden Strategien hervorgehoben, um effizientes oder abgeschwächtes Targeting, je nach der gewünschten Anwendung, zu erreichen. KW - CRISPR/Cas-Methode KW - CRISPR KW - Genome editing KW - Antimicrobials KW - Cas13 KW - Cas12a Y1 - 2024 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-371264 ER - TY - THES A1 - Seal, Rishav T1 - Selective inhibition of the transcription factor NFAT in mitigating GvHD with small molecule inhibitors T1 - Selektive Hemmung des Transkriptionsfaktors NFAT bei der Milderung von GvHD durch kleine Molekül-Inhibitoren N2 - Hematopoietic stem cell transplantation (HSCT) is a promising therapy for various malignancies and immune deficiency diseases, but it is often associated with graft versus host disease (GvHD), a life-threatening complication arising from immunological incompatibility between donor T cells and host tissues. Current standard therapies for GvHD involve the use of calcineurin inhibitors (CNIs) such as cyclosporine A (CsA) and tacrolimus (FK506), which effectively suppress T cell activation and proliferation. However, these drugs also impair the graft versus leukemia (GvL) effect, which is the advantageous ability of donor T cells to eliminate malignant cells. Our previous studies demonstrated that the selective deletion of one or two members of the nuclear factor of activated T cells (NFAT) transcription factor family in donor T cells effectively prevented harmful GvHD without compromising GvL activity. This finding highlighted the potential of NFAT as a therapeutic target for GvHD. In this study, we developed and evaluated novel treatment strategies that specifically target NFAT during allogeneic HSCT. We focused on the development of small molecules that mimic the PxIxIT motif of NFAT, thereby competitively inhibiting its binding to CN (CN) without affecting CN phosphatase activity. We identified two promising candidates, C17 and MRD37, and evaluated their efficacy in inhibiting NFAT and suppressing pro-inflammatory cytokine production. Among these molecules, MRD37 demonstrated the highest potency in selectively inhibiting NFAT at a sub-IC50 concentration without compromising the functional capacity of regulatory T cells (Tregs) in vitro. Furthermore, we demonstrated that MRD37 could effectively protect mice from major mismatch GvHD in vivo. This protection was initially predicted to be due to the enhanced presence of Tregs and Tr1-type cells but when pretreated T cells devoid of Tregs were transplanted it unraveled an additional increase of Th2-like cytokine release. Finally, our in vitro studies on human T cells confirmed that MRD37 could specifically inhibit NFAT while preserving the Treg population, suggesting its potential as a novel therapeutic strategy for GvHD. Our findings provide compelling evidence for the development of MRD37 as promising alternative to CNIs in mitigating GvHD. N2 - Die hämatopoetische Stammzelltransplantation (HSCT) ist eine vielversprechende Therapie für verschiedene bösartige Erkrankungen und Immunschwächekrankheiten, wird jedoch häufig mit der Graft versus Host Disease (GvHD) in Verbindung gebracht, einer lebensbe drohlichen Komplikation, die durch immunologische Inkompatibilität zwischen Spender T Zellen und Wirtsgewebe entsteht. Die derzeitigen Standardtherapien für die GvHD umfassen den Einsatz von Calcineurin Inhibitoren (CNI) wie Cyclosporin A (CsA) und Tacroli mus (FK506), die die Aktivierung und Vermehrung von T Zellen wirksam unterdrücken. Diese Medikamente beeinträchtigen jedoch auch den Transplantat gegen Leukämie Effekt (GvL), d. h. die vorteilhafte Fähigkeit von Spender T Zellen, bösartige Zellen zu elimin ieren. Unsere früheren Studien haben gezeigt, dass die selektive Deletion von einem oder zwei Mitgliedern der Transkriptionsfaktor Familie Nuclear Factor of Activated T Cells (NFAT) in Spender T Zellen die schädliche GvHD wirksam verhindert, ohne die GvL Aktivitä t zu beeinträchtigen. Dieses Ergebnis unterstreicht das Potenzial von NFAT als therapeutisches Ziel für GvHD. In dieser Studie haben wir neuartige Behandlungsstrategien entwickelt und evaluiert, die spezifisch auf NFAT bei allogener HSCT abzielen. Wir konzentrierten uns auf die Entwicklung kleiner Moleküle, die das PxIxIT Motiv von NFAT nachahmen und dadurch seine Bindung an Calcineurin (CN) kompetitiv hemmen, ohne die Phosphataseaktivität von CN zu beeinträchtigen. Wir haben zwei vielversprechende Kandidaten, C17 und MRD37, identifiziert und ihre Wirksamkeit bei der Hemmung von NFAT und der Unterdrückung der Produ ktion entzündungsfördernder Zytokine untersucht. Von diesen Molekülen zeigte MRD37 die höchste Wirksamkeit bei der selektiven Hemmung von NFAT in einer Konzentration unterhalb von IC50, ohne die Funktionsfähigkeit der regulatorischen T Zellen (Tregs) zu be einträchtigen. Darüber hinaus konnten wir zeigen, dass MRD37 Mäuse in vivo wirksam vor Major Mismatch GvHD schützen kann. Ursprünglich wurde angenommen, dass dieser Schutz auf das verstärkte Vorhandensein von Tregs und Zellen vom Tr1 Typ zurückzuführen ist , doch als vorbehandelte T Zellen ohne Tregs transplantiert wurden, zeigte sich darüberhinaus eine erhöhte Freisetzung von Th2 ähnlichen Zytokinen. Schließlich bestätigten unsere In vitro Studien an menschlichen T Zellen, dass MRD37 spezifisch NFAT hemmen kann, während die Treg 9 Population erhalten bleibt, was auf sein Potenzial als neuartige therapeutische Strategie für Population erhalten bleibt, was auf sein Potenzial als neuartige therapeutische Strategie für GvHD hindeutet.GvHD hindeutet. Unsere Ergebnisse liefern überzeugende Beweise für die Entwicklung von MRD37 als Unsere Ergebnisse liefern überzeugende Beweise für die Entwicklung von MRD37 als vielversprechende Alternative zu CNIs bei der Behandlung von GvHD.vielversprechende Alternative zu CNIs bei der Behandlung von GvHD. KW - GVHD KW - Transplantat-Wirt-Reaktion KW - Stammzelltransplantation KW - Graft versus host disease KW - NFAT inhibitor KW - Stem cell transplantation KW - CsA KW - T cell Y1 - 2024 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-370537 ER - TY - THES A1 - Dorband, Moritz T1 - Geometric Phases and Factorisation in Quantum Physics and Gravity T1 - Geometrische Phasen und Faktorisierung in Quantenphysik und Gravitation N2 - In this thesis I explore the interplay of geometry and quantum information theory via the holographic principle, with a specific focus on geometric phases in quantum systems like two interacting qubits, and how they relate to entanglement measures and Hilbert space factorisation. I establish geometric phases as an indicator for Hilbert space factorsiation, both in an abstract sense using von Neumann operator algebras as well as applied to the eternal black hole within the AdS/CFT correspondence. For the latter case I show that geometric phases allow to diagnose non-factorisation from a boundary point of view. I also introduce geometric quantum discord as a second geometric measure for non-factorisation and reveals its potential implications for the study of black hole microstates. N2 - In dieser Arbeit untersuche ich das Zusammenspiel von Geometrie und Quanteninformation mit Hilfe des holografischen Prinzips. Dabei konzentriere ich mich besonders auf geometrische Phasen in Quantensystemen wie zwei wechselwirkenden Qubits und darauf, wie sie mit Verschränkungsmaßen und Hilbert-Raum-Faktorisierung zusammenhängen. Ich führe geometrische Phasen als Indikator für die Faktorisierung des Hilbert-Raums ein, sowohl in einem abstrakten Sinne unter Verwendung von von Neumann-Operator-Algebren als auch angewandt auf das ewige Schwarze Loch im Rahmen der AdS/CFT-Korrespondenz. im zweiten Fall zeige ich, dass geometrische Phasen es erlauben, die Nicht-Faktorisierung von der Randperspektive aus zu diagnostizieren. Außerdem führe ich die geometrische Quantendiskordanz als zweites geometrisches Maß für die Nicht-Faktorisierung ein und zeige ihre möglichen Auswirkungen auf die Untersuchung von Mikrozuständen Schwarzer Löcher auf. KW - AdS-CFT-Korrespondenz KW - Schwarzes Loch KW - Quanteninformation KW - VonNeumann-Algebra KW - Berry-Phase KW - Hilbert space factorisation KW - Quantum information KW - AdS/CFT correspondence KW - Geometric phase KW - VonNeumann algebra Y1 - 2024 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-370937 ER - TY - THES A1 - Kappenberger, Jeannette Sarah T1 - Biochemical characterization of the TFIIH translocase XPB from \(Chaetomium\) \(thermophilum\) T1 - Biochemische Charakterisierung der TFIIH Translokase XPB aus \(Chaetomium\) \(thermophilum\) N2 - DNA repair and gene expression are two major cellular processes that are fundamental for the maintenance of biological life. Both processes require the enzymatic activity of the super family 2 helicase XBP, which is an integral subunit of the general transcription factor TFIIH. During transcription initiation, XPB catalyzes the initial melting of promoter DNA enabling RNA polymerase II to engage with the coding DNA strand and start gene transcription. In nucleotide excision repair, XPB acts in concert with the other TFIIH helicase XPD causing strand separation around a lesion site. Mutations within the genes encoding XPB or other TFIIH subunits are associated with different cancer types as well as with the autosomal recessive disorders Xeroderma Pigmentosum and trichothiodystrophy and rarely combined features of Xeroderma Pigmentosum and Cockayne syndrome. In the last few years, great progress has been made towards unraveling the structure of TFIIH and its individual subunits including XPB. These structural insights tremendously improved our understandings with respect to the molecular interactions within this intriguing protein complex. However, the underlying regulation mechanisms that functionally control XPB during transcription and repair remained largely elusive. We thus executed the biochemical characterization of this protein to investigate the functional network that regulates XPB within the scaffold of TFIIH. Due to their enhanced stability compared to the human proteins, we utilized the proteins that originate from the thermophilic fungus Chaetomium thermophilum for this purpose as a model organism for eukaryotic TFIIH. The present work provides novel insights into the enzymatic function and regulation of XPB. We could show that both, DNA and the TFIIH subunit p52 stimulate XPB’s ATPase activity and that the p52-mediated activity is further boosted by p8, another subunit within TFIIH. Surprisingly, DNA can activate XPB’s ATPase activity to a greater extent than its TFIIH interaction partners p52/p8, but when both, i.e. p52/p8 and DNA are present at the same time, p52 dominates the activation and the enzymatic speed is maintained at the level observed through the sole activation of p52/p8. We thus defined p52 as the master regulator of XPB that simultaneously activates and represses XPB’s enzymatic activity. Based on a correlative mutagenesis study of the main interface between p52 and XPB that was set into context with recent structural data, a model for the p52-mediated activation and speed limitation of XPB’s ATPase was proposed. The research on XPB’s ATPase was expanded with the investigation of the inhibition mechanism of XPB’s ATPase via the natural compound Triptolide. Furthermore, we investigated XPB’s DNA translocase function and could observe that XPB can only perform its translocase movement when it is fully incorporated into core TFIIH and this translocase movement is further enhanced by the nucleotide excision repair factor XPA. Fluorescence polarization measurements with nucleotide analogues revealed that XPB displays the highest affinity towards DNA in the ADP + Pi bound state and its binding is weakened when ADP is bound or the nucleotide is dissociated from the enzyme, suggesting a movement on the DNA during the distinct states of the ATPase cycle. Finally, the well-known and highly conserved RED motif was found to be the crucial element in XPB to enable this translocase movement. Combined, the data presented in this work provide novel insights into the intricate regulation network that controls XPB’s enzymatic activity within TFIIH and furthermore show that XPB’s enzymatic activity is tightly controlled by various factors. N2 - DNA Reparatur und Genexpression sind zwei fundamentale zelluläre Prozesse die unabdingbar für die Aufrechterhaltung des biologischen Lebens sind. Beide Prozesse benötigen die Enzymaktivität der Superfamilie 2 Helikase XPB, welche eine Untereinheit des Transkriptionsfaktors TFIIH darstellt. Während der Transkriptions-Initiation katalysiert XPB das initiale Aufschmelzen der Promoter-DNA und befähigt dadurch die RNA-Polymerase II dazu an den codierenden DNA Strang zu binden und die Genexpression zu starten. In der Nukleotid-Exzisions-Reparatur agiert XPB zusammen mit der zweiten TFIIH Helikase, XPD, und bewirkt die Öffnung des DNA Stranges an der Stelle des DNA-Schadens. Mutationen des XPB-Gens oder der Gene der anderen TFIIH Untereinheiten sind mit verschiedenen Krebsarten, sowie den autosomal rezessiv vererbten Krankheiten Xeroderma Pigmentosum und Trichothiodystrophie assoziiert. In seltenen Fällen kann eine kombinierte Form von Xeroderma Pigmentosum und Cockayne Syndrom auftreten. In den letzten Jahren wurde mittels der Cryo-EM die Strukturaufklärung von TFIIH und seinen Untereinheiten einschließlich XPB signifikant vorangebracht. Diese neuen strukturellen Einsichten haben unser Verständnis über den molekularen Aufbau des TFIIH Komplexes entscheidend verbessert. Jedoch sind die Regulationsmechanismen, die XPB auf funktionaler Ebene kontrollieren, noch größtenteils unbekannt. Um das funktionelle Netzwerk, das XPB innerhalb von TFIIH reguliert, zu erforschen, haben wir die biochemische Charakterisierung von XPB verfolgt. Aufgrund ihrer erhöhten Stabilität gegenüber den humanen Proteinen wurden für diese Analyse die Proteine des thermophilen Pilzes Chaetomium thermophilum als Modellorganismus für TFIIH verwendet. Die vorgelegte Arbeit liefert neue Erkenntnisse über die enzymatische Funktion und Regulation von XPB. Wir konnten zeigen, dass sowohl DNA, als auch die TFIIH Untereinheit p52 die ATPase Aktivität von XPB stimulieren und dass die p52-vermittelte Aktivierung durch p8, eine weitere Untereinheit von TFIIH, noch weiter verstärkt wird. In Gegenwart von DNA beobachtet man jedoch die höchste ATPase Aktivität. Wenn beide Aktivatoren, also p52/p8 und DNA, gleichzeitig anwesend waren, dominierte die niedrige p52-vermittelte Aktivierung gegenüber der DNA-vermittelten Aktivierung. Das p52-Protein agiert also als Aktivator und Deaktivator indem es die enzymatische Aktivität des XPB-Proteins gleichzeitig aktiviert und hemmt und kann damit folglich als Hauptregulator von XPB bezeichnet werden. Basierend auf einer korrelativen Mutagenese-Analyse der Interaktionsfläche zwischen p52 und XPB sowie auf den aktuellsten Strukturdaten, wurde ein Modell für die p52-vermittelte Aktivierung und Geschwindigkeitsregulierung von XPBs ATPase generiert. Des Weiteren wurde der Einfluss des Naturproduktes Triptolid auf die Hemmung der enzymatischen Aktivität des XPB Proteins untersucht. Darüber hinaus haben wir die doppelsträngige DNA-Translokase-Aktivität von XPB analysiert und konnten feststellen, dass die Translokation nur erfolgen kann, wenn XPB vollständig in den Kern-TFIIH-Komplex integriert ist. Der Nukleotid-Exzisions-Reparatur- Faktor XPA stimulierte diese Translokase-Aktivität zusätzlich. Fluoreszenz-Polarisations-Messungen mit Nukleotid-Analoga zeigten, dass XPB die höchste Affinität für DNA im ADP + Pi gebundenen Zustand aufweist und dass diese Bindung gelockert wird, wenn ADP gebunden oder das Nukleotid dissoziiert ist. Dies deutet auf einen Bewegungsmechanismus auf der DNA während der verschiedenen Stadien des ATPase-Zyklus hin. Abschließend konnten wir zeigen, dass das hochkonservierte RED-Motiv eine entscheidende Rolle für die Translokase Bewegung des XPB-Proteins einnimmt. Zusammenfassend präsentiert diese Arbeit neue Erkenntnisse, die unser Verständnis des Regulierungsnetzwerkes, das die enzymatische Aktivität von XPB innerhalb von TFIIH steuert, entscheidend vorangebracht haben. KW - DNS-Reparatur KW - Xeroderma pigmentosum KW - Helicasen KW - Transkriptionsfaktor KW - Nucleotide Excision Repair Y1 - 2024 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-244096 ER - TY - THES A1 - Liu, Yang T1 - Predictions for Composite Higgs Models Using Gauge/Gravity Duality T1 - Vorhersagen für zusammengesetzte Higgs-Modelle unter Verwendung der Eich-/Gravitationsdualität N2 - This thesis is dedicated to construct a non-abelian holographic dynamical minimal composite Higgs model. We first build a non-abelian bottom-up AdS/YM model that can explain the QCD meson spectrum well. The model is made non-abelian by considering non-abelian DBI action in the top-down model. We then change the dual theory from the QCD to the minimal composite Higgs model U (4)/Sp(4). By adding a second explicit U (4) → Sp(4) breaking through the NJL interaction at the boundary, we managed to construct a composite Higgs phase and a technicolor phase in this model. The transition between the two phases is also realized, which is controlled by the NJL coupling. This thesis is based on the works [1, 2]. N2 - Diese Arbeit konstruiert ein nicht-abelsches holographisches dynamisches minimales Composite-Higgs-Modell. Wir erstellen zunächst ein nicht-abelsches Bottom-up-AdS/YM-Modell, das das QCD-Mesonenspektrum gut erklären kann. Das Modell ist nicht-abelsch, da die nicht-abelsche DBI-Wirkung im Top-Down-Modell berücksichtigt wird. Anschließend ändern wir die duale Theorie von der QCD auf das minimale Composite-Higgs-Modell U (4)/Sp(4). Durch das Hinzufügen einer zweiten expliziten Brechung U (4) → Sp(4), das die NJL-Wechselwirkung an der Grenze durchbricht, konstruierten wir in diesem Modell eine Composite-Higgs-Phase und eine Technicolor-Phase. Auch der Übergang zwischen den beiden Phasen wird realisiert, welcher durch die NJL-Kopplung gesteuert wird. Diese Arbeit basiert auf den Arbeiten [1, 2]. KW - Composite Higgs KW - Gauge/gravity duality KW - holographic model KW - Higgs-Modell Y1 - 2024 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-370833 ER - TY - THES A1 - Rode, Stefan T1 - Automated resummation of electroweak Sudakov logarithms in diboson production T1 - Automatisierte Resummierung elektroschwacher Sudakov-Logarithmen in Vektorboson-Paarproduktion N2 - The present thesis is concerned with the automated computation of integrated and differential cross sections of diboson production in proton–proton and electron–positron collisions at very high energies, including a resummation of electroweak Sudakov logarithms to all orders in the fine-structure constant using soft–collinear effective theory. The search for new physics at future colliders such as the FCC–hh or the CLIC requires precise predictions for scattering cross sections from the theoretical high-energy physics com- munity. Electroweak Sudakov logarithms, which currently limit the accuracy of predictions in the high-energy tails of differential distributions for LHC-like energies, are known to destroy the convergence behaviour of the fixed-order perturbative series, once sufficiently high energies are considered. To resum these large corrections, soft–collinear effective theory has been applied to simple processes, which permits analytic calculations. Within this work, we present an automated computation within a Monte Carlo integration framework, thus facilitating the computation of fully differential cross section to complicated processes. This requires the use of the Catani– Seymour subtraction algorithm to treat the occurring infrared divergences. The machinery is applied to all diboson processes with intermediate weak gauge bosons, including the photon- induced W+ W− -production channel. To this end we carefully study the validity of the necessary assumptions such as the double- pole approximation and estimate the order of magnitude of neglected effects. Especially the non-doubly-resonant contributions turn out to be sizeable in several interesting phase-space regions. For lepton collisions at 3 TeV we obtain the integrated cross sections of W-pair and Z-pair production to be shifted by more than 20% with respect to the Born value, owing to the resum- mation of the leading-logarithmic corrections These effects are partly cancelled by subleading effects. For proton–proton collisions at √ s = 100 TeV we observe sizeable resummation effects in the high-energy tails, while the integrated cross sections are dominated by interactions, for which soft–collinear effective theory is not applicable. N2 - Das Thema ist der vorliegenen Arbeit ist die automatisierte Berechnung differenzieller und integrierter Wirkungsquerschnitte der Paarerzeugung schwerer Eichbosonen bei sehr hohen Streuenergien mit Resummierung der auftretenden elektroschwachen Sudakov-Logarithmen zu allen Ordnungen in der Feinstrukturkonstanten mittels Soft-Collinear Effective Theory. Die Suche nach Physik jenseits des Standardmodells an zukunftigen Teilchenbeschleunigern wie dem FCC oder dem CLIC erfordert hochpräzise Voraussagen fur Streuquerschnitte seitens der theoretischen Physik. Es ist seit langem bekannt, dass elektroschwache Sudakov-Logarithmen, die bereits gegenwärtig die Genauigkeit der Voraussagen in den Hochenergieschwänzen von Verteilungen limitieren, die Konvergenz der konventionellen Störungsreihen vollkommen zunichte machen, wenn hinreichend hohe Energien erreicht werden. Mittels Soft-Collinear Effective Theory wurden diese Logarithmen bereits in der Vergangenheit in einfachen Prozessen, die eine analytische Behandlung erlauben, resummiert. Im Rahmen dieser Arbeit wurden diese Methoden in ein Monte-Carlo-Integrationsprogramm implementiert, um somit vollständig differenzielle Vorhersagen präsentieren zu können. Dies erfordert die Behandlung von Infrarotdivergenzen mit Hilfe des Catani-Seymour-Algorithmus. Mit diesen Werkzeugen wurden resummierte Streuquerschnitte fur verschiedene Vektorboson-Paarproduktionsprozesse berechnet, u.a. fur den Photon-Photon-induzierten Produktionskanal zur W-Boson-Paarproduktion. Auf dem Weg dorthin sind verschiedene vereinfachende Annahmen notwendig, deren Gultigkeit im Rahmen dieser Arbeit ebenfalls getestet wurde, so z.B. die Qualität der Doppelpolnäherung. Des weiteren wurden Größenordnungen vernachlässigter Effekte abgeschätzt. Dabei haben sich vor allem nicht doppelt resonante Beiträge in bestimmten Phasenraumregionen als beträchtlich herausgestellt. Der Resummationseffekt der fuhrend logarithmischen Korrekturen verschiebt die integrierten Paarproduktionsstreuquerschnitte um mehr als 20% bezogen auf den Bornstreuquerschnitt im Falle von Leptonkollisionen bei einer Schwerpunktsenergie von 3 TeV. Diese Effekte werden allerdings teilweise von nicht-führenden Beiträgen kompensiert. Fur Proton-Proton-Kollisionen bei √ s = 100 TeV finden wir deutliche Resummationseffekte in allen Hochenergieschwänzen, während die integrierten Wirkungsquerschnitte von Phasenraumregionen dominiert werden, in denen Soft-Collinear Effective Theory nicht anwendbar ist. KW - High-energy physics Y1 - 2024 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-371060 ER - TY - THES A1 - Lechermeier, Carina T1 - Neuroanatomical and functional evaluation of ADHD candidate genes in the model organism zebrafish (\(Danio\) \(rerio\)) T1 - Neuroanatomische und funktionelle Auswertung von ADHS Kandidatengenen im Modellorganismus Zebrafisch (\(Danio\) \(rerio\)) N2 - Attention deficit hyperactivity disorder (ADHD) is one of the most prevalent developmental disorders, affecting 5.9% children and adolescents and 2.5% adults worldwide. The core characteristics are age-inappropriate levels of hyperactivity, impulsivity and inattention, often accompanied by co-morbidities such as mood and conduct disorders as wells as learning deficits. In the majority of cases, ADHD is caused by an interplay of accumulated genetic and environmental risk factors. Twin studies report a very high heritability of 70–80%, however, common genetic variants in the population only explain a third of the heritability. The rest of the genetic predisposition is composed of rare copy number variations (CNVs) and gene x environment interactions including epigenetic alterations. Through genome wide association (GWAS) and linkage studies a number of likely candidate genes were identified. A handful of them play a role in dopamine or noradrenaline neurotransmitter systems, simultaneously those systems are the main targets of common drug treatment approaches. However, for the majority of candidates the biological function in relation to ADHD is unknown. It is crucial to identify those functions in order to gain a deeper understanding of the pathomechanism and genetic networks potentially responsible for the disorder. This work focuses on the three candidate genes GFOD1, SLC2A3 and LBX1 and their role in the healthy organism as well as in case of ADHD. The neuroanatomy was regarded through expression analysis and various behavioural assays of activity were performed to link alterations on the transcript level to phenotypes associated with the neurodevelopmental disorder. Zebrafish orthologues of the human risk genes were identified and extensive temporal and spacial expression characterisation performed via RNA in situ hybridisation. Through morpholino derived knock-down and mRNA overexpression zebrafish models with subsequent behavioural analysis, both hyper- and hypoactive phenotypes were discovered. Additional expression analysis through double in situ hybridisation revealed a co-localisation during zebrafish neurodevelopment of each gfod1 and slc2a3a together with gad1b, a marker for GABAergic neurons. Interestingly, both risk genes have previously been associated with glucose homeostasis and energy metabolism, which when disrupted could lead to alterations in signal transduction and neuron survival. Likewise, Lbx1 plays a pivotal role in GABAergic versus glutamatergic neuron specification during spinal cord and hindbrain development in mice and chicken. Preliminary results of this work suggest a similar role in zebrafish. Taken together, those findings on the one hand represent a sturdy basis to con- tinue studies of the function of the genes and on the other hand open up the opportunity to investigate novel aspects of ADHD research by exploring the role of the GABAergic neurotransmitter system or the connection between energy metabolism and psychiatric disorders. N2 - Die Aufmerksamkeitsdefizit-/Hyperaktivitätsstörung (ADHS) ist eine der am weitesten verbreiteten Entwicklungsstörungen, davon sind 5,9% Kinder und Jugendliche und 2,5% Erwachsene weltweit betroffen. Die Kernsymptome sind altersunangemessene Hyperaktivität, Impulsivität und Unaufmerksamkeit, oft begleitet von Begleiterkrankungen wie emotionale Dysregulation oder Verhal- tensauffälligkeiten sowie Lerndefiziten. In den meisten Fällen wird ADHS durch ein Zusammenspiel von angehäuften genetischen und umweltbedingten Risikofaktoren verursacht. Durch Zwillingsstudien gelang man zu einer errechneten Erblichkeit von 70–80%, jedoch erklären häufig auftretende genetische Varianten in der Bevölkerung nur ein Drittel der Erblichkeit. Der Rest der genetischen Veranlagung setzt sich aus seltenen Kopienzahlvariationen (CNV) und Interaktionen von Gen x Umwelt, einschließlich epigenetischer Veränderungen, zusammen. Durch genomweite Assoziationsstudien (GWAS) und Kopplungsanalysen wurden eine Reihe von wahrscheinlichen Kandidatengenen identifiziert. Eine Handvoll von ihnen spielen eine Rolle in den Dopamin oder Noradrenalin Neurotransmittersystemen. Diese Systeme sind gleichzeitig die Hauptangriffspunkte der gängigsten Medikamente, die zur Behandlung von ADHS eingesetzt werden. Allerdings ist für die Mehrheit der Kandidatengene die biologische Funktion in Bezug auf ADHS unbekannt. Es ist essentiell diese Funktionen zu identifizieren um ein tieferes Verständnis der Ätiopathogenese und der genetische Netzwerke, die möglicherweise für die Störung verantwortlich sind, zu erlangen. Diese Arbeit konzentriert sich auf die drei Kandidatengene GFOD1, SLC2A3 und LBX1 und ihre Rolle im gesunden Organismus sowie während ADHS. Die Neuroanatomie wurde durch Expressionsanalyse betrachtet und verschiedene aktivitätsbasierte Verhaltensessays wurden durchgeführt, um Veränderungen auf Transkriptebene mit den zugehörigen Phänotypen der neurologischen Entwick- lungsstörung in Verbindung zu bringen. Zebrafischorthologe der menschlichen Kandidatengene wurden identifiziert und umfangreiche zeitliche und räumli- che Expressionsanalysen via RNA in situ Hybridisierung durchgeführt. Durch Morpholino-Knockdown und mRNA-Überexpressions Zebrafischmodelle mit anschließender Verhaltensanalyse wurden sowohl hyper- als auch hypoaktive Phänotypen entdeckt. Eine zusätzliche Expressionsanalyse durch doppelte in situ Hybridisierung ergab eine Kolokalisierung während der Zebrafischneuroentwicklung von jeweils gfod1 und slc2a3a zusammen mit gad1b, einem Marker für GABAerge Neuronen. Interessanterweise wurden beide Risikogene zuvor mit der Glukosehomöostase und dem Energiestoffwechsel in Verbindung gebracht, die, wenn sie gestört werden, zu Veränderungen der Signalübertragung und der Lebensdauer von Neuronen führen können. Desgleichen spielt Lbx1 eine entscheidende Rolle bei der Spezifikation von GABAergen versus glutamatergenen Neuronen während der Entwicklung des Rückenmarks in der Wirbelsäule und im Hinterhirn von Mäusen und Hühnern. Vorläufige Ergebnisse dieser Arbeit deuten auf eine ähnliche Rolle beim Zebrafisch hin. Zusammengenommen stellen diese Erkenntnisse einerseits eine solide Grundlage für weitere Untersuchungen zur Funktion der Gene dar, andererseits eröffnet sich daraus die Möglichkeit neue Aspekte der ADHS-Forschung zu untersuchen, bei denen der Fokus auf der Rolle des GABAergen Neurotransmittersystems oder der Beziehung zwischen Energiestoffwechsel und psychiatrischen Erkrankungen liegt. KW - Aufmerksamkeitsdefizit-Syndrom KW - Zebrabärbling KW - ADHD KW - zebrafish KW - genes KW - behaviour KW - ADHS Y1 - 2024 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-371084 ER - TY - THES A1 - Zhu, Yan T1 - Small RNA-associated RNA-binding proteins in \(Fusobacterium\) \(nucleatum\) T1 - Kleine RNA-assoziierte RNA-bindende Proteine in \(Fusobacterium\) \(nucleatum\) N2 - Fusobacterium nucleatum is an emerging cancer-associated bacterium belonging to the Fusobacteriota phylum, which is evolutionary distant from all model bacteria. Recent analysis generated global fusobacterial RNA maps, which enabled the discovery of 24 small noncoding RNAs (sRNAs) in F. nucleatum. Notably, the σE-dependent sRNA FoxI and FoxJ act as a posttranscriptional regulator of several cell envelope proteins. The σE-dependent sRNAs in Escherichia coli and Salmonella require the RNA chaperone Hfq for their functions. Intriguingly, F. nucleatum seems to have no homologs of the three common RNA-binding proteins (RBPs) CsrA, Hfq and ProQ. However, it remains unclear if other families of RBPs act in concert with FoxI, FoxJ and other fusobacterial sRNAs. This work has successfully established a 14-mer capture tagged-sRNA affinity purification procedure initially using 6S RNA as a proof-of-concept. Applying this method to 19 different F. nucleatum sRNAs led to a comprehensive mapping of sRNA-binding proteins in this bacterium. This screen identified a total of 75 proteins significantly enriched across all sRNAs and prominent in ribosomal proteins, uncharacterized proteins and enzymes associated with metabolism. This work further focused on the homologs of two KH domain proteins KhpA and KhpB, which were recently recognized as global RBPs in various Gram-positive bacteria such as Streptococcus pneumoniae, Clostridioides difficile, and Enterococcus faecalis. Comparative analyses revealed conserved domain composition and gene synteny of KhpA and KhpB across F. nucleatum, S. pneumoniae, C. difficle and E. faecalis, indicating conserved roles of these proteins in bacteria. Further protein-protein interaction assays and global RNA targets profiling demonstrated that KhpA and KhpB form dimers and act together as broad RBPs, binding to sRNAs, mRNAs and tRNAs in F. nucleatum. Further functional characterizations unveiled that KhpA/B are required for the growth of F. nucleatum under nutrient limitation conditions and impact cell morphology. Additionally, the two RBPs also influence global gene expression in F. nucleatum affecting various bacterial physiological processes, including ethanolamine utilization. In summary, this work established a sRNA-centric approach for screening sRNA-binding proteins in F. nucleatum. Further, the assay could be applied in other non-model organisms and is feasible to screen multiple sRNA baits in parallel for sRNA-interactors. By applying this procedure to nearly all known fusobacterial sRNAs, this work generated an extensive map of sRNA-interacting proteins in F. nucleatum. Molecular and genetic studies identified that KhpA/B act as major RBPs and gene regulators in F. nucleatum, representing important first steps in elucidating key players of post-transcriptional control at the root of the bacterial phylogenetic tree. N2 - Fusobacterium nucleatum ist ein relevantes krebsassoziiertes Bakterium des Phylums Fusobacteriota, welches sich evolutionär von allen anderen Modellbakterien abgrenzt. In einer kürzlich durchgeführten Analyse wurden fusobakterielle RNAs global kartiert, was die Entdeckung von 24 kleinen nichtkodierenden RNAs (sRNAs) in F. nucleatum ermöglichte. Besonders hervorzuheben ist die σE-abhängige sRNAs FoxI und FoxJ, die als posttranskriptioneller Regulator von mehreren Proteine der Zellhülle fungiert. Die σE-abhängigen sRNAs in Escherichia coli und Salmonella benötigen das RNA-Chaperonprotein Hfq für ihre Funktionen. Interessanterweise scheint F. nucleatum aber keine Homologe der drei verbreiteten RNA-Bindeproteine (RBPs) CsrA, Hfq und ProQ zu besitzen. Es bleibt jedoch unklar, ob andere RBP-Familien mit FoxI, FoxJ und sonstigen fusobakteriellen sRNAs interagieren. Diese Arbeit hat erfolgreich ein 14-mer Capture-Markierung basierendes sRNA Affinitätsreinigungsverfahren etabliert, das zunächst unter Verwendung von 6S RNA erprobt wurde. Die Anwendung dieser Methode auf 19 verschiedene sRNAs in F. nucleatum führte zu einer umfassenden Übersicht von sRNA-bindenden Proteinen in diesem Bakterium. Unter allen sRNAs konnten mit Hilfe dieses Screenings insgesamt 75 signifikant angereicherte Proteine identifiziert werden, so vor allem ribosomale Proteine, uncharakterisierte Proteine und Metabolismus-assoziierte Enzyme. Diese Arbeit konzentrierte sich weiterführend auf die Homologe der zwei KH-Domänenproteine KhpA und KhpB, die kürzlich als globale RBPs in verschiedenen Gram-positiven Bakterien, wie Streptococcus pneumoniae, Clostridioides difficile und Enterococcus faecalis beschrieben wurden. Vergleichende Analysen bewiesen eine konservierte Domänenzusammensetzung und Gensyntenie von KhpA und KhpB in F. nucleatum, S. pneumoniae, C. difficile und E. faecalis, was wiederum auf konservierte Funktionen dieser Proteine in Bakterien hinweist. Weitere Protein-Protein-Interaktionsassays und globale Assays zur Identifizierung der Ziel-RNAs zeigten, dass KhpA und KhpB Dimere bilden und gemeinsam als umfangreiche RBPs wirken, die an sRNAs, mRNAs und tRNAs in F. nucleatum binden. Funktionelle Charakterisierungen der Proteine ergaben, dass KhpA/B für das Wachstum von F. nucleatum unter Nährstoffmangel erforderlich sind und die Zellmorphologie beeinflussen. Zusätzlich spielen die beiden RBPs auch eine Rolle in der globalen Genexpression in F. nucleatum und wirken sich auf verschiedene physiologische Prozesse aus, einschließlich der Ethanolamin-Nutzung. Zusammenfassend etablierte diese Arbeit einen sRNA-orientierten Ansatz zur Untersuchung von sRNA-Bindeproteinen in F. nucleatum. Darüber hinaus kann dieser Ansatz potenziell in anderen Nicht-Modellorganismen angewendet werden und eignet sich um mehrere sRNA-Baits parallel auf deren sRNA-Interaktionspartner zu untersuchen. Durch die Anwendung dieses Verfahrens auf nahezu allen bekannten fusobakteriellen sRNAs wurde eine umfangreiche Kartierung der sRNA-Interaktoren in F. nucleatum generiert. Die hier beschriebenen molekularen und genetischen Studien, in welchen KhpA/B als wichtige RBPs und Genregulatoren von F. nucleatum identifiziert wurden, stellen wichtige erste Schritte bei der Aufklärung der Schlüsselakteure der posttranskriptionellen Kontrolle am Ursprung des bakteriellen Stammbaums dar. KW - Fusobacterium nucleatum KW - RNA-binding proteins KW - Small non-coding RNAs KW - Proteine Y1 - 2024 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-370731 ER - TY - THES A1 - Drakopoulos, Antonios T1 - Opioid receptor oligomerization study through fluorescent selective ligands T1 - Untersuchung der Opioid Rezeptor Oligomerisierung mittels fluoreszierender selektiver Liganden N2 - Opioid receptors (ORs) are among the most intensively studied members of the G protein-coupled receptor (GPCR) family due to their important role in pain management and their involvement in psychological and neurological disorders. However, currently available opioid drugs exhibit both serious drawbacks, such as addiction, and life-threatening side effects, such as respiratory depression. Contrary to the classic monomeric model, indirect evidence suggests that ORs might form dimers, which could be endowed with a distinct pharmacological profile, and, thus, be exploited to develop innovative drugs. However, direct evidence for the spontaneous formation of OR dimers in living cells under physiological condition are missing. The focus of this thesis was the design, synthesis and characterization of new, highly subtype-selective OR fluorescent ligands to be used as tools for state-of-the-art microscopy methods, such as single molecule microscopy (SMM), in heterologous cells and potentially in native tissue, in order to investigate OR organization and mobility on the surface of intact, living cells, at low/physiological expression levels. The μOR is the OR subtype which plays the most critical role in pain modulation, while mediating the effects of the most powerful analgesic drugs. Also, it is the OR subtype which is mostly responsible for the major adverse effects of the currently marketed opioid drugs. We aimed to develop a new μOR-selective fluorescent ligand with a potential irreversible binding mode. Although the approach was in principle successful, i.e. the labelled cells were visible and distinguishable; this initial attempt was not suitable for SMM due to the ligands’ poor selectivity and affinity as well as due to its high background noise. A second generation of the fluorescent ligand was designed; however the synthesis and characterization are part of another doctoral thesis. Lately, δOR has received attention as a promising drug target, due to its distinct pharmacological profile which features low abuse liability and lack of physical dependence. In addition, δOR expression has been associated with cancer regulation in the periphery, thus further highlighting the interest of imaging tools for this receptor. In this thesis, the development and characterization of two new δOR-selective fluorescent probes with excellent optical properties, based on the well-studied ligand naltrindole (NTI) is presented. Their application in SMM studies is currently underway at the group of Prof. Dr. Davide Calebiro at the University of Birmingham. The κOR is a subtype which has also emerged as a drug target due to its low abuse potential. Despite a growing interest in this receptor, κOR-selective fluorescent probes have been particularly scarce in literature. Herein, the design, synthesis and characterization of the first reported set of fluorescent κOR-selective probes with antagonistic properties, based on the established ligand 5’-guanidinonaltrindole (5’-GNTI) is presented. Two of these were employed for SMM experiments to investigate κOR homodimerization, localization and trafficking. Our findings do not support homodimerization of the κOR-bound probe complexes, while showing that the majority of them follow a normal Brownian diffusion on the cell surface. N2 - Opioid-Rezeptoren (OR) gehören aufgrund ihrer wesentlichen Rolle bei der Schmerztherapie und ihrer Beteiligung an physiologischen und neurologischen Störungen zu den am intensivsten untersuchten Mitgliedern der G-Protein-gekoppelten Rezeptor (GPCR) Familie. Jedoch haben aktuell erhältliche Opioid-Arzneimittel schwerwiegende Nachteile, wie Abhängigkeit, und lebensbedrohliche Nebenwirkungen, wie Atemdepression. Im Gegensatz zu dem klassischen Monomer-Modell legen indirekte Hinweise nahe, dass ORs Dimere formen können, welche mit einem spezifischen pharmakologischen Profil ausgestattet sein könnten und daher für die Entwicklung innovativer Arzneimittel verwendet werden könnten. Jedoch gibt es keinen direkten Beweis für die spontane Bildung von OR-Dimeren in lebenden Zellen unter physiologischen Bedingungen. Der Fokus dieser Doktorarbeit war daher das Design, die Synthese und Charakterisierung von neuen hoch subtyp-selektiven fluoreszierenden OR Liganden, welche als Hilfsmittel für hochmoderne Mikroskopie-Anwendungen Anwendung finden sollen, wie Einzelmolekül-Mikroskopie (EMM) in heterologen Zellen und potentiell in nativem Gewebe, um OR-Organisierung und Mobilität auf der Oberfläche von intakten lebenden Zellen bei niedrigen/physiologischen Expressions-Spiegeln zu untersuchen. Der μOR ist der OR Subtyp, der die entscheidenste Rolle bei der Schmerzmodulierung spielt, indem er die Wirkung der stärksten analgetischen Arzneien vermittelt. Des Weiteren ist dieser OR-Subtyp der Subtyp, der größtenteils für die wesentlichen unerwünschten Nebenwirkungen der aktuell vermarkteten Opioid-Arzneimittel verantwortlich ist. Das Ziel dieser Arbeit war daher, einen neuen μOR-selektiven fluoreszierenden Liganden mit einem potentiell irreversiblen Bindungsmodus zu entwickeln. Obwohl dieser Ansatz prinzipiell erfolgreich war, das heißt die markierten Zellen waren sicht- und unterscheidbar, war dieser erste Ansatz aufgrund der geringen Selektivität und Affinität des Liganden und aufgrund seines hohen Hintergrundrauschens nicht für EMM geeignet. Daher wurde eine zweite Generation fluoreszierender Liganden entworfen. Deren Synthese und Charakterisierung ist jedoch Teil einer anderen Doktorarbeit. Kürzlich erhielt der δOR aufgrund seines spezifischen pharmakologischen Profils, welches ein geringes Missbrauchsrisiko und das Fehlen körperlicher Abhängigkeit beinhaltet, vielseitige Beachtung als ein vielversprechendes Arznei-Target. Des Weiteren wurde δOR-Expression mit Krebsregulation in der Peripherie assoziiert, was das Interesse an einem bildgebenden Werkzeug für diesen Rezeptor zusätzlich unterstreicht. In dieser Doktorarbeit wird die Entwicklung und Charakterisierung von zwei neuen, auf dem gut untersuchten Liganden Naltrindol (NTI) basierenden, δOR-selektiven fluoreszierenden Sonden mit sehr guten optischen Eigenschaften gezeigt. Ihre Anwendung in EMM Untersuchungen läuft derzeit bei Kooperationspartnern im Arbeitskreis von Professor Davide Calebiro an der Universität Birmingham an. Der κOR ist der Subtyp, der auch als Arznei-Target aufgrund seines geringen Missbrauchspotentials in Erscheinung getreten ist. Obwohl steigendes Interesse an diesem Rezeptor besteht, sind κOR-selektive fluoreszierende Sonden in der Literatur bisher kaum beschrieben. In dieser Arbeit wird das Design, die Synthese und Charakterisierung des ersten beschriebenen Sets von fluoreszierenden κOR-selektiven Sonden mit antagonistischen Eigenschaften, basierend auf dem Liganden 5’-Guanidinonaltrindol (5’-GNTI) gezeigt. Zwei dieser Liganden wurden für EMM Experimente verwendet, um die κOR Homodimerisierung, Lokalisation und Transportwege zu untersuchen. Unsere Ergebnisse zeigen keine Homodimerisierung des κOR-gebundenen Sondenkomplexes und außerdem, dass die Mehrheit der Rezeptoren einer normalen Brown’schen Diffusion auf der Zelloberfläche folgt. KW - Opioidrezeptor KW - fluorescent ligands KW - opioid receptors KW - TIRF microscopy KW - GPCR oligomerization KW - Oligomerisation KW - Ligand KW - Fluoreszierende Liganden KW - GPCR Oligomerisierung Y1 - 2024 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-207179 ER - TY - THES A1 - Steinmüller, Sophie Anna Maria T1 - Benzimidazole-Based Photoswitches and Photoswitchable Cannabinoid 2 Receptor Ligands T1 - Benzimidazol-Basierte Photoschalter und Photoschaltbare Liganden für den Cannabinoid 2 Rezeptor N2 - The field of photopharmacology has attracted considerable attention due to applying the spatial and temporal precision of light to pharmacological systems. Photoswitchable biologically active compounds have proven useful in the field of G protein-coupled receptors (GPCRs), which are of tremendous therapeutic relevance. Generally, the pharmacology of GPCRs is complex, perhaps even more complex than originally thought. Suitable tools are required to dissect the different signalling pathways and mechanisms and to unravel how they are connected in a holistic image. This is reflected in the enormous scientific interest in CB2R, as the neuroprotective and immunomodulatory effects attributed to CB2R agonists have not yet translated into effective therapeutics. This work focused on the development of a novel photoswitchable scaffold based on the privileged structure of benzimidazole and its application in photoswitchable CB2R ligands as photopharmacological tools for studying the CB2R. The visible-light photoswitchable ligand 10d enables the investigation of CB2R activation with regard to βarr2 bias, exhibiting a unique pharmacological profile as a “cis-on” affinity switch at receptor level and as a “trans-on” efficacy-switch in βarr2-mediated receptor internalization. The novel photoswitchable scaffold developed in this work further serves as a guide for the development of novel photoswitchable GPCR ligands based on the privileged structure of benzimidazole. To obtain a different tool compound for studying CB2R activation and signalling mechanisms, a previously reported putatively dualsteric CB2R ligand was rendered photoswitchable, by linking the orthosteric agonist to a CB2R-selective PAM via photoswitchable azobenzene. Compound 27-para exhibits a desirable “cis-on” behaviour across all investigated assays with >10-fold higher potency compared to its trans-isomer and can be used as an efficacy-switch employing specific concentrations. N2 - Das Forschungsfeld der Photopharmakologie hat stark an Beachtung gewonnen, da es die Anwendung der räumlichen und zeitlichen Präzision von Licht auf pharmakologische Systeme ermöglicht. Photoschaltbare biologisch aktive Verbindungen haben sich besonders für die Erforschung von G-Protein-gekoppelten Rezeptoren (GPCRs) als nützlich erwiesen, welche sich durch ihr enormes therapeutisches Potenzial auszeichnen. Die Pharmakologie der GPCRs ist komplex, vielleicht sogar komplexer als ursprünglich angenommen. Um die verschiedenen Signalwege und Mechanismen zu verstehen und zu entschlüsseln, wie sie in einem ganzheitlichen Bild zusammenhängen, werden geeignete Instrumente benötigt. Dies zeigt sich auch in dem enormen wissenschaftlichen Interesse am CB2R, da die den CB2R-Agonisten zugeschriebenen neuroprotektiven und immunmodulatorischen Effekte noch nicht in wirksame Therapeutika umgesetzt werden konnten. Die vorliegende Arbeit konzentrierte sich auf die Entwicklung eines neuartigen photoschaltbaren Gerüsts, das auf der privilegierten Struktur von Benzimidazol basiert, und dessen Anwendung in photoschaltbaren CB2R-Liganden als photopharmakologische Werkzeuge zur Untersuchung des CB2R. Der mit sichtbarem Licht schaltbare Ligand 10d ermöglicht die Untersuchung der CB2R-Aktivierung in Hinblick auf bevorzugte βarr2-Rekrutierung gegenüber G-Proteinen, mit einem einzigartigen pharmakologischen Profil als „cis-on"-Affinitätsschalter auf Rezeptorebene und als „trans-on"-Wirksamkeitsschalter bei der βarr2-vermittelten Rezeptorinternalisierung. Das in dieser Arbeit entwickelte neuartige photoschaltbare Gerüst dient als Leitfaden für die Entwicklung neuartiger photoschaltbarer GPCR-Liganden basierend auf der privilegierten Struktur von Benzimidazol. Um ein anderes Werkzeug für die Untersuchung der CB2R-vermittelten Signalmechanismen zu erhalten, wurde ein zuvor beschriebener, vermeintlich dualsterischer CB2R-Ligand photoschaltbar gemacht. Hierfür wurde ein orthosterischer Agonist mit einem CB2R-selektiven PAM über ein photoschaltbares Azobenzol verknüpft. Die Verbindung 27-para zeigt in allen untersuchten Assays das bevorzugte „cis on"-Verhalten mit einer >10-fach höheren Potenz im Vergleich zu ihrem trans-Isomer. KW - Cannabinoide KW - Photoswitchable KW - Cannabinoids Y1 - 2024 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-348943 ER - TY - THES A1 - Hadi, Naji Said Aboud T1 - In vitro Studies on the Genotoxicity of Selected Pyrrolizidine Alkaloids T1 - In-vitro-Studien zur Genotoxizität ausgewählter Pyrrolizidinalkaloide N2 - Cancer is one of the leading causes of death worldwide. Toxic contaminants in human food or medicinal products, such as substances like pyrrolizidine alkaloids (PAs), have been thought to contribute to cancer incidence. PAs are found in many plant species as secondary metabolites, and they may affect humans through contaminated food sources, herbal medicines, and dietary supplements. Hundreds of compounds belonging to PAs have been identified, differing in their chemical structures, either in their necine base moiety or esterification at their necic acid moiety. PAs undergo hepatic metabolism, and after this process, they can induce hepatotoxicity, genotoxicity, and carcinogenicity. However, the mechanism of inducing genotoxicity and carcinogenicity is still unclear and warrants further investigation. Therefore, the present study aims to investigate the mechanism of genotoxicity induced by selected PAs with different chemical structures in in vitro systems. Primarily, human hepatoma HepG2 cells were utilized, and in co-culture, metabolically active HepG2 cells were combined with non-metabolically active human cervical HeLa H2B-GFP cells. First, the genotoxicity of the PAs europine, lycopsamine, retrorsine, riddelliine, seneciphylline, echimidine, and lasiocarpine was investigated in the cytokinesis-block micronucleus (CBMN) assay. All seven selected PAs caused the formation of micronuclei in a dose-dependent manner, with the maximal increase of micronucleus formation ranging from 1.64 to 2.0 fold. The lowest concentrations at which significant induction of micronuclei was found were 3.2 µM for lasiocarpine and riddelliine, 32 µM for retrorsine and echimidine, and 100 µM for seneciphylline, europine, and lycopsamine. These results confirmed previously published potency rankings in the micronucleus assay. The same PAs, with the exception of seneciphylline, were also investigated in a crosslink-modified comet assay, and reduced tail formation after hydrogen peroxide treatment was found in all diester-type PAs. Meanwhile, an equimolar concentration of the monoesters europine and lycopsamine did not significantly reduce DNA migration. Thus, the crosslinking activity was related to the ester type. Next, the role of metabolic enzymes and membrane transporters in PA-induced genotoxicity was assessed. Ketoconazole (CYP 450-3A4 inhibitor) prevented lasiocarpine-induced micronucleus formation completely, while furafylline (CYP 450-1A2 inhibitor) reduced lasiocarpine-induced micronucleus formation, but did not abolish it completely. This implies that the CYP 450 enzymes play an important role in PA-induced genotoxicity. Carboxylesterase 2 enzyme (CES 2) is commonly known to be involved in the detoxification of xenobiotics. Loperamide (CES 2 inhibitor) yielded an increased formation of lasiocarpine-induced micronuclei, revealing a possible role of CES-mediated detoxification in the genotoxicity of lasiocarpine. Also, intracellular glutathione (GSH) plays an important role in the detoxification of xenobiotics or toxins in the cells. Cells which had been pretreated with L-buthionine sulfoximine (BSO) to reduce GSH content were significantly more sensitive for the induction of micronucleus formation by lasiocarpine revealing the importance of GSH in PA-induced genotoxicity. Quinidine (Q) and nelfinavir (NFR) are OCT1 and OATP1B1 influx transporter inhibitors, respectively, which reduced micronucleus induction by lasiocarpine (only quinidine significantly), but not completely, pointing to a relevance of OCT1 for PA uptake in HepG2 cells. Verapamil (V) and benzbromarone (Bz) are MDR1 and MRP2 efflux transporter inhibitors, respectively, and they caused a slightly increased micronucleus induction by lasiocarpine (significant only for benzbromarone) thus, revealing the role of efflux transporters in PA-induced genotoxicity. The mechanistic approach to PA-induced genotoxicity was further studied based on oxidative stress via the formation of reactive oxygen species (ROS) in HepG2 cells. Overproduction of ROS can cross-link cellular macromolecules such as DNA, leading to genomic damage. An equimolar concentration of 10 µM of lasiocarpine (open-diester PA), riddelliine (cyclic-diester PA), and europine (monoester) significantly induced ROS production, with the highest ROS generation observed after lasiocarpine treatment, followed by riddelliine and then europine. No significant increase in ROS production was found with lycopsamine (10 µM; monoester PA), even at a higher concentration (320 µM). The generation of ROS by these PAs was further analyzed for confirmation by using 5 mM of the thiol radical scavenger antioxidant N-acetyl cysteine (NAC) combined with lasiocarpine, riddelliine, or europine. This analysis yielded a significant decrease in ROS after combining NAC with lasiocarpine, riddelliine, and europine. In addition, lasiocarpine, riddelliine, and europine induced a loss of mitochondrial membrane potential, pointing to mitochondria as the source of ROS generation. In vivo, hepatic sinusoidal epithelial cells (HSECs) are known to be damaged first by PAs after hepatic metabolization, but HSECs themselves do not express the required metabolic enzymes for activation of PAs. To mimic this situation, HepG2 cells were used to metabolically activate PA in a co-culture with HeLa H2B-GFP cells as non-metabolically active neighbours. Due to the green fluorescent GFP label the HeLa cells could be identified easily based in the co-culture. The PAs europine, riddelliine and lasiocarpine induced micronucleus formation in HepG2 cells, and in HeLa H2B-GFP cells co-cultured with HepG2 cells, but not in HeLa H2B-GFP cells cultured alone. Metabolic inhibition of CYP 450 enzymes with ketoconazole abrogated micronucleus formation induced by the same PAs tested in the co-culture. The efflux transporter inhibitors verapamil and benzbromarone reduced the micronucleus formation in the co-culture. Furthermore, mitotic disturbances as an additional genotoxic mechanism of action were observed in HepG2 cells and in HeLa H2B-GFP cells co-cultured with HepG2 cells, but not in HeLa H2B-GFP cells cultured alone. Overall, we were able to show that PAs were activated by HepG2 cells and the metabolites induced genomic damage in co-cultured non-metabolically active green HeLa cells. Finally, in HepG2 cells as well as the co-culture, combinations of PAs lasiocarpine and riddelliine favoured an additive effect rather than synergism. Thus, this study therefore provides support that the assumption of dose-addition can be applied in the characterization of the genotoxicity risk of PAs present in a mixture. N2 - Krebs ist eine der häufigsten Todesursachen weltweit. Toxische Verunreinigungen in Lebensmitteln oder pflanzlichen Arzneimitteln, wie Pyrrolizidinalkaloide (PAs), können zur Krebsinzidenz beitragen. PAs kommen in vielen Pflanzenarten als Sekundärmetabolite vor. Menschen können diese über kontaminierte Nahrungsquellen, pflanzliche Arzneimittel und Nahrungsergänzungsmittel aufnehmen. Eine Vielzahl von Verbindungen, die zu pyrrolizidinalkaloidhaltigen Substanzen (PAs) gehören, wurden identifiziert. Diese unterscheiden sich in ihrer chemischen Struktur entweder durch ihre Necinbaseneinheit oder ihre Veresterung an der Necicsäureeinheit. Nach metabolischer Aktivierung in der Leber können PAs Hepatotoxizität, Genotoxizität und Karzinogenität induzieren. Jedoch ist der Genotoxizitätsmechanismus nicht vollständig aufgeklärt und erfordert weitere Untersuchungen. Das Ziel dieser Studie liegt in der Untersuchung des Mechanismus der Genotoxizität, die in vitro durch bestimmte PAs mit unterschiedlicher chemischer Struktur induziert wird. Hierbei wurden primär humane Hepatom-HepG2-Zellen verwendet sowie in Co-Kultur metabolisch aktive HepG2-Zellen und nicht-metabolisch aktive humane zervikale HeLa H2B-GFP-Zellen. Zunächst wurde die Genotoxizität der PAs Europin, Lycopsamin, Retrorsin, Riddelliin, Seneciphyllin, Echimidin und Lasiocarpin im Zytokinese-Block-Mikronukleus-Assay (CBMN) untersucht. Die sieben (7) ausgewählten PAs führten dosisabhängig zur Bildung von Mikrokernen. Der maximale Anstieg der Mikronukleusbildung lag für alle PAs im Bereich des 1,64- bis 2,0-fachen des Ausgangswertes. Die niedrigsten Konzentrationen, bei denen eine signifikante Induktion von Mikrokernen gefunden wurde, waren 3,2 μM für Lasiocarpin und Riddelliin, 32 μM für Retrorsin und Echimidin sowie 100 μM für Seneciphyllin, Europin und Lycopsamin. Diese Ergebnisse bestätigen zuvor veröffentlichte Potenz-Rankings im Mikronukleus-Assay. Die Genotoxizität der gleichen PAs, mit Ausnahme von Seneciphyllin, wurde zusätzlich mittels eines Crosslink-modifizierten Comet-Assay untersucht. Es wurde eine reduzierte Schweifbildung nach der Behandlung mit Wasserstoffperoxid in allen PAs des Diestertyps gefunden, während eine äquimolare Konzentration der Monoester Europin und Lycopsamin die DNA-Migration nicht signifikant reduzierte. Dies deutet darauf hin, dass die Vernetzungsaktivität von PAs auf der Ester-Einheit beruht. Als nächstes wurde die Rolle von Stoffwechselenzymen und Membrantransportern in der PA-induzierten Genotoxizität untersucht. Ketoconazol (CYP 450-3A4-Inhibitor) verhinderte die Lasiocarpin-induzierte Mikronukleusbildung vollständig, während Furafyllin (CYP 450-1A2-Inhibitor) die Lasiocarpin-induzierte Mikronukleusbildung reduzierte, aber nicht vollständig beseitigte. Dies deutet darauf hin, dass CYP 450-Enzyme eine wichtige Rolle bei der PA-induzierten Genotoxizität spielen. Es ist allgemein bekannt, dass das Enzym Carboxylesterase 2 (CES-2) an der Entgiftung von Xenobiotika beteiligt ist. Loperamid (CES-2-Inhibitor) führte zu einer erhöhten Bildung von Lasiocarpin-induzierten Mikrokernen, was auf eine mögliche Rolle der CES-vermittelten Entgiftung bei der Genotoxizität von Lasiocarpin hindeutet. Auch intrazelluläres Glutathion (GSH) spielt eine wichtige Rolle bei der Entgiftung von Xenobiotika oder Toxinen. Zellen, die mit L-Buthioninsulfoximin (BSO) vorbehandelt worden waren, um den GSH-Gehalt zu reduzieren, waren signifikant empfindlicher für die Induktion der Mikronukleusbildung durch Lasiocarpin, was die Bedeutung von GSH für die PA-induzierte Genotoxizität zeigt. Chinidin (Q) und Nelfinavir (NFR) sind OCT1- bzw. OATP1B1-Influx-Transporter-Inhibitoren, die die Mikronukleus-Induktion durch Lasiocarpin reduzierten (nur Chinidin signifikant), aber nicht vollständig, was auf eine Relevanz von OCT1 für die PA-Aufnahme in HepG2-Zellen hindeutet.Verapamil (V) und Benzbromaron (Bz) sind MDR1- bzw. MRP2-Efflux-Transporter-Inhibitoren und verursachten eine leicht erhöhte Mikronukleus-Induktion durch Lasiocarpin (signifikant nur für Benzbromaron), was die Rolle von Efflux-Transportern bei der PA-induzierten Genotoxizität aufzeigt. Der Mechanismus der PA-induzierten Genotoxizität wurde auf der Grundlage von oxidativem Stress durch die Bildung von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) in HepG2-Zellen weiter untersucht. Eine Überproduktion von ROS kann zelluläre Makromoleküle wie DNA vernetzen, was zu genomischen Schäden führt. Eine äquimolare Konzentration von 10 μM von Lasiocarpin (Open-Diester PA), Riddelliin (Cyclic-Diester PA) und Europin (Monoester) induzierte signifikant die ROS-Produktion, wobei die höchste ROS-Erzeugung nach Lasiocarpin-Behandlung beobachtet wurde, gefolgt von Riddelliin und Europin. Mit Lycopsamin (10 μM; Monoester PA) wurde auch bei höherer Konzentration (320 μM) keine signifikante Steigerung der ROS-Produktion gefunden. Um die Beteiligung von ROS am Mechanismus der Genotoxizität einzelner PAs genauer zu betrachten und die bisherigen Ergebnisse zu bestätigen, wurden weitere Untersuchungen in Anwesenheit des Sauerstoffradikalfängers N-Acetylcysteine (NAC) in Kombination mit Lasiocarpin, Riddelliin oder Europin durchgeführt. Diese Analyse ergab eine signifikante Abnahme der ROS-Produktion nach der Kombination von NAC mit Lasiocarpin, Riddelliin und Europin. Darüber hinaus induzierten Lasiocarpin, Riddelliin und Europin Veränderungen im mitochondrialen Membranpotenzial. Dies deutet darauf hin, dass ROS vermehrt in den Mitochondrien der Zellen gebildet werden. Aus in vivo Daten ist bekannt, dass hepatische sinusoidale Epithelzellen (HSECs) die Zelltypen innerhalb der Leber sind, die nach der metabolischen Aktivierung von PAs zuerst geschädigt werden. Jedoch exprimieren HSECs nicht die erforderlichen Stoffwechselenzyme für die Aktivierung von PAs. Um diese Situation nachzuahmen, wurden HepG2-Zellen verwendet, um PAs in einer Kokultur mit HeLa H2B-GFP-Zellen als nicht-metabolisch aktive Nachbarn metabolisch zu aktivieren. Durch die grün fluoreszierende GFP-Markierung konnten die HeLa-Zellen in der Co-Kultur leicht identifiziert werden. Die PAs Europine, Riddelliin und Lasiocarpin induzierten die Bildung von Mikrokernen in HepG2-Zellen und in HeLa H2B-GFP-Zellen, die mit HepG2-Zellen kokultiviert wurden, jedoch nicht in HeLa H2B-GFP-Zellen, die allein kultiviert wurden. Die metabolische Hemmung von CYP 450-Enzymen mit Ketoconazol hob die Mikronukleusbildung, welche durch die zuvor getesteten PAs induziert wurde, auf. Die Efflux-Transporter-Inhibitoren Verapamil und Benzbromaron reduzierten die Mikronukleusbildung in der Kokultur. Darüber hinaus wurden mitotische Störungen als zusätzlicher genotoxischer Wirkmechanismus in der Co-Kultur aus HepG2-Zellen und in HeLa H2B-GFP-Zellen beobachtet, jedoch nicht in HeLa H2B-GFP-Zellen, die allein kultiviert wurden. Zusammengefasst deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass PAs durch HepG2-Zellen bioaktiviert werden können und aus PAs gebildete Metabolite genomische Schäden in kokultivierten, nicht-metabolisch aktiven HeLa-Zellen induzierten. Abschließend zeigen Kombinationen der PAs Lasiocarpin und Riddelliin sowohl in HepG2-Zellen als auch in der Co-Kultur eher einen additiven Effekt als einen Synergismus. Diese Studie liefert daher Unterstützung für die Annahme, dass die Dosisaddition zur Charakterisierung des genotoxischen Risikos von in einem Gemisch vorhandenen PAs angewendet werden kann. KW - Pyrrolizidine alkaloids KW - HeLa H2B-GFP-Zellen KW - Pyrrolizidinalkaloide KW - Kleinkern KW - Mutagenität KW - Genotoxizität KW - DNA-Vernetzung KW - mitotische Störung KW - Co-culture KW - metabolische Aktivierung KW - Membrantransporter KW - metabolische Enzyme KW - HepG2-Zellen KW - Genotoxicity KW - Micronuclei KW - DNA crosslink KW - Mitotic disturbance KW - Metabolic activation KW - Membrane transporters KW - Metabolic enzymes KW - HepG2 cells KW - HeLa H2B-GFP cells KW - micronucleus Y1 - 2024 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-370376 ER - TY - THES A1 - Kawan, Mona T1 - The membrane trafficking protein myoferlin is a novel interactor of p97 T1 - Das Membrantransportprotein Myoferlin ist ein neuer Interaktor von p97 N2 - p97 uses the energy of ATP hydrolysis to unfold and thereby segregate proteins. It is involved in various cellular processes such as proteasomal degradation, DNA damage repair, autophagy, and endo-lysosomal trafficking. The specificity for these processes is controlled by more than 30 regulatory cofactors. Interactions of p97 with cofactors and target proteins are known to be highly dynamic and transient. To identify new interaction partners and to uncover novel cellular functions of p97, the interactome of endogenous p97 was determined by using in cellulo crosslinking followed by immunoprecipitation and mass spectrometry. Myoferlin (MYOF) was identified as a novel interactor of p97 and the interaction was validated in reciprocal immunoprecipitation experiments for different cell lines. The ferlin family member MYOF is a tail-anchored membrane protein containing multiple C2 domains. MYOF is involved in various membrane repair and trafficking processes such as the endocytic recycling of cell surface receptors. The MYOF interactome was determined by mass spectrometry. Among others, the p97 cofactor PLAA, CD71 and Rab14 were identified as common interactors of p97 and MYOF. Immunoprecipitation experiments with PLAA KO cells revealed that the interaction between MYOF and p97 depends on PLAA. Immunofluorescence microscopy showed a co-localization of MYOF with Rab14 and Rab11, which are both involved in endocytic recycling pathways. Furthermore, immunofluoroscence experiments revealed that MYOF and the p97 cofactor PLAA are localized to Rab14- and Rab5-positive endosomal compartments. Using p97 inhibitors and p97 trapping mutants, the presence of p97 at MYOF-positive and Rab14-positive structures could be demonstrated. Consistent with this finding, the endocytic recycling of transferrin was delayed upon inhibition of p97. Taken together, this work identified MYOF as a novel interactor of p97 and suggests a role for p97 in the recycling of endocytic cargo. N2 - p97 nutzt die aus der ATP-Hydrolyse gewonnene Energie, um Proteine zu entfalten und dadurch zu trennen. Es ist an verschiedenen zellulären Prozessen wie dem proteasomalen Abbau, der Reparatur von DNA-Schäden, der Autophagie und dem endo-lysosomalen Transport beteiligt. Die Spezifität für diese Prozesse wird durch mehr als 30 regulatorische Cofaktoren gesteuert. Wechselwirkungen von p97 mit Cofaktoren und Zielproteinen sind bekanntermaßen hochdynamisch und treten oft nur vorübergehend auf. Um neue Interaktionspartner zu identifizieren und neue zelluläre Funktionen von p97 aufzudecken, wurde das Interaktom von endogenem p97 unter Verwendung von in cellulo crosslinking, gefolgt von IP und Massenspektrometrie bestimmt. Dabei wurde MYOF als neuartiger Interaktor von p97 entdeckt und diese Interaktion wurde in reziproken IP-Experimenten und für verschiedene Zelllinien bestätigt. MYOF gehört der Ferlin Familie an und besitzt mehrere C2-Domänen sowie eine Trans-membrandomäne. MYOF ist bekanntermaßen an verschiedenen Membranreparatur- und Transportvorgängen wie beispielsweise dem endozytischen Recycling von Zelloberflächenrezeptoren beteiligt. Das Interaktom von MYOF wurde durch Massenspektrometrie bestimmt. Dabei wurden unter anderem der p97 Cofaktor PLAA, CD71 und Rab14 als gemeinsame Interaktoren von p97 und MYOF identifiziert. Durch IP-Experimente mit PLAA KO Zellen wurde eine Abhängigkeit der Interaktion zwischen MYOF und p97 von PLAA nachgewiesen. Mit IF-Mikroskopie konnte eine Kolokalisation von MYOF mit Rab14 und Rab11, die beide an endosomalen Recycling-Wegen beteiligt sind, beobachtet werden. Des Weiteren zeigten IF-Experimente, dass MYOF und der p97-Cofaktor PLAA an Rab14- und Rab5-positiven endosomalen Kompartimenten lokalisiert sind. Durch die Verwendung von p97-Inhibitoren oder p97 Mutanten, die ATP nicht hydrolysieren können und so verstärkt Substrate anreichern, konnte gezeigt werden, dass p97 an MYOF-positiven und Rab14-positiven Strukturen nachgewiesen werden kann. In Übereinstimmung mit diesem Befund wurde das endozytische Recycling von Transferrin durch die Inhibierung von p97 verzögert. Zusammengefasst zeigt diese Arbeit, dass MYOF ein neuer Interaktor von p97 ist, und deutet auf eine Rolle von p97 beim Recycling von endozytischer Fracht hin. KW - Endosom KW - p97 KW - Myoferlin Y1 - 2024 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-281218 ER - TY - THES A1 - Geißendörfer, Lisa T1 - The Macroeconomic Dimensions of Credit: A Comprehensive Analysis of Finance, Inequality and Growth T1 - Die makroökonomischen Dimensionen von Kredit: Eine umfassende Analyse von Finanzsystem, Ungleichheit und Wachstum N2 - Besonders einflussreich für das moderne Verständnis zur makroökonomischen Rolle von Banken und Kredit ist die monetäre Wachstumstheorie von Schumpeter. Ausgehend von dieser wird in dieser Dissertation die makroökonomische Rolle des Finanzsystems für die (1) Erzeugung von Wirtschaftswachstum, (2) Lenkung von ökonomischen Ressourcen und (3) Verteilung von Wohlstand untersucht. In Kapitel 3 wird zunächst empirisch gezeigt, dass 1.) ein positiver Zusammenhang zwischen dem Wachstum von Krediten und Wirtschaftswachstum besteht, auch für entwickelte Länder, 2.) kein empirischer Zusammenhang von Haushaltssparen und Wirtschaftswachstum festgestellt werden kann, und 3.) auf länderspezifischer Ebene sowohl positive, als auch negative und insignifikante Effekte von Kredit auf Wirtschaftswachstum existieren. Damit zeigt sich eine breite empirische Evidenz für Schumpeters monetäre Hypothesen. Eine besonders interessante Anwendung von Schumpeters Wachstumstheorie zeigt sich in China. Die Ergebnisse der empirischen Analyse legen nahe, dass es generell einen positiven Zusammenhang zwischen Kredit- und Wirtschaftswachstum in China gibt, der aber nicht linear in Bezug auf Regionen, Zeitpunkte und Größe des Finanzsystems ist. Weiterhin deuten die Ergebnisse darauf hin, dass die kreditfinanzierte Industriepolitik in China zu mehr Investitionen und BIP-Wachstum beigetragen haben könnte, wobei es jedoch Nichtlinearitäten zwischen einzelnen Branchen und Unternehmenstypen gibt. Zuletzt wird in Kapitel 5 die Frage aufgeworfen, welche Rolle das Finanzsystem bei der Verteilung des Wohlstands spielt. Während Kredite an Haushalte und Unternehmen, zusammen mit Indikatoren zum Arbeits- und Sparverhalten, sowie zur Altersstruktur der Bevölkerung, die wichtigsten Determinanten von Vermögensungleichheit sind, zeigen sich in der Beziehung von Krediten und Vermögensungleichheit ebenfalls verschiedene Nichtlinearitäten, u.a. im Bezug auf den Entwicklungsstand von Finanzsystemen und Wohneigentumsquoten. N2 - Schumpeter's monetary growth theory is particularly influential for the modern understanding of the macroeconomic role of banks and credit. Based on this theory, this dissertation examines the macroeconomic role of the financial system, especially credit, in (1) generating economic growth, (2) directing economic resources and (3) distributing wealth. Chapter 3 first shows empirically that 1) there is a positive correlation between the growth of credit and economic growth, even for developed countries, 2) no empirical correlation between household saving and economic growth can be established, and 3) there are both positive, negative and insignificant effects of credit on economic growth at country-specific level. Thus, there is broad empirical support for Schumpeter's monetary hypotheses. A particularly interesting application of Schumpeter's growth theory can be seen in China. The results of the empirical study suggest that there is generally a positive correlation between credit and economic growth in China, that is, however, not linear in terms of regions, time and size of the financial system. Furthermore, the results in Chapter 4 suggest that credit-financed industrial policy in China may have contributed to more investment and GDP growth, although there are non-linearities between individual industries and types of companies. Finally, Chapter 5 raises the question of the role of the financial system in the distribution of wealth. While credit to households and companies, together with indicators of working and saving behavior and the age structure of the population, are the most important determinants of wealth inequality, there are also various non-linearities in the relationship between credit and wealth inequality, including in relation to the level of development of financial systems and home ownership ratios. KW - Kredit KW - Wirtschaftswachstum KW - Industriepolitik KW - Ungleichheit KW - Finance-Growth-Nexus KW - Vermögensungleichheit KW - Finanzwirtschaft KW - Finanzsystem Y1 - 2024 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-370037 ER - TY - THES A1 - Waltmann, Maria T1 - Neurocognitive mechanisms of loss of control in Binge Eating Disorder T1 - Neurokognitive Mechanismen des Kontrollverlusts im Rahmen der Binge- Eating-Störung N2 - Binge Eating Disorder (BED) is a common, early-onset mental health condition characterised by uncontrollable episodes of overeating followed by negative emotions such as guilt and shame. An improved understanding of the neurocognitive mechanisms underlying BED is central to the development of more targeted and effective treatments. This thesis comprises a systematic review and three empirical studies contributing to this endeavour. BED can be thought of as a disorder of cognitive-behavioural control. Indeed, self-report evidence points towards enhanced impulsivity and compulsivity in BED. However, retrospective self-reports do not capture the mechanisms underlying impulsive and compulsive lapses of control in the moment. The systematic review therefore focussed on the experimental literature on impulsivity and compulsivity in BED. The evidence was very mixed, although there was some indication of altered goal-directed control and behavioural flexibility in BED. We highlight poor reliability of experimental paradigms and the failure to properly account for weight status as potential reasons for inconsistencies between studies. Moreover, we propose that impulsivity and/or compulsivity may be selectively enhanced in negative mood states in BED and may therefore not be consistently detected in lab-based studies. In the empirical studies, we explored the role of behavioural flexibility in BED using experimental and neuroimaging methods in concert with computational modelling. In the first empirical study, we assessed the reliability of a common measure of behavioural flexibility, the Probabilistic Reversal Learning Task (PRLT). We demonstrate that the behavioural and computational metrics of the PRLT have sufficient reliability to justify past and future applications if calculated using hierarchical modelling. This substantially improves reliability by reducing error variance. The results support the use of the PRLT in the second and third empirical studies on development and BED. Because a majority of patients develop BED as adolescents or young adults, we speculated that it may emerge as a consequence of disrupted or deficient maturation of behavioural flexibility. Little is known about typical development in this domain. We therefore investigated normative development of reversal learning from adolescence to adulthood in the second empirical study. Typically- developing adolescents exhibited less adaptive and more erratic and explorative behaviour than adults. This behaviour was accounted for by reduced sensitivity to positive feedback in a reinforcement learning model, and partially mediated by reduced activation reflecting uncertainty in the medial prefrontal cortex, a region known to mature substantially during adolescence. In the third empirical study, we investigated reversal learning in BED, paying special attention to potential biases associated with learning from wins vs learning from losses. We speculated that negative urgency could make it more difficult for BED patients to learn and make decisions under pressure to avoid losses. To dissociate between effects of excess weight and BED, we collected data from obese individuals with and without BED as well as normal-weight controls. As hypothesised, there were subtle neurocognitive differences between obese participants with and without BED with regard to learning to obtain rewards and to avoid losses. Obese individuals showed relatively impaired learning to obtain rewards, while BED patients showed relatively impaired learning to avoid losses. This was reflected in differential learning signals in the brain and associated with BED symptom severity. In sum, this thesis shows that the evidence on impulsivity and compulsivity in BED is inconsistent and offers potential explanations for this inconsistency. It highlights the need for reliability in interindividual difference research and indicates ways to improve it. Further, it charts the typical development of reversal learning from adolescence to adulthood and underscores the relevance of exploration in the context of learning and decision-making in adolescence. Finally, it demonstrates qualitative differences between BED and obesity, hinting at a pivotal role of aversive states in loss of control in BED. N2 - Binge-Eating-Störung (BES) ist eine weit verbreitete psychische Erkrankung, die häufig im Jugend- oder jungen Erwachsenenalter beginnt und von Episoden unkontrollierten Überessens gefolgt von negativen Emotionen wie Schuld und Scham gekennzeichnet ist. Ein verbessertes Verständnis der neurokognitiven Mechanismen, die der BES zugrunde liegen, ist zentral für die Entwicklung zielgerichteterer und effektiverer Therapieansätze. Die vorliegende Dissertation umfasst eine systematische Übersichtsarbeit und drei empirische Studien, die zu diesem Vorhaben beitragen. BES kann als eine Störung der kognitiven oder Verhaltenskontrolle betrachtet werden. Selbsteinschätzungsdaten aus Fragebogenstudien deuten klar auf erhöhte Impulsivität und Zwanghaftigkeit hin. Retrospektive Selbsteinschätzungsdaten können jedoch wenig Aufschluss über die Mechanismen geben, die impulsiven und zwanghaften Kontrollverlusten zugrunde liegen. Als Ausgangspunkt dieser Arbeit haben wir daher eine systematische Übersicht der experimentellen Literatur zu Impulsivität und Zwanghaftigkeit bei BES erstellt, die in dieser Hinsicht mehr Einblick verspricht. Die Studienlage war sehr heterogen, aber es gab vorläufige Hinweise auf veränderte zielgerichtete Kontrolle und Verhaltensflexibilität bei BES. Wir zeigen auf, dass unzureichende Reliabilität experimenteller Paradigmen und mangelnde Berücksichtigung wichtiger Störvariablen wie Körpergewicht mögliche Gründe für die großen Inkonsistenzen zwischen Studien sein könnten. Weiterhin vermuten wir, dass Impulsivität und/oder Zwanghaftigkeit im Rahmen der BES selektiv erhöht sein könnten, wenn Patient*innen sich in negativen Gemütszuständen befinden, und daher in Laborstudien nicht konsistent nachgewiesen werden können. Die empirischen Studien untersuchten die Rolle von Verhaltensflexibilität bei BES anhand experimenteller und bildgebender Verfahren sowie mathematischer Modellierung. In der ersten empirischen Studie untersuchten wir die Reliabilität der Probabilistic Reversal Learning Task (PRLT), eines gängigen Maßes der Verhaltensflexibilität. Wir konnten zeigen, dass die Verhaltensmaße und Metriken der mathematischen Modelle der PRLT adäquate Reliabilität aufweisen – allerdings nur, wenn sie anhand von hierarchischen Modellen errechnet werden. Letzteres reduziert die Fehlervarianz und verbessert die Reliabilität damit erheblich. Die Ergebnisse stützen die Verwendung der PRLT in unseren Studien zu Verhaltensflexibilität in der Entwicklung und bei BES. Da BES seine Erstmanifestation oft im Jugend- oder frühen Erwachsenenalter hat, liegt die Vermutung nahe, dass sie sich als Folge einer gestörten oder defizitären Reifung der Verhaltensflexibilität entwickeln könnte. Da jedoch wenig über die typische Entwicklung in diesem Bereich bekannt ist, haben wir in der zweiten empirischen Studie zunächst die normative Entwicklung von Reversal- Learning vom Jugend- zum Erwachsenenalter untersucht. Gesunde Jugendliche zeigten weniger adaptives, erratischeres und explorativeres Verhalten als Erwachsene. Unser mathematisches Modell des Verstärkungslernens erklärt dieses Muster durch eine verringerte Empfindlichkeit gegenüber positivem Feedback. Zudem konnten wir zeigen, dass dieses Verhalten teilweise durch reduzierte Aktivierung des medialen prefrontalen Kortex vermittelt war, einer Region, die im Jugendalter eine substanzielle Reifung durchmacht. In der dritten empirischen Studie haben wir schließlich Reversal-Learning bei BES untersucht und dabei spezielles Augenmerk auf potenzielle Verzerrungen im Lernen zum Erlangen von Belohnungen im Gegensatz zum Lernen zur Verlustvermeidung gelegt. Um Effekte von BES und Adipositas zu unterscheiden, haben wir Daten von adipösen Personen mit und ohne BES, sowie gesunden Normalgewichtigen erhoben. Wie erwartet gab es subtile neurokognitive Unterschiede zwischen adipösen Proband*innen mit und ohne BES im Hinblick auf Lernen zum Erlangen von Belohnungen und Vermeiden von Verlusten. So war Adipositas durch relativ beeinträchtigtes Lernen zum Erlangen von Belohnungen gekennzeichnet, während BES durch relativ beeinträchtigtes Lernen zur Vermeidung von Verlusten gekennzeichnet war. Dieser Unterschied spiegelte sich in der neuronalen Kodierung von Lernsignalen wieder und korrelierte mit der Symptomschwere der BES. Zusammenfassend zeigt diese Dissertation, dass die Literatur zu Impulsivität und Zwanghaftigkeit in BES inkonsistent ist und legt Gründe für diese Inkonsistenzen nahe. Sie hebt die kritische Rolle der Reliabilität von Instrumenten in der Forschung in differentieller und klinischer Psychologie sowie Psychiatrie hervor und zeigt Möglichkeiten auf, diese zu verbessern. Weiterhin zeichnet sie ein Bild der Entwicklung von Reversal Learning vom Jugend- zum Erwachsenenalter und unterstreicht die Relevanz von Explorationsverhalten im Kontext von Lernen und Entscheiden im Jugendalter. Schließlich zeigt sie qualitative Unterschiede zwischen BES und Adipositas auf und legt weitere Forschung in Hinblick auf eine möglicherweise zentrale Rolle negativer Emotionen für Kontrollverlust bei BES nahe. KW - Binge-eating Disorder KW - Kognitive Entwicklung KW - Reliabilität KW - Impulsivität KW - Computational Psychiatry KW - fMRI / Neuroimaging KW - Binge-Eating-Störung Y1 - 2024 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-364300 ER - TY - THES A1 - Jorgacevic, Ivana T1 - Elucidating the interconnection of GvHD and Western diet-induced atherosclerosis T1 - Aufklärung des Zusammenhangs von GvHD und durch westliche Ernährung induzierter Atherosklerose N2 - Allogeneic hematopoietic cell transplantation (Allo-HCT) is the main and only treatment for many malignant and non-malignant haematological disorders. Even though the treatment has improved through the years and patient life expectancy has increased, graft versus host disease (GvHD) is still considered the main obstacle and one of the main reasons for increased mortality. Furthermore, improved patient’s survival and life expectancy brought into question the late post-HCT complications. The leading cause of late death after allo-HCT is the relapse of primary disease as well as chronic GvHD (cGvHD). However, a clear relationship was also described with pulmonary complications, endocrine dysfunction and infertility, and cataracts in post-HCT patients. In the last years big concern regarding a cumulative cardiovascular incidence in long-term survivors has been raised. Severe cardiovascular disease (CVD) is caused by atherosclerosis which is considered a chronic inflammatory disease of blood vessels. As such, it takes a long time from endothelial damage, as the onset event, and followed plaque formation to a manifestation of severe consequences, such as stroke, coronary heart disease, or peripheral arterial disease. Endothelial damage is well documented in patients post-HCT. In the context of allo-HCT, the endothelial damage is induced by the conditioning regimen with or without total body irradiation (TBI). Furthermore, endothelial cells (ECs) have been documented as a target of GvHD and increased concentration of circulating endothelial cells (CEC) coinciding with an increase in the number of circulating alloreactive T cells. According to 2021 ESC Guidelines on CVD prevention, the main atherosclerotic CVD (ASCVD) risk factors are blood apolipoprotein B (ApoB)-containing lipoproteins (of which low-density lipoprotein (LDL) is the most abundant), high blood pressure, cigarette smoking and diabetes mellitus (DM). GvHD is considered a high-risk factor for the onset of dyslipidaemia, hypertension, and DM. Overall, the risk of premature cardiovascular death is 2.7 fold increased in comparison to the general population, while the cumulative incidence of cardiovascular complications was shown to be up to 47% at ten years after reduced intensity conditioning (RIC), post-HCT. However, up to date, there are no available studies elucidating the interconnection between GvHD and atherosclerosis. The goal of this study was, therefore, to investigate the involvement of GvHD in the progression of atherosclerosis as well as to elucidate whether cytotoxic, CD8+ T cells that were shown to play a significant role in endothelial damage during the course of skin GvHD on one hand, and inducers of formation of unstable plaque on the other, are involved in this interconnection. For that purpose we established a novel minor histocompatibility anti gens (miHAg) allo-HCT Western diet (WD)-induced atherosclerosis mouse model. We were able to show that GvHD has a significant impact on atherosclerosis development in B6.Ldlr−/− recipient mice even in the absence of overt clinical disease activity. It seems that the impact is at least partly induced by CD8+ T cells, that showed significantly increased infiltration of aortic lesions in mice facing subclinical GvHD. As studies have shown in regular atherosclerotic mouse models as well as in humans, these CD8+ T cells exhibited not only increased expression of genes involved in activation, survival and differentiation to cytotoxic phenotype, but also some genes pointing out their exhaustion, that were absent in CD4+ T cell cluster. When anti-CD8β antibody was applied once per week along with WD feeding for eight weeks, the plaque formation was significantly reduced in aorta and aortic root pointing out the importance of these cells in an alloreactivity induced lesion formation. Furthermore, anti-CD8β treatment led to significantly decreased necrotic core formation followed by overall increase in plaque stability. Strikingly, bone marrow plus T cells (BMT) recipients fed WD showed significantly increased serum cholesterol levels in comparison to bone marrow (BM) (a group lacking alloreactive T cells that induce GvHD). This effect was reversed when anti-CD8β treatment was applied, suggesting, at least partly, an impact of alloreactive CD8+ T cells on cholesterol levels. Expression of genes responsible for lipid metabolism pointed out the tendency of the liver to regulate the increased cholesterol levels, however, the mechanism behind this phenotype still remains to be revealed. On the other hand, the impact of obesity, induced by chronic high-fat diet (HFD) feeding, has been shown to be an independent risk factor for gastrointestinal GvHD. Similarly, in major histocompatibility complex (MHC) disparate allo-HCT mouse model, we have noticed that even short-term WD intake leads to a significant decrease in survival of mice post-HCT. When the concentration of transplanted alloreactive T cells was reduced, the survival was improved, pointing out the involvement of these cells in the pathogenesis. Additionally, bioluminescence imaging (BLI) during initiation and effector phase of acute GvHD (aGvHD) revealed increased infiltration of alloreactive T cells in mice fed WD. Studies in an obesity model, we could confirm the involvement of specifically CD4+ T cells in WD induced impact, as the relative number of these cells was significantly increased in small intestine on day six post-HCT in mice fed WD. This increased intestinal infiltration was preceded by increase in the number of alloreactive T cells expressing intestine homing receptor (α4β7 integrin) in peripheral lymph nodes (LNs). Even though the number of T cells was not changed in the spleen of WD fed mice, the subset of CD4+ and CD8+ T cells that were highly secreting TNFα was increased as well as the expression of genes regulating pro-inflammatory cytokines such as IL-6 and interferon (IFN)γ pointing out significant WD-induced inflammation. Moreover, slight tendency towards increased intestinal permeability and load of translocated luminal bacteria, that we observed, could induce severe endotoxemia and dysregulated systemic immune response that could lead to detrimental induction of cell death. Justifying our speculations, we noted increased levels of transaminases and an increase in lactate dehydrogenase (LDH) levels (pointing out significant tissue damages). However, the exact mechanism behind this detrimental WD impact still remains to be elucidated. N2 - Die allogene hämatopoetische Zelltransplantation (engl.: allogeneic hematopoietic cell transplantation; allo-HCT) ist die wichtigste und einzige Behandlung für viele bösartige und nicht bösartige hämatologische Erkrankungen. Auch wenn sich die Behandlung im Laufe der Jahre verbessert hat und die Lebenserwartung der Patienten gestiegen ist, gilt die Transplantat-gegen-Wirt-Krankheit (engl.: graft versus host disease; GvHD) nach wie vor als Haupthindernis und ist einer der Hauptgründe für die erhöhte Sterblichkeit. Darüber hinaus hat die Verbesserung der Überlebensrate und der Lebenserwartung der Patienten dazu geführt, dass die Spätkomplikationen nach der HCT in Frage gestellt wer den. Die Hauptursache für den späten Tod nach einer allo-HCT ist das Wiederauftreten der Primärerkrankung und die chronische GvHD (cGvHD). Es wurde jedoch auch ein ein deutiger Zusammenhang mit pulmonalen Komplikationen, endokriner Dysfunktion und Unfruchtbarkeit sowie Katarakten bei Patienten nach einer HCT beschrieben. In den letzten Jahren wurde große Besorgnis hinsichtlich einer kumulativen kardio vaskulären Inzidenz bei Langzeitüberlebenden geäußert. Schwere Herz-Kreislauf Erkrankungen werden durch Atherosklerose verursacht, die als chronische Entzündu ngserkrankung der Blutgefäße gilt. Von der Endothelschädigung als Beginn und der anschließenden Plaquebildung bis zur Manifestation schwerwiegender Folgen wie Schla ganfall, koronare Herzkrankheit oder periphere arterielle Verschlusskrankheit vergeht eine lange Zeit. Endothelschäden sind bei Patienten nach HCT gut dokumen tiert. Im Zusammenhang mit der allo-HCT wird die Endothelschädigung durch das Konditionierungsschema mit oder ohne TBI induziert. Darüber hinaus wurde dokumentiert, dass Endothelzellen ein Ziel der GvHD sind und dass eine erhöhte Konzentration zirkulierender Endothelzellen (engl: circulating endothelial cells; CEC) mit einem Anstieg der Anzahl zirkulierender alloreaktiver T-Zellen korreliert. Nach den ESC-Leitlinien 2021 zur Prävention von Herz-Kreislauf-Erkrankungen sind die wichtigsten Risikofaktoren für atherosklerotische Herz-Kreislauf-Erkrankungen (engl.: atherosclerotic cardiovascular disease; ASCVD) Apolipoprotein B (ApoB)-haltige Lipoproteine im Blut (von denen das Low-Density-Lipoprotein (LDL) am häufigsten vorkommt), Bluthochdruck, Zigarettenrauchen und Diabetes mellitus (DM). GvHD gilt als Hochrisikofaktor für das Auftreten von Dyslipidämie, Bluthochdruck und DM. Insgesamt ist das Risiko eines vorzeitigen kardiovaskulären Todes im Vergleich zur Allgemeinbevölkerung um das 2,7-fache erhöht, während die kumulative Inzidenz kardiovaskulärer Komp likationen zehn Jahre nach einer Konditionierung mit reduzierter Intensität (RIC) nach einer HCT bei bis zu 47% lag. Bislang gibt es jedoch keine Studien, die den Zusam menhang zwischen GvHD und Atherosklerose aufklären. Ziel dieser Studie war es daher, die Beteiligung der GvHD am Fortschreiten der Atherosklerose zu untersuchen und zu klären, ob zytotoxische CD8+ T-Zellen, die einerseits eine bedeutende Rolle bei der En dothelschädigung im Verlauf der Haut-GvHD spielen und andererseits die Bildung insta biler Plaques induzieren, an diesem Zusammenhang beteiligt sind. Zu diesem Zweck haben wir ein neuartiges miHAg-allo-HCT Atherosklerose-Mausmodell etabliert. Wir konnten zeigen, dass GvHD einen signifikanten Einfluss auf die Entwicklung von Atherosklerose in B6.Ldlr−/−-Empfängermäusen hat, selbst wenn keine klinische Krankheitsaktivität vor 3 Chapter 1. Summary liegt. Es scheint, dass dieser Einfluss zumindest teilweise durch CD8+ T-Zellen induziert wird, die bei Mäusen mit subklinischer GvHD eine signifikant erhöhte Infiltration von Aortenläsionen zeigten. Dies wurde auch in Studien in regulären Atherosklerose-Modellen sowie beim Menschen gezeigt. Diese CD8+-T-Zellen wiesen nicht nur eine erhöhte Expression von Genen auf, die an der Aktivierung, dem Überleben und der Differenzierung zum zytotoxischen Phänotyp beteiligt sind, sondern auch einige Gene, die auf zelluläre Erschöpfung hinweisen, die im CD4+-T-Zell-Cluster fehlten. Wurde ein Anti-CD8β-Antikörper einmal wöchentlich zusammen mit der Fütterung von WD acht Wochen lang verabreicht, so wurde die Plaquebildung in der Aorta und der Aortenwurzel signifikant reduziert, was auf die Bedeutung dieser Zellen bei der durch Alloreaktivität induzierten Läsionsbildung hinweist. Darüber hinaus führte eine Anti-CD8β-Behandlung zu einer signifikant verringerten Bildung eines nekrotischen Kerns, gefolgt von einer allge meinen Zunahme der Plaquestabilität. Auffallend ist, dass BMT-Empfänger, die mit WD gefüttert wurden, im Vergleich zu BM (einer Gruppe ohne alloreaktive T-Zellen, die GvHD induzieren) signifikant erhöhte Serumcholesterinwerte aufwiesen. Dieser Effekt kehrte sich um, wenn eine Anti-CD8β-Behandlung durchgeführt wurde, was zumindest teilweise auf einen Einfluss alloreaktiver CD8+-T-Zellen auf den Cholesterinspiegel schließen lässt. Die Expression von Genen, die für den Lipidstoffwechsel verantwortlich sind, wies auf die Tendenz der Leber hin, den erhöhten Cholesterinspiegel zu regulieren; der Mechanismus, der diesem Phänotyp zugrunde liegt, muss jedoch noch aufgeklärt werden. Andererseits hat sich gezeigt, dass die durch chronische Fütterung induzierte Fettleibigkeit ein un abhängiger Risikofaktor für gastrointestinale GvHD ist. In ähnlicher Weise haben wir in dem MHC disparaten allo-HCT-Mausmodell festgestellt, dass selbst eine kurzfristige WD-Zufuhr zu einer signifikanten Verringerung des Überlebens der Mäuse nach der HCT führte. Wenn die Konzentration der transplantierten alloreaktiven T-Zellen reduziert wurde, verbesserte sich die Überlebensrate, was auf die Beteiligung dieser Zellen an der Pathogenese hinweist. Darüber hinaus zeigte die Biolumineszenz-Bildgebung (engl.: bio luminiscence imaging; BLI) während der Initiations- und Effektorphase der aGvHD eine erhöhte Infiltration alloreaktiver T-Zellen bei Mäusen, die mit WD gefüttert wurden. Wie Studien gezeigt in einem Adipositasmodell vorgeschlagen haben, konnten wir die Beteili gung von spezifisch CD4+ T-Zellen an der WD-induzierten Wirkung bestätigen, da die relative Anzahl dieser Zellen im Dünndarm am sechsten Tag nach der HCT bei Mäusen, die mit WD gefüttert wurden, signifikant erhöht war. Dieser erhöhten Darminfiltration ging ein Anstieg der Zahl alloreaktiver T-Zellen voraus, die den Darm-Homing-Rezeptor (α4β7-Integrin) in den peripheren LNs exprimieren. Obwohl sich die Anzahl der T-Zellen in der Milz von mit WD gefütterten Mäusen nicht veränderte, war die Untergruppe der CD4+- und CD8+-T-Zellen, die in hohem Maße TNFα sezernierten, ebenso erhöht wie die Expression von Genen, die pro-inflammatorische Zytokine wie IL-6 und IFNγ reg ulieren, was auf eine signifikante WD-induzierte Entzündung hinweist. Darüber hinaus könnte die von uns beobachtete leichte Tendenz zu einer erhöhten intestinalen Perme abilität und Belastung mit translozierten luminalen Bakterien eine schwere Endotoxämie und eine dysregulierte systemische Immunantwort auslösen, die zu einer schädlichen In duktion des Zelltods führen könnte. Zur Untermauerung unserer Spekulationen stellten wir erhöhte Transaminasenwerte und einen Anstieg der LDH-Werte fest (was auf erhe bliche Gewebeschäden hinweist).Jedoch verbleibt der genaue Mechanismus, der zu den verheerenden Auswirkungen von WD führt, ungeklärt. KW - Periphere Stammzellentransplantation KW - Arteriosklerose KW - GvHD KW - HCT KW - Atherosclerosis Y1 - 2024 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-325792 ER - TY - THES A1 - Kreisz, Philipp T1 - Group S1 bZIP transcription factors regulate sink tissue development by controlling carbon and nitrogen resource allocation in \(Arabidopsis\) \(thaliana\) T1 - Gruppe S1 bZIP Transkriptionsfaktoren regulieren die Entwicklung von sink-Geweben durch Kontrolle der Verteilung von Kohlen- und Stickstoff Ressourcen in \(Arabidopsis\) \(thaliana\) N2 - The evolutionary success of higher plants is largely attributed to their tremendous developmental plasticity, which allows them to cope with adverse conditions. However, because these adaptations require investments of resources, they must be tightly regulated to avoid unfavourable trade-offs. Most of the resources required are macronutrients based on carbon and nitrogen. Limitations in the availability of these nutrients have major effects on gene expression, metabolism, and overall plant morphology. These changes are largely mediated by the highly conserved master kinase SNF1-RELATED PROTEIN KINASE1 (SnRK1), which represses growth and induces catabolic processes. Downstream of SnRK1, a hub of heterodimerising group C and S1 BASIC LEUCINE ZIPPER (bZIP) transcription factors has been identified. These bZIPs act as regulators of nutrient homeostasis and are highly expressed in strong sink tissues, such as flowers or the meristems that initiate lateral growth of both shoots and roots. However, their potential involvement in controlling developmental responses through their impact on resource allocation and usage has been largely neglected so far. Therefore, the objective of this work was to elucidate the impact of particularly S1 bZIPs on gene expression, metabolism, and plant development. Due to the high homology and suspected partial redundancy of S1 bZIPs, higher order loss-of-function mutants were generated using CRISPR-Cas9. The triple mutant bzip2/11/44 showed a variety of robust morphological changes but maintained an overall growth comparable to wildtype plants. In detail however, seedlings exhibited a strong reduction in primary root length. In addition, floral transition was delayed, and siliques and seeds were smaller, indicating a reduced supply of resources to the shoot and root apices. However, lateral root density and axillary shoot branching were increased, suggesting an increased ratio of lateral to apical growth in the mutant. The full group S1 knockout bzip1/2/11/44/53 showed similar phenotypes, albeit far more pronounced and accompanied by growth retardation. Metabolomic approaches revealed that these architectural changes were accompanied by reduced sugar levels in distal sink tissues such as flowers and roots. Sugar levels were also diminished in leaf apoplasts, indicating that long distance transport of sugars by apoplastic phloem loading was impaired in the mutants. In contrast, an increased sugar supply to the proximal axillary buds and elevated starch levels in the leaves were measured. In addition, free amino acid levels were increased in bzip2/11/44 and bzip1/2/11/44/53, especially for the important transport forms asparagine and glutamine. The increased C and N availability in the proximal tissues could be the cause of the increased axillary branching in the mutants. To identify bZIP target genes that might cause the observed shifts in metabolic status, RNAseq experiments were performed. Strikingly, clade III SUGARS WILL EVENTUALLY BE EXPORTED (SWEET) 8 genes were abundant among the differentially expressed genes. As SWEETs are crucial for sugar export to the apoplast and long-distance transport through the phloem, their reduced expression is likely to be the cause of the observed changes in sugar allocation. Similarly, the reduced expression of GLUTAMINE AMIDOTRANSFERASE 1_2.1 (GAT1_2.1), which exhibits glutaminase activity, could be an explanation for the abundance of glutamine in the mutants. Additional experiments (ATAC-seq, DAP� seq, PTA, q-RT-PCR) supported the direct induction of SWEETs and GAT1_2.1 by S1 bZIPs. To confirm the involvement of these target genes in the observed S1 bZIP mutant phenotypes, loss-of-function mutants were obtained, which showed moderately increased axillary branching. At the same time, the induced overexpression of bZIP11 in axillary meristems had the opposite effect. Collectively, a model is proposed for the function of S1 bZIPs in regulating sink tissue development. For efficient long-distance sugar transport, bZIPs may be required to induce the expression of clade III SWEETs. Thus, reduced SWEET expression in the S1 bZIP mutants would lead to a decrease in apoplastic sugar loading and a reduced supply to distal sinks such as shoot or root apices. The reduction in long� distance transport could lead to sugar accumulation in the leaves, which would then increasingly be transported via symplastic routes towards proximal sinks such as axillary branches and lateral roots or sequestered as starch. The reduced GAT1_2.1 levels lead to an abundance of glutamine, a major nitrogen transport form. The combined effect on C and N allocation results in increased nutrient availability in proximal tissues, promoting the formation of lateral plant organs. Alongside emerging evidence highlighting the power of bZIPs to steer nutrient allocation in other species, a novel but evolutionary conserved role for S1 bZIPs as regulators of developmental plasticity is proposed, while the generation of valuable data sets and novel genetic resources will help to gain a deeper understanding of the molecular mechanisms involved N2 - Der evolutionäre Erfolg höherer Pflanzen wird weitgehend auf ihre enorme Entwicklungsplastizität zurückgeführt, die es ihnen ermöglicht, widrigen Bedingungen zu trotzen. Da diese Anpassungen jedoch einen immensen Ressourceneinsatz erfordern, müssen sie streng reguliert werden, um unvorteilhafte Reaktionen zu vermeiden. Den Großteil der benötigten Ressourcen machen Makronährstoffe auf der Basis von Kohlenstoff und Stickstoff aus. Eine eingeschränkte Verfügbarkeit dieser Nährstoffe hat erhebliche Auswirkungen auf die Genexpression, den Stoffwechsel und die Morphologie der Pflanzen. Diese Veränderungen werden größtenteils durch die hochkonservierte Kinase SNF1-RELATED PROTEIN KINASE1 (SnRK1) vermittelt, die das Wachstum unterdrückt und katabole Prozesse einleitet. Downstream von SnRK1 wurde ein Netzwerk von heterodimerisierenden Transkriptionsfaktoren der Gruppe C und S1 BASIC LEUCINE ZIPPER (bZIP) identifiziert. Diese bZIPs wirken als Regulatoren der Nährstoffhomöostase und werden vor allem in starken sink-Geweben wie Blüten oder den Meristemen, die das Seitenwachstum von Sprossen und Wurzeln ermöglichen, exprimiert. Ihre potenzielle Beteiligung an der Steuerung von Entwicklungsreaktionen durch ihren Einfluss auf die Ressourcenzuteilung und -nutzung wurde bisher jedoch weitgehend vernachlässigt. Ziel dieser Arbeit war es daher, die Auswirkungen insbesondere von S1 bZIPs auf die Genexpression, den Stoffwechsel und die Pflanzenentwicklung zu erforschen. Aufgrund der hohen Homologie und der vermuteten teilweisen Redundanz der S1 bZIPs wurden mithilfe von CRISPR-Cas9 loss-of-function Mutanten höherer Ordnung erzeugt. Die Dreifachmutante bzip2/11/44 zeigte eine Vielzahl robuster morphologischer Veränderungen, behielt aber insgesamt ein mit Wildtyp-Pflanzen vergleichbares Wachstum bei. Im Detail jedoch wiesen die Keimlinge eine starke Verringerung der Primärwurzellänge auf. Darüber hinaus verzögerte sich der Blühzeitpunkt, und die Schoten und Samen waren kleiner, was auf eine geringere Versorgung der Spross- und Wurzelspitzen mit Ressourcen hinweist. Die Dichte der Seitenwurzeln und die axilläre Verzweigung des Sprosses waren jedoch erhöht, was auf ein erhöhtes Verhältnis von lateralem zu apikalem Wachstum in der Mutante hindeutet. Die Knockout-Mutante bzip1/2/11/44/53 zeigte ähnliche Phänotypen, wenn auch weitaus ausgeprägter und begleitet von Wachstumsverzögerungen. Metabolische Untersuchungen ergaben, dass diese Veränderungen in der Architektur mit reduzierten Zuckerspiegeln in distalen sink� Geweben wie Blüten und Wurzeln einhergingen. Die Zuckerspiegel waren auch in den Apoplasten der Blätter vermindert, was darauf hindeutet, dass der Ferntransport von Zucker durch apoplastische Phloembeladung in den Mutanten beeinträchtigt war. Im Gegensatz dazu wurden eine erhöhte Zuckerzufuhr zu den proximalen Achselknospen und erhöhte Stärkekonzentrationen in den Blättern gemessen. Zusätzlich war die Konzentration freier Aminosäuren in bzip2/11/44 und bzip1/2/11/44/53 10 erhöht, insbesondere für die wichtigen Transportformen Asparagin und Glutamin. Die erhöhte C- und N-Verfügbarkeit in den proximalen Geweben könnte die Ursache für die verstärkte axilläre Verzweigung in den Mutanten sein. Um bZIP-Zielgene zu identifizieren, die die beobachteten Verschiebungen im Stoffwechselstatus verursachen könnten, wurden RNAseq-Experimente durchgeführt. Auffallend ist, dass die Gene der Gruppe III SUGARS WILL EVENTUALLY BE EXPORTED (SWEET) unter den unterschiedlich exprimierten Genen sehr häufig vorkamen. Da SWEETs für den Zuckerexport in den Apoplasten und den Langstreckentransport durch das Phloem von entscheidender Bedeutung sind, ist ihre verringerte Expression wahrscheinlich die Ursache für die beobachteten Veränderungen in der Zuckerallokation. Ebenso könnte die verringerte Expression von GLUTAMIN AMIDOTRANSFERASE 1_2.1 (GAT1_2.1), die Glutaminase-Aktivität aufweist, eine Erklärung für die Häufigkeit von Glutamin in den Mutanten sein. Zusätzliche Experimente (ATAC-seq, DAP-seq, PTA, q-RT-PCR) bestätigten die direkte Induktion von SWEETs und GAT1_2.1 durch S1 bZIPs. Um die Beteiligung dieser Zielgene an den in den S1 bZIP� Mutanten beobachteten Phänotypen zu bestätigen, wurden loss-of-function-Mutanten untersucht, die eine mäßig erhöhte axilläre Verzweigung aufwiesen. Gleichzeitig hatte die induzierte Überexpression von bZIP11 in axillären Meristemen den gegenteiligen Effekt. Auf Basis dieser Ergebnisse wird ein Modell für die Funktion von S1 bZIPs bei der Regulierung der Entwicklung von sink-Geweben vorgeschlagen. Für einen effizienten Zuckertransport über große Entfernungen könnten bZIPs erforderlich sein, um die Expression von SWEETs der Gruppe III zu induzieren. Eine verringerte SWEET-Expression in den S1 bZIP-Mutanten würde zu einem Rückgang der apoplastischen Zuckerbeladung und einer verringerten Versorgung von distalen sink-Geweben wie den Spross- oder Wurzelspitzen führen. Die Verringerung des Ferntransports könnte zu einer Anhäufung von Zucker in den Blättern führen, der dann verstärkt über symplastische Wege zu proximalen sink� Geweben wie den axillären Meristem und Seitenwurzeln transportiert oder als Stärke gespeichert wird. Die verringerte GAT1_2.1 Expression führt zu einem Überfluss an Glutamin, einer wichtigen Stickstofftransportform. Die kombinierte Wirkung auf die C- und N-Allokation führt zu einer erhöhten Nährstoffverfügbarkeit in den proximalen Geweben und fördert die Bildung von seitlichen Pflanzenorganen. Neben neuen Erkenntnissen, die die Wirksamkeit von bZIPs bei der Steuerung der Nährstoffallokation in anderen Arten unterstreichen, wird eine neuartige, jedoch evolutionär konservierte Rolle für S1 bZIPs als Regulatoren der Entwicklungsplastizität vorgeschlagen, während die Generierung wertvoller Datensätze und neuer genetischer Ressourcen dazu beitragen wird, ein tieferes Verständnis der beteiligten molekularen Mechanismen zu gewinnen. KW - Molekularbiologie KW - Sugar allocation KW - Nitrogen allocation KW - Basic leucine zipper KW - Developmental plasticity KW - CRISPR Cas9 KW - Ackerschmalwand KW - CRISPR/Cas-Methode KW - Arabidopsis thaliana Y1 - 2024 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-321925 ER - TY - THES A1 - Kumar, Manish T1 - Structural and compositional effects on tree-water relation T1 - Strukturelle und Zusammenseztungseffekte auf die Beziehung zwischen Baum und Wasser N2 - Forests are essential sources of tangible and intangible benefits, but global climate change associated with recurrent extreme drought episodes severely affects forest productivity due to extensive tree die-back. On that, it appeals to an urgency for large-scale reforestation efforts to mitigate the impact of climate change worldwide; however, there is a lack of understanding of drought-effect on sapling growth and survival mechanisms. It is also challenging to anticipate how long trees can survive and when they succumb to drought. Hence, to ensure success of reforestation programs and sustainable forest productivity, it is essential to identify drought-resistant saplings. For that, profound knowledge of hydraulic characteristics is needed. To achieve this, the study was split into two phases which seek to address (1) how the hydraulic and anatomical traits influence the sapling’s growth rate under drought stress. (2) how plant water potential regulation and physiological traits are linked to species’ water use strategies and their drought tolerance. The dissertation is assembled of two study campaigns carried out on saplings at the Chair of Botany II, University of Würzburg, Germany. The first study involved three ecologically important temperate broadleaved tree species — saplings of 18-month (Acer pseudoplatanus, Betula pendula, and Sorbus aucuparia) — grown from seeds in contrasting conditions (inside a greenhouse and outside), with the latter being subjected to severe natural heat waves. In the second study, two additional temperate species (Fagus sylvatica and Tilia cordata) were added. The drying-out event was conducted using a randomised blocked design by monitoring plant water status in a climate-controlled chamber and a greenhouse. In campaign I, I present the result based on analysed data of 82 plants of temperate deciduous species and address the juvenile growth rate trade-off with xylem safety-efficiency. Our results indicate biomass production varies considerably due to the contrasted growing environment. High hydraulic efficiency is necessary for increased biomass production, while safety-efficiency traits are decoupled and species-specific. Furthermore, productivity was linked considerably to xylem safety without revealing a well-defined pattern among species. Moreover, plasticity in traits differed between stressed and non-stressed plants. For example, safety-related characteristics were more static than efficiency-related traits, which had higher intra-specific variation. Moreover, we recorded anatomical and leaf traits adjustments in response to a stress condition, but consistency among species is lacking. In campaign II, I combined different ways to estimate the degree of isohydry based on water potential regulation and connected the iso-anisohydric spectrum (i.e., hydroscape area, HSA) to hydraulic traits to elucidate actual plant performance during drought. We analysed plant water potential regulation (Ψpd and Ψmd) and stomatal conductance of 28-29 month saplings of five species. I used a linear mixed modelling approach that allowed to control individual variations to describe the water potential regulation and tested different conceptual definitions of isohydricity. The combined methods allowed us to estimate species' relative degree of isohydry. Further, we examined the traits coordination, including hydraulic safety margin, HSM; embolism resistance, P88; turgor loss, Ψtlp; stomata closure, Ps90; capacitance, C; cuticular conductance, gmin, to determine time to hydraulic failure (Thf). Thf is the cumulative effect of time to stomata closure (Tsc) and time after stomatal closure to catastrophic hydraulic failure (Tcrit). Our results show the species' HSA matches their stomatal stringency, which confirms the relationship between stomatal response and leaf water potential decline. Species that close stomata at lower water potential notably had a larger HSA. Isohydric behaviour was mostly associated with leaf hydraulic traits and poorly to xylem safety traits. Species' degree of isohydry was also unrelated to the species' time to death during drying-out experiments. This supports the notion that isohydry behaviours are linked to water use rather than drought survival strategies. Further, consistent with our assumptions, more isohydric species had larger internal water storage and lost their leaf turgor at less negative water potentials. Counter to our expectations, neither embolism resistance nor the associated hydraulic safety margins were related to metrics of isohydry. Instead, our results indicate traits associated with plant drought response to cluster along two largely independent axes of variation (i.e., stomatal stringency and xylem safety). Furthermore, on the temporal progression of plant drought responses, stomatal closure is critical in coordinating various traits to determine species' hydraulic strategies. Desiccation avoidance strategy was linked to Tsc and coordinated traits response of Ps90, Ψtlp, and HSA, whereas desiccation tolerance was related to Tcrit and traits such as lower P88 value, high HSM, and lower gmin. Notably, the shoot capacitance (C) is crucial in Thf and exhibits dichotomous behaviour linked to both Tsc and Tcrit. In conclusion, knowledge of growth rate trade-offs with xylem safety-efficiency combined with traits linked to species’ hydraulic strategies along the isohydry could substantially enhance our ability to identify drought-resistant saplings to ensure the success of reforestation programs and predicting sensitivity to drought for achieving sustainable forest ecosystems. N2 - Wälder sind wichtige Quellen materieller und immaterieller Vorteile, aber der globale Klimawandel, der mit wiederkehrenden extremen Dürreperioden einhergeht, beeinträchtigt die Produktivität der Wälder aufgrund des starken Absterbens von Bäumen erheblich. Deshalb werden dringend groß angelegte Aufforstungsmaßnahmen gefordert, um die Auswirkungen des Klimawandels weltweit abzumildern. Allerdings fehlt es an Kenntnissen über die Auswirkungen von Dürre auf das Wachstum und die Überlebensmechanismen von Jungbäumen. Es ist auch schwierig, vorherzusehen, wie lange Bäume überleben können und wann sie der Trockenheit erliegen. Um den Erfolg von Wiederaufforstungsprogrammen und die nachhaltige Produktivität der Wälder zu gewährleisten, ist es daher unerlässlich, trockenheitsresistente Setzlinge zu identifizieren. Dazu ist eine profunde Kenntnis der hydraulischen Eigenschaften erforderlich. Um dies zu erreichen, wurde die Studie in zwei Phasen aufgeteilt, in denen untersucht werden soll, (1) wie die hydraulischen und anatomischen Merkmale die Wachstumsrate der Setzlinge unter Trockenstress beeinflussen. (2) wie die Regulierung des pflanzlichen Wasserpotenzials und die physiologischen Merkmale mit den Wassernutzungsstrategien der Arten und ihrer Trockentoleranz zusammenhängen. Die Dissertation setzt sich aus zwei Studienkampagnen zusammen, die am Lehrstuhl für Botanik II der Universität Würzburg an Setzlingen durchgeführt wurden. In der ersten Studie wurden drei ökologisch wichtige Laubbaumarten der gemäßigten Zonen - 18-monatige Setzlinge (Acer pseudoplatanus, Betula pendula und Sorbus aucuparia) - aus Samen unter unterschiedlichen Bedingungen (in einem Gewächshaus und im Freien) aufgezogen, wobei letztere schweren natürlichen Hitzewellen ausgesetzt waren. In der zweiten Studie wurden zwei weitere gemäßigte Arten (Fagus sylvatica und Tilia cordata) hinzugefügt. Der Austrocknungsversuch wurde in einem randomisierten Blockdesign durchgeführt, bei dem der Wasserhaushalt der Pflanzen in einer klimatisierten Kammer und einem Gewächshaus überwacht wurde. In Kampagne I präsentiere ich die Ergebnisse, die auf den analysierten Daten von 82 Pflanzen gemäßigter Laubbaumarten basieren, und gehe auf den Kompromiss zwischen der Wachstumsrate von Jungpflanzen und der Sicherheitseffizienz des Xylems ein. Unsere Ergebnisse zeigen, dass die Biomasseproduktion aufgrund der unterschiedlichen Wachstumsbedingungen stark variiert. Eine hohe hydraulische Effizienz ist für eine erhöhte Biomasseproduktion notwendig, während die Sicherheitseffizienz entkoppelt und artspezifisch ist. Darüber hinaus war die Produktivität in erheblichem Maße mit der Xylemsicherheit verknüpft, ohne dass sich ein klar definiertes Muster zwischen den Arten ergab. Darüber hinaus war die Plastizität der Merkmale zwischen gestressten und nicht gestressten Pflanzen unterschiedlich. So waren beispielsweise sicherheitsbezogene Merkmale statischer als effizienzbezogene Merkmale, die eine stärkere intra-spezifische Variation aufwiesen. Darüber hinaus haben wir Anpassungen der anatomischen Merkmale und der Blatteigenschaften als Reaktion auf eine Stressbedingung festgestellt, aber es fehlt die Konsistenz zwischen den Arten. In Kampagne II kombinierte ich verschiedene Methoden zur Schätzung des Isohydrierungsgrads auf der Grundlage der Wasserpotenzialregulierung und verknüpfte das iso-anisohydrische Spektrum (d. h. die Hydroscape-Fläche, HSA) mit hydraulischen Merkmalen, um die tatsächliche Leistung der Pflanzen bei Trockenheit zu ermitteln. Wir analysierten die Regulierung des pflanzlichen Wasserpotenzials (Ψpd und Ψmd) und die stomatäre Leitfähigkeit von 28-29 Monate alten Setzlingen von fünf Arten. Ich verwendete einen linearen gemischten Modellierungsansatz, der die Kontrolle individueller Variationen zur Beschreibung der Wasserpotenzialregulierung ermöglichte, und testete verschiedene konzeptionelle Definitionen der Isohydrizität. Die kombinierten Methoden ermöglichten es uns, den relativen Grad der Isohydrizität der Arten zu schätzen. Darüber hinaus untersuchten wir die Koordination der Merkmale, einschließlich der hydraulischen Sicherheitsspanne (HSM), des Embolieresistenz (P88), des Turgorverlustes (Ψtlp), des Spaltöffnungsgrades (Ps90), der Kapazität (C) und des kutikulären Leitwertes (gmin), um die Zeit bis zum hydraulischen Versagen (Thf) zu bestimmen. Thf ist der kumulative Effekt der Zeit bis zum Schließen der Spaltöffnungen (Tsc) und der Zeit nach dem Schließen der Spaltöffnungen bis zum katastrophalen hydraulischen Versagen (Tcrit). Unsere Ergebnisse zeigen, dass die HSA der Arten mit ihrer Spaltöffnungsintensität übereinstimmt, was die Beziehung zwischen der Spaltöffnungsreaktion und dem Rückgang des Wasserpotenzials der Blätter bestätigt. Arten, die ihre Spaltöffnungen bei einem niedrigeren Wasserpotenzial schließen, hatten einen deutlich größeren HSA. Das isohydrische Verhalten stand hauptsächlich mit den hydraulischen Eigenschaften der Blätter in Verbindung und kaum mit den Sicherheitsmerkmalen des Xylems. Der Grad der Isohydrierung der Arten stand auch in keinem Zusammenhang mit der Zeit bis zum Absterben der Arten während der Austrocknungsversuche. Dies unterstützt die Annahme, dass das Isohydrie-Verhalten eher mit der Wassernutzung als mit Überlebensstrategien bei Trockenheit zusammenhängt. Darüber hinaus wiesen isohydrische Arten, wie von uns angenommen, einen größeren internen Wasserspeicher auf und verloren ihren Blattturgor bei weniger negativen Wasserpotentialen. Entgegen unseren Erwartungen standen weder die Embolieresistenz noch die damit verbundenen hydraulischen Sicherheitsspannen in Zusammenhang mit Isohydratisierungsmerkmalen. Stattdessen deuten unsere Ergebnisse darauf hin, dass sich die Merkmale, die mit der Reaktion der Pflanzen auf Trockenheit in Verbindung stehen, entlang zweier weitgehend unabhängiger Variationsachsen (d. h. stomatäre Strenge und Xylem-Sicherheit) gruppieren. Was den zeitlichen Verlauf der pflanzlichen Reaktionen auf Trockenheit betrifft, so ist der Stomataverschluss für die Koordinierung der verschiedenen Merkmale entscheidend, um die hydraulischen Strategien der Arten zu bestimmen. Die Strategie zur Vermeidung von Austrocknung war mit Tsc und koordinierten Merkmalen wie Ps90, Ψtlp und HSA verbunden, während die Austrocknungstoleranz mit Tcrit und Merkmalen wie einem niedrigeren P88-Wert, einem hohen HSM und einem niedrigeren gmin zusammenhing. Insbesondere die Sprosskapazität (C) ist für Thf entscheidend und zeigt ein dichotomes Verhalten, das sowohl mit Tsc als auch mit Tcrit zusammenhängt. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass das Wissen um die Wechselwirkungen zwischen der Wachstumsrate und der Sicherheitseffizienz des Xylems in Verbindung mit Merkmalen, die mit den hydraulischen Strategien der Arten entlang der Isohydrie zusammenhängen, unsere Fähigkeit, trockenheitsresistente Setzlinge zu identifizieren, erheblich verbessern könnte, um den Erfolg von Aufforstungsprogrammen zu gewährleisten und die Empfindlichkeit gegenüber Trockenheit vorherzusagen, um nachhaltige Waldökosysteme zu erreichen. KW - Wachstumsrate KW - hydraulic efficiency KW - phenotypic plasticity KW - growth rate KW - safety-efficiency trade-off KW - vulnerability curve KW - stomatal closure KW - desiccation time KW - hydroscape KW - cuticular conductance KW - shoot capacitance KW - Baum KW - Wasser KW - hydraulische Effizienz KW - Verwundbarkeitskurve KW - Stomatenverschluss KW - Hydroscape-Gebiet Y1 - 2024 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-326245 ER - TY - THES A1 - Franken, Robert T1 - Precision Predictions for \(\mathrm W^+ \mathrm W^-\) Scattering at the LHC T1 - Präzisionsvorhersagen für \(\mathrm W^+ \mathrm W^-\) -Streuung am LHC N2 - In this thesis we examine the vector boson scattering (VBS) process \(\mathrm p \mathrm p \to \mathrm e^+ \nu_\mathrm e\mu^-\bar\nu_\mu\mathrm j\mathrm j +X\) (short: \(\mathrm W^+\mathrm W^-\) scattering) at NLO accuracy in two experimental setups by performing a Monte Carlo analysis of a \(13\,\mathrm{TeV}\) LHC run. \(\mathrm W^+\mathrm W^-\) scattering shows similarities and differences compared to the scattering of other vector bosons. We present a detailed description of the types of appearing subprocesses and background processes. We give insight into our code which solves the problems we are faced within \(\mathrm W^+\mathrm W^-\) scattering. This is especially the presence of the Higgs-boson resonance in the fiducial phase-space region. Particular attention is dedicated to the permutation of resonances. The integrated signal cross section at LO \(\mathcal O(\alpha^6)\) amounts to \(2.6988(3)\,\mathrm{fb}\) and \(1.5322(2)\,\mathrm{fb}\), respectively, in the two experimental setups. The LO QCD-induced background of \(\mathcal O(\alpha_\mathrm s^2\alpha^4)\) amounts to \(6.9115(9)\,\mathrm{fb}\) and \(1.6923(3)\,\mathrm{fb}\). The EW corrections to the signal are \(-11.4\%\) and \(-6.7\%\), the QCD corrections amount to \(-5.2\%\) and \(-23.0\%\). The EW corrections to the background are \(-8.3\%\) and \(-5.3\%\), the QCD corrections amount to \(-30.3\%\) and \(-77.6\%\). Our results for the QCD corrections and the QCD-induced background include a large uncertainty from varying the renormalisation and factorisation scale, and we discuss improvements for future calculations. We show the differential cross sections with unique features of \(\mathrm W^+\mathrm W^-\) scattering compared to other VBS processes and investigate in particular the subprocess of Higgs-boson production by using a modified version of our setups. N2 - In dieser Arbeit untersuchen wir den Vektorboson-Streuprozess (VBS-Prozess) \(\mathrm p\mathrm p \to \mathrm e^+\nu_\mathrm e\mu^-\bar\nu_\mu\mathrm j\mathrm j + X\) (kurz: \(\mathrm W^+\mathrm W^-\)-Streuung) auf nächstführender Ordnung in zwei Versuchsanordnungen, indem wir eine Monte-Carlo-Analyse des LHC-Betriebs bei \(13\,\mathrm{TeV}\) durchführen. \(\mathrm W^+\mathrm W^-\)-Streuung zeigt Gemeinsamkeiten mit der und Unterschiede zur Streuung anderer Vektorbosonen. Wir stellen eine detaillierte Beschreibung der Arten auftauchender Subprozesse und Hintergrundprozesse vor und geben Einsicht in unseren Code, der die Probleme löst, vor die wir im Rahmen der \(\mathrm W^+\mathrm W^-\)-Streuung gestellt wurden. Dies ist insbesondere die Präsenz der Higgs-Boson-Resonanz im Bezugsphasenraum. Besonderes Augenmerk wird auf die Permutation der Resonanzen gelegt. Wir präsentieren den integrierten Wirkungsquerschnitt. Der integrierte Wirkungsquerschnitt des Signals beträgt \(2{,}6988(3)\,\mathrm{fb}\) beziehungsweise \(1{,}5322(2)\,\mathrm{fb}\) auf führender Ordnung \(\mathcal O(\alpha^6)\) in den beiden experimentellen Setups. Der QCD-Hintergrund auf führender Ordnung \(\mathcal O(\alpha_\mathrm s^2\alpha^4)\) beträgt \(6{,}9115(9)\,\mathrm{fb}\) bzw. \(1{,}6923(3)\,\mathrm{fb}\). Die elektroschwachen Korrekturen zum Signal belaufen sich auf \(-11{,}4\%\) bzw. \(-6{,}7\%\), die QCD-Korrekturen auf \(-5{,}2\%\) bzw. \(-23{,}0\%\). Die elektroschwachen Korrekturen zum Hintergrund sind \(-8{,}3\%\) bzw. \(-5{,}3\%\), die QCD-Korrekturen \(-30{,}3\%\) bzw. \(-77{,}6\%\). Unsere Ergebnisse für die QCD-Korrekturen und den QCD-induzierten Hintergrund enthalten eine große Unsicherheit durch die Variation der Renormierungs- und Faktorisierungsskala und wir diskutieren Verbesserungen für zukünftige Rechnungen. Wir zeigen die differentiellen Wirkungsquerschnitte mit Eigenheiten von \(\mathrm W^+\mathrm W^-\)-Streuung verglichen mit anderen VBS-Prozessen und betrachten insbesondere den Subprozess der Higgs-Boson-Produktion, indem wir eine modifizierte Version unserer Versuchsanordnungen verwenden. KW - W-Boson KW - Streuquerschnitt KW - LHC KW - Präzisionsvorhersage Y1 - 2024 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-369445 ER - TY - THES A1 - Fohmann, Ingo T1 - The Role of Sphingosine 1-phosphate and S1PR1-3 in the Pathophysiology of Meningococcal Meningitis T1 - Die Rolle von Sphingosin 1-Phosphat und S1PR1-3 in der Pathophysiologie der durch Meningokokken ausgelösten Meningitis N2 - Neisseria meningitidis (N. meningitidis) is an obligate human pathogen which causes live-threatening sepsis and meningitis. The fatality rate after meningococcal infection is high and surviving patients often suffer from severe sequelae. To cause meningitis, N. meningitidis must overcome the endothelium of the blood-brain barrier. The bacterium achieves this through the interaction with endothelial surface receptors leading to alternations of the cellular metabolism and signaling, which lastly results in cellular uptake and barrier traversal of N. meningitidis. Sphingosine 1-phosphate (S1P) is a lipid mediator that belongs to the class of sphingolipids and regulates the integrity of the blood-brain barrier through the interaction with its cognate receptors S1P receptors 1-3 (S1PR1-3). In this study, high performance liquid chromatography coupled with mass spectrometry (LC-MS/MS) was used to generate a time-resolved picture of the sphingolipid metabolism in a brain endothelial cell line (hCMEC/D3) upon meningococcal infection. Among various changes, S1P was elevated in the cellular compartment as well as in the supernatant of infected hCMEC/D3s. Analysis of mRNA expression in infected hCMEC/D3s with quantitative real-time polymerase chain reaction (RT-qPCR) revealed that the increase in S1P could be attributed to the enhanced expression of the S1P-generating enzyme sphingosine kinase 1 (SphK1). Antibody-based detection of SphK1 protein or phosphorylation at SphK1 residue Serine 225 in hCMEC/D3 plasma membrane fractions via Western Blot revealed that N. meningitidis also induced SphK1 phospho-activation and recruitment to the plasma membrane. Importantly, recruitment of SphK1 to the plasma membrane increases the probability of substrate encounter, thus elevating SphK activity. Enhanced SphK activity was also reflected on a functional level, as detected by a commercially available ATP depletion assay used for measuring the enzymatic activity of SphK. Infection of hCMEC/D3 cells with pilus-deficient mutants resulted in a lower SphK activation compared to the N. meningitidis wild type strain. hCMEC/D3 treatment with pilus-enriched protein fractions showed SphK activation similar to the infection with living bacteria and could be ascribed to pilus interaction with the membrane-proximal domain of cellular surface receptor CD147. Inhibition of SphK1 or SphK2 through pre-treatment with specific inhibitors or RNA interference reduced uptake of N. meningitidis into hCMEC/D3 cells, as measured with Gentamicin protection assays. Released S1P induced the phospho-activation of epidermal growth factor receptor (EGFR) via S1PR2 activation, whose expression was also increasing during infection. Furthermore, S1PR2 blockage had a preventive effect on bacterial invasion into hCMEC/D3 cells. On the contrary, activation of S1PR1+3 also reduced bacterial uptake, indicating an opposing regulatory role of S1PR1+3 and S1PR2 during N. meningitidis uptake. Moreover, SphK2 inhibition prevented inflammatory cytokine expression as well as release of interleukin-8 after N. meningitidis infection. Taken together, this study demonstrates the central role of S1P and its cognate receptors S1PR1-3 in the pathophysiology of meningococcal meningitis. N2 - Neisseria meningitidis (N. meningitidis) ist ein obligat humanpathogenes Bakterium, welches lebensbedrohliche Sepsis und Meningitis auslöst. Die Todesrate nach einer Meningokokkeninfektion ist hoch und überlebende Patienten leiden oft unter gravierenden Folgeschäden. N. meningitidis muss zuerst das Endothel der Blut-Hirn-Schranke überwinden, um Meningitis auslösen zu können. Das Bakterium erzielt dies durch die Interaktion mit endothelialen Rezeptoren, welche den zellulären Metabolismus und die zellulären Signalwege beeinflusst und letztlich zur zellulären Aufnahme von N. meningitidis und zur Überwindung der Barriere führt. Sphingosine 1-phosphat (S1P) ist ein Lipidmediator, der zur Klasse der Sphingolipide gehört und die Integrität der Blut-Hirn-Schranke durch die Interaktion mit den zugehörigen S1P Rezeptoren 1-3 (S1PR1-3s) beeinflusst. In dieser Arbeit wurde Hochleistungsflüssigkeitschromatographie-gekoppelte Massenspektrometrie (LC-MS/MS) genutzt, um ein zeitlich aufgelöstes Bild des Sphingolipidmetabolismus in einer Hinendothelzelllinie (hCMEC/D3) nach Meningokokkeninfektion zu generieren. Neben zahlreichen Veränderungen zeigte sich ein Anstieg von S1P im zellulären Kompartiment und im Überstand von infizierten hCMEC/D3 Zellen. Die Analyse der mRNA Expression in infizierten hCMEC/D3 Zellen mittels quantitativer Echtzeit-Polymerase-Kettenreaktion (RT-qPCR) offenbarte, dass der Anstieg von S1P auf eine erhöhte Expression der S1P-bildenden Sphingosinkinase 1 (SphK1) zurückzuführen war. Die ntikörperbasierte Detektion des Proteins SphK1 oder dessen Phosphorylierung an Serin 225 in den Membranfraktionen von hCMEC/D3 Zellen mittels Western Blot zeigte, dass N. meningitidis außerdem die Phospho-Aktivierung und Membrantranslokation von SphK1 induzierte. Die Plasmamembrantranslokation von SphK1 erhöht die Wahrscheinlichkeit auf das Substrat Sphingosine zu treffen und verstärkt somit die SphK-Aktivität. Die erhöhte SphK-Aktivität zeigte sich auch auf funktioneller Ebene, wie mittels eines ATP-Verbrauchs-Assays zur Messung der SphK-Aktivität nachgewiesen werden konnte. Die Infektion von hCMEC/D3 Zellen mit Pilus-defizienten Mutanten resultierte in einer geringeren SphK-Aktivierung im Vergleich zum Wildtypstamm. Die Behandlung von hCMEC/D3 Zellen mit Pilus-aufgereinigten Fraktionen zeigte eine SphK-Aktivierung, die mit der Aktivierung durch lebende Bakterien vergleichbar war und der Interaktion des Pilus mit der membranproximalen Domäne des zellulären Oberflächenrezeptors CD147 zugeordnet werden konnte. Die Inhibition von SphK1 und SphK2 durch die Vorbehandlung mit spezifischen Inhibitoren oder RNA-Interferenz reduzierte die Aufnahme von N. meningitidis in hCMEC/D3 Zellen, wie mittels Gentamicin Protection Assay nachgewiesen wurde. Das freigesetzte S1P induzierte die Phospho-Aktivierung des epidermalen Wachstumsfaktorrezeptors (EGFR) durch die Aktivierung von S1PR2, welcher während der Infektion vermehrt exprimiert wurde. Die Blockierung von S1PR2 hatte einen präventiven Effekt auf die bakterielle Invasion in hCMEC/D3 Zellen. Im Gegenzug reduzierte die Aktivierung von S1PR1+3 ebenfalls die bakterielle Aufnahme, was auf eine gegensätzliche regulatorische Rolle von S1PR1+3 und S1PR2 während der Aufnahme von N. meningitidis in hCMEC/D3 Zellen hindeutet. Darüber hinaus verhinderte die Inhibition von SphK2 die Expression von inflammatorischen Cytokinen sowie die Freisetzung von Interleukin-8 nach Infektion mit N. meningitidis. Zusammenfassend zeigt diese Arbeit die zentrale Rolle von S1P und den zugehörigen Rezeptoren S1PR1-3 in der Pathophysiologie der durch Meningokokken ausgelösten Meningitis. KW - Blut-Hirn-Schranke KW - Sphingosinkinase KW - Sphingolipide KW - Bakterielle Infektion KW - Sphingosine 1-phosphate KW - Sphingosine 1-phosphate receptor KW - Epidermal growth factor receptor KW - CD147 KW - S1P KW - S1PR KW - Meningococci KW - Basigin KW - EGFR KW - Meningitis cerebrospinalis epidemica KW - Meningitis, Meningococcal Y1 - 2024 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-369764 ER - TY - THES A1 - Baumann, Johannes T1 - Induced Superconductivity in HgTe Quantum Point Contacts T1 - Induzierte Supraleitung in Quecksilbertellurid Quantenpunktkontakten N2 - In this thesis, the Josephson effect in mercury telluride based superconducting quantum point contacts (SQPCs) is studied. Implementing such confined structures into topological superconductors has been proposed as a means to detect and braid Majorana fermions. For the successful realization of such experiments though, coherent transport across the constriction is essential. By demonstrating the Josephson effect in a confined topological system, the presented experiments lay the foundation for future quantum devices that can be used for quantum computation. In addition, the experiments also provide valuable insights into the behavior of the Josephson effect in the low-channel limit (N<20). Due to the confinement of the weak link, we can also study the Josephson effect in a topological insulator, where the edge modes interact. In conclusion, this thesis discusses the fabrication of, and low-temperature measurements on mercury telluride quantum point contacts embedded within Josephson junctions. We find that the merging of the currently used fabrication methods for mercury telluride quantum point contacts and Josephson junctions does not yield a good enough device quality to resolve subbands of the quantum point contact as quantization effects in the transport properties. As we attribute this to the long dry etching time that is necessary for a top-contact, the fabrication process was adapted to reduce the defect density at the superconductor-semiconductor interface. Employing a technique that involves side contacting the mercury telluride quantum well and reducing the size of the mercury telluride mesa to sub-micrometer dimensions yields a quantized supercurrent across the junction. The observed supercurrent per mode is in good agreement with theoretical predictions for ballistic, one-dimensional modes that are longer than the Josephson penetration depth. Moreover, we find that oscillatory features superimpose the plateaus of the supercurrent and the conductance. The strength of these oscillatory features are sample-dependent and complicate the identification of plateaus. We suggest that the oscillatory features originate mainly from local defects and the short gate electrode. Additionally, resonances are promoted within the weak link if the transparency of the superconductor-HgTe interface differs from one. Furthermore, the research explores the regimes of the quantum spin Hall effect and the 0.5 anomaly. Notably, a small yet finite supercurrent is detected in the QSH regime. In samples fabricated from thick mercury telluride quantum wells, the supercurrent appears to vanish when the quantum point contact is tuned into the regime of the 0.5 anomaly. For samples fabricated from thin mercury telluride quantum wells, the conductance as well as the supercurrent vanish for strong depopulation. In these samples though, the supercurrent remains detectable even for conductance values significantly below 2 e²/h. Numerical calculation reproduce the transport behavior of the superconducting quantum point contacts. Additionally, the topological nature of the weak link is thoroughly investigated using the supercurrent diffraction pattern and the absorption of radio frequency photons. The diffraction pattern reveals a gate independent, monotonous decay of $I_\text{sw}(B)$, which is associated with the quantum interference of Andreev bound states funneled through the quantum point contact. Interestingly, the current distribution in the weak link appears unaffected as the quantum point contact is depleted. In the RF measurements, indications of a 4π periodic supercurrent are observed as a suppression of odd Shapiro steps. The ratio of the 4π periodic current to the 2π periodic current appears to decrease for smaller supercurrents, as odd Shapiro steps are exclusively suppressed for large supercurrents. Additionally, considering the observation that the supercurrent is small when the bulk modes in the quantum point contact are fully depleted, we suggest that the re-emerging of odd Shapiro steps is a consequence of the group velocity of the edge modes being significantly suppressed when the bulk modes are absent. Consequently, the topological nature of the superconducting quantum point contact is only noticeable in the transport properties when bulk modes are transmitted through the superconducting quantum point contact. The shown experiments are the first demonstration of mercury telluride superconducting quantum point contacts that exhibit signatures of quantization effects in the conductance as well as the supercurrent. Moreover, the experiments suggest that the regime of interacting topological edge channels is also accessible in mercury telluride superconducting quantum point contacts. This is potentially relevant for the realization of Majorana fermions and their application in the field of quantum computation. N2 - Gegenstand dieser Arbeit ist der Josephson-Effekt in supraleitenden Quantenpunktkontakten (SQPCs) aus Quecksilbertellurid. Grundsätzlich wurde postuliert, dass räumlich eingeschränkte topologische Supraleitung in Quantenpunktkontakten verwendet werden kann, um Majorana-Fermionen zu realisieren und zu manipulieren. Dafür ist allerdings kohärente Supraleitung durch die Verjüngung des Quantenpunktkontaktes unerlässlich. Dies wird durch die Beobachtung des Josephson-Effektes durch den Quecksilbertellurid-Quantenpunktkontakt demonstriert. Somit legen die präsentierten Experimente den Grundstein für zukünftige Quanten-Bauelemente mit Anwendung im Bereich des Quantencomputings. Darüber hinaus liefern die Experimente auch einen Einblick in das Verhalten eines Josephson-Kontaktes, wenn dessen Verbindungsstück nur eine kleinen Anzahl an Transportmoden befördern kann (N<20). Durch die räumliche Nähe der Randkanäle des zwei-dimensionalen topologischen Isolators in der Verjüngung wird außerdem untersucht, wie sich der Josephson-Effekt unter Interaktion der helikalen Randkanäle verhält. Grundsätzlich behandelt diese Arbeit die Herstellung und Vermessung von supraleitenden Quecksilbertellurid-Quantenpunktkontakten, welche in einen Josephson-Kontakt eingebettet sind. Zunächst wird gezeigt, dass bei dem Versuch einen supraleitenden Quecksilbertellurid-Quantenpunktkontakt durch Anwenden der bekannten Fabrikationsprozesse von Quecksilbertellurid-Quantenpunktkontakten und Josephson-Kontakten herzustellen, die Qualität der Probe nicht gut genug ist, um quantisierten Transport durch einzelne Subbänder des Quantenpunktkontaktes aufzuweisen. Dies wird auf das lange Trockenätzen zurückgeführt, welche für einen Kontakt von oben notwendig ist. Daher wurde der Strukturierungsprozess angepasst, um die Defektdichte an dem Supraleiter-Halbleiter-Kontakt zu verringern. Durch das seitliche Kontaktieren des Quecksilbertellurid-Quantentroges und die Verkleinerung der Mesa auf submikrometer Größe, wird ein quantisierter Suprastrom durch den Josepshon-Kontakt beobachtet. Hierbei stimmt der von den Transportmoden getragene Suptrastrom gut mit den theoretischen Vorhersagen für ballistische, eindimensionale Moden überein, wenn deren Modenlänge größer als die Josephson-Eindringtiefe ist. Darüber hinaus wird beobachtet, dass die Stufen im Suprastrom und im Leitwert von Oszillationen überlagert werden. Die Stärke der Oszillationen ist hierbei probenabhängig, was die Identifikation einzelner Stufen erschwert. Die Oszillationen sind auf lokale Defekte und die kurze Gateelektrode zurückzuführen. Zusätzlich entstehen Resonanzen im Verbindungsstück des Josephson-Kontaktes, wenn die Transparenz der Supraleiter-HgTe-Kontaktes von eins abweicht. Des Weiteren werden die Bereiche des Quanten-Spin-Hall-Effektes und der 0.5-Anomalie untersucht. Bemerkenswerterweise wird im Quanten-Spin-Hall-Regime ein kleiner, aber endlicher Suprastrom detektiert. In Proben aus dicken Quecksilbertellurid-Quantentrögen verschwindet der Suprastrom, wenn der Quantenpunktkontakt in das Regime der 0.5-Anomalie gebracht wird. Bei dünnen Quecksilbertellurid-Quantentrögen verschwinden sowohl Leitwert als auch Suprastrom, wenn die Ladungsträgerdichte über das Quanten-Spin-Hall-Regime hinaus verringert wird. In diesen Proben bleibt allerdings der Suprastrom selbst für Leitwerte, die deutlich unter G=2 e²/h liegen, eindeutig erhalten. Das Transportverhalten der supraleitenden Quantenpunktkontakte wird durch numerische Simulationen reproduziert. Letztendlich werden die topologischen Eigenschaften des Verbindungsstückes auch durch das Beugungsbild des Suprastromes und durch die Absorption von RF-Photonen untersucht. Das Beugungsbild des Suprastromes zeigt einen monotonen Abfall von ebendiesem bei ansteigendem Magnetfeld, welcher unabhängig von der angelegten Gatespannung ist. Dieses Verhalten basiert auf Interferenzeffekten von gebundenen Andreev-Zuständen, welche die Verjüngung passieren. Interessanterweise scheint die Stromverteilung in dem Verbindungsstück unverändert zu bleiben, wenn der Quantenpunktkontakt entleert wird. In den RF-Messungen wird mit der Unterdrückung von ungeraden Shapiro-Stufen ein Anzeichen für einen 4\π-periodischen Suprastroms beobachtet. Das Verhältnis des 4π-periodischen Anteils des Suprastroms zum 2π-periodischen Anteil des Suprastroms wird kleiner, wenn der gesamte Suprastrom verringert wird. Demnach sind ungerade Shapiro-Stufen nur für große Supraströme unterdrückt. Wenn man darüber hinaus berücksichtigt, dass der Suprastrom klein ist, wenn die Volumenzustände im Quantenpunktkontakt entleert sind, liegt es nahe, dass das Wiederauftreten der ungeraden Shapiro-Stufen eine Konsequenz daraus ist, dass die Gruppengeschwindigkeit der helikalen Randkanäle unter Abwesenheit von Volumenzuständen deutlich verringert ist. Demzufolge sind die topologischen Eigenschaften des Verbindungsstückes nur bemerkbar, wenn auch Volumenzustände die Verjüngung passieren. Die gezeigten Experimente sind der erste Nachweis von supraleitenden Quantenpunktkontakten im zwei-dimensionalen topologischen Isolator Quecksilbertellurid, welche Kennzeichen von Quantisierungseffekte sowohl im Leitwert als auch im Suprastrom aufzeigen. Darüber hinaus implizieren die Experimente, dass der Bereich von interagierenden topologischen Randkanälen auch in supraleitenden Quecksilbertellurid-Quantenpunktkontakten zugänglich ist. Dies hat potenziell Relevanz für die Realisierung von Majorana-Fermionen in vergleichbaren Systemen und deren Anwendung im Bereich des Quantencomputing. KW - Topologischer Isolator KW - Supraleitung KW - Quecksilbertellurid KW - Niederdimensionaler Halbleiter KW - Topologische Supraleitung KW - Topological superconductivity KW - HgTe Y1 - 2024 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-369405 ER - TY - THES A1 - Gamboa Vargas, Juan Fernando T1 - Receptors of the TNFSF in the biology and regulation of Tregs T1 - Rezeptoren der TNFSF in der Biologie und Regulation von regulatorischen T-Zellen N2 - In this work we expanded upon a study from our group where a ligand-based TNF-α mutein was developed to engage specifically TNFR2 and not TNFR1 activating Tregs and expanding them, which in an allo-HCT context conferred protection from GvHD. Fusing TNF trimers to the heavy chain of an Fc-dead and mouse irrelevant antibody, a new generation of this agonist was developed called NewSTAR2. It is believed that other members of the TNFSF can also target Tregs, therefore additional agonists against DR3 and GITR were developed under the same principles as for NewSTAR2. Phenotyping analysis of the expression of these three receptors were done to confirm their specificity for Tregs before in vitro and in vivo testings with mice or murine splenic cells. A potent expansion of Tregs was seen with NewSTAR2 and the other agonists as well as upregulation of activation markers on Tregs. Thorough analyses with NewSTAR2-treated mice showed how Tregs in several immune and non-immune organs were expanded and upregulated immunomodulatory receptors. A miniature suppressive assay and other cocultures with responder cells confirmed their enhanced suppression over unstimulated Tregs through contact dependent and independent mechanisms. Despite other myeloid cells also being increased after treatment, no undesired effects were observed under steady-state and prophylactic administration of a single dose of NewSTAR2 improved survival frequencies and lessened development of clinical symptoms. Prophylactic treatment with the other TNFRSF agonists showed similar protection yet Fc(DANA)-muTL1A was superior in in terms of less death events and lower clinical score. It was found that not all the three TNFSF members have redundant functions as development of skin lesions was observed with GITRL-based agonist Fc(DANA)-muGITRL, although its expansion of Tregs in steady-state was remarkable with no apparent adverse effects. Neither agonist had an impact on donor cell engraftment or allorective T cell response, however NewSTAR2-treatmend proved to reduce inflammation in small intestine and liver. This work is proof of concept of the effectivity of selectively engaging TNFSF to activate Tregs and expand them systemically allowing them to control strong and complex immune interactions like those governing GvHD. N2 - In dieser Arbeit erweiterten wir eine Studie unserer Gruppe, in der ein ligandenbasiertes TNF-α-Mutein entwickelt wurde, um spezifisch TNFR2 und nicht TNFR1 zu aktivieren und Tregs zu erweitern, was in einem allo-HCT-Kontext Schutz vor GvHD verlieh. Durch die Fusion von TNF-Trimeren mit der schweren Kette eines Fc-toten und Maus-irrelevanten Antikörpers wurde eine neue Generation dieses Agonisten namens NewSTAR2 entwickelt. Es wird angenommen, dass andere Mitglieder des TNFSF ebenfalls auf Tregs abzielen können. Daher wurden zusätzliche Agonisten gegen DR3 und GITR nach denselben Prinzipien wie für NewSTAR2 entwickelt. Eine phänotypische Analyse der Expression dieser drei Rezeptoren wurde durchgeführt, um ihre Spezifität für Tregs vor In-vitro- und In-vivo-Tests mit Mäusen oder murinen Milzzellen zu bestätigen. Bei NewSTAR2 und den anderen Agonisten wurde eine starke Expansion der Tregs sowie eine Hochregulierung der Aktivierungsmarker auf Tregs beobachtet. Gründliche Analysen mit NewSTAR2-behandelten Mäusen zeigten, wie Tregs in mehreren Immun- und Nichtimmunorganen erweitert und immunmodulatorische Rezeptoren hochreguliert wurden. Ein Miniatur-Suppressionstest und andere Kokulturen mit Responderzellen bestätigten deren verstärkte Unterdrückung nicht stimulierter Tregs durch kontaktabhängige und unabhängige Mechanismen. Obwohl auch andere myeloische Zellen nach der Behandlung zunahmen, wurden unter der Steady-State- und prophylaktischen Verabreichung einer Einzeldosis NewSTAR2 keine unerwünschten Wirkungen beobachtet, was die Überlebenshäufigkeit verbesserte und die Entwicklung klinischer Symptome verringerte. Die prophylaktische Behandlung mit den anderen TNFRSF-Agonisten zeigte einen ähnlichen Schutz, Fc(DANA)-muTL1A war jedoch in Bezug auf weniger Todesereignisse und einen niedrigeren klinischen Score überlegen. Es wurde festgestellt, dass nicht alle drei TNFSF-Mitglieder über redundante Funktionen verfügen, da die Entwicklung von Hautläsionen mit dem GITRL-basierten Agonisten Fc(DANA)-muGITRL beobachtet wurde, obwohl die Expansion der Tregs im Steady-State bemerkenswert war und keine offensichtlichen nachteiligen Auswirkungen auftrat. Keiner der beiden Agonisten hatte einen Einfluss auf die Transplantation von Spenderzellen oder die allorektive T-Zell-Reaktion, allerdings reduzierte die NewSTAR2-Behandlung nachweislich Entzündungen im Dünndarm und in der Leber. Diese Arbeit ist ein Beweis für die Wirksamkeit der selektiven Aktivierung von TNFSF, um Tregs zu aktivieren und sie systemisch zu erweitern, sodass sie starke und komplexe Immuninteraktionen steuern können, wie sie GvHD steuern. KW - Regulatorischer T-Lymphozyt KW - Transplantat-Wirt-Reaktion KW - Tumor-Nekrose-Faktor KW - TNFRSF KW - Regulatory T cells KW - Graft versus host disease KW - Tumornekrosefaktor Rezeptor-Superfamilie KW - Regulatorische T-Zellen KW - Transplantat-gegen-Wirt-Reaktion Y1 - 2024 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-369801 ER - TY - THES A1 - van Dorp, Joel T1 - Site-specific biomolecule modification for directed surface attachment T1 - Ortsspezifische Biomolekülmodifikation zur gezielten Oberflächenanbindung N2 - Site-directed bioorthogonal conjugation techniques have substantially advanced research in numerous areas. Their exceptional value reflects in the extent of applications, that have been realized with spacial-controlled bioorthogonal reactions. Specific labeling of surfaces, proteins, and other biomolecule allows for new generations of drug delivery, tracking, and analyzing systems. With the continuous advance and refinement of available methods, this field of research will become even more relevant in the time to come. Yet, as individual as the desired purpose is, as different can be the most suitable modification strategy. In this thesis, two different bioconjugation approaches, namely CuAAC and factor XIIIa mediated ligation, are used in distinct application fields, featuring eGFP as a model protein showcasing the advantages as well as the challenges of each technique. The introduction of a unique accessible functionality is the most critical feature of a site-specific reaction, and the first considerable hurdle to clear. While most surfaces, peptides, or small molecules might require less expenditure to modulate, equipping large biomolecules like proteins with additional traits requires careful consideration to preserve the molecule’s stability and function. Therefore, the first section of this project comprises the engineering of eGFP via rational design. Initially, wild-type eGFP was subcloned, expressed, and characterized to serve as a reference value for the designed variants. Subsequently, eGFP was mutated and expressed to display a recognition site for factor XIIIa. Additionally, a second mutant harbored a TAG-codon to enable amber codon suppression and consequently the incorporation of the alkyne bearing unnatural amino acid Plk to support a CuAAC reaction. Fluorescence spectroscopy was used to confirm that the fluorescent properties of all expressed muteins were identically equal to wild-type eGFP, which is a reliable marker for the intact barrel structure of the protein. Trypsin digestion and HPLC were deployed to confirm each protein variant's correct sequence and mass. The second part of this work focuses on the conjugation of cargo molecules deploying the chosen approaches. Solid-phase peptide synthesis was used to create a peptide that served as a lysine donor substrate in the crosslinking mechanism of FXIIIa. Additionally, the peptide was provided with a cysteine moiety to allow for highly flexible and simple loading of desired cargo molecules via conventional thiol-Michael addition, thus establishing an adaptive labeling platform. The effective ligation was critically reviewed and confirmed by monitoring the exact mass changes by HPLC. Protocols for attaching payloads such as biotin and PEG to the linker peptide were elaborated. While the biotin construct was successfully conjugated to the model protein, the eGFP-PEG linkage was not achieved judging by SDS-PAGE analysis. Furthermore, featuring isolated peptide sequences, the properties of the FXIIIa-mediated reaction were characterized in detail. Relative substrate turnover, saturation concentrations, by-product formation, and incubation time were comprehensively analyzed through HPLC to identify optimal reaction conditions. CuAAC was successfully used to label the Plk-eGFP mutein with Azide-biotin, demonstrated by western blot imaging. Within the last part of this study, the application of the conjugation systems was extended to different surfaces. As regular surfaces do not allow for immediate decoration, supplementary functionalization techniques like gold-thiol interaction and silanization on metal oxides were deployed. That way gold-segmented nanowires and Janus particles were loaded with enoxaparin and DNA, respectively. Nickel and cobalt nanowires were modified with silanes that served as linker molecules for subsequent small molecule attachment or PEGylation. Finally, the eGFP muteins were bound to a particle surface in a site-specific manner. Beads displaying amino groups were utilized to demonstrate the effective use of FXIIIa in surface modification. Moreover, the bead’s functional moieties were converted to azides to enable CuAAC “Click Chemistry” and direct comparison. Each modification was analyzed and confirmed through fluorescence microscopy. N2 - Techniken zur ortsspezifischen bioorthogonalen Konjugation von Biomolekülen haben die Forschung in zahlreichen Bereichen erheblich vorangebracht. Ihr außerordentlicher Wert spiegelt sich in der Vielzahl der Anwendungen wider, die mit bioorthogonalen Reaktionen realisiert werden konnten. Die kontrollierte Bestückung von Oberflächen, Proteinen und anderen Biomolekülen ermöglicht neue Generationen von Systemen zur Arzneimittelapplikation als auch zu Tracking- und Analyseverfahren. Mit der kontinuierlichen Weiterentwicklung und Verfeinerung der verfügbaren Methoden wird dieses Forschungsgebiet in Zukunft noch mehr an Bedeutung gewinnen. Doch so individuell wie der gewünschte Zweck ist, so unterschiedlich kann auch die am besten geeignete Modifikationsstrategie sein. In dieser Arbeit werden zwei verschiedene Biokonjugationsansätze, nämlich CuAAC und Faktor-XIIIa-vermittelte Ligation, in unterschiedlichen Anwendungsbereichen eingesetzt, wobei eGFP als Modellprotein dient, um sowohl die Vorteile als auch die Herausforderungen der jeweiligen Technik aufzuzeigen. Die Einführung einer genau abgrenzbaren Funktionalität ist das wichtigste Merkmal einer ortsspezifischen Reaktion und die erste große Hürde, die es zu nehmen gilt. Während die meisten Oberflächen, Peptide oder kleinen Moleküle mit geringem Aufwand moduliert werden können, erfordert das Ausstatten von Proteinen mit zusätzlichen Merkmalen sorgfältige Überlegung und weitreichende Kenntnis, um die Stabilität und Funktion der Molekülstruktur zu erhalten. Der erste Abschnitt dieses Projekts umfasst daher das Protein-Engineering von eGFP durch rationales Design. Zunächst wurde der Wildtyp von eGFP subkloniert, exprimiert und charakterisiert, um als Referenzwert für die entworfenen Varianten zu dienen. Anschließend wurde eGFP so mutiert und exprimiert, dass es eine Erkennungsstelle für Faktor XIIIa aufweist. Zusätzlich enthielt eine zweite Mutante ein TAG-Codon, um die Unterdrückung des Amber-Codons und damit den Einbau der Alkin-tragenden unnatürlichen Aminosäure Plk zu ermöglichen, um wiederum eine CuAAC-Reaktion zu unterstützen. Mit Hilfe von Fluoreszenzspektroskopie wurde bestätigt, dass die Fluoreszenzeigenschaften aller exprimierten Muteine identisch mit denen des Wildtyps eGFP sind, was ein zuverlässiger Marker für die intakte Barrel-Struktur des Proteins ist. Trypsinverdau und HPLC wurden eingesetzt, um die korrekte Sequenz und Masse der einzelnen Proteinvarianten zu bestätigen. Der zweite Teil dieser Arbeit konzentriert sich auf die Konjugation von „Cargo-Molekülen“ unter Verwendung der gewählten Ansätze. Mittels Festphasen-Peptidsynthese wurde ein Peptid hergestellt, das als Lysin-Donor-Substrat im Vernetzungsmechanismus von FXIIIa diente. Zusätzlich wurde das Peptid mit einem Cystein-Element versehen, um eine hochflexible und einfache Beladung mit gewünschten Frachtmolekülen durch konventionelle Thiol-Michael-Addition zu ermöglichen und so eine adaptive Koppelungsplattform zu schaffen. Die effektive Ligation wurde durch die Überwachung der genauen Massenänderungen mittels HPLC kritisch überprüft und bestätigt. Es wurden Protokolle für die Anbringung von Nutzlasten wie Biotin und PEG an das Linker-Peptid ausgearbeitet. Während das Biotin-Konstrukt erfolgreich an das Modellprotein konjugiert wurde, konnte die eGFP-PEG-Bindung nach Auswertung der SDS-PAGE-Analyse nicht erreicht werden. Darüber hinaus wurden anhand der isolierten Peptidsequenzen die Eigenschaften der FXIIIa-vermittelten Reaktion im Detail charakterisiert. Relativer Substratumsatz, Sättigungskonzentrationen, Nebenproduktbildung und Inkubationszeit wurden mittels HPLC umfassend analysiert, um optimale Reaktionsbedingungen zu ermitteln. CuAAC wurde erfolgreich zur Markierung des Plk-eGFP-Muteins mit Azid-Biotin eingesetzt, was durch Western-Blot-Darstellung nachgewiesen wurde. Im letzten Teil dieser Arbeit wurde die Anwendung der Konjugationssysteme auf verschiedene Oberflächen übertragen. Da normale Oberflächen keine unmittelbare Dekoration erlauben, wurden zusätzliche Funktionalisierungstechniken wie Gold-Thiol-Wechselwirkung und Silanisierung auf Metalloxiden eingesetzt. Auf diese Weise wurden goldsegmentierte Nanowires und Januspartikel mit Enoxaparin bzw. DNA beladen. Nickel- und Kobalt-Nanowires wurden mit Silanen modifiziert, die als Verbindungsmoleküle für die anschließende Anlagerung kleiner Moleküle oder PEGylierung dienten. Schließlich wurden die eGFP-Muteine ortsspezifisch an eine Partikeloberfläche gebunden. Beads mit Aminogruppen wurden verwendet, um den effektiven Einsatz von FXIIIa bei der Oberflächenmodifikation zu demonstrieren. Darüber hinaus wurden die funktionellen Einheiten der Beads in Azide umgewandelt, um eine CuAAC-„Klickchemie" und somit einen direkten Vergleich zu ermöglichen. Jede Modifikation wurde mit Hilfe der Fluoreszenzmikroskopie analysiert und bestätigt. KW - Proteinglutamin-Glutamyltransferase KW - Click-Chemie KW - Rekombinantes Protein KW - Nanodraht KW - Bioengineering KW - Surface modification KW - Site-specific modification KW - CuAAC Y1 - 2024 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-369536 ER - TY - THES A1 - Zimmermann, Sebastian Andres T1 - Drug Monitoring of Kinase Inhibitors in the Context of Precision Medicine – Focus on Minimally Invasive Microsampling T1 - Arzneistoffspiegelmessung von Kinaseinhibitoren im Kontext der Präzisionsmedizin – Fokus auf minimalinvasives Mikrosampling N2 - The aim of the present work was to improve drug monitoring in patients with various diseases in the context of precision medicine. This was pursued through the development and validation of mass spectrometric methods for determining the drug concentrations of kinase inhibitors and their clinical application. Besides conventional approaches to determine plasma level concentrations, the focus was also on alternative sampling techniques using volumetric absorptive microsampling (VAMS). A conventional LC-MS/MS method was developed for the determination of cabozantinib in human EDTA plasma and validated according to the guidelines of the European and United States drug authorities (EMA, FDA). The method met the required criteria for linearity, accuracy and precision, selectivity, sensitivity, and stability of the analyte. Validation was also performed for dilution integrity, matrix effect, recovery, and carry-over, with results also in accordance with the requirements. The importance of monitoring the exposure of cabozantinib was demonstrated by a clinical case report of a 34-year-old female patient with advanced adrenocortical carcinoma who also required hemodialysis due to chronic kidney failure. Expected cabozantinib plasma concentrations were simulated for this off-label use based on a population pharmacokinetic model. It was shown that the steady state trough levels were much lower than expected but could not be explained by hemodialysis. Considering the critical condition and potential drug-drug interaction with metyrapone, a substance the patient had taken among several others during the observation period, individual pharmacokinetics could consequently not be estimated without drug monitoring. In addition, a VAMS method for simultaneous determination of ten kinase inhibitors from capillary blood was developed. This microsampling technique was mainly characterized by the collection of a defined volume of blood, which could be dried and subsequently analyzed. The guidelines for bioanalytical method validation of the EMA and FDA were also used for this evaluation. As the nature of dried blood samples differs from liquid matrices, further parameters were investigated. These include the investigation of the hematocrit effect, process efficiency, and various stability conditions, for example at increased storage temperatures. The validation showed that the developed method is suitable to analyze dried matrix samples accurate, precise, and selective for all analytes. Apart from the stability tests, all acceptance criteria were met. The decreased stability of two analytes was probably due to the reproducible but reduced recovery. In vitro studies provided results on the VAMS-to-plasma correlation to predict the analyte distribution between both matrices, at least in an exploratory manner. It revealed a heterogeneous picture of analytes with different VAMS-to-plasma distributions. Furthermore, the analysis of 24 patient samples indicated the applicability of at-home VAMS. Both should be confirmed later as part of the clinical validation. The clinical investigation of the VAMS method pursued two objectives. On the one hand, the simultaneous collection of VAMS and serum samples should enable a conversion of the determined concentrations and, on the other hand, the feasibility of autonomous microsampling at home should be examined more closely. For the former, it could be shown that different conversion methods are suitable for converting VAMS concentrations into serum levels. The type of conversion was secondary for the prediction. However, the previously defined criteria could not be fulfilled for all five kinase inhibitors investigated. The framework conditions of the study led to increased variability, especially for analytes with short half-life. A low and varying hematocrit, caused by the underlying disease, also made prediction difficult for a specific patient collective. For the second objective, investigating the feasibility of VAMS, different aspects were considered. It could be shown that the majority of patients support home-based microsampling. The acceptance is likely to increase even further when microsampling is no longer part of a non-interventional study, but participation is accompanied by targeted monitoring and subsequent adjustment of the therapy. The fact that additional training increases understanding of the correct sampling procedure is also a source of confidence. Demonstrated stability during storage under real-life conditions underlines the practicality of this sampling technique. Taken together, mass spectrometric methods for both plasma and VAMS could be developed and validated, and their clinical application could be successfully demonstrated. The availability of simple bioanalytical methods to determine kinase inhibitor exposure could improve access to prospective studies and thus facilitate the implementation of routine therapeutic drug monitoring. N2 - Ziel der vorliegenden Arbeit war es, den Einsatz des Drug Monitorings bei Patienten mit verschiedenen Erkrankungen im Rahmen der Präzisionsmedizin zu erleichtern. Dies wurde durch die Entwicklung und Validierung massenspektrometrischer Methoden zur Bestimmung der Wirkstoffkonzentrationen von Kinaseinhibitoren und deren klinische Anwendung verfolgt. Dabei standen neben konventionellen Ansätzen zur Bestimmung der Plasmaspiegelkonzentration auch alternative Entnahmetechniken in Form von „Volumetric Absorptive Microsampling (VAMS)“ im Mittelpunkt. Eine solche konventionelle LC-MS/MS-Methode wurde zur Bestimmung von Cabozantinib in humanem EDTA-Plasma entwickelt und nach den Richtlinien der europäischen und US-amerikanischen Arzneimittelbehörden (EMA, FDA) validiert. Die Methode erfüllte die geforderten Kriterien bezüglich Linearität, Richtigkeit und Präzision, Selektivität, Sensitivität und Stabilität des Analyten. Die Validierung erfolgte auch hinsichtlich Verdünnungsintegrität, Matrixeffekt, Wiederfindung, und Analyt-Verschleppung, deren Ergebnisse ebenso in Übereinstimmung mit den Vorgaben standen. Die Bedeutung der Expositionsüberwachung von Cabozantinib wurde anhand eines klinischen Fallberichts einer 34-jährigen Patientin mit fortgeschrittenem Nebennierenrindenkarzinom, die aufgrund chronischen Nierenversagens zudem dialysepflichtig war, gezeigt. Die erwartbaren Cabozantinib-Plasmakonzentrationen wurden für diesen Off-Label-Use basierend auf einem populations-pharmakokinetischen Modell simuliert. Es zeigte sich, dass die Steady-State-Talspiegel wesentlich niedriger waren als angenommen, sich aber nicht durch die Hämodialyse erklären ließen. Unter Berücksichtigung des kritischen Gesundheitszustandes und möglicher Arzneimittelinteraktionen mit Metyrapon, einer Substanz, die die Patientin neben einigen anderen während des Beobachtungszeitraums eingenommen hatte, konnte die individuelle Pharmakokinetik folglich nicht ohne Arzneistoffspiegelmessung abgeschätzt werden. Darüber hinaus konnte eine VAMS-Methode zur simultanen Bestimmung von zehn Kinaseinhibitoren aus Kapillarblut entwickelt werden. Dieses Mikrosampling-Verfahren zeichnete sich vor allem durch die Entnahme eines definierten Blutvolumens aus, welches getrocknet und anschließend analysiert werden konnte. Auch hierbei wurden die Richtlinien für bioanalytische Methodenvalidierung der EMA und FDA zur Beurteilung herangezogen. Da sich die Beschaffenheit der Trockenblutproben von flüssigen Matrices unterscheidet, wurden weitere Einflussfaktoren untersucht. Dazu gehören die Untersuchung des Hämatokrit-Effekts, der Prozesseffizienz und verschiedener Stabilitätsbedingungen, zum Beispiel bei erhöhten Lagertemperaturen. Die Validierung zeigte, dass die entwickelte Methode in der Lage ist Trockenmatrixproben für alle Analyten richtig, präzise und selektiv zu messen. Von den Stabilitätsuntersuchungen abgesehen wurden alle Akzeptanzkriterien erfüllt. Die verminderte Stabilität von zwei Analyten ist vermutlich durch die zwar reproduzierbare, aber geringere Wiederfindungsrate zu begründen. In vitro Untersuchungen lieferten Ergebnisse über die VAMS-zu-Plasma-Korrelation, um die Analytverteilung zwischen beiden Matrizes zumindest exploratorisch vorherzusagen. Dabei zeigte sich ein heterogenes Bild von Analyten mit unterschiedlicher VAMS-zu-Plasma-Verteilung. Darüber hinaus zeigten die Messungen von 24 Patientenproben die Anwendbarkeit von VAMS im häuslichen Umfeld. Beides sollte später im Rahmen der klinischen Validierung bestätigt werden. Die klinische Untersuchung der VAMS-Methode verfolgte zweierlei Ziele. Zum einen sollte durch die zeitgleiche Entnahme von VAMS und Serumproben eine Umrechnung der ermittelten Konzentrationen ermöglicht und zum anderen die Durchführbarkeit der eigenständigen Mikroprobenentnahme zuhause genauer überprüft werden. Für Ersteres konnte gezeigt werden, dass verschiedene Umrechnungsmethoden geeignet sind, VAMS-Konzentrationen in Serumspiegel umzurechnen. Die Art der Umrechnung war für die Vorhersage zweitrangig. Allerdings konnten nicht für alle fünf untersuchten Kinaseinhibitoren die zuvor festgelegten Kriterien erfüllt werden. Die Rahmenbedingungen der Studie führten vor allem bei Analyten mit geringer Halbwertszeit zu einer erhöhten Variabilität. Ein geringer und schwankender Hämatokritwert, bedingt durch die zugrundeliegende Erkrankung, erschwerte zudem die Vorhersage bei einem bestimmten Patientenkollektiv. Für das zweite Ziel, die Durchführbarkeit von VAMS zu untersuchen, wurden verschiedene Aspekte betrachtet. Es konnte gezeigt werden, dass die Mehrheit der Patienten die häusliche Mikroprobenentnahme befürwortet. Die Akzeptanz dürfte sogar noch weiter steigen, wenn die Mikroprobenentnahme nicht mehr nur Teil einer nicht-interventionellen Studie ist, sondern die Teilnahme mit einer gezielten Überwachung und anschließenden Anpassung der Therapie einhergeht. Zuversichtlich stimmte auch die Tatsache, dass ein zusätzliches Training das Verständnis für die korrekte Durchführung erhöht. Dass sich die Stabilität auch bei der Lagerung unter Realbedingungen zeigen ließ, unterstreicht die Praxistauglichkeit dieser Sampling-Technik. Insgesamt konnten sowohl für Plasma als auch VAMS massenspektrometrische Methoden entwickelt, validiert und deren klinische Anwendung erfolgreich demonstriert werden. Die Verfügbarkeit von simplen bioanalytischen Methoden zur Bestimmung der Kinaseinhibitor-Exposition könnte den Zugang zu prospektiven Studien und damit die Einführung von routinemäßigem Therapeutischen Drug Monitoring erleichtern. KW - Arzneimittelüberwachung KW - Blutspiegel KW - Klinische Pharmazie KW - Kinaseinhibitor KW - Therapeutisches Drug Monitoring KW - TDM KW - Precision medicine KW - Volumetric absorptive microsampling KW - VAMS Y1 - 2024 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-369550 ER - TY - THES A1 - Diehl, Janina Marie Christin T1 - Ecology and evolution of symbiont management in ambrosia beetles T1 - Ökologie und Evolution des Symbiontenmanagements bei Ambrosiakäfern N2 - The relationship between a farmer and their cultivated crops in agriculture is multifaceted, with pathogens affecting both the farmer and crop, and weeds that take advantage of resources provided by farmers. For my doctoral thesis, I aimed to gain a comprehensive understanding of the ecology and symbiosis of fungus farming ambrosia beetles. Through my research, I discovered that the microbial composition of fungus gardens, particularly the mutualists, is significantly influenced by the presence of both adults and larvae. The recognition of both beneficial and harmful symbionts is crucial for the success of ambrosia beetles, who respond differently depending on their life stage and the microbial species they encounter, which can contribute to the division of labour among family groups. The presence of antagonists and pathogens in the fungus garden depends on habitat and substrate quality, and beetle response to their introduction results in behavioural and developmental changes. Individual and social immunity measures, as well as changes in bacterial and fungal communities, were detected as a result of pathogen introduction. Additionally, the ability of ambrosia beetles to establish two nutritional fungal species depends on several factors. These insects must strike a balance between their essential functions and adapt to the constantly changing ecological and social conditions, which demonstrates their adaptive flexibility. However, interpreting data from laboratory studies should be approached with caution, as the natural environment allows for more flexibility and the potential for other beneficial symbionts to become more prominent if required. To aid in my research, I designed primers that use the ‘fungal large subunit’ (LSU) as genetic marker to identify and differentiate mutualistic and antagonistic fungi in X. saxesenii. The primers were able to distinguish closely related species of the Ophiostomataceae and other fungal symbionts. This allowed me to associate the abundance of key fungal taxa with factors such as the presence of beetles, the nest's age and condition, and the various developmental stages present. My primers are a valuable tool for understanding fungal communities, including their composition and the identification of previously unknown functional symbionts. However, some aspects should be approached with caution due to the exclusion of non-amplified taxa in the relative fungal community compositions. N2 - Die Beziehung zwischen einem Landwirt und der von ihm angebauten Nahrung in der Landwirtschaft ist vielschichtig: Pathogene, die sowohl den Landwirt als auch die Pflanzen befallen, und Unkräuter, die sich die von Landwirten bereitgestellten Ressourcen zunutzen machen. In meiner Doktorarbeit wollte ich ein umfassendes Verständnis der Ökologie und der Symbiose von pilzzüchtenden Ambrosiakäfern erlangen. Im Rahmen meiner Forschung fand ich heraus, dass die mikrobielle Zusammensetzung von Pilzgärten, insbesondere der Mutualisten, durch die Anwesenheit sowohl der erwachsenen Tiere als auch der Larven erheblich beeinflusst wird. Die Erkennung sowohl nützlicher als auch schädlicher Symbionten ist entscheidend für den Erfolg der Ambrosiakäfer, die je nach Lebensstadium und den angetroffenen Mikrobenarten unterschiedlich reagieren, was zur Arbeitsteilung zwischen Familiengruppen beitragen kann. Das Vorhandensein von Antagonisten und Krankheitserregern im Pilzgarten hängt von der Qualität des Lebensraums und des Substrats ab, und die Reaktion der Käfer auf ihre Einschleppung führt zu Veränderungen im Verhalten und in der Entwicklung. Individuelle und soziale Immunitätsmaßnahmen sowie Veränderungen der Bakterien- und Pilzgemeinschaften wurden als Folge der Einführung von Krankheitserregern festgestellt. Darüber hinaus hängt die Fähigkeit von Ambrosiakäfern, zwei Nährpilzarten zu etablieren, von mehreren Faktoren ab. Diese Insekten müssen ein Gleichgewicht zwischen ihren lebenswichtigen Funktionen herstellen und sich an die ständig ändernden ökologischen und sozialen Bedingungen anpassen, was ihre Anpassungsfähigkeit zeigt. Bei der Interpretation von Daten aus Laborstudien ist jedoch Vorsicht geboten, da die natürliche Umgebung mehr Flexibilität zulässt und die Möglichkeit bietet, dass andere nützliche Symbionten bei Bedarf stärker in Erscheinung treten. Um meine Forschung zu unterstützen, habe ich Primer entwickelt, die die ‘fungal large subunit‘ (LSU) als genetischen Marker verwenden, um mutualistische und antagonistische Pilze in X. saxesenii zu identifizieren und zu unterscheiden. Die Primer waren in der Lage, eng verwandte Arten der Ophiostomataceae und andere Pilzsymbionten zu unterscheiden. Auf diese Weise konnte ich die Häufigkeit der wichtigsten Pilztaxa mit Faktoren wie dem Vorhandensein von Käfern, dem Alter und Zustand des Nests und den verschiedenen Entwicklungsstadien in Verbindung bringen. Meine Primer sind ein wertvolles Instrument für das Verständnis von Pilzgemeinschaften, einschließlich ihrer Zusammensetzung und der Identifizierung von bisher unbekannten funktionellen Symbionten. Einige Aspekte sind jedoch mit Vorsicht zu genießen, da nicht amplifizierte Taxa in den relativen Zusammensetzungen der Pilzgemeinschaften nicht berücksichtigt werden. KW - ambrosia beetles KW - symbiont management KW - amplicon sequencing KW - fungus farming KW - microbial communities KW - social behaviour KW - Ökologie KW - Evolution Y1 - 2024 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-321213 ER - TY - THES A1 - Mathew-Schmitt, Sanjana T1 - Development of blood-brain barrier spheroid models based on human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) and investigation of shear stress on hiPSC-derived brain capillary endothelial-like cells T1 - Entwicklung von Sphäroid-Modellen der Blut-Hirn-Schranke basierend auf menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen (hiPSCs) und Untersuchung der Scherbeanspruchung von hiPSC-abgeleiteten Hirnkapillarendothel-ähnlichen Zellen N2 - A highly regulated microenvironment is essential in maintaining normal functioning of the central nervous system (CNS). The existence of a biological barrier, termed as the blood-brain barrier (BBB), at the blood to brain interface effectively allows for selective passage of substances and pathogens into the brain (Kadry, Noorani et al. 2020). The BBB chiefly serves in protecting the brain from extrinsic toxin entry and pathogen invasions. The BBB is formed mainly by brain capillary endothelial cells (BCECs) which are responsible for excluding ∼ 100% of large-molecule neurotherapeutics and more than 98% of all small-molecule drugs from entry into the brain. Minimal BBB transport of major potential CNS drugs allows for attenuated effective treatments for majority of CNS disorders (Appelt-Menzel, Oerter et al. 2020). Animals are generally used as model systems to study neurotherapeutic delivery into the brain, however due to species based disparity, experimental animal models lead to several false positive or false negative drug efficacy predictions thereby being unable to fully predict effects in humans (Ruck, Bittner et al. 2015). An example being that over the last two decades, much of the studies involving animals lead to high failure rates in drug development with ~ 97% failure in cancers and ~ 99% failure for Alzheimer´s disease (Pound 2020). Widespead failures in clinical trials associated with neurological disorders have resulted in questions on whether existing preclinical animal models are genuinely reflective of the human condition (Bhalerao, Sivandzade et al. 2020). Apart from high failure rates in humans, the costs for animal testings is extremely high. According to the Organisation for Economic Co-operation and Development (OECD), responsible for determining animal testing guidelines and methodology for government, industry, and independent laboratories the average cost of a single two-generation reproductive animal toxicity study worldwide is 318,295 € and for Europe alone is ~ 285,842 € (Van Norman 2019). Due to these reasons two separate movements exist within the scientific world, one being to improve animal research and the other to promote new approach methodologies with the European government setting 2025 - 2035 as a deadline for gradually disposing the use of animals in pharmaceutical testing (Pound 2020). The discovery of human induced pluripotent stem cell (hiPSC) technology in 2006 (Takahashi and Yamanaka 2006, Takahashi, Tanabe et al. 2007) revolutionized the field of drug discovery in-vitro. HiPSCs can be differentiated into various tissue types that mimic disease phenotypes, thereby offering the possibility to deliver humanized in-vitro test systems. With respect to the BBB, several strategies to differentiate hiPSCs to BCECs (iBCECs) are reported over the years (Appelt-Menzel, Oerter et al. 2020). However, iBCECs are said to possess an epithelial or undifferentiated phenotype causing incongruity in BBB lineage specifications (Lippmann, 7 Azarin et al. 2020). Therefore, in order to identify a reliable differentiation strategy in deriving iBCECs possessing hallmark BBB characteristics, which can be used for downstream applications, the work in this thesis compared two methods, namely the co-differentiation (CD) and the directed differentiation (DD). Briefly, CD mimics a brain like niche environment for iBCEC specification (Lippmann, Al-Ahmad et al. 2014), while DD focuses on induction of the mesoderm followed by iBCEC specification (Qian, Maguire et al. 2017). The results obtained verified that while iBCECs derived via CD, in comparison to human BCEC cell line hCMEC/D3 showed the presence of epithelial transcripts such as E-Cadherin (CDH1), and gene level downregulation of endothelial specific platelet endothelial cell adhesion molecule-1 (PECAM-1) and VE-cadherin (CDH5) but demonstrated higher barrier integrity. The CD strategy essentially presented iBCECs with a mean trans-endothelial electrical resistance (TEER) of ~ 2000 – 2500 Ω*cm2 and low permeability coefficients (PC) of < 0.50 μm/min for small molecule transport of sodium fluorescein (NaF) and characteristic BCEC tight junction (TJ) protein expression of claudin-5 and occludin. Additionally, iBCECs derived via CD did not form tubes in response to angiogenic stimuli. DD on the other hand resulted in iBCECs with similar down regulations in PECAM-1 and CDH5 gene expression. They were additionally characterized by lower barrier integrity, measured by mean TEER of only ~ 250 – 450 Ω*cm2 and high PC of > 5 μm/min in small molecule transport of NaF. Although iBCECs derived via DD formed tubes in response to angiogenic stimuli, they did not show positive protein expression of characteristic BCEC TJs such as claudin-5 and occludin. These results led to the hypothesis that maturity and lineage specification of iBCECs could be improved by incorporating in-vivo like characteristics in-vitro, such as direct co-culture with neurovascular unit (NVU) cell types via spheroid formation and by induction of shear stress and fluid flow. In comparison to standard iBCEC transwell mono-cultures, BBB spheroids showed enhanced transcript expression of PECAM-1 and reduced expression of epithelial markers such as CDH1 and claudin-6 (CLDN6). BBB spheroids showed classical BCEC-like ultrastructure that was identified by TJ particles on the protoplasmic face (P-face) and exoplasmic face (E-face) of the plasma membrane. TJ strands were organized as particles and particle-free grooves on the E-face, while on the P-face, partly beaded particles and partly continuous strands were identified. BBB spheroids also showed positive protein expression of claudin-5, VE-cadherin, PECAM-1, glucose transporter-1 (GLUT-1), P-glycoprotein (P-gp) and transferrin receptor-1 (Tfr-1). BBB spheroids demonstrated higher relative impedance percentages in comparison to spheroids without an iBCEC barrier. Barrier integrity assessments additionally corresponded with lower permeability to small molecule tracer NaF, with spheroids containing iBCECs showing higher relative fluorescence unit percentages (RFU%) of ~ 90% in apical compartments, compared to ~ 80% in spheroids without iBCECs. In summary, direct cellular contacts in the complex spheroid model resulted in enhanced maturation of iBCECs. 8 A bioreactor system was used to further assess the effect of shear stress. This system enabled inclusion of fluidic flow and shear stress conditions in addition to non-invasive barrier integrity measurements (Choi, Mathew et al. 2022). iBCECs were cultured for a total of seven days post differentiation (d17) within the bioreactor and barrier integrity was non-invasively monitored. Until d17 of long-term culture, TEER values of iBCECs steadily dropped from ~ 1800 Ω*cm2 ~ 400 Ω*cm2 under static conditions and from ~ 2500 Ω*cm2 to ~ 250 Ω*cm2 under dynamic conditions. Transcriptomic analyses, morphometric analyses and protein marker expression showed enhanced maturation of iBECs under long-term culture and dynamic flow. Importantly, on d10 claudin-5 was expressed mostly in the cytoplasm with only ~ 5% iBCECs showing continuous staining at the cell borders. With increase in culture duration, iBCECs at d17 of static culture showed ~ 18% of cells having continuous cell border expression, while dynamic conditions showed upto ~ 30% of cells with continuous cell-cell border expression patterns. Similarly, ~ 33% of cells showed cell-cell border expression of occludin on d10 with increases to ~ 55% under d17 static and up to ~ 65% under d17 dynamic conditions, thereby indicating iBCEC maturation. In conclusion, the data presented within this thesis demonstrates the maturation of iBCECs in BBB spheroids, obtained via direct cellular contacts and by the application of flow and shear stress. Both established novel models need to be further validated for pharmaceutical drug applications together with in-vitro-in-vivo correlations in order to exploit their full potential. N2 - Eine hochregulierte Mikroumgebung ist für die Aufrechterhaltung der normalen Funktion des Zentralen Nervensystems (ZNS) unerlässlich. Das Vorhandensein einer biologischen Barriere, der so genannten Blut-Hirn-Schranke (BHS), als Schnittstelle zwischen Blutkreislauf und Gehirn ermöglicht den selektiven Durchgang von Substanzen und Pathogenen in das Gehirn (Kadry, Noorani et al. 2020). Die BHS dient hauptsächlich dazu, das Gehirn vor dem Eindringen von Toxinen von außen und dem Eindringen von Krankheitserregern zu schützen. Die BHS wird hauptsächlich von Hirnkapillarendothelzellen (engl. brain capillary endothelial cells, BCECs) gebildet, die dafür verantwortlich sind, dass ∼ 100% der großmolekularen Neurotherapeutika und mehr als 98% aller kleinmolekularen Medikamente nicht in das Gehirn gelangen können. Ein eingeschränkter BHS-Transport wichtiger potenzieller Wirkstoffe führt zu einer abgeschwächten Wirksamkeit der Behandlung der meisten ZNS-Erkrankungen (Pardridge 2005). Mäuse, Ratten, Schweine und Rinder werden in der Regel als Modellsysteme verwendet, um die Verabreichung von Neurotherapeutika in das Gehirn zu untersuchen. Aufgrund der Unterschiede zwischen den Spezies führen experimentelle Tiermodelle jedoch vermehrt zu falsch positiven oder falsch negativen Vorhersagen über die Wirksamkeit von Medikamenten, so dass sie nicht in der Lage sind, die Wirkungen beim Menschen vollständig vorherzusagen (Ruck, Bittner et al. 2015). Ein Beispiel dafür ist, dass in den letzten zwei Jahrzehnten ein Großteil der Studien an Tieren zu Misserfolgsraten in der Wirkstoffzulassung geführt hat. Bei einer Fehlerrate von 97% im Zusammenhang mit Krebs und ~99% bei Alzheimer führt dies zum Therapieversagen (Pound 2020). Die weit verbreiteten Misserfolge bei klinischen Versuchen im Zusammenhang mit neurologischen Erkrankungen haben zu der Frage geführt, ob die bestehenden präklinischen Tiermodelle wirklich die Physiologie des Menschen widerspiegeln (Bhalerao, Sivandzade et al. 2020). Abgesehen von den hohen Ausfallraten sind die Kosten für Tierversuche extrem hoch. Nach Angaben der Organisation für wirtschaftliche Zusammenarbeit und Entwicklung (engl. Organisation for Economic Co-operation and Development, OECD), welche für die Festlegung von Tierversuchsrichtlinien und -methoden für die Regierung, die Industrie und unabhängige Labore zuständig ist, belaufen sich die durchschnittlichen Kosten für eine einzige Zwei-Generationen-Studie zur Reproduktionstoxizität an Tieren weltweit auf 318.295 € und allein für Europa auf ~ 285.842 € (Van Norman 2019). Aus diesen Gründen gibt es zwei unterschiedliche Bemühungen unter den Wissenschaftlern. Zum einen zur Verbesserung der Tierforschung und zum anderen zur Förderung neuer Methoden gemäß den 3R (eng. replace, reduce, refine), wobei die europäische Regierung die Jahre 2025 bis 2035 als Frist für den schrittweisen Verzicht auf Tierversuche in der Forschung festgelegt hat (Pound 2020). Die 10 Entdeckung der humanen induziert pluripotenten Stammzell (hiPSC)-Technologie im Jahr 2006 (Takahashi und Yamanaka 2006, Takahashi, Tanabe et al. 2007) hat den Bereich der Arzneimittelforschung revolutioniert, da hiPSCs in verschiedene Gewebetypen differenziert werden können und damit die Möglichkeit bieten, humanisierte in-vitro-Testsysteme bereitzustellen, die zur Untersuchung verschiedener Krankheiten verwendet werden können. In Bezug auf die BHS wurde im Laufe der Jahre mehrere Strategien zur Differenzierung von hiPSCs zu BCECs (iBCECs) etabliert (Appelt-Menzel, Oerter et al. 2020), allerdings wird ihnen ein epithelialer Phänotyp nachgesagt, was zu Fragen in der Spezifikation der BBB führt (Lippmann, Azarin et al. 2020). Um eine verlässliche Differenzierungsstrategie für die Gewinnung von iBCECs mit charakteristischen BHS-Merkmalen zu finden, welche für Downstream-Anwendungengenutztwerden können, wurden in dieser Arbeit zwei Methoden verglichen. Die Ko-Differenzierung (engl. co-differentiation, CD) und die gerichtete Differenzierung (engl. directed differentiation, DD). Zusammengefasst simuliert die CD eine ZNS-ähnliche Mikroumgebung für die Spezifikation der iBCECs nach (Lippmann, Al-Ahmad et al. 2014), während sich die DD auf die Induktion des Mesoderms und die anschließende iBCEC-Spezifikation konzentriert (Qian, Maguire et al. 2017). Die erzielten Ergebnisse bestätigten, dass iBCECs, welche mittels CD abgeleitet wurden, im Vergleich zur humanen BCEC-Zelllinie (hCMEC/D3) zwar epitheliale Transkripte wie E-Cadherin (CDH1) besitzen, aber eine Herabregulierung von Thrombozyten-Endothelzell-Adhäsionsmolekül-1 (PECAM-1) und VE-Cadherin (CDH5) aufweisen. Die von CD abgeleiteten iBCECs hatten zudem eine höhere Barriere-Integrität und Funktionalität gezeigt. Im Wesentlichen führte die CD-Strategie zu iBCECs mit einem hohen transendothelialen elektrischen Widerstand (engl. Transendothelialelectrical resistance, TEER) von 2000 - 2500Ω*cm2, einem niedrigen Permeabilitätskoeffizienten (eng. Permeability co-efficient, PC) von < 0,50 μm/min für den Transport kleiner Moleküle wie Natriumfluorescein (NaF) und einer charakteristischen Expression von BCEC-spezifischen Tight Junction (TJ)-Proteinen wie Claudin-5 und Occludin. Außerdem bildeten iBCECs, welche über CD gewonnen wurden, keine Gefäßstrukturen als Reaktion auf angiogene Stimuli. DD hingegen führte zu iBCECs mit einer ähnlichen Herabregulierung der PECAM-1- und CDH5-Genexpression, die zusätzlich durch eine geringere Barriereintegrität, gemessen an einem niedrigen TEER von nur ~ 250 - 450 Ω*cm2 und einem hohen PC von > 5 μm/min, bei dem Transport von NaF gekennzeichnet war. Obwohl die über DD gewonnenen iBCECs in der Lage waren Gefäßnetze auszubilden, zeigten sie keine Expression der charakteristischen BCEC-TJs wie Claudin-5 und Occludin. Diese Ergebnisse führten zu der Hypothese, die in-vitro Differenzierung und Reifung von iBCECs zu verbessern, indem in-vivo-ähnliche Stimuli in-vitro angewandt werden, wie z. B. die direkte Kokultur mit Zelltypen der neurovaskulären Einheit (NVE) durch Sphäroidbildung und die Induktion von Scherstress in einem dynamischen Flussmodell. Im Vergleich zu iBCEC- 11 basierten Transwellmodellen, die zumeist in Monokulturen aufgebaut werden, zeigten die BHS-Sphäroide eine erhöhte Expression von PECAM-1 und eine reduzierte Expression von Epithelmarkern wie E-Cadherin (CDH1) und Claudin-6 (CLDN6). BHS-Sphäroide zeigten eine klassische BCEC-ähnliche Ultrastruktur, die durch TJ-Partikel auf der protoplasmatischen Phase (P-Phase) und der exoplasmatischen Phase (E-Phase) der Plasmamembran gekennzeichnet war. Die TJ-Stränge waren als Partikel und partikelfreie Rillen auf der E-Phase organisiert, während auf der P-Phase teils Partikel und teils kontinuierliche Stränge zu erkennen waren. BHS-Sphäroide zeigten auch eine positive Proteinexpression von Claudin-5, VE-Cadherin, PECAM-1, Glukose-Transporter-1 (GLUT-1), P-Glykoprotein (P-gp) und Transferrin-Rezeptor-1 (Tfr-1). Die BHS-Sphäroide wiesen ebenfalls höhere relative Impedanzwerte im Vergleich zu Sphäroiden ohne iBCEC-Barriere auf. Die Bewertung der Integrität der Barriere korrespondierte zudem mit einer geringeren Permeabilität für den niedermolekularen Tracer NaF, wobei Sphäroide mit iBCECs einen höheren Prozentsatz an relativen Fluoreszenzeinheiten (RFU%) von etwa 90% in den apikalen Kompartimenten aufwiesen, verglichen mit etwa 80% in Sphäroiden ohne iBCECs. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass direkte zelluläre Kontakte im komplexen Sphäroidmodell zu einer verstärkten Reifung von iBCECs führten. In-vivo ist die BHS Scherbelastungen ausgesetzt, die einen wichtigen und oft vernachlässigten physiologischen Stimulus darstellen (Cucullo, Hossain et al. 2011). Um die Auswirkung von Scherstress auf die Eigenschaften und die Reifung von iBCECs zu messen, wurden diese in einem Bioreaktorsystem kultiviert.(Choi, Mathew et al. 2022). Hier war es möglich, iBCECs für insgesamt sieben Tage nach der Differenzierung (d17) erfolgreich in diesem System zu kultivieren und zusätzlich die Barriereintegrität nicht-invasiv zu überwachen. Bis d17 der Langzeitkultur fielen die TEER-Werte von iBCECs stetig von ~ 1800 Ω*cm2 ~ 400 Ω*cm2 unter statischen Bedingungen bzw. von ~ 2500 Ω*cm2 auf ~ 250 Ω*cm2 unter dynamischen Bedingungen. Zusätzliche Untersuchungen und Vergleiche von iBCECs unter diesen Kulturbedingungen mittels transkriptioneller und morphometrischer Analysen, sowie Expression von Proteinmarkern zeigten, dass iBCECs aufgrund der Langzeitkultur und des dynamischen Flusses eine verstärkte Reifung vorweisen. Wichtig ist, dass Claudin-5 bei d10 hauptsächlich im Zytoplasma exprimiert wurde und nur etwa 5% der iBCECs eine kontinuierliche Färbung an den Zellgrenzen aufwiesen. Mit zunehmender Kulturdauer zeigten iBCECs bei d17 in statischer Kultur ~ 18% der Zellen mit kontinuierlicher Zellrandexpression, während unter dynamischen Bedingungen bis zu ~ 30% der Zellen kontinuierliche Zellrandexpressionsmuster aufwiesen. In ähnlicher Weise zeigten ~ 33% der Zellen eine Zell-Zell-Grenzexpression von Occludin an d10 mit einem Anstieg auf ~ 55% unter d17 statischen und bis zu ~ 65% unter d17 dynamischen Bedingungen, was auf eine iBCEC-Reifung hinweist. Zusammenfassend zeigen die in dieser Arbeit vorgestellten Daten die Reifung von iBCECs in 12 BHS Sphäroiden, die durch direkte Zell - Zell Kontakte und in dynamischen Strömungsmodellen durch die Anwendung von Scherspannungen erreicht wird. Beide etablierten neuen Modelle müssen für pharmazeutische Anwendungen zusammen mit In-vitro-in-vivo-Korrelationen weiter validiert werden, um ihr volles Potential zu beweisen. KW - Blut-Hirn-Schranke KW - Blood-brain barrier Y1 - 2024 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-322475 ER - TY - THES A1 - Nair, Radhika Karal T1 - Structural and biochemical characterization of USP28 inhibition by small molecule inhibitors T1 - Strukturelle und biochemische Charakterisierung der Hemmung von USP28 durch niedermolekulare Inhibitoren N2 - Ubiquitination is an important post-translational modification that maintains cellular homeostasis by regulating various biological processes. Deubiquitinases (DUBs) are enzymes that reverse the ubiquitination process by catalyzing the removal of ubiquitin from a substrate. Abnormal expression or function of DUBs is often associated with the onset and progression of various diseases, including cancer. Ubiquitin specific proteases (USPs), which constitute the largest family of DUBs in humans, have become the center of interest as potential targets in cancer therapy as many of them display increased activity or are overexpressed in a range of malignant tumors or the tumor microenvironment. Two related members of the USP family, USP28 and USP25, share high sequence identities but play diverse biological roles. USP28 regulates cell proliferation, oncogenesis, DNA damage repair and apoptosis, whereas USP25 is involved in the anti-viral response, innate immunity and ER-associated degradation in addition to carcinogenesis. USP28 and USP25 also exhibit different oligomeric states – while USP28 is a constitutively active dimer, USP25 assumes an auto-inhibited tetrameric structure. The catalytic domains of both USP28 and USP25 comprise the canonical, globular USP-domain but contain an additional, extended insertion site called USP25/28 catalytic domain inserted domain (UCID) that mediates oligomerization of the proteins. Disruption of the USP25 tetramer leads to the formation of an activated dimeric protein. However, it is still not clear what triggers its activation. Due to their role in maintaining and stabilizing numerous oncoproteins, USP28 and USP25 have emerged as interesting candidates for anti-cancer therapy. Recent advances in small-molecular inhibitor development have led to the discovery of relatively potent inhibitors of USP28 and USP25. This thesis focuses on the structural elucidation of USP28 and the biochemical characterization of USP28/USP25, both in complex with representatives of three out of the eight compound classes reported as USP28/USP25-specific inhibitors. The crystal structures of USP28 in complex with the AZ compounds, Vismodegib and FT206 reveal that all three inhibitor classes bind into the same allosteric pocket distant from the catalytic center, located between the palm and the thumb subdomains (the S1-site). Intriguingly, this binding pocket is identical to the UCID-tip binding interface in the USP25 tetramer, rendering the protein in a locked, inactive conformation. Formation of the binding pocket in USP28 requires a shift in the helix α5, which induces conformational changes and local distortion of the binding channel that typically accommodates the C-terminal tail of Ubiquitin, thus preventing catalysis and abrogating USP28 activity. The key residues of the USP28-inhibitor binding pocket are highly conserved in USP25. Mutagenesis studies of these residues accompanied by biochemical and biophysical assays confirm the proposed mechanism of inhibition and similar binding to USP25. This work provides valuable insights into the inhibition mechanism of the small molecule compounds specifically for the DUBs USP28 and USP25. The USP28-inhibitor complex structures offer a framework to develop more specific and potent inhibitors. N2 - Ubiquitinierung ist eine wichtige posttranslationale Modifikation, die die zelluläre Homöostase aufrechterhält, indem sie verschiedene biologische Prozesse reguliert. Deubiquitinasen (DUBs) sind Enzyme, die den Ubiquitinierungsprozess umkehren, indem sie die Entfernung von Ubiquitin von einem Substrat katalysieren. Eine abnorme Expression oder Funktion von DUBs wird häufig mit dem Auftreten und Fortschreiten verschiedener Krankheiten, einschließlich Krebs, in Verbindung gebracht. Ubiquitin-spezifische Proteasen (USPs), die im Menschen die größte Familie der DUBs bilden, sind als potenzielle Ziele in der Krebstherapie von besonderem Interesse, da viele von ihnen in bösartigen Tumoren oder deren Mikroumgebung abnormal aktiv oder überexprimiert sind. Die zwei eng verwandten Mitglieder der USP-Familie, USP28 und USP25, weisen eine hohe Sequenzidentität auf, sind aber an unterschiedlichen biologischen Prozessen beteiligt. USP28 reguliert die Zellproliferation, die Onkogenese, die Reparatur von DNA-Schäden und die Apoptose, während USP25 eine Rolle bei der antiviralen Reaktion, der angeborenen Immunität, dem ER-assoziierten Abbau und der Carcinogenese spielt. USP28 und USP25 weisen auch unterschiedliche oligomere Zustände auf. Während USP28 ein konstitutiv aktives Dimer bildet, tritt USP25 als auto-inhibiertes Tetramer auf. Strukturell bestehen die katalytischen Domänen sowohl von USP28 als auch von USP25 aus der kanonischen globulären USP-Domäne enthalten jedoch eine zusätzliche Insertion, die als „USP25/28 catalytic domain inserted domain (UCID)“ bezeichnet wird und die Oligomerisierung der Proteine vermittelt. Die Dissoziation des USP25 Tetramers in Dimere führt zu einem aktivierten USP25-Protein. Es ist jedoch immer noch nicht klar, was seine Aktivierung auslöst. Aufgrund ihrer Rolle bei der Aufrechterhaltung und Stabilisierung zahlreicher Onkoproteine haben sich USP28 und USP25 als interessante Kandidaten für die Entwicklung von Medikamenten in der Krebstherapie erwiesen. Jüngste Fortschritte in der Entwicklung von niedermolekularen Inhibitoren haben zur Entdeckung von relativ potenten Inhibitoren von USP28 und USP25 geführt. Diese Arbeit konzentriert sich auf die Strukturaufklärung von USP28 und die biochemische Charakterisierung von USP28/USP25, beide im Komplex mit Vertretern von drei der acht Verbindungsklassen, die als USP28/USP25-spezifische Inhibitoren bekannt sind. Die Kristallstrukturen von USP28 im Komplex mit den AZ-Verbindungen, Vismodegib und FT206 zeigen, dass alle Inhibitoren in einer ähnlichen Region an USP28 binden - einer allosterischen Tasche, die in der Nähe des katalytischen Zentrums liegt und sich zwischen der Handflächen- und der Daumen-Subdomäne befindet. Diese Bindungstasche ist identisch mit der Position, an der der „UCID-tip“ im USP25-Tetramer bindet und das Protein in eine verschränkte, inaktive Konformation versetzt. Die Bildung der Bindungstasche in USP28 erfordert eine Verschiebung der α5-Helix, die zu Konformationsänderungen und einer lokalen Verzerrung des Bindungskanalsführt, der normalerweise den C-terminus des Ubiquitin-Moleküls bindet und so die Katalyse verhindert und die Aktivität von USP28 hemmt. Die Schlüsselreste der USP28-Inhibitor-Bindungstasche sind in USP25 hoch konserviert. Mutagenese-Studien dieser Aminosäuren, begleitet von biochemischen und biophysikalischen Analysen, bestätigen den vorgeschlagenen Mechanismus der Hemmung und eine ähnliche Bindung der Inhibitoren an USP25. Diese Arbeit liefert wertvolle Einblicke in den Hemmungsmechanismus der Kleinmolekülverbindungen, die spezifisch für die DUBs USP28 und USP25 entwickelt worden sind. Die Strukturen der USP28-Inhibitor-Komplexe bieten eine Grundlage für die zukünftige Entwicklung spezifischerer und wirksamerer Inhibitoren. KW - USP KW - Inhibition KW - enzyme KW - crystallography KW - Unique Selling Proposition KW - Inhibition KW - Enzym KW - Kristallographie Y1 - 2024 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-281742 ER - TY - THES A1 - Kanmegne Tamga, Dan Emmanuel T1 - Modelling Carbon Sequestration of Agroforestry Systems in West Africa using Remote Sensing T1 - Modellierung der Kohlenstoffbindung von agroforstwirtschaftlichen Systemen in Westafrika mittels Fernerkundung N2 - The production of commodities such as cocoa, rubber, oil palm and cashew, is the main driver of deforestation in West Africa (WA). The practiced production systems correspond to a land managment approach referred to as agroforestry systems (AFS), which consist of managing trees and crops on the same unit of land.Because of the ubiquity of trees, AFS reported as viable solution for climate mitigation; the carbon sequestrated by the trees could be estimated with remote sensing (RS) data and methods and reported as emission reduction efforts. However, the diversity in AFS in relation to their composition, structure and spatial distribution makes it challenging for an accurate monitoring of carbon stocks using RS. Therefore, the aim of this research is to propose a RS-based approach for the estimation of carbon sequestration in AFS across the climatic regions of WA. The main objectives were to (i) provide an accurate classification map of AFS by modelling the spatial distribution of the classification error; (ii) estimate the carbon stock of AFS in the main climatic regions of WA using RS data; (iii) evaluate the dynamic of carbon stocks within AFS across WA. Three regions of interest (ROI) were defined in Cote d'Ivoire and Burkina Faso, one in each climatic region of WA namely the Guineo-Congolian, Guinean and Sudanian, and three field campaigns were carried out for data collection. The collected data consisted of reference points for image classification, biometric tree measurements (diameter, height, species) for biomass estimation. A total of 261 samples were collected in 12 AFS across WA. For the RS data, yearly composite images from Sentinel-1 and -2 (S1 and S2), ALOS-PALSAR and GEDI data were used. A supervised classification using random forest (RF) was implemented and the classification error was assessed using the Shannon entropy generated from the class probabilities. For carbon estimation, different RS data, machine learning algorithms and carbon reference sources were compared for the prediction of the aboveground biomass in AFS. The assessment of the carbon dynamic was carried between 2017 and 2021. An average carbon map was genrated and use as reference for the comparison of annual carbon estimations, using the standard deviation as threshold. As far as the results are concerned, the classification accuracy was higher than 0.9 in all the ROIs, and AFS were mainly represented by rubber (38.9%), cocoa (36.4%), palm (10.8%) in the ROI-1, mango (15.2%) and cashew (13.4%) in ROI-2, shea tree (55.7%) and African locust bean (28.1%) in ROI-3. However, evidence of misclassification was found in cocoa, mango, and shea butter. The assessment of the classification error suggested that the error level was higher in the ROI-3 and ROI-1. The error generated from the entropy was able to reduced the level of misclassification by 63% with 11% of loss of information. Moreover, the approach was able to accuretely detect encroachement in protected areas. On carbon estimation, the highest prediction accuracy (R²>0.8) was obtained for a RF model using the combination of S1 and S2 and AGB derived from field measurements. Predictions from GEDI could only be used as reference in the ROI-1 but resulted in a prediction error was higher in cashew, mango, rubber and cocoa plantations, and the carbon stock level was higher in African locust bean (43.9 t/ha), shea butter (15 t/ha), cashew (13.8 t/ha), mango (12.8 t/ha), cocoa (7.51 t/ha) and rubber (7.33 t/ha). The analysis showed that carbon stock is determined mainly by the diameter (R²=0.45) and height (R²=0.13) of trees. It was found that crop plantations had the lowest biodiversity level, and no significant relationship was found between the considered biodiversity indices and carbon stock levels. The assessment of the spatial distribution of carbon sources and sinks showed that cashew plantations are carbon emitters due to firewood collection, while cocoa plantations showed the highest potential for carbon sequestration. The study revealed that Sentinel data could be used to support a RS-based approach for modelling carbon sequestration in AFS. Entropy could be used to map crop plantations and to monitor encroachment in protected areas. Moreover, field measurements with appropriate allometric models could ensure an accurate estimation of carbon stocks in AFS. Even though AFS in the Sudanian region had the highest carbon stocks level, there is a high potential to increase the carbon level in cocoa plantations by integrating and/or maintaining forest trees. N2 - Die Produktion von Rohstoffen wie Kakao, Kautschuk, Ölpalmen und Cashew ist die Hauptursache fur die Entwaldung in Westafrika (WA). Die verwendeten Produktionssyteme entsprechen einem Landbewirtschaftungskonzept, welches als Agroforstsysteme (AFS) bezeichnet wird und darin besteht, Baume und Nutzpflanzen auf der gleichen Landeinheit zu bewirtschaften. Aufgrund der kohlenstoffbindung durch Baumen sind AFS als praktikable Losung fur den Klimaschutz anerkannt, die Vielfalt der AFS in Bezug auf ihre Zusammensetzung, Struktur un raumliche Verteilung erschwert jedoch eine genaue Schatzung der Kohlenstoffvorrate. Hier konnen Daten und Methoden der satellitenbasierten Erdbeobachtung ansetzten. Ziel dieser Forschungsarbeit ist es daher, einen fernerkundungs-basierten Ansatz fur die Schatzung der Kohlenstoffbindung in AFS in den Klimaregionen von WA vorzuschlagen. Die Hauptziele waren (i) die Erstellung einer genauen Klassifizierungskarte von AFS durch Modellierung der raumlichen verteilung des Klassifizierungsfehlers; (ii) die Shatzung des Kohlenstoffbestands von AFS in den wichtigsten Klimaregionen von WA unter Verwendung von Fernerkundungs-daten (RS); (iii) die Bewertung der raumlichen Verteilung von Kohlenstoffquellen und -senken innerhalb von AFS in ganz WA. Fur jede Klimaregion in West Afrika wurden drei Regionen von Interesse (ROI) festgelegt, namlich die guineisch-kongolesische (ROI 1), die guineische (ROI 2) und die sudanesische Region (ROI 3) in Côte d'Ivoire und Burkina Faso, und es wurden drei Feldkampagnen zur Datenerhebung durchgefuhrt. Die gesammelten Daten bestanden aus Referenzpunkten fur die Bildklassifizierung und biometrischen Messungen (Durchmesser, Hohe, Artname) zur Schatzung der Biomasse. Insgesamt wurden 261 Proben in 12 AFS in ganz WA gesammelt. Fur die RS-Daten wurden jahrliche Komposite von Sentinel-1 und -2 (s1 und S3), ALOS-PALSAR und GEDI-Daten verwendet. Es wurde eine uberwachte Klassifizierung mit Random Forest (RF) algorithmus durch gefuhrt, und der Klassifizierungsfehler wurde anhand der aus den Klassenwahrscheinlichkeiten generierten Shannon-Entropie bewertet. Fur die Kohlenstoffschatzung wurden verschiedene RS-Daten, Algorithmen fur maschinelles Lernen und Kohlenstoff-Referenzquellen fur die Vorhesage des Kohlenstoffs in AFS verglichen. Die Bewertung der raumlichen Verteilung von Kohlenstoffsenken und -quellen basierte auf der Bewertung von Anomalien in der Kohlenstoffdynamik zwischen 2017 und 2021. Es wurde eine Karte zum durchschnittliche gebundenen Kohkenstoff erstellt, und die jahrliche Differenz wurde verwendet, um Kohlenstoffsenken und -quellen zu identifizieren. Die Klassifizierungsgenauigkeit war in allen ROI hoher als 0.9, in der Region dominierten Kautschuk (38.9%), Kakao (36.4%), Palme (10.8%) in ROI-1, Mango (15.2%) und Cashew (13.4%) in ROI-2, Sheabaum (55.7%) und Johannisbrot (28.1%) in ROI-3. Hinweise auf eine Fehlklassifizierung wurden vor allem bei Kakao, Mango un Sheabutter gefunden. Die Bewertung des Klassifizierungsfehlers ergab, dass das Fehlerniveau in ROI-3 und ROI-1 hoher war. Der aus der Entropie generiete Fehler konnte das Ausmass der Fehlklassifizierung reduzieren, ohne die gut klassifizierten Pixel zu beeintrachtigen. Ausserdem war der Ansatz in der Lage, Eingriffe in Schutzgebiete zuverlassig un akkurat zu erkennen. Was die Kohlenstoffschatzung betrifft, so wrude die hochste Vorhersagegenauigkeit (R²> 0.8)bei der Kombination von S1 und S2 mit Random Forest und AGB aus Feldmessungen erzielt. Vorhersagen von GEDI konnten nur als Referenz in der ROI verwendet werden, fuhrten aber zu einem Vorhersagefehler bei Cashew-, Mango-, Kautschuk- und Kakaoplantagen hoher war und der Kohlenstoffbestand bei Johannisbrot (43.9t/ha), Sheabutter (15 t/ha), Cashew (13.8 t/ha), Mango (12.8t/ha), Kakao (7.51 t/ha) und Kautschuk (7.33 t/ha) hoher war. Die Analyse zeigte, dass der Kohlenstoffbestand hauptsachlich durch den Durchmesser (R²=0.45) und die Hohe (R²=0.13) der Baume beeinflusst wird. Zudem wurde festgestellt, dass Plantagenkulturen die geringste Biodiversitat aufweisen, und es wurde kein signifikanter Zusammenhang zwischen Biodiversitatsindizes und Kohlenstoffvorraten festgestellt. Die Bewertung der raumlichen Verteilung von Kohlenstoffquellen und -senken zeigte, dass Cashew ein Kohlenstoffemittent ist, da in dieser Region Brennholz gesammelt wird, wahrend Kakaoplantagen wichtige Kohlenstoffsenken sind. Die Studie ergab zudem, dass Sentinel-Daten zur Unterstutzung eines RS-basierten Ansatzes fur die Modellierung der Kohlenstoffbindung in AFS verwendet werden konnten. Die Entropie konnte zur Kartierung von Anbauplantagen und zur uberwachen von Schutzgebiete verwendet werden. Daruber hinaus gewahrleisten feldmessungen mit geeigneten allometrischen Modellen eine genaue Schatzung der Kohlenstoffvorrate in AFS. Die AFS in der sudanesischen Region weisen die hochsten Kohlenstoffvorrate auf, aber es besteht die Moglichkeit, den Kohlenstoffgehalt in Kakaoplantagen durch die Integration und/oder Erhaltung von Waldbaumen zu erhoehen. KW - Sequestrierung KW - Fernerkundung KW - Westafrika KW - carbon sequestration KW - agroforestry systems KW - remote sensing KW - West Africa Y1 - 2024 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-369269 ER - TY - THES A1 - Merscher, Alma-Sophia T1 - To Fear or not to Fear: Unraveling the (Oculo)motor and Autonomic Components of Defensive States in Humans T1 - Vor Furcht Erstarren: Charakterisierung der (Okulo)motorischen und Autonomen Komponenten Menschlicher Defensivreaktionen N2 - Defensive behaviors in response to threats are key factors in maintaining mental and physical health, but their phenomenology remains poorly understood. Prior work reported an inhibition of oculomotor activity in response to avoidable threat in humans that reminded of freezing behaviors in rodents. This notion of a homology between defensive responding in rodents and humans was seconded by concomitant heart rate decrease and skin conductance increase. However, several aspects of this presumed defense state remained ambiguous. For example, it was unclear whether the observed oculomotor inhibition would 1) robustly occur during preparation for threat-avoidance irrespective of task demands, 2) reflect a threat-specific defensive state, 3) be related to an inhibition of somatomotor activity as both motion metrics have been discussed as indicators for freezing behaviors in humans, and 4) manifest in unconstrained settings. We thus embarked on a series of experiments to unravel the robustness, threat-specificity, and validity of previously observed (oculo)motor and autonomic dynamics upon avoidable threat in humans. We provided robust evidence for reduced gaze dispersion, significantly predicting the speed of subsequent motor reactions across a wide range of stimulus contexts. Along this gaze pattern, we found reductions in body movement and showed that the temporal profiles between gaze and body activity were positively related within individuals, suggesting that both metrics reflect the same construct. A simultaneous activation of the parasympathetic (i.e., heart rate deceleration) and sympathetic (i.e., increased skin conductance and pupil dilation) nervous system was present in both defensive and appetitive contexts, suggesting that these autonomic dynamics are not only sensitive to threat but reflecting a more general action-preparatory mechanism. We further gathered evidence for two previously proposed defensive states involving a decrease of (oculo)motor activity in a naturalistic, unconstrained virtual reality environment. Specifically, we observed a state consisting of a cessation of ongoing behaviors and orienting upon relatively distal, ambiguous threat (Attentive Immobility) while an entire immobilization and presumed allocation of attention to the threat stimulus became apparent upon approaching potential threat (Immobility under Attack). Taken together, we provided evidence for specific oculomotor and autonomic dynamics upon increasing levels of threat that may inspire future translational work in rodents and humans on shared mechanisms of threat processing, ultimately supporting the development of novel therapeutic approaches. N2 - Angemessen auf Gefahren zu reagieren, ist überlebensnotwendig, wissenschaftlich jedoch wenig verstanden. Eine frühere Studie wies auf, dass ProbandInnen ihre Augen weniger bewegten, wenn sie mit einer Bedrohung konfrontiert waren, der sie mit einer schnellen Bewegung entkommen konnten. Dieses eingeschränkte Blickbewegungsmuster wurde von einer Herzraten-Dezeleration und einem Anstieg der Hautleitfähigkeit begleitet und wies damit Ähnlichkeiten mit bestimmten Erstarrungsreaktionen auf Bedrohungen (Freezing) bei Nagetieren auf. Es blieb jedoch unklar, ob die eingeschränkten Augenbewegungen 1. robust und unabhängig von spezifischen Aufgabenstellungen als Reaktion auf eine vermeidbare Bedrohung auftreten, 2. eine bedrohungsspezifische Komponente eines Defensivzustands darstellen, 3. von einer körperlichen Bewegungsreduktion begleitet und 4. im freien Raum auftreten würden. Wir haben daher untersucht, ob dieses eingeschränkte Blickbewegungsmuster sowie seine autonomen Begleiterscheinungen robust, bedrohungsspezifisch und valide sind. In unseren Studien traten verringerte Augenbewegungen robust und bedrohungsspezifisch als Reaktion auf vermeidbare Bedrohungen auf und sagten schnellere Reaktionszeiten vorher. Die eingeschränkten Augenbewegungen wurden von verringerten Körperbewegungen begleitet, deren zeitliche Verläufe miteinander korrelierten. Dies könnte auf ein zugrundeliegendes gemeinsames Konstrukt hinweisen. Wir beobachteten außerdem eine Herzraten-Dezeleration sowie erhöhte Hautleitfähigkeit und Pupillendilation in bedrohlichen und appetitiven Kontexten, was darauf hindeutet, dass diese autonomen Dynamiken nicht nur durch Bedrohungen, sondern auch allgemein handlungsvorbereitend ausgelöst werden können. Zuletzt konnten wir in einer frei explorierbaren, virtuellen Umgebung Hinweise auf zwei Defensivzustände liefern, deren Unterscheidung zuvor postuliert, jedoch noch nicht weitreichend belegt war. Bei relativ weit entfernter und ambivalenter Gefahr hielten die ProbandInnen inne und drehten sich, vermutlich zur Orientierung, zum potentiellen Ort der Bedrohung hin (Attentive Immobility). Wenn sich die Bedrohung jedoch näherte, verringerten sich sowohl Körper- als auch Augenbewegungen, als würden die ProbandInnen ihre Aufmerksamkeit auf die Bedrohung ausrichten (Immobility under Attack). Zusammenfassend lieferten unsere Erhebungen damit Belege für spezifische (okulo)motorische und autonome Dynamiken bei steigender Bedrohung, die zukünftige translationale Forschungen über Homologien von Defensivzuständen zwischen Nagetieren und Menschen inspirieren und damit womöglich die Entwicklung neuer therapeutischer Verfahren unterstützen können. KW - Furcht KW - Fear Y1 - 2024 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-327913 ER - TY - THES A1 - Laqua, Caroline T1 - Association of myocardial tissue characteristics and functional outcome in biopsy-verified myocarditis assessed by cardiac magnetic resonance imaging T1 - Zusammenhänge zwischen geweblichen Eigenschaften des Myokards und funktionellem Outcome bei biopsie-verifizierter Myokarditis im Kardio-MRT N2 - The relation between LV function and cardiac MRI tissue characteristics in separate myocardial segments and their change over time has yet to be explored in myocarditis. Thus, our research aimed to investigate possible associations between global and regional myocardial T1 and T2 times and peak strain in patients with suspected myocarditis. From 2012 to 2015, 129 patients with clinically suspected myocarditis of the prospective, observational MyoRacer-Trial underwent systematic biventricular EMB at baseline and cardiac MRI at baseline and after three months as a follow-up. We divided the LV myocardium into 17 segments and estimated the segmental myocardial strain using FT. We registered T1 and T2 maps to the cine sequences and transferred the segmentations used for FT to ensure conformity of the myocardial segments. Multi-level multivariable linear mixed effects regression was applied to investigate the relation of segmental myocardial strain to relaxation times and their respective change from baseline to follow-up. We found a significant improvement in myocardial peak strain from baseline to follow-up (p < 0.001; all p-values given for likelihood ratio tests) and significant associations between higher T1 and T2 times and lower segmental myocardial peak strain (p ranging from < 0.001 to 0.049). E.g., regression coefficient (Reg. coef.) for segmental radial peak strain in short axis view (SRPS_SAX) and T1 time: -1.9, 95% CI (-2.6;-1.2) %/100 ms, p < 0.001. A decrease in T1 and T2 times from baseline to follow-up was also significantly related to a recovery of segmental peak strains (p ranging from < 0.001 to 0.050). E.g., Reg. coef. for SRPS_SAX per ΔT1: -1.8, 95% CI (-2.5;-1.0) %/100 ms, p < 0.001. Moreover, the higher the baseline T1 time, the more substantial the functional recovery from baseline to follow-up (p ranging from 0.004 to 0.042, e.g., for SRPS_SAX: Reg. coef. 1.3, 95% CI (0.4;2.1) %/100 ms, p 0.004). We did not find an effect modification by the presence of myocarditis in the EMB (p > 0.1). Our cross-sectional and longitudinal analyses provide evidence of dose-dependent correlations between T1 and T2 relaxation times and myocardial peak strain in patients with clinical presentation of myocarditis, regardless of the EMB result. Thus, assessing strain values and mapping relaxation times helps estimate the functional prognosis in patients with clinically suspected myocarditis. N2 - Die Zusammenhänge zwischen der kardialen linksventrikulären (LV) Funktion und magnetresonanztomographisch erhebbaren Parametern des Myokards sowie deren jeweiligen Entwicklungen im zeitlichen Verlauf einer Myokarditis sind bisher nicht umfassend untersucht. Daher beschäftigt sich die vorliegende Arbeit mit der Erforschung des Verhältnisses von globalen und regionalen peak strain-Werten und T1 und T2 Zeiten des LV Myokards in der Magnetresonanztomographie (MRT) bei Patienten mit Verdacht auf Myokarditis. Die MyoRacer-Studie ist eine prospektive Beobachtungsstudie, die von 2012 bis 2015 am Herzzentrum des Universitätsklinikums Leipzig durchgeführt wurde. Dabei wurden 129 Patienten mit klinischem Verdacht auf Myokarditis mittels biventrikulärer Myokardbiopsie sowie kardialer MRT untersucht. Drei Monate nach der Erstuntersuchung (EU) erfolgte eine MRT-Folgeuntersuchung (FU). Für unsere Analysen unterteilten wir das LV Myokard standardmäßig in 17 Segmente, um mithilfe der Technik des feature trackings den segmentalen peak strain zu evaluieren. Weiterhin registrierten wir T1 und T2 maps gegen cine-Sequenzen der MRT und übertrugen die Segmentierungen aus den cine-Sequenzen zwecks Übereinstimmung in die MRT maps. Anschließend analysierten wir die Zusammenhänge zwischen segmentalem strain und T1 und T2 Zeiten und deren jeweiligen Veränderungen im zeitlichen Verlauf mithilfe eines hierarchischen, multivariablen, gemischten linearen Regressionsmodells. Unsere Ergebnisse zeigen eine signifikante Verbesserung der peak strain-Werte von der EU zur FU (p < 0.001; alle p-Werte für likelihood ratio tests angegeben) sowie eine signifikante Assoziation von erhöhten T1 und T2 Zeiten mit verminderten segmentalen peak strain-Werten (p zwischen < 0.001 und 0.049). Weiterhin war ein Abfall der T1 und T2 Zeiten von der EU zur FU signifikant mit einer Erholung der segmentalen peak strain-Werte verknüpft (p zwischen < 0.001 und 0.050). Je höher die T1 Zeiten bei der EU ausfielen, desto stärker erholte bzw. verbesserte sich der peak strain von der EU zur FU (p zwischen 0.004 und 0.042). Eine Effektmodifikation durch den bioptischen Nachweis einer Myokarditis war nicht zu beobachten (p > 0.1). Unsere Quer- und Längsschnittanalysen belegen dosisabhängige Zusammenhänge zwischen T1 und T2 Zeiten und myokardialen peak strain-Werten bei Patienten mit dem klinischen Bild einer Myokarditis, unabhängig vom Ergebnis der Myokardbiopsie. Daher ist die Bestimmung von T1 und T2 Zeiten und myokardialem strain mittels kardialer MRT zur Abschätzung der funktionellen Prognose bei Patienten mit klinischem Verdacht auf Myokarditis hilfreich. KW - Myokarditis KW - Kernspintomografie KW - T1-Zeit KW - T2-Zeit KW - strain KW - t1 time KW - t2 time KW - myocarditis KW - MRI Y1 - 2024 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-363903 ER - TY - THES A1 - Hahn, Sarah T1 - Investigating non-canonical, 5' UTR-dependent translation of MYC and its impact on colorectal cancer development T1 - Untersuchung der nicht-kanonischen, 5' UTR-abhängigen Translation von MYC und ihres Einflusses auf die Entwicklung von Darmkrebs N2 - Colorectal cancer (CRC) is the second most common tumour disease in Germany, with the sequential accumulation of certain mutations playing a decisive role in the transition from adenoma to carcinoma. In particular, deregulation of the Wnt signalling pathway and the associated deregulated expression of the MYC oncoprotein play a crucial role. Targeting MYC thus represents an important therapeutic approach in the treatment of tumours. Since direct inhibition of MYC is challenging, various approaches have been pursued to date to target MYC indirectly. The MYC 5' UTR contains an internal ribosomal entry site (IRES), which has a particular role in the initiation of MYC translation, especially in multiple myeloma. As basis for this work, it was hypothesised on the basis of previous data that translation of MYC potentially occurs via its IRES in CRC as well. Based on this, two IRES inhibitors were tested for their potential to regulate MYC expression in CRC cells. In addition, alternative, 5’ UTR-dependent translation of MYC and interacting factors were investigated. EIF3D was identified as a MYC 5' UTR binding protein which has the potential to regulate MYC expression in CRC. The results of this work suggest that there is a link between eIF3D and MYC expression/translation, rendering eIF3D a potential therapeutic target for MYC-driven CRCs. N2 - Das kolorektale Karzinom (KRK) ist die zweithäufigste Tumorerkrankung in Deutschland, wobei die sequenzielle Akkumulation bestimmter Mutationen eine entscheidende Rolle beim Übergang vom Adenom zum Karzinom spielt. Insbesondere die Deregulation des Wnt-Signalweges und die damit verbundene deregulierte Expression des MYC-Onkoproteins spielen eine entscheidende Rolle. MYC ist ein zentraler Vermittler von Zellfunktionen und reguliert als Transkriptionsfaktor die Expression fast aller Gene sowie verschiedener RNA-Spezies. Selbst kleine Veränderungen der zellulären MYC-Konzentration können das Proliferationsverhalten beeinflussen und die Entstehung und das Fortschreiten von Tumoren fördern. Die gezielte Beeinflussung von MYC stellt daher einen wichtigen therapeutischen Ansatz für die Behandlung von Tumoren dar. Da eine direkte Hemmung von MYC aufgrund seiner Struktur herausfordernd ist, wurden bisher verschiedene Ansätze verfolgt, um MYC indirekt zu beeinflussen, etwa über seinen Interaktionspartner MAX oder auf Ebene der Stabilität, Transkription oder Translation. In unserer eigenen Forschungsgruppe lag der Schwerpunkt in den letzten Jahren speziell auf der Translation von MYC im KRK. Es konnte gezeigt werden, dass die Hemmung der kanonischen cap-abhängigen Translation nicht wie erwartet zu einer Verringerung der zellulären MYC-Level führt, was auf einen alternativen Mechanismus der MYC-Translation hindeutet, der unabhängig vom eIF4F-Komplex abläuft. Die 5'-UTR von MYC enthält eine interne ribosomale Eintrittsstelle (IRES), die eine besondere Rolle bei der Initiierung der MYC-Translation spielt, insbesondere im Multiplen Myelom. Als Grundlage für diese Arbeit wurde daher die Hypothese aufgestellt, dass die Translation von MYC im KRK möglicherweise ebenfalls über die IRES erfolgt. Auf dieser Grundlage wurden zunächst zwei publizierte IRES-Inhibitoren auf ihr Potenzial zur Regulierung der MYC-Expression in KRK-Zellen getestet. J007-IRES hatte keine Auswirkungen auf die MYC-Proteinmenge, und Cymarin scheint weitaus globalere Auswirkungen zu haben, die nicht ausschließlich auf die Verringerung der MYC-Proteinmenge zurückzuführen sind. Daher wurde weiter untersucht, inwieweit die alternative Translation von MYC generell von der 5'-UTR und damit interagierenden Faktoren abhängig ist. EIF3D wurde als MYC-5'-UTR-Bindungsprotein identifiziert, dessen Knockdown zu reduzierten MYC-Leveln, einem Proliferationsdefizit sowie einer Verringerung der globalen Proteinsynthese in KRK-Zellen führte. Darüber hinaus führte die Depletion von EIF3D zu ähnlichen Veränderungen im zellulären Genexpressionsmuster wie die Depletion von MYC, wobei viele tumorassoziierte Signalwege betroffen waren. Mittels eCLIP-seq wurde die Bindung von eIF3D an die MYC mRNA nachgewiesen, der genaue Mechanismus einer möglicherweise durch eIF3D vermittelten Translation von MYC muss jedoch weiter untersucht werden. Die Ergebnisse dieser Arbeit deuten darauf hin, dass eine Verbindung zwischen eIF3D und der MYC-Expression/Translation besteht, wodurch eIF3D zu einem potenziellen therapeutischen Ziel für MYC-getriebene KRKs wird. KW - Myc KW - Translation KW - Colorectal cancer KW - 5' UTR Y1 - 2024 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-364202 ER - TY - THES A1 - Heimberger, Kevin T1 - Regulation pathways of c-MYC under glutamine-starving conditions in colon carcinoma cells T1 - Regulierungsmechanismen von c-MYC in Darmkrebszellen unter Glutaminmangelbedingungen N2 - Colon carcinomas (CRC) are statistically among the most fatal cancer types and hence one of the top reasons for premature mortality in the developed world. CRC cells are characterized by high proliferation rates caused by deregulation of gene transcription of proto-oncogenes and general chromosomal instability. On macroscopic level, CRC cells show a strongly altered nutrient and energy metabolism. This work presents research to understand general links between the metabolism and transcription alteration. Mainly focussing on glutamine dependency, shown in colon carcinoma cells and expression pathways of the pro-proliferation protein c-MYC. Previous studies showed that a depletion of glutamine in the cultivation medium of colon carcinoma cell lines caused a proliferation arrest and a strong decrease of overall c-MYC levels. Re-addition of glutamine quickly replenished c-MYC levels through an unknown mechanism. Several proteins altering this regulation mechanism were identified and proposed as possible starting point for further in detail studies to unveil the precise biochemical pathway controlling c-MYC translation repression and reactivation in a rapid manner. On a transcriptional level the formation of RNA:DNA hybrids, so called R-loops, was observed under glutamine depleted conditions. The introduction and overexpression of RNaseH1, a R-loop degrading enzyme, in combination with an ectopically expressed c-MYC variant, independent of cellular regulation mechanisms by deleting the regulatory 3’-UTR of the c-MYC gene, lead to a high rate of apoptotic cells in culture. Expression of a functionally inactive variant of RNaseH1 abolished this effect. This indicates a regulatory function of R-loops formed during glutamine starvation in the presence of c-MYC protein in a cell. Degradation of R-loops and high c-MYC levels in this stress condition had no imminent effect on the cell cycle progression is CRC cells but disturbed the nucleotide metabolism. Nucleotide triphosphates were strongly reduced in comparison to starving cells without R-loop degradation and proliferating cells. This study proposes a model of a terminal cycle of transcription termination, unregulated initiation and elongation of transcription leading to a depletion of energy resources of cells. This could finally lead to high apoptosis of the cells. Sequencing experiments to determine a coinciding of termination sites and R-loop formation sides failed so far but show a starting point for further studies in this essential survival mechanism involving R-loop formation and c-MYC downregulation. N2 - Darmkrebs gehört statistisch zu den Krebsarten mit den höchsten Sterblichkeitsraten und zählen somit zu den häufigsten Todesursachen der entwickelten Länder. Darmkrebszellen zeichnen sich durch chromosomale Instabilität und hohe Proliferationsraten aus, die durch eine Deregulierung der Expression verschiedener Proto-Onkogene zustande kommen. Generell besitzen diese Krebszellen einen stark veränderten Nährstoff- und Energiestoffwechsel im Vergleich zu gesunden somatischen Zellen. Diese Arbeit strebt ein besseres Verständnis der Verbindung zwischen dem Metabolismus und der Gen-Expression an. Das Hauptaugenmerk liegt hierbei auf dem Mechanismus der Expression des proliferationsfördernden Proteins c-MYC und der Abhängigkeit von Glutamin, die Darmkrebszellen charakterisiert. Frühere Studien haben gezeigt, dass der Entzug von Glutamin aus dem Kulturmedium von Darmkrebszelllinien eine Arretierung des Zellzyklus bewirkt sowie die Konzentration des Proteins c-MYC reduziert. Erneute Zugabe von Glutamin zum Medium stellt die MYC-Konzentration schnell wieder her. Die Hintergründe dieses Mechanismus sind bislang aber kaum verstanden. Einige Proteine wurden hier als potenzielle Kandidaten identifiziert, die einen Einfluss auf den biochemischen Prozess haben könnten, der die schnelle Wiederaufnahme der c-MYC Translation gewährleistet. Auf Translationsebene wurden RNA:DNA-Hybriden, sogenannte R-loops, gefunden, die sich unter anderem unter Glutamin-Mangelbedingungen im Genom bilden können. Ein gezielter Abbau dieser R-loops mithilfe des Enzyms RNaseH1, in Kombination mit der ektopischen Expression einer c-MYC-Variante, die unempfindlich gegenüber der zelleigenen Regulationsmechanismen ist, führte zu einer erhöhten Anzahl an apoptotischen Zellen in Kultur. Exprimiert man eine funktionell inaktive Variante der RNaseH1, statt der funktionellen, so kann dieser Apoptose-fördernde Prozess nicht beobachtet werden. Dies bestärkt die Hypothese, dass die R-loops, die sich während eines Glutamin-Mangels und hoher c-MYC-Konzentration bilden, eine regulatorische Funktion innehaben. Als Ursache für die Apoptose konnte ein Effekt der veränderten Expression auf das Fortschreiten des Zellzyklus ausgeschlossen werden. Jedoch zeigte sich eine Veränderung im Nukleotid-Metabolismus. Betroffene Zellen zeigten deutlich reduzierte Nuklotidtriphosphat-Konzentrationen im Vergleich zu Zellen unter Glutaminmangelbedingungen ohne R-loop-Abbau. In dieser Arbeit wurde ein Modell entwickelt, das einen sich selbst negativ verstärkenden Zyklus vorschlägt, der die Zellen zur Apoptose führt. Transkriptionstermination und eine unkontrollierte Initiation der Transkription im Wechsel führt zu einem Verbrauch der lebensnotwendigen Energieressourcen der Zellen. Sequenzierungsexperimente zur Lokalisierung der R-loops und Terminationsstellen sind bislang fehlgeschlagen, bieten jedoch Ansätze für künftige Forschung. KW - Myc KW - cMYC regulation KW - Colorectal Cancer KW - Glutamine KW - Translation regulation Y1 - 2024 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-363316 ER - TY - THES A1 - Beudert, Matthias T1 - Bioinspired Modification and Functionalization of Hydrogels for Applications in Biomedicine T1 - Biologisch-inspirierte Modifizierung und Funktionalisierung von Hydrogelen für Anwendungen in der Biomedizin N2 - Over the years, hydrogels have been developed and used for a huge variety of different applications ranging from drug delivery devices to medical products. In this thesis, a poly(2-methyl-2-oxazoline) (POx) / poly(2-n-propyl-2-oxazine) (POzi) bioink was modified and analyzed for the use in biofabrication and targeted drug delivery. In addition, the protein fibrinogen (Fbg) was genetically modified for an increased stability towards plasmin degradation for its use as wound sealant. In Chapter 1, a thermogelling, printable POx/POzi-based hydrogel was modified with furan and maleimide moieties in the hydrophilic polymer backbone facilitating post-printing maturation of the constructs via Diels-Alder chemistry. The modification enabled long-term stability of the hydrogel scaffolds in aqueous solutions which is necessary for applications in biofabrication or tissue engineering. Furthermore, we incorporated RGD-peptides into the hydrogel which led to cell adhesion and elongated morphology of fibroblast cells seeded on top of the scaffolds. Additional printing experiments demonstrate that the presented POx/POzi system is a promising platform for the use as a bioink in biofabrication. Chapter 2 highlights the versatility of the POx/POzi hydrogels by adapting the system to a use in targeted drug delivery. We used a bioinspired approach for a bioorthogonal conjugation of insulin-like growth factor I (IGF-I) to the polymer using an omega-chain-end dibenzocyclooctyne (DBCO) modification and a matrix metalloprotease-sensitive peptide linker. This approach enabled a bioresponsive release of IGF-I from hydrogels as well as spatial control over the protein distribution in 3D printed constructs which makes the system a candidate for the use in personalized medicine. Chapter 3 gives a general overview over the necessity of wound sealants and the current generations of fibrin sealants on the market including advantages and challenges. Furthermore, it highlights trends and potential new strategies to tackle current problems and broadens the toolbox for future generations of fibrin sealants. Chapter 4 applies the concepts of recombinant protein expression and molecular engineering to a novel generation of fibrin sealants. In a proof-of-concept study, we developed a new recombinant fibrinogen (rFbg) expression protocol and a Fbg mutant that is less susceptible to plasmin degradation. Targeted lysine of plasmin cleavage sites in Fbg were exchanged with alanine or histidine in different parts of the molecule. The protein was recombinantly produced and restricted plasmin digest was analyzed using high resolution mass spectrometry. In addition to that, we developed a novel time resolved screening protocol for the detection of new potential plasmin cleavage sites for further amino acid exchanges in the fibrin sealant. N2 - Hydrogele wurden im Laufe der Jahre für eine Vielzahl von Anwendungen, von der Verabreichung von Medikamenten bis hin zu medizinischen Produkten, entwickelt und eingesetzt. In dieser Arbeit wurde eine Poly(2-methyl-2-oxazolin) POx) / Poly(2-n-propyl-2- oxazin) (POzi) Biotinte modifiziert und für den Einsatz in der Biofabrikation und für die gezielte Verabreichung von Medikamenten analysiert. Außerdem wurde das Protein Fibrinogen (Fbg) gentechnisch verändert, um seine Stabilität gegenüber dem Plasminabbau in seiner Funktion als Wundkleber zu erhöhen In Kapitel 1 wurde ein thermogelierendes, druckbares Hydrogel auf POx/POzi-Basis mit Furan- und Maleimid-Funktionen im hydrophilen Polymerrückgrat modifiziert, was die Reifung der Konstrukte nach dem Druck durch Diels-Alder-Chemie bewirkt. Die Modifizierung ermöglichte eine langfristige Stabilität der Hydrogele in wässrigen Lösungen, was für Anwendungen im Bereich der Biofabrikation oder im Tissue Engineering erforderlich ist. Darüber hinaus haben wir RGD-Peptide in das Hydrogel integriert, was zur Zelladhäsion und einer verlängerten Morphologie von Fibroblasten, die auf den Gelen ausgesät wurden, führte. Weitere Druckexperimente zeigen außerdem, dass das POx/POzi-System eine vielversprechende Plattform für den Einsatz als Biotinte in der Biofabrikation ist. Kapitel 2 unterstreicht die Vielseitigkeit der POx/POzi-Hydrogele, indem das System für die gezielte Abgabe von Medikamenten angepasst wird. Wir verwendeten einen von der Natur inspirierten Ansatz für eine biorthogonale Konjugation vom Insuline-like Growth Factor I (IGF- I) an das Polymer unter Verwendung einer Dibenzocyclooctin-Modifikation des Polymers am Ende der Omega-Kette und eines Matrix-Metalloproteasen-empfindlichen Peptid-Linkers. Dieser Ansatz ermöglichte eine bioresponsive Freisetzung von IGF-I aus Hydrogelen sowie eine räumliche Kontrolle über die Proteinverteilung in 3D-gedruckten Konstrukten, was das System zu einem Kandidaten für den Einsatz in der personalisierten Medizin macht. Kapitel 3 gibt einen allgemeinen Überblick über die Notwendigkeit von Wundversiegelungsmitteln und die derzeit auf dem Markt befindlichen Generationen von Fibrinklebern einschließlich der Vorteile und Herausforderungen. Darüber hinaus werden Trends und potenzielle neue Strategien zur Lösung aktueller Probleme und zur Erweiterung der Toolbox für künftige Generationen von Fibrinklebern aufgezeigt. In Kapitel 4 werden die Konzepte der rekombinanten Proteinexpression und des Molecular Engineering auf eine neue Generation von Fibrin Wundklebern angewandt. In einer Proof-of- Concept-Studie haben wir ein neues rekombinantes Fbg Expressionsprotokoll und eine Fbg Mutante entwickelt, die weniger anfällig für einen Abbau durch Plasmin ist. Gezielte Lysine in Plasmin-Schnittstellen in Fbg wurde entweder durch Alanin oder Histidin in unterschiedlichen Teilen des Moleküls ausgetauscht. Das Protein wurde rekombinant hergestellt und eine verminderte Schnittrate wurde mittels hochauflösender Massenspektrometrie gezeigt. Zusätzlich haben wir ein neues zeitaufgelöstes Screening-Protokoll entwickelt, mit dem sich neue potenzielle Plasmin-Spaltstellen für weitere Aminosäurenaustausche in Fibrin-Klebern auflösen lassen. KW - Hydrogel KW - Targeted drug delivery KW - 3 D bioprinting KW - Hydrogels KW - Modification KW - Bioinks KW - Fibrinogen KW - Drug Delivery Y1 - 2024 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-322887 ER - TY - THES A1 - Zhao, Suting T1 - Symmetry Resolution of Entanglement in Holography T1 - Symmetrieaufgelöste Verschränkung in Holographie N2 - This thesis investigates the charged moments and the symmetry-resolved entanglement entropy in the context of the AdS3/CFT2 duality. In the first part, I focus on the holographic U(1) Chern-Simons-Einstein gravity, a toy model of AdS3/CFT2 with U(1) Kac-Moody symmetry. I start with the vacuum background with a single entangling interval. I show that, apart from a partition function in the grand canonical ensemble, the charged moments can also be interpreted as the two-point function of vertex operators on the replica surface. For the holographic description, I propose a duality between the bulk U(1) Wilson line and the boundary vertex operators. I verify this duality by deriving the effective action for the Chern-Simons fields and comparing the result with the vertex correlator. In the twist field approach, I show that the charged moments are given by the correlation function of the charged twist operators and the additional background operators. To solve the correlation functions involved, I prove the factorization of the U(1) extended conformal block into a U(1) block and a Virasoro block. The general expression for the U(1) block is derived by directly summing over the current descendant states, and the result shows that it takes an identical form as the vertex correlators. This leads to the conclusion that the disjoint Wilson lines compute the neutral U(1) block. The final result for the symmetry-resolved entanglement entropy shows that it is always charge-independent in this model. In the second part, I study charged moments in higher spin holography, where the boundary theory is a CFT with W3 symmetry. I define the notion of the higher spin charged moments by introducing a spin-3 modular charge operator. Restricting to the vacuum background with a single entangling interval, I employ the grand canonical ensemble interpretation and calculate the charged moments via the known higher spin black hole solution. On the CFT side, I perform a perturbative expansion for the higher spin charged moments in terms of the connected correlation functions of the spin-3 modular charge operators. Using the recursion relation for the correlation functions of the W3 currents, I evaluate the charged moments up to the quartic order of the chemical potential. The final expression matches with the holographic result. My results both for U(1) Chern-Simons Einstein gravity and W3 higher spin gravity constitute novel checks of the AdS3/CFT2 correspondence. N2 - Diese Arbeit untersucht die Symmetrie-aufgelöste Verschränkungsentropie im Kontext der AdS3/CFT2-Dualität. Im ersten Teil konzentriere ich mich auf die holographische U(1) Chern-Simons-Einstein- Gravitations-Theorie, welches ein Spielzeugmodell für AdS3/CFT2 mit U(1) Kac-Moody-Symmetrie ist. Ich beginne mit dem Vakuumhintergrund mit einem einzigen Verschränkungsintervall. Ich zeige, dass neben einer Partitionsfunktion im großen kanonischen Ensemble die geladenen Momente auch als Zweipunktfunktion von Vertex-Operatoren auf der Replikationsoberfläche interpretiert werden können. Für deren holographische Beschreibung wähle ich eine Dualität zwischen der Bulk U(1) Wilson-Linie und den Randvertexoperatoren. Diese Dualität verifiziere ich, indem ich die effektive Wirkung für die Chern-Simons-Felder herleite und das Ergebnis mit dem Vertex-Korrelator vergleiche. Im Twist-Field-Ansatz zeige ich, dass die geladenen Momente durch die Korrelationsfunktion der geladenen Twist-Operatoren und der zusätzlichen Hintergrundoperatoren gegeben sind. Um die beteiligten Korrelationsfunktionen zu lösen, beweise ich die Faktorisierung des U(1) erweiterten konformen Blocks in einen U(1)-Block und einen Virasoro- Block. Der allgemeine Ausdruck für den U(1) Block wird direkt durch die Summierung über alle Absteigerzustände hergeleitet. Das erzielte Ergebnis hat tatsächlich die gleiche Form wie die Vertex-Korrelatoren hat. Dies führt zur Schlussfolgerung, dass die getrennten Wilson-Linien den neutralen U(1) Block berechnen. Das Endergebnis für die Symmetrieaufgelöste Verschränkungsentropie zeigt, dass sie in diesem Modell immer ladungsunabhängig ist. Im zweiten Teil untersuche ich geladene Momente in der Holographie höherer Spins, wobei die Randtheorie eine CFT mit W3 Symmetrie ist. Ich definiere das Konzept der geladenen Momente höheren Spins, indem ich einen Spin-3-modularen Ladungsoperator einführe.Wenn ich mich auf den Vakuum-Hintergrund mit einem einzelnen Verschränkungsintervall beschränke, nutze ich die Interpretation des großkanonischen Ensembles und berechne die geladenen Momente mithilfe der bekannten Lösung für das schwarze Loch höheren Spins. Auf der CFT-Seite führe ich eine perturbative Expansion für die höheren spingeladenen Momente in Bezug auf die verbundenen Korrelationsfunktionen der modularen Spin-3-Ladungsoperatoren durch. Unter Verwendung der Rekursionsrelationen für die Korrelationsfunktionen der W3-Ströme werte ich die geladenen Momente bis zur quartischen Ordnung des chemischen Potenzials aus. Das endgültige Ergebnis stimmt mit dem holographischen Ergebnis überein. Meine Ergebnisse für U(1) Chern-Simons-Einstein-Gravitation und W3 höhere Spingravitation stellen neuartige Überprüfungen des AdS3/CFT2 dar Korrespondenz. KW - AdS-CFT-Korrespondenz KW - Gauge/Gravity Duality KW - Symmetry Resolution KW - Quantum Information Y1 - 2024 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-363854 ER - TY - THES A1 - Dietrich, Oliver T1 - Integrating single-cell multi-omics to decipher host-pathogen interactions T1 - Integration von Genomik Daten einzelner Zellen zur Entschlüsselung von Wirt-Pathogen Interaktionen N2 - Interactions between host and pathogen determine the development, progression and outcomes of disease. Medicine benefits from better descriptions of these interactions through increased precision of prevention, diagnosis and treatment of diseases. Single-cell genomics is a disruptive technology revolutionizing science by increasing the resolution with which we study diseases. Cell type specific changes in abundance or gene expression are now routinely investigated in diseases. Meanwhile, detecting cellular phenotypes across diseases can connect scientific fields and fuel discovery. Insights acquired through systematic analysis of high resolution data will soon be translated into clinical practice and improve decision making. Therefore, the continued use of single-cell technologies and their application towards clinical samples will improve molecular interpretation, patient stratification, and the prediction of outcomes. In the past years, I was fortunate to participate in interdisciplinary research groups bridging biology, clinical research and data science. I was able to contribute to diverse projects through computational analysis and biological interpretation of sequencing data. Together, we were able to discover cellular phenotypes that influence disease progression and outcomes as well as the response to treatment. Here, I will present four studies that I have conducted in my PhD. First, we performed a case study of relapse from cell-based immunotherapy in Multiple Myeloma. We identified genomic deletion of the epitope as mechanism of immune escape and implicate heterozygosity or monosomy of the genomic locus at baseline as a potential risk factor. Second, we investigated the pathomechanisms of severe COVID-19 at the earliest stage of the COVID- 19 pandemic in Germany in March 2020. We discovered that profibrotic macrophages and lung fibrosis can be caused by SARS-CoV-2 infection. Third, we used a mouse model of chronic infection with Staphylococcus aureus that causes Osteomyelitis similar to the human disease. We were able to identify dysregulated immunometabolism associated with the generation of myeloid-derived suppressor cells (MDSC). Fourth, we investigated Salmonella infection of the human small intestine in an in vitro model and describe features of pathogen invasion and host response. Overall, I have been able to successfully employ single-cell sequencing to discover important aspects of diseases ranging from development to treatment and outcome. I analyzed samples from the clinics, human donors, mouse models and organoid models to investigate different aspects of diseases and managed to integrate data across sample types, technologies and diseases. Based on successful studies, we increased our efforts to combine data from multiple sources to build comprehensive references for the integration of large collections of clinical samples. Our findings exemplify how single-cell sequencing can improve clinical research and highlights the potential of mechanistic discoveries to drive precision medicine. N2 - Interaktionen zwischen Wirt und Pathogen bestimmen die Entwicklung und den Verlauf von Erkrankungen als auch deren Ausgang. Die Medizin zieht Nutzen aus genaueren Beschreibungen von Krankheiten durch höhere Präzision von Prävention, Diagnose und Behandlung. Genomische Messungen in einzelnen Zellen werden durch innovative Technologien ermöglicht, welche die Wissenschaft revolutionieren indem sie die Auflösung erhöhen mit der wir Krankheiten untersuchen können. Inzwischen werden sowohl die Zusammensetzung von Zelltypen als auch Unterschiede in der Genexpression routinemäßig über Krankheiten hinweg untersucht. Der Einsatz von Technologien die einzelne Zellen untersuchen und ihre Anwendung auf klinische Proben wird die molekulare Interpretation, die Stratifizierung von Patienten und die Prognose des Ausgangs von Krankheiten verbessern. In den letzten Jahren konnte ich mich an interdisziplinären Forschungsgruppen beteiligen und die Bereiche der Biologie, klinischer Forschung und Datenwissenschaften kombinieren. Ich war in der Lage zu unterschiedlichen Projekten beizutragen und eine führende Rolle in der Analyse und biologischen Interpretation von Daten aus Sequenzierungen zu übernehmen. Zusammen konnten wir zelluläre Phänotypen entdecken, die Entwicklung und Ausgang von Krankheiten sowie die Antwort auf Therapien beeinflussen. In dieser Arbeit werde ich vier Studien vorstellen, die ich während meiner Promotion durchgeführt habe. Zuerst haben wir einen Fall vom Rezidiv des Multiplen Myeloms nach zellulärer Immuntherapie untersucht. Dabei konnten wir feststellen, dass eine Deletion des genomischen Abschnitts für das immunogene Epitop dafür sorgte, dass die Krebszellen der Immunantwort entkommen konnten. Des weiteren konnten wir nachweisen, dass einige Patienten vor Beginn der Therapie nur eine Kopie des Gens besitzen und dadurch einen potentiellen Risikofaktor für ein Scheitern der Therapie. Zweitens haben wir im März 2020 die ersten Fälle von akutem Lungenversagen in COVID-19 und die Ursachen der Pathologie untersucht. Dabei haben wir festgestellt, das profibrotische Makrophagen und Lungenfibrose durch SARS-CoV-2 ausgelöst werden. Als Drittes haben wir Osteomyelitis in Mäusen untersucht, die von dem Bakterium Staphylococcus aureus ausgelöst wird und der Erkrankung im Menschen ähnlich ist. Wir konnten feststellen, dass deregulierter Metabolismus von Immunzellen der Enstehung von myeloiden Zellen mit T-Zell supprimierender Aktivität (MDSC) zugrunde liegt. Viertens haben wir die Infektion des humanen Dünndarms mit Salmonella in einem Organoidmodell untersucht und konnten Merkmale der Pathogeninvasion und der Wirtsantwort beschreiben. Insgesamt konnte ich die Sequenzierung von RNAs in einzelnen Zellen nutzen um wichtige Aspekte in der Entwicklung, dem Verlauf und dem Ausgang von Erkrankungen zu entdecken. Ich konnte Proben aus der Klinik, von Donoren, Mausmodellen und Organoidmodellen analysieren und die Daten über die Art von Proben, Technologien und Krankheiten hinweg integrieren. Durch unsere erfolgreichen Studien konnten wir uns ambitioniertere Ziele setzen um Daten von verschiedenen Quellen in umfassenden Referenzen zusammenzuführen um große Kollektionen klinischer Proben gemeinsam zu untersuchen. Unsere Ergebnisse demonstrieren wie die Untersuchung einzelner Zellen die klinische Forschung verbessern kann und zeigt das Potential auf wie Entdeckungen in der Biomedizin zur Präzisionsmedizin beitragen können. KW - Einzelzellanalyse KW - Single-cell sequencing KW - Host-Pathogen Interactions Y1 - 2024 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-360138 ER - TY - THES A1 - Aroko, Erick Onyango T1 - Trans-regulation of \(Trypanosoma\) \(brucei\) variant surface glycoprotein (VSG) mRNA and structural analysis of a \(Trypanosoma\) \(vivax\) VSG using X-ray crystallography T1 - Trans-regulierung der mRNA des variablen Oberflächenglykoprotein (VSG) von \(Trypanosoma\) \(brucei\) und strukturelle Analyse eines \(Trypanosoma\) \(vivax\) VSG mittels Kristallstrukturanalyse N2 - African trypanosomes are unicellular parasites that cause nagana and sleeping sickness in livestock and man, respectively. The major pathogens for the animal disease include Trypanosoma vivax, T. congolense, and T. brucei brucei, whereas T. b. gambiense and T. b. rhodesiense are responsible for human infections. Given that the bloodstream form (BSF) of African trypanosomes is exclusively extracellular, its cell surface forms a critical boundary with the host environment. The cell surface of the BSF African trypanosomes is covered by a dense coat of immunogenic variant surface glycoproteins (VSGs). This surface protein acts as an impenetrable shield that protects the cells from host immune factors and is also involved in antibody clearance and antigenic variation, which collectively ensure that the parasite stays ahead of the host immune system. Gene expression in T. brucei is markedly different from other eukaryotes: most genes are transcribed as long polycistronic units, processed by trans-splicing a 39-nucleotide mini exon at the 5′ and polyadenylation at the 3′ ends of individual genes to generate the mature mRNA. Therefore, gene expression in T. brucei is regulated post-transcriptionally, mainly by the action of RNA binding proteins (RBPs) and conserved elements in the 3′ untranslated regions (UTR) of transcripts. The expression of VSGs is highly regulated, and only a single VSG gene is expressed at a time from one of the ~15 subtelomeric domains termed bloodstream expression sites (BES). When cells are engineered to simultaneously express two VSGs, the total VSG mRNA do not exceed the wild type amounts. This suggests that a robust VSG mRNA balancing mechanism exists in T. brucei. The present study uses inducible and constitutive expression of ectopic VSG genes to show that the endogenous VSG mRNA is regulated only if the second VSG is properly targeted to the ER. Additionally, the endogenous VSG mRNA response is triggered when high amounts of the GFP reporter with a VSG 3′UTR is targeted to the ER. Further evidence that non-VSG ER import signals can efficiently target VSGs to the ER is presented. This study suggests that a robust trans-regulation of the VSG mRNA is elicited at the ER through a feedback loop to keep the VSG transcripts in check and avoid overshooting the secretory pathway capacity. Further, it was shown that induction of expression of the T. vivax VSG ILDat1.2 in T. brucei causes a dual cell cycle arrest, with concomitant upregulation of the protein associated with differentiation (PAD1) expression. It could be shown that T. vivax VSG ILDat1.2 can only be sufficiently expressed in T. brucei after replacing its native GPI signal peptide with that of a T. brucei VSG. Taken together, these data indicate that inefficient VSG GPI anchoring and expression of low levels of the VSG protein can trigger differentiation from slender BSF to stumpy forms. However, a second T. vivax VSG, ILDat2.1, is not expressed in T. brucei even after similar modifications to its GPI signals. An X-ray crystallography approach was utilized to solve the N-terminal domain (NTD) structure of VSG ILDat1.2. This is first structure of a non-T. brucei VSG, and the first of a surface protein of T. vivax to be solved. VSG ILDat1.2 NTD maintains the three-helical bundle scaffold conserved in T. brucei surface proteins. However, it is likely that there are variations in the architecture of the membrane proximal region of the ILDat1.2 NTD and its CTD from T. brucei VSGs. The tractable T. brucei system is presented as a model that can be used to study surface proteins of related trypanosome species, thus creating avenues for further characterization of trypanosome surface coats. N2 - Afrikanische Trypanosomen sind einzellige Parasiten, die Nagana in Nutzvieh und die Schlafkrankheit im Menschen verursachen. Zu den Hauptverursachern der Tierkrankheit gehören Trypanosoma vivax, T. congolense und T. brucei brucei, während T. b. gambiense und T. b. rhodesiense für Infektionen im Menschen verantwortlich sind. Da die Blutstromform (BSF) der afrikanischen Trypanosomen rein extrazellulär vorkommt, bildet die Zelloberfläche eine kritische Grenzregion mit der Wirtsumgebung. Die Zelloberoberfläche der BSF afrikanischer Trypanosomen ist mit einem dichten Mantel an immunogenen variablen Oberflächenglykoproteinen (variant surface glycoprotein, VSG) umgeben. Dieses Oberflächenprotein dient als Barriere zum Schutz gegen Faktoren des Wirtsimmunsystems und spielt ebenfalls eine Rolle in Antikörper-Clearance und antigener Variation, welche gemeinsam dafür sorgen, dass der Parasit dem Wirtsimmunsystem stets einen Schritt voraus bleibt. Die Genexpression von T. brucei weist dezidierte Unterschiede im Vergleich zu anderen Eukaryoten auf: Die meisten Gene werden als lange polyzystronische Einheiten transkribiert, die durch trans-Splicing eines Miniexons aus 39 Nukleotiden am 5′ und Polyadenylierung am 3′ Ende der individuellen Gene prozessiert wird. Daher wird die Genexpression in T. brucei posttranskriptionell reguliert, zumeist durch RNA Bindeproteine (RBPs) und konservierte Elemente in der 3′ untranslatierten Region (UTR). Die Expression der VSGs ist stark reguliert, so wird zu einer gegebenen Zeit stets nur ein VSG Gen aus einer von ~15 Subtelomerregionen, die Blutstrom Expressionsorte (bloodstream expression sites, BES) genannt werden, exprimiert. Zellen, die gentechnisch manipuliert wurden um zwei VSGs zu exprimieren, produzieren die gleiche Menge an VSG mRNA wie Wildtyp Zellen. Dies deutet auf die Existenz eines robusten Mechanismus zur Regulierung der Gesamt-VSG mRNA Menge in T. brucei hin. Diese Arbeit verwendet induzierbare sowie konstitutive Expression eines ektopischen VSG Gens um zu zeigen, dass die endogene VSG mRNA nur reguliert wird, wenn das zweite VSG zum ER gelangt. Außerdem wird die endogene VSG mRNA Antwort auch ausgelöst, wenn hohe Mengen eines GFP Reporters, der eine VSG 3′UTR enthält, zum ER geleitet wird. Weiterhin, wird gezeigt, dass ER Importsignale anderer Proteine VSGs effizient zum ER dirigieren können. Das Ergebnis dieser Studie deutet darauf hin, dass eine Rückkopplungsschleife am ER eine robuste trans-Regulation der VSG mRNA auslöst, die die VSG Transkripte limitiert und somit eine Überlastung des sekretorischen Wegs verhindert. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass es nach Induktion der Expression des T. vivax VSGs ILDat1.2 in T. brucei zu einem doppelten Zellzyklusarrest mit gleichzeitiger Hochregulation der Expression des protein associated with differentation (PAD1) kam und dass dieses T. vivax VSG nur nach Austausch des GPI Signalpeptids durch das eines T. brucei VSGs effizient exprimiert werden konnte. Zusammengenommen suggerieren diese Daten, dass eine ineffiziente GPI-Verankerung und wenig abundante Expression des VSGs die Differenzierung der sogenannten slender BSF zur sogenannten stumpy Form einleiten kann. Ein zweites T. vivax VSG, ILDat2.1, konnte hingegen auch nach Austausch des GPI Signals nicht in T. brucei exprimiert werden. Mit Hilfe der Röntgenstrukturanalyse wurde die Struktur der N-terminalen Domäne (NTD) des ILDat1.2 VSGs gelöst. Es handelt sich hierbei um die erste Proteinstruktur eines VSGs, welches nicht aus T. brucei stammt und die erste Struktur eines Oberflächenproteins von T. vivax. Das in T. brucei Oberflächenproteinen konservierte drei-Helix Grundgerüst ist auch in der NTD des ILDat1.2 VSGs enthalten. Die Architektur der Membranproximalen Gegend der IlDat1.2 NTD und CTD unterscheiden sich aber vermutlich von der der T. brucei VSGs. Das leicht handhabbare T. brucei System bietet somit ein geeignetes Modell um die Oberflächenproteine anderer afrikanischer Trypanosomen Spezies zu untersuchen und eröffnet neue Wege zur Charakterisierung ihrer Oberflächenmäntel. KW - Trypanosoma vivax KW - Trypanosoma brucei KW - Variant surface glycoprotein KW - messenger RNA KW - Regulation of expression KW - messenger RNA regulation KW - VSG structure Y1 - 2024 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-241773 ER - TY - THES A1 - Yu, Yanying T1 - Applied machine learning for the analysis of CRISPR-Cas systems T1 - Angewandtes maschinelles Lernen für die Analyse von CRISPR-Cas-Systemen N2 - Among the defense strategies developed in microbes over millions of years, the innate adaptive CRISPR-Cas immune systems have spread across most of bacteria and archaea. The flexibility, simplicity, and specificity of CRISPR-Cas systems have laid the foundation for CRISPR-based genetic tools. Yet, the efficient administration of CRISPR-based tools demands rational designs to maximize the on-target efficiency and off-target specificity. Specifically, the selection of guide RNAs (gRNAs), which play a crucial role in the target recognition of CRISPR-Cas systems, is non-trivial. Despite the fact that the emerging machine learning techniques provide a solution to aid in gRNA design with prediction algorithms, design rules for many CRISPR-Cas systems are ill-defined, hindering their broader applications. CRISPR interference (CRISPRi), an alternative gene silencing technique using a catalytically dead Cas protein to interfere with transcription, is a leading technique in bacteria for functional interrogation, pathway manipulation, and genome-wide screens. Although the application is promising, it also is hindered by under-investigated design rules. Therefore, in this work, I develop a state-of-art predictive machine learning model for guide silencing efficiency in bacteria leveraging the advantages of feature engineering, data integration, interpretable AI, and automated machine learning. I first systematically investigate the influential factors that attribute to the extent of depletion in multiple CRISPRi genome-wide essentiality screens in Escherichia coli and demonstrate the surprising dominant contribution of gene-specific effects, such as gene expression level. These observations allowed me to segregate the confounding gene-specific effects using a mixed-effect random forest (MERF) model to provide a better estimate of guide efficiency, together with the improvement led by integrating multiple screens. The MERF model outperformed existing tools in an independent high-throughput saturating screen. I next interpret the predictive model to extract the design rules for robust gene silencing, such as the preference for cytosine and disfavoring for guanine and thymine within and around the protospacer adjacent motif (PAM) sequence. I further incorporated the MERF model in a web-based tool that is freely accessible at www.ciao.helmholtz-hiri.de. When comparing the MERF model with existing tools, the performance of the alternative gRNA design tool optimized for CRISPRi in eukaryotes when applied to bacteria was far from satisfying, questioning the robustness of prediction algorithms across organisms. In addition, the CRISPR-Cas systems exhibit diverse mechanisms albeit with some similarities. The captured predictive patterns from one dataset thereby are at risk of poor generalization when applied across organisms and CRISPR-Cas techniques. To fill the gap, the machine learning approach I present here for CRISPRi could serve as a blueprint for the effective development of prediction algorithms for specific organisms or CRISPR-Cas systems of interest. The explicit workflow includes three principle steps: 1) accommodating the feature set for the CRISPR-Cas system or technique; 2) optimizing a machine learning model using automated machine learning; 3) explaining the model using interpretable AI. To illustrate the applicability of the workflow and diversity of results when applied across different bacteria and CRISPR-Cas systems, I have applied this workflow to analyze three distinct CRISPR-Cas genome-wide screens. From the CRISPR base editor essentiality screen in E. coli, I have determined the PAM preference and sequence context in the editing window for efficient editing, such as A at the 2nd position of PAM, A/TT/TG downstream of PAM, and TC at the 4th to 5th position of gRNAs. From the CRISPR-Cas13a screen in E. coli, in addition to the strong correlation with the guide depletion, the target expression level is the strongest predictor in the model, supporting it as a main determinant of the activation of Cas13-induced immunity and better characterizing the CRISPR-Cas13 system. From the CRISPR-Cas12a screen in Klebsiella pneumoniae, I have extracted the design rules for robust antimicrobial activity across K. pneumoniae strains and provided a predictive algorithm for gRNA design, facilitating CRISPR-Cas12a as an alternative technique to tackle antibiotic resistance. Overall, this thesis presents an accurate prediction algorithm for CRISPRi guide efficiency in bacteria, providing insights into the determinants of efficient silencing and guide designs. The systematic exploration has led to a robust machine learning approach for effective model development in other bacteria and CRISPR-Cas systems. Applying the approach in the analysis of independent CRISPR-Cas screens not only sheds light on the design rules but also the mechanisms of the CRISPR-Cas systems. Together, I demonstrate that applied machine learning paves the way to a deeper understanding and a broader application of CRISPR-Cas systems. N2 - Unter den Verteidigungsstrategien, welche sich über Millionen von Jahren in Mikroben entwickelt haben, hat sich das angeborene adaptive CRISPR-Cas Immunsystem in vielen Bakterien und den meisten Archaeen verbreitet. Flexibilität, Einfachheit und Spezifizität von CRISPR-Cas Systemen bilden die Grundlage für CRISPR-basierten genetischen Werkzeugen. Dennoch verlangt die effiziente Anwendung CRISPR-basierter genetischer Werkzeuge ein rationales Design, um die Effektivität zu maximieren und Spezifizität zu gewährleisten. Speziell die Auswahl an Leit-RNAs, oder auch „guide“ RNAs (gRNAs), welche eine essentielle Rolle in der Ziel-Erkennung des CRISPR-Cas Systems spielen, ist nicht trivial. Trotz aufkommender Techniken des maschinellen Lernens, die mit Hilfe von Vorhersage-Algorithmen eine Unterstützung im gRNA-Design darstellen, sind die Design-Regeln für viele CRISPR-Cas Systeme schlecht definiert und die breite Anwendung dadurch bisher gehindert. CRISPR Interferenz (CRISPRi), eine Methode der Genrepression, nutzt ein katalytisch inaktives Cas-Protein, um die Gen-Transkription zu verhindern und ist eine führende Technik für Gen-Funktionsstudien, der Manipulation von Stoffwechselwegen und genomweiter Screens in Bakterien. Auch wenn viele der Anwendungen vielversprechend sind, ist die Umsetzung aufgrund der wenig untersuchten Design-Regeln schwierig. Daher entwickele ich in dieser Arbeit ein hochmodernes auf maschinellem Lernen basierendes Modell für die Vorhersage der gRNA Genrepressions-Effizienz in Bakterien, wobei die Merkmalskonstruktion, Datenintegration, interpretierbare künstliche Intelligenz (KI) und automatisiertes maschinelles Lernen genutzt wurden. Zuerst untersuche ich systematisch die Einflussfaktoren, welche zum Ausmaß der Depletion in genomweiten CRISPRi-Screens zur Gen-Essentialität in Escherichia coli beitragen und demonstriere den überraschend dominanten Beitrag genspezifischer Effekte, wie z. B. dem Genexpressionslevel. Diese Beobachtungen erlaubten mir die genspezifischen Störvariablen mit einem sogenannten mixed-effect random forest (MERF) Modell zu segregieren, um eine bessere Einschätzung der gRNA Effizienz zu erreichen und durch die Integration zusätzlicher Screen-Daten noch weiter zu verbessern. Das MERF Modell übertraf dabei bereits existierende Werkzeuge in einem unabhängigen Hochdurchsatz Sättigungs-Screen. Als nächstes interpretiere ich die Modell Vorhersage, um Design-Regeln für eine solide Genrepression zu extrahieren, wie z. B. eine Präferenz für Cytosin und eine Abneigung gegenüber Guanin und Thymin innerhalb und der „protospacer adjacent motif“ (PAM) direkt umgebenden Sequenz. Weiterhin integrierte ich das MERF Modell in einem Web-basierten Werkzeug, welches unter www.ciao.helmholtz-hiri.de frei zugänglich ist. Ein Vergleich von existierenden Werkzeugen mit dem MERF Modell zeigt, dass alternative, für CRISPRi in Eukaryoten optimierte, gRNA Design-Werkzeuge schlecht abschneiden, sobald sie in Bakterien angewandt werden. Dies lässt Zweifel an einer robusten Übertragbarkeit dieser Vorhersage-Algorithmen zwischen verschiedenen Organismen. Zusätzlich haben CRISPR-Cas Systeme, trotz einiger genereller Gemeinsamkeiten, höchst diverse Wirkungsmechanismen. Die Vorhersagemuster eines Datensets sind daher schlecht generalisierbar, sobald sie auf andere Organismen oder CRISPR-Cas Techniken angewandt werden. Diese Lücke kann mit dem hier präsentierten Ansatz des maschinellen Lernens für CRISPRi geschlossen werden und als eine Vorlage für die Entwicklung effektiver Vorhersage-Algorithmen für spezifische Organismen oder CRISPR-Cas Systeme dienen. Der explizite Arbeitsablauf beinhaltet drei Hauptschritte: 1) Aufnehmen des Merkmalsets des jeweiligen CRISPR-Cas Systems bzw. der CRISPR-Cas Technik; 2) Optimierung des maschinellen Lernen Modells durch automatisiertes maschinelles Lernen; 3) Erklärung des Modells mit interpretierbarer KI. Um die Anwendbarkeit des Arbeitsablaufs und die Diversität der Ergebnisse, im Zusammenhang mit unterschiedlichen Organismen und CRISPR-Cas Systemen, zu demonstrieren, habe ich diese Arbeitsschritte zur Analyse drei unterschiedlicher genomweiter Screens angewandt. Von dem CRISPR „base editor“ Essentialitäts-Screen in E. coli, konnten die PAM Präferenzen und der Sequenzkontext innerhalb des Editierungsfensters für eine effiziente Editierung abgeleitet werden. Beispielsweise tragen ein A an der zweiten PAM Position, ein A/TT/TG an der PAM direkt nachgeschalten Position und ein TC an der vierten oder fünften gRNA Position zur effizienten Editierung bei. Im CRISPR-Cas13a Screen in E. coli, stellten wir eine starke Korrelation zwischen dem Genexpressionslevel und der gRNA-Depletion fest. Zusätzlich ist das Expressionslevel des Ziel-Gens der stärkste Vorhersagefaktor des Modells, was das Expressionslevel als Hauptdeterminante für die Cas13-induzierte Immunität hervorhebt und die bessere Charakterisierung von CRISPR-Cas13 Systemen ermöglicht. Aus dem CRISPR-Cas12a Screen in Klebsiella pneumoniae, habe ich gRNA Design Regeln für die robuste antimikrobielle Aktivität über unterschiedliche K. pneumoniae Stämme hinweg extrahiert und einen Vorhersage-Algorithmus für das gRNA Design bereitgestellt. Dies ermöglicht die Nutzung von Cas12a als eine alternative Lösung, um Antibiotikaresistenzen zu bekämpfen. Zusammengefasst präsentiert diese Thesis einen akkuraten Vorhersage-Algorithmus für die CRISPRi gRNA Effizienz in Bakterien und gibt Einblicke in die Determinanten für eine effiziente Genrepression und optimales gRNA Design. Die systematische Exploration führte zu einem robusten Ansatz des maschinellen Lernens für effektive Modell Entwicklungen in unterschiedlichen bakteriellen Spezies und CRISPR-Cas Systemen. Durch die Anwendung dieses Ansatzes auf unabhängige CRISPR-Cas Screens, konnte ich nicht nur wichtige Design Regeln ableiten, sondern auch die Mechanismen der jeweiligen CRISPR-Cas Systeme besser erleuchten. Zu guter Letzt demonstriere ich hier, dass angewandtes maschinelles Lernen den Weg zu einem tieferen Verständnis und einer breiteren Anwendung von CRISPR-Cas Systemen ebnen kann. KW - Maschinelles Lernen KW - CRISPR/Cas-Methode KW - Bakterien KW - machine learning KW - CRISPR-Cas KW - guide effiiciency Y1 - 2024 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-320219 ER - TY - THES A1 - Kuklovsky [former Finke], Valerie T1 - Are some bees smarter than others? An examination of consistent individual differences in the cognitive abilities of honey bees T1 - Sind manche Bienen schlauer als andere? Eine Untersuchung von konsistenten individuellen Unterschieden in den kognitiven Fähigkeiten von Honigbienen N2 - Cognition refers to the ability to of animals to acquire, process, store and use vital information from the environment. Cognitive processes are necessary to predict the future and reduce the uncertainty of the ever-changing environment. Classically, research on animal cognition focuses on decisive cognitive tests to determine the capacity of a species by the testing the ability of a few individuals. This approach views variability between these tested key individuals as unwanted noise and is thus often neglected. However, inter-individual variability provides important insights to behavioral plasticity, cognitive specialization and brain modularity. Honey bees Apis mellifera are a robust and traditional model for the study of learning, memory and cognition due to their impressive capabilities and rich behavioral repertoire. In this thesis I have applied a novel view on the learning abilities of honey bees by looking explicitly at individual differences in a variety of learning tasks. Are some individual bees consistently smarter than some of her sisters? If so, will a smart individual always perform good independent of the time, the context and the cognitive requirements or do bees show distinct isolated ‘cognitive modules’? My thesis presents the first comprehensive investigation of consistent individual differences in the cognitive abilities of honey bees. To speak of an individual as behaving consistently, a crucial step is to test the individual multiple times to examine the repeatability of a behavior. I show that free-flying bees remain consistent in a visual discrimination task for three consecutive days. Successively, I explored individual consistency in cognitive proficiency across tasks involving different sensory modalities, contexts and cognitive requirements. I found that free-flying bees show a cognitive specialization between visual and olfactory learning but remained consistent across a simple discrimination task and a complex concept learning task. I wished to further explore individual consistency with respect to tasks of different cognitive complexity, a question that has never been tackled before in an insect. I thus performed a series of four experiments using either visual or olfactory stimuli and a different training context (free-flying and restrained) and tested bees in a discrimination task, reversal learning and negative patterning. Intriguingly, across all these experiments I evidenced the same results: The bees’ performances were consistent across the discrimination task and reversal learning and negative patterning respectively. No association was evidenced between reversal learning and negative patterning. After establishing the existence of consistent individual differences in the cognitive proficiency of honey bees I wished to determine factors which could underlie these differences. Since genetic components are known to underlie inter-individual variability in learning abilities, I studied the effects of genetics on consistency in cognitive proficiency by contrasting bees originating from either from a hive with a single patriline (low genetic diversity) or with multiple patrilines (high genetic diversity). These two groups of bees showed differences in the patterns of individually correlated performances, indicating a genetic component accounts for consistent cognitive individuality. Another major factor underlying variability in learning performances is the individual responsiveness to sucrose solution and to visual stimuli, as evidenced by many studies on restrained bees showing a positive correlation between responsiveness to task relevant stimuli and learning performances. I thus tested whether these relationships between sucrose/visual responsiveness and learning performances are applicable for free-flying bees. Free-flying bees were again subjected to reversal learning and negative patterning and subsequently tested in the laboratory for their responsiveness to sucrose and to light. There was no evidence of a positive relationship between sucrose/visual responsiveness and neither performances of free-flying bees in an elemental discrimination, reversal learning and negative patterning. These findings indicate that relationships established between responsiveness to task relevant stimuli and learning proficiency established in the laboratory with restrained bees might not hold true for a completely different behavioral context i.e. for free-flying bees in their natural environment. These results show that the honey bee is an excellent insect model to study consistency in cognitive proficiency and to identify the underlying factors. I mainly discuss the results with respect to the question of brain modularity in insects and the adaptive significance of individuality in cognitive abilities for honey bee colonies. I also provide a proposition of research questions which tie in this theme of consistent cognitive proficiency and could provide fruitful areas for future research. N2 - Unter Kognition versteht man die Fähigkeit von Tieren, essenzielle Informationen aus der Umwelt zu erfassen, zu verarbeiten, zu speichern und zu nutzen. Kognitive Prozesse sind notwendig, um die Zukunft vorherzusagen und die Unvorhersehbarkeit der sich ständig verändernden Umwelt zu verringern. Die Forschung der Kognition von Tieren konzentriert sich klassischerweise auf entscheidende kognitive Tests, um die Fähigkeit einer Spezies anhand der Leistungen einiger weniger Individuen zu bestimmen. Bei diesem Ansatz wird die Variabilität zwischen Individuen als unerwünschtes Rauschen betrachtet und daher vernachlässigt. Die interindividuelle Variabilität liefert jedoch wichtige Erkenntnisse über die Plastizität des Verhaltens, die kognitive Spezialisierung und die Modularität des Gehirns. Die Honigbiene Apis mellifera ist aufgrund ihrer eindrucksvollen Fähigkeiten und ihres reichen Verhaltensrepertoires ein robuster und traditioneller Modellorganismus für die Untersuchung von Lernen, Gedächtnis und Kognition. In dieser Arbeit habe ich das Lernverhalten von Honigbienen in einem neuen Blickwinkel betrachtet, indem ich explizit die individuellen Unterschiede bei diversen Lernaufgaben untersucht habe. Zeigen manche Bienen durchweg eine erhöhte Lernleistung im Vergleich zu ihren Schwestern? Wenn ja, erbringt ein Individuum unabhängig von der Zeit, dem Kontext und den kognitiven Anforderungen der Lernaufgaben immer gute Leistungen, oder zeigen Bienen ausgeprägte unabhängige "kognitive Module"? Die vorliegende Doktorarbeit stellt die erste umfassende Untersuchung konsistenter individueller Unterschiede in den kognitiven Fähigkeiten von Honigbienen dar. Um von einem konsistenten Verhalten sprechen zu können, ist es entscheidend das Individuum mehrfach zu testen, um die Wiederholbarkeit eines Verhaltens zu untersuchen. Ich konnte zeigen, dass frei fliegende Bienen bei einer visuellen Unterscheidungsaufgabe an drei aufeinanderfolgenden Tagen eine konsistente Lernleistung zeigen. Im Anschluss untersuchte ich die individuelle Konsistenz der kognitiven Fähigkeiten bei Lernaufgaben mit unterschiedlichen sensorischen Modalitäten, Kontexten und kognitiven Anforderungen. Frei fliegende Bienen zeigten eine kognitive Spezialisierung zwischen visuellem und olfaktorischem Lernen, während sie bei einer einfachen Unterscheidungsaufgabe und einer komplexen Konzeptlernaufgabe konsistent im Lernverhalten blieben. Anschließend wollte ich die individuelle Konsistenz im Lernverhalten bei Aufgaben unterschiedlicher kognitiver Komplexität weiter erforschen, eine Frage, die bisher noch nie bei einem Insekt behandelt wurde. Ich führte dazu eine Reihe von vier Experimenten durch, bei denen entweder visuelle oder olfaktorische Stimuli und ein unterschiedlicher Trainingskontext (frei fliegend oder eingespannt) verwendet wurden. Die Bienen wurden in einer Unterscheidungsaufgabe, einer Umlernaufgabe und in Negative Patterning getestet. Erstaunlicherweise wurden bei diesen Experimenten die gleichen Ergebnisse festgestellt: Die Lernleitung der Bienen in der Unterscheidungsaufgabe zeigte eine positive Korrelation mit der Lernleistung im Umlernen und Negative Patterning. Zwischen dem Umkehrlernen und Negative Patterning konnte jedoch kein Zusammenhang festgestellt werden. Nachdem ich festgestellt hatte, dass es konsistente individuelle Unterschiede in den kognitiven Fähigkeiten von Bienen gibt, wollte ich die Faktoren ermitteln, die diesen Unterschieden zugrunde liegen könnten. Es war bereits bekannt, dass genetische Komponenten der interindividuellen Variabilität im Lernverhalten zugrunde liegen. Deshalb untersuchte ich den Einfluss von genetischer Vielfalt auf die Beständigkeit von kognitiven Fähigkeiten, indem ich Bienen gegenüberstellte, die entweder aus einem Bienenstock mit einer einzigen Patriline (geringe genetische Vielfalt) oder mit mehreren Patrilinen (hohe genetische Vielfalt) stammten. Diese beiden Gruppen von Bienen wiesen Unterschiede in den Mustern der individuellen korrelierten Lernleistungen auf, was darauf hindeutet, dass eine genetische Komponente für kognitive Individualität verantwortlich ist. Ein weiterer wichtiger Faktor, welcher der Variabilität im Lernverhalten zugrunde liegt, ist die individuelle Reaktionsfähigkeit auf Saccharose Lösungen und auf visuelle Stimuli. Dies wurde durch viele Studien an eingespannten Bienen gezeigt, die eine positive Korrelation zwischen der Reaktionsfähigkeit auf aufgabenrelevante Reize und den Lernfähigkeiten feststellten. Ich habe daher untersucht, ob diese Beziehungen zwischen der Reaktionsfähigkeit auf Saccharose und visuellen Stimuli und den Lernleistungen auch für frei fliegende Bienen zutreffen. Die individuellen Lernleistungen im Umlernen und Negative patterning von frei fliegenden Bienen wurden erneut ermittelt und anschließend wurde im Labor die Reaktionsfähigkeit auf Saccharose und Licht getestet. Es gab keine Hinweise auf eine positive Korrelation zwischen der Reaktionsfähigkeit auf Saccharose und Licht und den Lernleistungen von frei fliegenden Bienen. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass Beziehungen zwischen der Reaktionsfähigkeit auf aufgabenrelevante Stimuli und der Lernleistung, die im Labor mit eingespannten Bienen festgestellt wurden, möglicherweise nicht für einen anderen Verhaltenskontext gelten, d. h. für frei fliegende Bienen in ihrer natürlichen Umgebung. Diese Ergebnisse zeigen, dass die Honigbiene ein hervorragendes Insektenmodell ist, um die Konsistenz kognitiver Fähigkeiten zu untersuchen und die zugrunde liegenden Faktoren zu ermitteln. Ich diskutiere die Ergebnisse vor allem im Hinblick auf die Frage der Modularität des Gehirns bei Insekten und die adaptive Bedeutung von individuellen konsistenten kognitiven Fähigkeiten für Honigbienenvölker. Ich schlage auch Forschungsfragen vor, die mit individuellen konsistenten kognitiven Fähigkeiten zusammenhängen und wertvolle Bereiche für künftige Forschungen darstellen könnten. KW - Lernen KW - Biene KW - Kognition KW - Individual differences KW - Cognitive consistency KW - Cognitive profile KW - Learning KW - Honeybee KW - Cognition Y1 - 2024 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-323012 ER - TY - THES A1 - Hartmann, Oliver T1 - Development of somatic modified mouse models of Non-Small cell lung cancer T1 - Entwicklung von somatisch veränderten Mausmodellen für nichtkleinzelligen Lungenkrebs N2 - In 2020, cancer was the leading cause of death worldwide, accounting for nearly 10 million deaths. Lung cancer was the most common cancer, with 2.21 million cases per year in both sexes. This non-homogeneous disease is further subdivided into small cell lung cancer (SCLC, 15%) and non-small cell lung cancer (NSCLC, 85%). By 2023, the American Cancer Society estimates that NSCLC will account for 13% of all new cancer cases and 21% of all estimated cancer deaths. In recent years, the treatment of patients with NSCLC has improved with the development of new therapeutic interventions and the advent of targeted and personalised therapies. However, these advances have only marginally improved the five-year survival rate, which remains alarmingly low for patients with NSCLC. This observation highlights the importance of having more appropriate experimental and preclinical models to recapitulate, identify and test novel susceptibilities in NSCLC. In recent years, the Trp53fl/fl KRaslsl-G12D/wt mouse model developed by Tuveson, Jacks and Berns has been the main in vivo model used to study NSCLC. This model mimics ADC and SCC to a certain extent. However, it is limited in its ability to reflect the genetic complexity of NSCLC. In this work, we use CRISPR/Cas9 genome editing with targeted mutagenesis and gene deletions to recapitulate the conditional model. By comparing the Trp53fl/fl KRaslsl- G12D/wt with the CRISPR-mediated Trp53mut KRasG12D, we demonstrated that both showed no differences in histopathological features, morphology, and marker expression. Furthermore, next-generation sequencing revealed a very high similarity in their transcriptional profile. Adeno-associated virus-mediated tumour induction and the modular design of the viral vector allow us to introduce additional mutations in a timely manner. CRISPR-mediated mutation of commonly mutated tumour suppressors in NSCLC reliably recapitulated the phenotypes described in patients in the animal model. Lastly, the dual viral approach could induce the formation of lung tumours not only in constitutive Cas9 expressing animals, but also in wildtype animals. Thus, the implementation of CRISPR genome editing can rapidly advance the repertoire of in vivo models for NSCLC research. Furthermore, it can reduce the necessity of extensive breeding. N2 - Krebs war mit fast 10 Millionen Todesfällen weltweit die häufigste Todesursache in 2020. Mit 2,21 Millionen Fällen pro Jahr in beiden Geschlechtern kombiniert war Lungenkrebs die häufigste Unterart. Auszeichnend für dieses Krankheit ist die hohe Komplexität und Heterogenität. Daher wird diese weiter in kleinzelligen Lungenkrebs (SCLC, 15 %) und nicht-kleinzelligen Lungenkrebs (NSCLC, 85 %) unterteilt. Die American Cancer Society schätzt, dass bis 2023 13 % aller neuen Krebsfälle und 21 % aller geschätzten Krebstodesfälle auf das nicht-kleinzellige Lungenkarzinom entfallen werden. In den letzten Jahren hat sich die Behandlung von Patienten mit nicht-kleinzelligem Lungenkarzinom durch die Entwicklung neuer therapeutischer Maßnahmen und das Anwenden personalisierter Therapien verbessert. Allerdings haben diese Fortschritte die Fünfjahresüberlebensrate nur geringfügig verbessert, die für Patienten mit NSCLC nach wie vor alarmierend niedrig ist. Diese macht deutlich, wie wichtig es ist, über geeignetere experimentelle und präklinische Modelle zu verfügen, um neue Therapieansätze beim NSCLC zu rekapitulieren, zu identifizieren und zu testen. In der letzten Dekade war das von Tuveson, Jacks und Berns entwickelte Trp53fl/fl KRaslsl-G12D/wt-Mausmodell das wichtigste In-vivo-Modell zur Untersuchung von NSCLC. Dieses kann grundlegend das Krankheitsbild von NSCLC wiederspiegeln. Es ist jedoch nur begrenzt in der Lage, die genetische Komplexität von NSCLC im vollen Umfang zu refelktieren. In dieser Arbeit verwenden wir CRISPR/Cas9 Genome Editing mit gezielter Mutagenese und Gendeletionen, um das konditionale Modell zu rekapitulieren. Durch den Vergleich des Trp53fl/fl KRaslsl-G12D/wt mit dem CRISPR-vermittelten Trp53mut KRasG12D konnten wir zeigen, dass beide keine Unterschiede in Bezug auf histopathologische Merkmale, Morphologie und Markerexpression aufweisen. Darüber hinaus ergab die Analyse mittels Next Generation Sequencing 8Hochdruchsatz.Sequenzierung) eine sehr große Ähnlichkeit in ihrem Transkriptionsprofil. Die Adeno-assoziierte Virus-vermittelte Tumorinduktion und der modulare Aufbau des viralen Vektors ermöglichen es uns, zusätzliche Mutationen zeitnah einzuführen. Die CRISPR-vermittelte Mutation von häufig mutierten Tumorsuppressoren bei NSCLC rekapitulierte zuverlässig die bei Patienten beschriebenen Phänotypen im Tiermodell. Schließlich konnte der duale virale Ansatz die Bildung von Lungentumoren nicht nur in konstitutiv Cas9 exprimierenden Tieren, sondern auch in Wildtyp-Tieren induzieren. Somit kann die Anwendung von CRISPR-Genome Editing das Repertoire an In-vivo- Modellen für die NSCLC-Forschung rasch erweitern. Darüber hinaus kann es die Notwendigkeit umfangreicher Züchtungen verringern. KW - CRISPR/Cas-Methode KW - in vivo KW - Lung Cancer KW - CRISPR/Cas9 KW - in vivo genome editing KW - Immunohistochemistry KW - Nicht-kleinzelliges Bronchialkarzinom KW - NSCLC KW - Mouse Model KW - CRISPR Y1 - 2024 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-363401 ER - TY - THES A1 - Birke, Claudius B. T1 - Low Mach and Well-Balanced Numerical Methods for Compressible Euler and Ideal MHD Equations with Gravity T1 - Low Mach und Well-Balanced Numerische Verfahren für die kompressiblen Euler und idealen MHD Gleichungen mit Gravitation N2 - Physical regimes characterized by low Mach numbers and steep stratifications pose severe challenges to standard finite volume methods. We present three new methods specifically designed to navigate these challenges by being both low Mach compliant and well-balanced. These properties are crucial for numerical methods to efficiently and accurately compute solutions in the regimes considered. First, we concentrate on the construction of an approximate Riemann solver within Godunov-type finite volume methods. A new relaxation system gives rise to a two-speed relaxation solver for the Euler equations with gravity. Derived from fundamental mathematical principles, this solver reduces the artificial dissipation in the subsonic regime and preserves hydrostatic equilibria. The solver is particularly stable as it satisfies a discrete entropy inequality, preserves positivity of density and internal energy, and suppresses checkerboard modes. The second scheme is designed to solve the equations of ideal MHD and combines different approaches. In order to deal with low Mach numbers, it makes use of a low-dissipation version of the HLLD solver and a partially implicit time discretization to relax the CFL time step constraint. A Deviation Well-Balancing method is employed to preserve a priori known magnetohydrostatic equilibria and thereby reduces the magnitude of spatial discretization errors in strongly stratified setups. The third scheme relies on an IMEX approach based on a splitting of the MHD equations. The slow scale part of the system is discretized by a time-explicit Godunov-type method, whereas the fast scale part is discretized implicitly by central finite differences. Numerical dissipation terms and CFL time step restriction of the method depend solely on the slow waves of the explicit part, making the method particularly suited for subsonic regimes. Deviation Well-Balancing ensures the preservation of a priori known magnetohydrostatic equilibria. The three schemes are applied to various numerical experiments for the compressible Euler and ideal MHD equations, demonstrating their ability to accurately simulate flows in regimes with low Mach numbers and strong stratification even on coarse grids. N2 - Physikalische Regime mit sehr niedrigen Machzahlen und starken Abschichtungen stellen konventionelle Finite Volumen Verfahren vor erhebliche Herausforderungen. In dieser Arbeit präsentieren wir drei neue Verfahren, die in der Lage sind, die Herausforderungen zu bewältigen. Die neuen Verfahren sind speziell an kleine Machzahlen angepasst und können (magneto-)hydrostatische Gleichgewichte exakt erhalten. Diese Eigenschaften sind essentiell für eine effiziente Berechnung präziser Lösungen in den betrachteten Regimen. Zunächst konzentrieren wir uns auf die Konstruktion eines approximativen Riemannlösers innerhalb von Godunov-artigen Finite Volumen Verfahren. Ein neues Relaxationssystem führt zu einem Relaxationslöser für die Euler Gleichungen mit Gravitation, der zwei Relaxationsgeschwindigkeiten verwendet. Abgeleitet von grundlegenden mathematischen Prinzipien reduziert dieser Löser die künstliche Dissipation im subsonischen Bereich und erhält hydrostatische Gleichgewichte. Der Löser ist besonders stabil, da er eine diskrete Entropieungleichung erfüllt, die Positivität von Dichte und interner Energie bewahrt und Schachbrettmuster unterdrückt. Das zweite Verfahren löst die idealen MHD Gleichungen und kombiniert verschiedene Ansätze, um die einzelnen numerischen Herausforderungen zu bewältigen. Für einen effizienten Umgang mit niedrigen Machzahlen wird eine Variante des HLLD Lösers mit künstlich niedriger Dissipation sowie eine teilweise implizite Zeitdiskretisierung zur Lockerung der CFL Zeitschrittbeschränkung gewählt. Eine Deviation Well-Balancing Methode wird angewendet, um magnetohydrostatische Gleichgewichte zu bewahren und dadurch das Ausmaß von räumlichen Diskretisierungsfehlern in stark geschichteten Atmosphären zu reduzieren. Das dritte Verfahren verwendet einen IMEX Ansatz, welcher auf einer Aufspaltung der MHD Gleichungen basiert. Das Teilsystem mit langsamen Ausbreitungsgeschwindigkeiten wird durch eine zeit-explizite Godunov-artige Methode diskretisiert, während das Teilsystem mit schnellen Ausbreitungsgeschwindigkiten implizit durch zentrale finite Differenzen diskretisiert wird. Numerische Dissipationsterme und die CFL Zeitschrittbeschränkung der Methode hängen somit nur von den langsamen Wellen des expliziten Teils ab, so dass die Methode besonders für subsonische Regime geeignet ist. Deviation Well-Balancing gewährleistet die Erhaltung a priori bekannter magnetohydrostatischer Gleichgewichte. Die drei Verfahren werden auf numerische Experimente für die kompressiblen Euler und idealen MHD Gleichungen angewendet und zeigen darin ihre Fähigkeit, Strömungen in Regimen mit niedrigen Machzahlen und starker Schichtung auch auf groben diskreten Gittern akkurat zu simulieren. KW - Magnetohydrodynamik KW - Numerische Strömungssimulation KW - Finite-Volumen-Methode KW - relaxation method KW - IMEX scheme KW - low Mach number KW - well-balanced Y1 - 2024 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-363303 ER - TY - THES A1 - Ramirez, Yesid A. T1 - Structural basis of ubiquitin recognition and rational design of novel covalent inhibitors targeting Cdu1 from \(Chlamydia\) \(Trachomatis\) T1 - Strukturelle Grundlage der Ubiquitin-Erkennung und rationales Design neuer kovalenter Inhibitoren gegen die Deubiquitinylase Cdu1 aus \(Chlamydia\) \(Trachomatis\) N2 - The WHO-designated neglected-disease pathogen Chlamydia trachomatis (CT) is a gram-negative bacterium responsible for the most frequently diagnosed sexually transmitted infection worldwide. CT infections can lead to infertility, blindness and reactive arthritis, among others. CT acts as an infectious agent by its ability to evade the immune response of its host, which includes the impairment of the NF-κB mediated inflammatory response and the Mcl1 pro-apoptotic pathway through its deubiquitylating, deneddylating and transacetylating enzyme ChlaDUB1 (Cdu1). Expression of Cdu1 is also connected to host cell Golgi apparatus fragmentation, a key process in CT infections. Cdu1 may this be an attractive drug target for the treatment of CT infections. However, a lead molecule for the development of novel potent inhibitors has been unknown so far. Sequence alignments and phylogenetic searches allocate Cdu1 in the CE clan of cysteine proteases. The adenovirus protease (adenain) also belongs to this clan and shares a high degree of structural similarity with Cdu1. Taking advantage of topological similarities between the active sites of Cdu1 and adenain, a target-hopping approach on a focused set of adenain inhibitors, developed at Novartis, has been pursued. The thereby identified cyano-pyrimidines represent the first active-site directed covalent reversible inhibitors for Cdu1. High-resolution crystal structures of Cdu1 in complex with the covalently bound cyano-pyrimidines as well as with its substrate ubiquitin have been elucidated. The structural data of this thesis, combined with enzymatic assays and covalent docking studies, provide valuable insights into Cdu1s activity, substrate recognition, active site pocket flexibility and potential hotspots for ligand interaction. Structure-informed drug design permitted the optimization of this cyano-pyrimidine based scaffold towards HJR108, the first molecule of its kind specifically designed to disrupt the function of Cdu1. The structures of potentially more potent and selective Cdu1 inhibitors are herein proposed. This thesis provides important insights towards our understanding of the structural basis of ubiquitin recognition by Cdu1, and the basis to design highly specific Cdu1 covalent inhibitors. N2 - Der Krankheitserreger Chlamydia trachomatis (CT) - ein gramnegatives Bakterium - ist verantwortlich für die häufigste sexuell übertragene Infektionskrankheit weltweit, die CT basierte Chlamydiose. Sie wird von der Weltgesundheitsorganisation zu den vernachlässigten Krankheiten gezählt. CT Infektionen können unter anderem zu Unfruchtbarkeit, Erblindung und reaktiver Arthritis führen. CT agiert als Krankheitserreger mittels seiner Fähigkeit, die Immunantwort des Wirts zu umgehen. Dies umfasst unter anderem die Schwächung und Störung der NF-κB vermittelten Entzündungsantwort und des Mcl1 pro-Apoptoseweges über ihr deubiquitinierendes, deneddylierendes und trans-acetylierendes Enzym ChlaDub1 (Cdu1). Die Expression von Cdu1 ist aber auch mit der Fragmentierung des Golgi-Apparates des Wirtes verknüpft, ein Schlüsselprozess bei Infektionen mit CT. Cdu1 ist daher vermutlich ein attraktives Zielprotein für die Entwicklung von Wirkstoffen, um CT Infektionen zu behandeln. Eine Leitstrukturverbindung zur Entwicklung neuer wirksamer Inhibitoren war bislang jedoch noch nicht bekannt. Sequenzvergleiche und phylogenetische Untersuchungen verorten Cdu1 im CE Clan der Cysteinproteasen. Die Adenovirus-Protease (Adenain) gehört ebenfalls diesem Clan an und besitzt strukturelle Ähnlichkeit mit Cdu1. Unter Ausnutzung der topologischen Ähnlichkeiten der aktiven Zentren von Cdu1 und Adenain wurde ein Target-Hopping Ansatz mit einem klar definierten und fokussierten Satz von bei Novartis entwickelten Adenain-Inhibitoren verfolgt. Die hierbei identifizierten Cyano-Pyrimidine stellen die ersten kovalenten Inhibitoren von Cdu1 dar, die an das aktive Zentrum von Cdu1 binden und es direkt adressieren. Hochauflösend wurden Kristallstrukturen sowohl von Komplexen von Cdu1 mit kovalent gebundenen Cyano-Pyrimidinen als auch mit Cdu1’s natürlichem Substrat Ubiquitin bestimmt. Die Kristallstrukturdaten dieser Doktorarbeit in Kombination mit Enzymassays und kovalenten Docking-Studien liefern wertvolle Hinweise bezüglich der Aktivität des Enzyms, der molekularen Substraterkennung, der Flexibiliät der Proteintasche rund um das aktive Zentrum und potentielle Hotspots für die Wechselwirkung mit Liganden. Ein strukturbasiertes Wirkstoffdesign erlaubte die Optimierung des Cyano-Pyrimidin-basierten Molekülgerüstes, die zu der Entwicklung der HJR108 Verbindung führte. Es ist das erste Molekül seiner Art, das speziell dazu entworfen wurde Cdu1 zu inhibieren. Strukturen potentiell noch wirksamerer und selektiver Cdu1 Inhibitoren werden in dieser Arbeit vorgeschlagen. Diese Dissertationsschrift liefert somit wertvolle Beiträge zum Verständnis der strukturellen Grundlagen der molekularen Erkennung von Ubiquitin durch Cdu1 und Hinweise, die die Entwicklung hoch-spezifischer kovalenter Cdu1 Inhibitoren erlauben sollten. KW - CE Proteaes KW - covalent inhibition KW - drug repurposing KW - DUB KW - Ubiquitin KW - Inhibitor KW - Chlamydia trachomatis Y1 - 2024 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-191683 ER - TY - THES A1 - Schulz, Daniel T1 - Development of Inhibitory Control in Kindergarten Children T1 - Entwicklung von Inhibitionskontrolle bei Kindern im Kindergartenalter N2 - This dissertation explores the development and assessment of inhibitory control – a crucial component of executive functions – in young children. Inhibitory control, defined as the ability to suppress inappropriate responses (Verbruggen & Logan, 2008), is essential for adaptable and goal-oriented behavior. The rapid and non-linear development of this cognitive function in early childhood presents unique challenges for accurate assessment. As children age, they often exhibit a ceiling effect in terms of response accuracy (Petersen et al., 2016), underscoring the need to consider response latency as well. Ideally, combining response latency with accuracy could yield a more precise measure of inhibitory control (e.g., Magnus et al., 2019), facilitating a detailed tracking of developmental changes in inhibitory control across a wider age spectrum. The three studies of this dissertation collectively aim to clarify the relationship between response accuracy, response latency, and inhibitory control across different stages of child development. Each study utilizes a computerized Pointing Stroop Task (Berger et al., 2000) to measure inhibitory control, examining the task's validity and the integration of dual metrics for a more comprehensive evaluation. The first study focuses on establishing the validity of using both response accuracy and latency as indicators of inhibitory control. Utilizing the framework of explanatory item-response modeling (De Boeck & Wilson, 2004), the study revealed how the task characteristics congruency and item position influence both the difficulty level and timing aspects in young children’s responses in the computerized Pointing Stroop task. Further, this study found that integrating response accuracy with latency, even in a basic manner, provides additional insights. Building upon these findings, the second study investigates the nuances of integrating response accuracy and latency, examining whether this approach can account for age-related differences in inhibitory control. It also explores whether response latencies may contain different information depending on the age and proficiency of the children. The study leverages novel and established methodological perspectives to integrate response accuracy and latency into a single metric, showing the potential applicability of different approaches for assessing inhibitory control development. The third study extends the investigation to a longitudinal perspective, exploring the dynamic relationship between response accuracy, latency, and inhibitory control over time. It assesses whether children who achieve high accuracy at an earlier age show faster improvement in response latency, suggesting a non-linear maturation pathway of inhibitory control. The study also examines if the predictive value of early response latency for later fluid intelligence is dependent on the response accuracy level. Together, these empirical studies contribute to a more robust understanding of the complex interaction between inhibitory control, response accuracy, and response latency, facilitating valid evaluations of cognitive capabilities in children. Moreover, the findings may have practical implications for designing educational strategies and clinical interventions that address the developmental trajectory of inhibitory control. The nuanced approach advocated in this dissertation suggests prioritizing accuracy in assessment and interventions during the early stages of children's cognitive development, gradually shifting the focus to response latency as children mature and secure their inhibitory control abilities. N2 - Die vorliegende Dissertation erforscht die Erfassung und Entwicklung von Inhibitionskontrolle bei jungen Kindern – einer zentralen Komponente der Exekutiven Funktionen. Inhibitionskontrolle, also die Fähigkeit, automatisierte aber unangemessene Reaktionen zu unterdrücken (Verbruggen & Logan, 2008), ist wesentlich für adaptives und zielgerichtetes Verhalten. Die schnelle und nichtlineare Entwicklung dieser kognitiven Funktion im frühen Kindesalter gestaltet eine präzise Messung herausfordernd. Mit zunehmendem Alter der Kinder zeigt sich häufig ein Deckeneffekt hinsichtlich der Antwortgenauigkeit (Petersen et al., 2016), was die Notwendigkeit hervorhebt, auch die Reaktionszeit in Betracht zu ziehen. Idealerweise könnte durch die Integration von Reaktionszeit und Antwortgenauigkeit ein Messwert berechnet werden (z.B. Magnus et al., 2019), welcher eine detaillierte Erfassung von Entwicklungsveränderungen der Inhibitionskontrolle über ein breiteres Altersspektrum hinweg ermöglicht. Die drei Studien dieser Dissertation zielen darauf ab, die Beziehung zwischen Antwortgenauigkeit, Reaktionszeit und Inhibitionskontrolle in verschiedenen Stadien der kindlichen Entwicklung zu untersuchen. Jede Studie nutzt eine computergestützte Inhibitionsaufgabe, den computerized Pointing-Stroop Task (cPST; Berger et al., 2000), um die Inhibitionskontrolle zu messen, wobei die Validität dieses Tests und die Integration von Antwortgenauigkeit und Reaktionszeit für eine umfassendere Bewertung untersucht werden. In der ersten Studie wird untersucht, ob sowohl Antwortgenauigkeit als auch Reaktionszeit valide Indikatoren für Inhibitionskontrolle in jungen Kindern darstellen. Unter Verwendung von explanatorischen Item-Response-Modellen zeigte die Studie, wie die Aufgabenmerkmale Kongruenz und Item-Position die Aufgabenschwierigkeit sowohl in Bezug auf Antwortgenauigkeit als auch Reaktionszeit im cPST beeinflussen. Darüber hinaus zeigten sich erste Hinweise, dass bereits eine rudimentäre Integration von Antwortgenauigkeit und Reaktionszeit zusätzliche Einsichten liefert. Aufbauend auf diesen Erkenntnissen untersucht die zweite Studie die Feinheiten der Integration von Antwortgenauigkeit und Reaktionszeit und prüft, ob moderne Methoden der Integration dieser beiden Metriken altersbedingte Unterschiede in der Inhibitionskontrolle berücksichtigen können. Sie erforscht auch, ob sich aus den Reaktionszeiten in Inhibitionsaufgaben, abhängig vom Alter und Können der Kinder, unterschiedliche Schlussfolgerungen ziehen lassen. Die Studie nutzt neue und etablierte methodische Ansätze, um Antwortgenauigkeit und Reaktionszeit zu einer Metrik zu integrieren und zeigt die potenzielle Anwendbarkeit verschiedener Ansätze zur Bewertung der Entwicklung der Inhibitionskontrolle. Die dritte Studie erweitert die Untersuchung auf eine Längsschnittperspektive und erforscht die dynamische Beziehung zwischen Antwortgenauigkeit, Reaktionszeit und Inhibitionskontrolle im Laufe der Entwicklung. Sie betrachtet, ob Kinder, die in jüngerem Alter eine hohe Genauigkeit erreichen, eine schnellere Verbesserung in der Reaktionszeit zeigen. Die Studie untersucht weiter, ob der prädiktive Wert von Reaktionszeit für zukünftige fluide Intelligenz in Abhängigkeit zu der Antwortgenauigkeit steht. Zusammen tragen diese empirischen Arbeiten zu einem tieferen Verständnis der komplexen Interaktion zwischen Inhibitionskontrolle, Antwortgenauigkeit und Reaktionszeit bei und erleichtern valide Bewertungen dieser kognitiven Fähigkeiten bei Kindern. Darüber hinaus könnten die Ergebnisse praktische Implikationen für die Gestaltung von Interventionen haben, die sich mit dem Entwicklungsverlauf der Inhibitionskontrolle befassen. Der in dieser Dissertation vertretene Ansatz legt nahe, Antwortgenauigkeit bei der Bewertung und Interventionen während der frühen Phasen der kognitiven Entwicklung von Kindern zu priorisieren und den Fokus allmählich auf die Reaktionszeit zu verlagern, sobald Kinder ihre Inhibitionskontrolle festigen und ausbauen. KW - Kognitive Entwicklung KW - Kognition KW - Psychologie KW - Executive Functions KW - Inhibitory Control KW - Inhibitionskontrolle KW - Linear-Mixed Models KW - Linear Gemischte Modelle KW - Cognition KW - Child Development KW - Kindliche Entwicklung KW - Exekutive Funktionen KW - Kinderentwicklung Y1 - 2024 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-357152 ER - TY - THES A1 - Bossert, Patrick T1 - Statistical structure and inference methods for discrete high-frequency observations of SPDEs in one and multiple space dimensions T1 - Statistische Struktur und Inferenzmethoden für diskrete hochfrequente Beobachtungen von SPDEs in einer und mehreren Raumdimensionen N2 - The focus of this thesis is on analysing a linear stochastic partial differential equation (SPDE) with a bounded domain. The first part of the thesis commences with an examination of a one-dimensional SPDE. In this context, we construct estimators for the parameters of a parabolic SPDE based on discrete observations of a solution in time and space on a bounded domain. We establish central limit theorems for a high-frequency asymptotic regime, showing substantially smaller asymptotic variances compared to existing estimation methods. Moreover, asymptotic confidence intervals are directly feasible. Our approach builds upon realized volatilities and their asymptotic illustration as the response of a log-linear model with a spatial explanatory variable. This yields efficient estimators based on realized volatilities with optimal rates of convergence and minimal variances. We demonstrate our results by Monte Carlo simulations. Extending this framework, we analyse a second-order SPDE model in multiple space dimensions in the second part of this thesis and develop estimators for the parameters of this model based on discrete observations in time and space on a bounded domain. While parameter estimation for one and two spatial dimensions was established in recent literature, this is the first work that generalizes the theory to a general, multi-dimensional framework. Our methodology enables the construction of an oracle estimator for volatility within the underlying model. For proving central limit theorems, we use a high-frequency observation scheme. To showcase our results, we conduct a Monte Carlo simulation, highlighting the advantages of our novel approach in a multi-dimensional context. N2 - Der Fokus dieser Dissertation liegt auf der Analyse von linearen stochastischen partiellen Differentialgleichungen (SPDEs) auf einem beschränkten Raum. Der erste Teil der Arbeit befasst sich mit der Untersuchung einer eindimensionalen SPDE. In diesem Zusammenhang konstruieren wir Schätzer für die Parameter einer parabolischen SPDE basierend auf diskreten Beobachtungen einer Lösung in Zeit und Raum. Wir leiten zentrale Grenzwertsätze innerhalb eines hochfrequenten Beobachtungsschemas her und zeigen dabei, dass die neu entwickelten Schätzer wesentlich kleinere asymptotische Varianzen im Vergleich zu bestehenden Schätzmethoden besitzen. Darüber hinaus sind asymptotische Konfidenzintervalle direkt realisierbar. Unser Ansatz basiert auf realisierten Volatilitäten und ihrer asymptotischen Darstellung durch ein log-lineares Modell mit einer räumlichen erklärenden Variable. Dies ergibt effiziente Schätzer basierend auf realisierten Volatilitäten mit optimalen Konvergenzraten und minimalen Varianzen. Wir demonstrieren unsere Ergebnisse mithilfe von Monte-Carlo-Simulationen. Den ersten Teil erweiternd, analysieren wir im zweiten Teil dieser Arbeit ein SPDE-Modell zweiter Ordnung in mehreren Raumdimensionen und entwickeln Schätzer für die Parameter dieses Modells basierend auf diskreten Beobachtungen in Zeit und Raum auf einem begrenzten Gebiet. Während die Parameterschätzung für eine und zwei Raumdimensionen in der Literatur bereits behandelt wurde, ist dies die erste Arbeit, die die Theorie auf einen multidimensionalen Rahmen verallgemeinert. Unsere Methodik ermöglicht die Konstruktion eines Orakelschätzers für den Volatilitätsparameter innerhalb des zugrundeliegenden Modells. Für den Beweis zentraler Grenzwertsätze verwenden wir ein hochfrequentes Beobachtungsschema. Um unsere Ergebnisse zu veranschaulichen, führen wir eine Monte-Carlo-Simulation durch, wobei wir die zugrundeliegende Simulationsmethodik hierfür herleiten. KW - Stochastische partielle Differentialgleichung KW - Multi-dimensional SPDEs KW - Central limit theorem under dependence KW - High-frequency data KW - Least squares estimation KW - One-dimensional SPDEs Y1 - 2024 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-361130 ER - TY - THES A1 - Wagner, Tim Matthias T1 - Characterization of 2D antimony lattices T1 - Charakterisierung 2D Antimon Atomgitter N2 - Two-dimensional lattices are in the focus of research in modern solid state physics due to their novel and exotic electronic properties with tremendous potential for seminal future applications. Of particular interest within this research field are quantum spin Hall insulators which are characterized by an insulating bulk with symmetry-protected metallic edge states. For electrons within these one-dimensional conducting channels, spin-momentum locking enables dissipationless transport - a property which promises nothing short of a revolution for electronic devices. So far, however, quantum spin Hall materials require enormous efforts to be realized such as cryogenic temperatures or ultra-high vacuum. A potential candidate to overcome these shortcomings are two-dimensional lattices of the topological semi-metal antimony due to their potential to host the quantum spin Hall effect while offering improved resilience against oxidation. In this work, two-dimensional lattices of antimony on different substrates, namely Ag(111), InSb(111) and SiC(0001), are investigated regarding their atomic structure and electronic properties with complimentary surface sensitive techniques. In addition, a systematic oxidation study compares the stability of Sb-SiC(0001) with that of the two-dimensional topological insulators bismuthene-SiC(0001) and indenene-SiC(0001). A comprehensive experimental analysis of the \((\sqrt{3}\times\sqrt{3})R30^\circ\) Sb-Ag(111) surface, including X-ray standing wave measurements, disproves the proclaimed formation of a buckled antimonene lattice in literature. The surface lattice can instead be identified as a metallic Ag\(_2\)Sb surface alloy. Antimony on InSb(111) shows an unstrained Volmer-Weber island growth due to its large lattice mismatch to the substrate. The concomitant moir\'{e} situation at the interface imprints mainly in a periodic height corrugation of the antimony islands which as observed with scanning tunneling microscopy. On islands with various thicknesses, quasiparticle interference patterns allow to trace the topological surface state of antimony down to the few-layer limit. On SiC(0001), two different two-dimensional antimony surface reconstructions are identified. Firstly, a metallic triangular $1\times1$ lattice which constitutes the antimony analogue to the topological insulator indenene. Secondly, an insulating asymmetric kagome lattice which represents the very first realized atomic surface kagome lattice. A comparative, systematic oxidation study of elemental (sub-)monolayer materials on SiC(0001) reveals a high sensitivity of indenene and bismuthene to small dosages of oxygen. An improved resilience is found for Sb-SiC(0001) which, however, oxidizes nevertheless if exposed to oxygen. These surface lattices are therefore not suitable for future applications without additional protective measures. N2 - Zweidimensionale Kristallgitter sind aufgrund ihrer neuartigen, exotischen elektronischen Eigenschaften ein hochaktuelles Thema der modernen Festkörperphysik mit enormen Potential für bahnbrechende zukünftige Anwendungen. Die Klasse der Quanten-Spin-Hall-Isolatoren erfährt in diesem Zusammenhang besondere Aufmerksamkeit in der aktuellen Forschung aufgrund ihrer durch Symmetrie geschützten, metallischen Randkanäle. In diesen ermöglicht das sogenannte "spin-momentum locking" der Elektronen einen verlustfreien Ladungstransport - eine Eigenschaft, die nichts weniger als eine Revolution auf dem Gebiet der Elektronik verspricht. Bisher konnten Quanten-Spin-Hall-Isolatoren allerdings nur unter enormem Aufwand bei kryogenen Temperaturen oder im Ultrahochvakuum realisiert werden. Eine Materialkandidat welcher es ermöglichen könnte diese Unzulänglichkeit-en zu überwinden, sind zweidimensionale Gitter des topologischen Halbmetalls Antimon. Diese zeigen zum einen eine erhöhte Widerstandsfähigkeit gegen Oxidation und gelten zum anderen als potentielle Kandidaten für die Realisierung eben jenes Quanten-Spin-Hall-Effekts. Im Rahmen dieser Arbeit werden zweidimensionale Antimongitter auf unterschiedlichen Substraten, nämlich Ag(111), InSb(111) und SiC(0001), mit komplementären oberflächensensitiven Messmethoden hinsichtlich ihrer atomaren Struktur und elektronischen Eigenschaften untersucht. Zusätzlich wird mittels einer systematischen Oxydationsstudie die Stabilität von Sb-SiC(0001) mit derjenigen der topologischen Isolatoren Bismuthene-SiC(0001) und Indenene-SiC(0001) verglichen. Eine umfängliche experimentelle Analyse der \((\sqrt{3}\times\sqrt{3})R30^\circ\) Sb-Ag(111) Oberfläche, inklusive stehenden Röntgenwellenfeldern, widerlegt die in der Literatur beschriebene Ausbildung eines gefalteten Antimonene-Gitters. Die Oberflächenstruktur kann stattdessen als metallische Ag\(_2\)Sb Oberflächenlegierung identifiziert werden. Auf InSb(111) zeigt Antimon, bedingt durch den großen Unterschied in der Gitterkonstante, ein unverzerrtes Volmer-Weber Inselwachstum. Die damit einhergehende Moir\'{e} Situation an der Grenzfläche spiegelt sich dabei in einer periodischen Wellung der Oberfläche wieder. Auf Antimon-Inseln unterschiedlicher Dicke kann der topologische Oberflächenzustand mittels Quasi-Teilchen-Interferenzmustern bis hinab auf Schichtdicken von wenigen Atomlagen beobachtet werden. Auf SiC(0001) können zwei unterschiedliche zweidimensionale Oberflächenrekonstruktionen von Antimon identifiziert werden. Zum einen ein metallisches $1\times1$ Dreiecksgitter, dem Antimon-Analogon zum topologischen Isolator Indenene. Zum anderen ein isolierendes asymme-trisches Antimon Kagomegitter - das Erste jemals hergestellte atomare Oberflächengitter mit Kagome-Struktur. Eine vergleichende systematische Oxydationsstudie von elementaren (Sub-)Monolagen-materialien auf SiC(0001) zeigt eine hohe Anfälligkeit von Indenene und Bismuthene gegen-über selbst kleinen Dosen an Sauerstoff. Sb-SiC(0001) zeigt eine deutlich stärkere Oxidationsresistenz, oxidiert aber ebenfalls in Kontakt mit Sauerstoff. Die untersuchten Oberflächengitter sind somit ohne zusätzliche Schutzmaßnahmen nicht für zukünftige Anwendungen nutzbar. KW - Antimon KW - experimental physics KW - condensed matter KW - 2D KW - antimony KW - ultra high vacuum KW - scanning tunneling microscopy KW - angle resolved photoemission spectroscopy KW - epitaxial growth KW - topological insulator KW - kagome lattice KW - Atomgitter Y1 - 2024 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-363292 ER - TY - THES A1 - Körner, Jacob T1 - Theoretical and numerical analysis of Fokker–Planck optimal control problems by first– and second–order optimality conditions T1 - Theoretische und numerische Analysis von Fokker-Planck optimalen Steuerungsproblemen mittels Optimalitätsbedingung erster und zweiter Ordnung N2 - In this thesis, a variety of Fokker--Planck (FP) optimal control problems are investigated. Main emphasis is put on a first-- and second--order analysis of different optimal control problems, characterizing optimal controls, establishing regularity results for optimal controls, and providing a numerical analysis for a Galerkin--based numerical scheme. The Fokker--Planck equation is a partial differential equation (PDE) of linear parabolic type deeply connected to the theory of stochastic processes and stochastic differential equations. In essence, it describes the evolution over time of the probability distribution of the state of an object or system of objects under the influence of both deterministic and stochastic forces. The FP equation is a cornerstone in understanding and modeling phenomena ranging from the diffusion and motion of molecules in a fluid to the fluctuations in financial markets. Two different types of optimal control problems are analyzed in this thesis. On the one hand, Fokker--Planck ensemble optimal control problems are considered that have a wide range of applications in controlling a system of multiple non--interacting objects. In this framework, the goal is to collectively drive each object into a desired state. On the other hand, tracking--type control problems are investigated, commonly used in parameter identification problems or stemming from the field of inverse problems. In this framework, the aim is to determine certain parameters or functions of the FP equation, such that the resulting probability distribution function takes a desired form, possibly observed by measurements. In both cases, we consider FP models where the control functions are part of the drift, arising only from the deterministic forces of the system. Therefore, the FP optimal control problem has a bilinear control structure. Box constraints on the controls may be present, and the focus is on time--space dependent controls for ensemble--type problems and on only time--dependent controls for tracking--type optimal control problems. In the first chapter of the thesis, a proof of the connection between the FP equation and stochastic differential equations is provided. Additionally, stochastic optimal control problems, aiming to minimize an expected cost value, are introduced, and the corresponding formulation within a deterministic FP control framework is established. For the analysis of this PDE--constrained optimal control problem, the existence, and regularity of solutions to the FP problem are investigated. New $L^\infty$--estimates for solutions are established for low space dimensions under mild assumptions on the drift. Furthermore, based on the theory of Bessel potential spaces, new smoothness properties are derived for solutions to the FP problem in the case of only time--dependent controls. Due to these properties, the control--to--state map, which associates the control functions with the corresponding solution of the FP problem, is well--defined, Fréchet differentiable and compact for suitable Lebesgue spaces or Sobolev spaces. The existence of optimal controls is proven under various assumptions on the space of admissible controls and objective functionals. First--order optimality conditions are derived using the adjoint system. The resulting characterization of optimal controls is exploited to achieve higher regularity of optimal controls, as well as their state and co--state functions. Since the FP optimal control problem is non--convex due to its bilinear structure, a first--order analysis should be complemented by a second--order analysis. Therefore, a second--order analysis for the ensemble--type control problem in the case of $H^1$--controls in time and space is performed, and sufficient second--order conditions are provided. Analogous results are obtained for the tracking--type problem for only time--dependent controls. The developed theory on the control problem and the first-- and second--order optimality conditions is applied to perform a numerical analysis for a Galerkin discretization of the FP optimal control problem. The main focus is on tracking-type problems with only time--dependent controls. The idea of the presented Galerkin scheme is to first approximate the PDE--constrained optimization problem by a system of ODE--constrained optimization problems. Then, conditions on the problem are presented such that the convergence of optimal controls from one problem to the other can be guaranteed. For this purpose, a class of bilinear ODE--constrained optimal control problems arising from the Galerkin discretization of the FP problem is analyzed. First-- and second--order optimality conditions are established, and a numerical analysis is performed. A discretization with linear finite elements for the state and co--state problem is investigated, while the control functions are approximated by piecewise constant or piecewise quadratic continuous polynomials. The latter choice is motivated by the bilinear structure of the optimal control problem, allowing to overcome the discrepancies between a discretize--then--optimize and optimize--then--discretize approach. Moreover, second--order accuracy results are shown using the space of continuous, piecewise quadratic polynomials as the discrete space of controls. Lastly, the theoretical results and the second--order convergence rates are numerically verified. N2 - In dieser Dissertation werden verschiedene Fokker--Planck (FP) optimale Steuerungsprobleme untersucht. Die Schwerpunkte liegen auf einer Analyse von Optimalitätsbedingungen erster und zweiter Ordnung, der Charakterisierung optimaler Steuerungen, dem Herleiten höhere Regularität von optimalen Kontrollen sowie einer theoretischen numerischen Analyse für ein numerisches Verfahren basierend auf einer Galerkin Approximation. Die Fokker--Planck Gleichung ist eine lineare, parabolische, partielle Differentialgleichung (PDE), die aus dem Gebiet stochastischer Differentialgleichungen und stochastischer Prozesse stammt. Im Wesentlichen beschreibt sie die zeitliche Entwicklung der Wahrscheinlichkeitsverteilung des Zustands eines Objekts bzw. eines Systems von Objekten unter dem Einfluss sowohl deterministischer als auch stochastischer Kräfte. Die Fokker--Planck Gleichung ist ein Eckpfeiler zum Verständnis und Modellieren von Phänomenen, die von der Diffusion und Bewegung von Molekülen in einer Flüssigkeit bis hin zu den Schwankungen in Finanzmärkten reichen. Zwei verschiedene Arten von optimalen Kontrollproblemen werden in dieser Arbeit umfassend analysiert. Einerseits werden Fokker--Planck Ensemble Steuerungsprobleme betrachtet, die in der Kontrolle von Systemen mit mehreren nicht wechselwirkenden Objekten vielfältige Anwendungen haben. In diesem Gebiet ist das Ziel, alle Objekte gemeinsam in einen gewünschten Zustand zu lenken. Andererseits werden Tracking Kontrollprobleme untersucht, die häufig bei Parameteridentifikationsproblemen auftreten oder aus dem Bereich inverser Probleme stammen. Hier besteht das Ziel darin, bestimmte Parameter oder Funktionen der Fokker--Planck Gleichung derart zu bestimmen, dass die resultierende Wahrscheinlichkeitsverteilung eine gewünschte Form annimmt, welche beispielsweise durch Messungen beobachtet wurde. In beiden Fällen betrachten wir FP Modelle, bei denen die Kontrollfunktion Teil des sogenannten Drifts ist, das heißt der Teil, der nur aus den deterministischen Kräften des Systems resultiert. Daher hat das FP Kontrollproblem eine bilineare Struktur. Untere und obere Schranken für die Kontrollfunktionen können vorhanden sein, und der Fokus liegt auf zeit-- und raumabhängigen Steuerungen für Ensemble Kontrollprobleme, sowie auf nur zeitlich abhängigen Steuerungen für Tracking Kontrollprobleme. Am Anfang der Dissertation wird ein Beweis für den Zusammenhang zwischen der FP Gleichung und stochastischen Differentialgleichungen dargelegt. Darüber hinaus werden stochastische optimale Steuerungsprobleme eingeführt, deren Ziel es ist, einen erwarteten Kostenwert zu minimieren. Zusätzlich wird das Problem als ein deterministisches FP Kontrollproblem formuliert. Für die Analyse dieses Kontrollproblems wird die Existenz und Regularität von Lösungen für die FP Differentialgleichung untersucht. Neue $L^\infty$--Abschätzungen für Lösungen werden für niedrige Raumdimensionen unter schwachen Annahmen an den Drift bewiesen. Zusätzlich werden, basierend auf der Theorie über Bessel Potentialräume, neue Glattheitseigenschaften für Lösungen des FP--Problems im Falle zeitabhängiger Steuerungen erarbeitet. Aufgrund dieser Eigenschaften ist die sogenannte control--to--state Abbildung, welche die Kontrollfunktion mit der entsprechenden Lösung des FP Problems verknüpft, wohldefiniert, Fréchet--differenzierbar und kompakt für geeignete Lebesgue--Räume oder Sobolev--Räume. Die Existenz optimaler Steuerungen wird unter verschiedenen Annahmen an den Funktionenraum der Kontrollen und des Kostenfunktionals bewiesen. Optimalitätsbedingungen erster Ordnung werden unter Verwendung des adjungierten Systems aufgestellt. Die daraus resultierende Charakterisierung optimaler Steuerungen wird genutzt, um eine höhere Regularität optimaler Steuerungen sowie ihrer Zustandsfunktion und des adjungierten Problems zu erhalten. Da das FP Kontrollproblem aufgrund der bilinearen Struktur nicht konvex ist, sollte eine Analyse von Optimalitätsbedingungen erster Ordnung durch eine Analyse von Optimalitätsbedingungen zweiter Ordnung ergänzt werden. Dies wird für das Ensemble Kontrollproblem im Fall von zeit-- und ortsabhängigen Steuerungen mit $H^1$--Regularität durchgeführt, und hinreichende Bedingungen für lokale Minimierer werden hergeleitet. Analoge Ergebnisse werden für das Tracking--Problem für nur zeitabhängige Steuerungen bewiesen. Die entwickelte Theorie zu diesem optimalen Steuerungsproblem und dessen Optimalitätsbedingungen wird angewendet, um eine numerische Analyse für eine Galerkin--Diskretisierung des FP Kontrollproblems durchzuführen. Der Schwerpunkt liegt auf Tracking--Problemen mit nur zeitabhängigen Steuerungen. Die Idee des vorgestellten Galerkin--Verfahrens besteht darin, das PDE--Optimierungsproblem zunächst durch ein System von Optimierungsproblemen mit gewöhnlichen Differentialgleichungen (ODE) als Nebenbedingung zu approximieren. Dann werden Bedingungen an das Problem präsentiert, sodass die Konvergenz optimaler Steuerungen von einem Problem zum anderen garantiert werden kann. Zu diesem Zweck wird eine Klasse bilinearer ODE--Kontrollprobleme analysiert, welche sich aus der Galerkin--Diskretisierung des FP Problems ergeben. Optimalitätsbedingungen erster und zweiter Ordnung werden bewiesen, und eine numerische Analyse wird durchgeführt. Eine Diskretisierung mit linearen Finiten--Elementen der Zustands-- und Adjungiertengleichung wird untersucht, während die Kontrollfunktionen durch stückweise konstante oder stetige, stückweise quadratische Polynome approximiert werden. Diese Wahl wird durch die bilineare Struktur des optimalen Kontrollproblems begründet, da sie es ermöglicht, die Diskrepanzen zwischen einem Ansatz von ,,zuerst diskretisieren dann optimieren" und ,,zuerst optimieren, dann diskretisieren" zu überwinden. Durch die Verwendung stetiger, stückweise quadratischer Polynome als Diskretisierung der Steuerungen kann außerdem quadratische Konvergenzordnung gezeigt werden. Abschließend werden die theoretischen Ergebnisse und die Konvergenzraten zweiter Ordnung numerisch verifiziert. KW - Parabolische Differentialgleichung KW - Fokker-Planck-Gleichung KW - Optimale Kontrolle KW - Optimalitätsbedingung KW - Finite-Elemente-Methode KW - accuracy estimate Y1 - 2024 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-362997 ER - TY - THES A1 - Kappes, Alexander T1 - High-Redshift Blazars Observed by the International LOFAR Telescope T1 - Mit dem internationalen LOFAR-Teleskop beobachtete Blazare mit hoher Rotverschiebung N2 - This work presents the first ILT observations of high redshift blazars and their study in terms of jet evolution, morphology, and interaction with the surrounding medium. Each of these represents a highly topical area of astronomywith a large number of open questions. To better understand Active Galactic Nuclei (AGN) and their fundamental inner workings, new techniques are needed to exploit the full potential of the next generation of radio interferometers. Some of these tools are presented here and applied to one of the latest generation of software radio telescopes. A major focus of the studies presented is on the unification model, where the observed blazars are discussed for their properties to be rotated counterparts of Fanaroff-Riley Class II (FR-II) radio galaxies, when classified as Flat Spectrum Radio Quasars (FSRQs). In addition, multiwavelength information has been included in the analysis. Both studies are feasibility studies that will serve as a basis for future similar studies. The characteristics discussed and their interpretation do not allow conclusions to be drawn for their respective populations. However, by applying them to a larger number of targets, population studies will be possible. The first chapters introduce the necessary topics, AGN, principles of radio observations and ILT, in the necessary depth to provide the reader with a solid knowledge base. They are particularly important for understanding the current limits and influences of uncertainties in the observation, calibration and imaging process. But they also shed light on realistic future improvements. A particular focus is on the development and evolution of the LOw-Frequency ARray (LOFAR)-Very Long Baseline Interferometry (VLBI) pipeline. With the tools at hand, the first study addresses the high redshift blazar S5 0836+710 $(z=2.218)$, which has been observed at various wavelengths and resolutions. It has a disrupted one-sided jet with an associated extended region further out. Despite the excellent wavelength coverage, only the additional ILT observations provided a complete picture of the source. With the data, the extended region could be classified as a hotspot moving at slightly relativistic speeds.. With the ILT data it was also possible to extract the flux of the core region of the AGN, and in projection to reveal the mixed counter-hotspot behind it. This also allowed constraints on jet parameters and environmental properties to be modelled, which were previously inconclusive. Technically, this study shows that the ILT can be used as an effective VLBI array for compact sources with small angular scales. However, the detection of faint components beyond redshifts of $z=2$ may require the capabilities of the Square Kilometre Array (SKA) to provide a significant number of detections to enable statistical conclusions. The second study uses a much improved calibration pipeline to analyse the high redshift blazar GB1508+5714 $(z=4.30)$. The ILT data revealed a previously unseen component in the eastern direction. A spectral index map was generated from the Karl G. Jansky Very Large Array (VLA) data, showing spectral index values of $-1.2_{-0.2}^{+0.4}$ for the western component, steeper than $-1.1$ for the eastern region, and $0.023 \pm 0.007$ for the core. Using the information provided by the ILT observation, as well as multi-wavelength information from other observations ranging from the long radio wavelengths to the $\gamma$ regime, four models were developed to interpret the observed flux with different emission origins. This also allowed to test a proposed interaction channel of the electrons provided by the jet, to cool off via inverse compton scattering with the Cosmic Microwave Background (CMB) photons, rather than by the usual synchrotron emission. This is referred to as cmb quenching in the literature, which could be shown in the study, to be necessary in any case. Finally, one of the four models was considered in which the hotspots in the detected components are unresolved and mixed by the lobe emission, with the X-ray emission coming from the lobes and partially mixed by the bright core region. The results of this preferred model are consistent with hotspots in a state of equipartition and lobes almost so. The study shows that high redshift blazars can be studied with the ILT, and expanding the sample of high redshift blazars resolved at multiple frequencies will allow a statistical study of the population. Finally, this work successfully demonstrates the powerful capabilities of the ILT to address questions that were previously inaccessible. The current state of the LOFAR-VLBI pipeline, when properly executed, allows work on the most challenging objects and will only improve in the future. In particular, this gives a glimpse of the possibilities that SKA will bring to astronomy. N2 - In dieser Arbeit werden die ersten Beobachtungen von Blazaren mit hoher Rotverschiebung, sowie ihre Untersuchung im Hinblick auf die Jet-Entwicklung, die Morphologie und die Wechselwirkung mit dem umgebenden Medium vorgestellt. Jeder dieser Bereiche stellt ein hochaktuelles Gebiet der Astronomie, mit einer großen Anzahl offener Fragen, dar. Um Active Galactic Nuclei (AGN) und ihr fundamentales Innenleben besser zu verstehen, sind neue Techniken erforderlich, um das volle Potenzial der nächsten Generation von Radiointerferometern auszuschöpfen. Einige dieser Werkzeuge werden hier vorgestellt und auf ein Teleskop der neuesten Generation von Software-Radioteleskopen angewandt. Ein Hauptaugenmerk der vorgestellten Studien liegt auf dem "Unification Model", bei dem die beobachteten Blazare auf ihre Eigenschaften als rotierte Gegenstücke von Fanaroff-Riley Class II (FR-II)-Radiogalaxien untersucht werden, wenn sie als Flat Spectrum Radio Quasars (FSRQs) klassifiziert werden. Darüber hinaus wurden Informationen über mehrere Wellenlängen in die Analyse einbezogen. Bei beiden Studien handelt es sich um Machbarkeitsstudien, die als Grundlage für künftige ähnliche Studien dienen werden. Die erörterten Merkmale und ihre Interpretation lassen keine Schlussfolgerungen für die jeweiligen Populationen zu. Erst durch die Anwendung auf eine größere Anzahl von Objekten werden Populationsstudien möglich sein. Die ersten Kapitel führen in die notwendigen Themen, AGN, Prinzipien der Radiobeobachtung und das International LOFAR Telescope (ILT), in der notwendigen Tiefe ein, um dem Leser eine solide Wissensbasis zu vermitteln. Sie sind besonders wichtig, um die aktuellen Grenzen und Einflüsse von Unsicherheiten im Beobachtungs-, Kalibrierungs- und Abbildungsprozess zu verstehen. Sie geben aber auch Aufschluss über realistische zukünftige Verbesserungen. Ein besonderer Schwerpunkt liegt auf der Entwicklung und Weiterentwicklung der LOw-Frequency ARray (LOFAR)-Very Long Baseline Interferometry (VLBI)-Pipeline. Mit den zur Verfügung stehenden Werkzeugen befasst sich die erste Studie mit dem hochrotverschobenen Blazar S5 0836+710 (z=2.218), der bei verschiedenen Wellenlängen und Auflösungen beobachtet wurde. Er hat einen unterbrochenen einseitigen Jet mit einer damit verbundenen ausgedehnten Region weiter außen. Trotz der hervorragenden Wellenlängenabdeckung ermöglichten erst die zusätzlichen Beobachtungen durch das ILT ein vollständiges Bild der Quelle. Mit den Daten konnte die ausgedehnte Region als Hotspot klassifiziert werden, der sich mit leicht relativistischen Geschwindigkeiten bewegt. Mit den ILT-Daten war es auch möglich, den Fluss der Kernregion des AGN zu extrahieren und in der Projektion den Hotspot des gegenläufigen Jets dahinter aufzudecken. Dies ermöglichte auch die Modellierung von Jet-Parametern und Umgebungseigenschaften, die zuvor nicht zugänglich waren. Technisch gesehen zeigt diese Studie insbesondere, dass das ILT als VLBI-Array für kompakte Quellen mit kleinen Winkelskalen effektiv verwendet werden kann. Die Entdeckung schwacher Komponenten jenseits von Rotverschiebungen von $z=2$ könnte jedoch das SquareKilometre Array (SKA) erfordern, um eine signifikante Anzahl von Entdeckungen zu liefern, welche statistische Schlussfolgerungen zulassen. Die zweite Studie verwendet eine stark verbesserte Kalibrierungspipeline, um den hoch rotverschobenen Blazar GB 1508+5714 (z=4.30) zu analysieren. Die ILT-Daten enthüllten eine bisher nicht gesehene Komponente in östlicher Richtung. Mit den Karl G. Jansky Very Large Array (VLA)-Daten wurde eine Spektralindexkarte erstellt, die Spektralindexwerte von $-1,2^{+0,4}_{-0,2}$ für die westliche Komponente, steiler als $-1,1$ für die östliche Region und $0,023 \pm 0,007$ für den Kern zeigt. Anhand der von der ILT-Beobachtung gelieferten Informationen sowie von Multi-Wellenlängen-Informationen aus anderen Beobachtungen, die von den langen Radiowellenlängen bis zum $\gamma$-Bereich reichen, wurden vier Modelle entwickelt, um den beobachteten Fluss mit unterschiedlichen Emissionsquellen zu interpretieren. Dies ermöglichte es auch, einen vorgeschlagenen Wechselwirkungskanal der Elektronen, welche durch den Jet bereitgestellt werden, zu testen, um sich durch inverse Compton-Streuung mit den Photonen der kosmischen Hintergrundstrahlung abzukühlen, anstatt durch die übliche Synchrotronemission. Dies wird in der Literatur als "CMB-Quenching" bezeichnet, welches in der Studie, als in jedem Fall notwendig, nachgewiesen werden konnte. Schließlich wurde eines der vier Modelle in Betracht gezogen, bei dem die Hotspots in den nachgewiesenen Komponenten unaufgelöst sind und durch die Lobe-Emission vermischt werden, wobei die Röntgenemission von den Lobes stammt und teilweise durch die helle Kernregion vermischt wird. Die Ergebnisse dieses bevorzugten Modells zeigen, dass sich die Hot Spots und Lobes nahezu in einem Zustand der Äquipartition befinden. Die Studie zeigt somit, dass Blazare mit hoher Rotverschiebung mit dem ILT untersucht werden können, und die Hinzunahme von weiteren Blazaren mit hoher Rotverschiebung, die mit mehreren Frequenzen aufgelöst wurden, eine statistische Untersuchung der Population ermöglichen werden. Schließlich demonstriert diese Arbeit erfolgreich die leistungsstarken Fähigkeiten des ILT, um Fragen anzugehen, die zuvor unzugänglich waren. Der derzeitige Stand der LOFAR-VLBI-Pipeline ermöglicht bei ordnungsgemäßer Ausführung die Arbeit an den anspruchsvollsten Objekten und wird sich in Zukunft noch weiter verbessern. Dies gibt insbesondere einen Einblick in die Möglichkeiten, die das SKA der Astronomie bieten wird. KW - Blazar KW - Kosmologie KW - Radioastronomie KW - Astrophysik KW - Cosmology KW - Radioastronomy KW - Astrophysics KW - LOFAR KW - International LOFAR Telescope Y1 - 2024 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-361444 ER -