TY  - THES
A1  - Niederlechner, Stefanie
T1  - Assessment of the basic molecular mechanisms underlying L-glutamine's cytoprotective effects after intestinal injury
T1  - Untersuchung und Auswertung der molekularen Mechanismen, die L-Glutamin's protektivem Zellmechanismus nach Intestinaler Verletzung zugrunde liegen
N2  - Critical illness like sepsis, shock, and intestinal bowel disease are one of the leading causes of morbidity and mortality in the US and around the world. At present, studies to define new therapeutic interventions that can protect tissues and cells against injury and attenuate inflammation are fields of intense investigation. While research over the past decade has clearly identified GLN as a vital stress substrate facilitating cellular survival following injury, the initiation steps in GLN’s cytoprotective molecular mechanism still remain elusive. Previously published work suggested that stabilization of ECM proteins and activation of ECM receptor osmosignaling may play a central role in the orchestration of many cellular pathways following stress. Thus, I hypothesized that preservation of ECM protein and EGFR levels as well as ECM receptor signaling play key roles in the molecular mechanisms underlying GLN’s protection against thermal injury in the intestine. I was able to confirm via Western blotting and by using silencing RNA against FN, Ntn-1, EGFR, and their negative controls, that GLN-mediated preservation of FN, Ntn-1, and EGFR levels is critical in GLN’s protection against hyperthermia in IEC-6 cells. By using a selective FN-Integrin interaction inhibitor GRGDSP, its negative control peptide GRGESP, and Src-kinase inhibitor PP2, I showed that FN-Integrin signaling and Src-kinase activation are essential in GLN-mediated protection in the intestine. This applied to EGFR signaling as demonstrated using the EGFR tyrosine kinase inhibitor AG1478. In addition to GRGDSP and AG1478, ERK1/2 inhibitors PD98059 and UO126 as well as the p38MAPK inhibitor SB203580 revealed that GLN is protective by activating ERK1/2 and dephosphorylating p38MAPK via FN-Integrin and EGFR signaling. However, GLN-mediated PI3-K/Akt/Hsp70 activation seems to occur independently of FN-Integrin and EGFR signaling as indicated by Western blots as well as experiments using the PI3-K inhibitor LY294002, GRGDSP, and AG1478. The results showed that GLN activates cell survival signaling pathways via integrins as well as EGFRs after hyperthermia. Moreover, I found that GLN-mediated preservation of FN expression after HS is regulated via PI3-K signaling. Whether GLN-mediated PI3-K signaling happens simultaneously to FN-Integrin and EGFR signaling or whether PI3-K signaling coordinates FN-Integrin and EGFR signaling needs to be investigated in future studies. Further, experiments with PD98059 and GRGDSP revealed that ERK1/2 assists in mediating transactivation of HSF-1 following HS. This leads to increases in Hsp70 expression via FN-Integrin signaling, which is known to attenuate apoptosis after thermal injury. Fluorescence microscopy results indicated that HS and GLN regulate cell are size changes and the morphology of F-actin via FN-Integrin signaling. Experiments using GRGDSP and GRGESP showed that GLN enhances cellular survival via FN-Integrin signaling in a manner that does not require increased intracellular GLN concentrations (as quantified using LC-MS/MS). In summary, my thesis work gives new and potentially clinically relevant mechanistic insights into GLN-mediated molecular cell survival pathways. These results warrant clinical translation to assess if clinical outcome of critically ill patients suffering from gastrointestinal diseases can be improved by GLN treatment and/or by targeting the molecular pathways found in my studies.
N2  - Kritische Erkrankungen wie Sepsis, Schock und entzündliche Darmerkrankungen sind eine der häufigsten Todesursachen in den Vereinigten Staaten und dem Rest der Welt. Von großer Bedeutung sind deshalb Studien, die darauf abzielen, neue therapeutische Ansätze zu finden, die Gewebe und Zellen vor Verletzungen schützen und Entzündungen verhindern. Im letzten Jahrzehnt hat sich herausgestellt, dass Glutamin Schutz gegen die pathophysiologischen und pathobiochemischen Entgleisungen während solcher Erkrankungen vermitteln kann. Trotzdem ist es bisher nur sehr unvollständig gelungen, die zugrundeliegenden molekularen Mechanismen, die für diese zellulären Schutzfunktionen von Glutamin verantwortlich sind, aufzuklären. In diesem Zusammenhang gab es erste Hinweise darauf, dass die Stabilisierung von extrazellulären Matrixproteinen und die Aktivierung der Signalwege extrazellulärer Matrixproteinrezeptoren eine wichtige Rolle spielen könnten. Hierauf basierend habe ich die Hypothesen aufgestellt, dass die Expression von extrazellulären Matrixproteingehalten und von epidermalen Wachstumsfaktorrezeptoren (EGFR), sowie die Aktivierung von Integrin- und EGFR-Signalwegen Schlüsselrollen in den protektiven Mechanismen von Glutamin spielen. Meine Arbeiten zeigten anhand von Western Blots und durch den Einsatz von Silencing RNA (gegen Fibronektin, Netrin-1, EGFR und deren Negativkontrollen), dass Glutamin extrazelluläre Matrixproteingehalte, wie Fibronektin und Netrin-1, und EGFR-Levels vor Hitzestress in Darmepithelzellen bewahrt, wodurch Apoptose verhindert wird. Außerdem konnte ich mit Hilfe des selektiven Inhibitors GRGDSP, seiner Negativkontrolle GRGESP und des Src-Kinase-Inhibitors PP2 nachweisen, dass auch die Aktivierung von Fibronektin-Integrin-Signalwegen und von Src-Kinasen an den Schutzmechanismen von Glutamin im Darm beteiligt sind. Wie mit Hilfe des spezifischen EGFR-Tyrosinkinase-Inhibitors AG1478 nachgewiesen werden konnte, trifft dies auch für die EGFR-Signalwege zu. Zusätzlich zu GRGDSP und AG1478 wurden auch die ERK1/2-Kinase-Inhibitoren PD98059 und UO126 und der p38MAPK-Inhibitor verwendet, um zu zeigen, dass Glutamin Darmepithelzellen durch die Aktivität von Fibronektin-Integrin- und EGFR-Signalwegen vor Hitzestress schützt, indem es EKR1/2 phosphoryliert und p38MAPK dephosphoryliert. PI-3K/Akt/Hsp70-Signalwege werden ebenfalls von Glutamin aktiviert, jedoch unabhängig von Fibronektin-Integrin- und EGFR-Signalwegen. Dies konnte anhand von Western Blot Experimenten und mit Hilfe von LY294002 (PI-3K-Inhibitor), GRGDSP und AG1478 bewiesen werden. Glutamin scheint die gleichen Signalwege sowohl mit Hilfe von Integrinen als auch von EGFR zu beeinflussen, um so den Zelltod in Darmepithelzellen nach Hitzestress zu verhindern. Desweiteren konnte gezeigt werden, dass Glutamin die Erhaltung von Fibronektinkonzentrationen nach Hitzestress durch den PI-3K-Signalweg reguliert. Ob Glutamin den PI-3K-Signalweg parallel zu den Integrin- und EGFR-Signalwegen aktiviert oder ob der von Glutamin ausgelöste PI-3K-Signalweg die Integrin- und EGFR-Signalwege steuert, muss noch weiter untersucht werden. Experimente mit PD98059 und GRGDSP zeigten, dass ERK1/2 in der Gegenwart von Glutamin den Transkriptionsfaktor HSF-1 durch den Fibronektin-Integrin-Signalweg nach Hitzestress transaktiviert. Dadurch nimmt die Expression von Hsp70, welches den Zelltod nach Hitzeschock verhindert, zu. Mit Hilfe der Fluoreszenzmikroskopie konnte gezeigt werden, dass Hitzestress und Glutamin die Zellgröße und die Aktinmorphologie von Darmepithelzellen durch Fibronektin-Integrin-Signalwege steuern können. Außerdem ergaben Versuche mit GRGDSP und GRGESP, dass Glutamin unabhänging von seinen intrazellulären Konzentrationen das Überleben von Darmepithelzellen durch die Aktivierung von Fibronektin-Integrin-Signalwegen erhöhen kann. Hierbei wurden die Glutaminkonzentrationen mit LC-MS/MS gemessen. Die Versuche im Rahmen meiner Dissertation konnten neue und potentiell klinisch relevante Signalwege der molekularen Schutzmechanismen von Glutamin aufdecken. Diese Ergebnisse können die Grundlage für translationale Studien darstellen, die weiter untersuchen, ob die Überlebensrate von Patienten mit entzündlichen Darmerkrankungen durch die Behandlung mit Glutamin oder durch gezielte Beeinflussung der hier untersuchten molekularen Mechanismen verbessert werden kann.
KW  - Glutamin
KW  - Integrine
KW  - Epidermaler Wachstumsfaktor-Rezeptor
KW  - Apoptosis
KW  - glutamine
KW  - integrins
KW  - epidermal growth factor receptor
KW  - cell death
KW  - cell survival
KW  - EGFR
KW  - ERK1/2
KW  - p38MAPK
KW  - PI3-K
KW  - Akt
KW  - Apoptose
Y1  - 2013
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-77399
ER  - 
TY  - THES
A1  - Laisney, Juliette Agnès Geneviève Claire
T1  - Characterisation and regulation of the Egfr/Egfr ligand system in fish models for melanoma
N2  - Fish of the genus Xiphophorus belong to the oldest animal models in cancer research. The oncogene responsible for the generation of spontaneous aggressive melanoma encodes for a mutated epidermal growth factor receptor (Egfr) and is called xmrk for Xiphophorus melanoma receptor kinase. Xmrk constitutive activation mechanisms and subsequent signaling pathways have already been investigated and charaterized but it is still unknown if Egfr ligands may also play a role in Xmrk-driven melanoma formation. To investigate the potential role of Egfr ligands in Xmrk-driven melanoma, I firstly analyzed the evolution of teleost and tetrapod Egfr/Egfr ligand systems. I especially focused on the analysis on the medaka fish, a closely related species to Xiphophorus, for which the whole genome has been sequenced. I could identify all seven Egfr ligands in medaka and could show that the two teleost-specific Egfr copies of medaka display dissimilar expression patterns in adult tissues together with differential expression of Egfr ligand subsets, arguing for subfunctionalization of receptor functions in this fish. Our phylogenetic and synteny analyses supported the hypothesis that only one gene in the chordate ancestor gave rise to the diversity of Egfr ligands found in vertebrate genomes today. I also could show that the Egfr extracellular subdomains implicated in ligand binding are not evolutionary conserved between tetrapods and teleosts, making the use of heterologous ligands in experiments with fish cells debatable. Despite its well understood and straight-forward process, Xmrk-driven melanomagenesis in Xiphophorus is problematic to further investigate in vivo. Our laboratory recently established a new melanoma animal model by generating transgenic mitf::xmrk medaka fishes, a Xiphophorus closely related species offering many more advantages. These fishes express xmrk under the control of the pigment-cell specific Mitf promoter. During my PhD thesis, I participated in the molecular analysis of the stably transgenic medaka and could show that the Xmrk-induced signaling pathways are similar when comparing Xiphophorus with transgenic mitf::xmrk medaka. These data together with additional RNA expression, protein, and histology analyses showed that Xmrk expression under the control of a pigment cell-specific promoter is sufficient to induce melanoma in the transgenic medaka, which develop very stereotyped tumors, including uveal and extracutaneous melanoma, with early onset during larval stages. To further investigate the potential role of Egfr ligands in Xmrk-driven melanoma, I made use of two model systems. One of them was the above mentioned mitf::xmrk medaka, the other was an in-vitro cell culture system, where the EGF-inducible Xmrk chimera HERmrk is stably expressed in murine melanocytes. Here I could show that HERmrk activation strongly induced expression of amphiregulin (Areg) and heparin-binding EGF-like growth factor (Hbegf) in melanocytes. This regulation was dependent on the MAPK and SRC signaling pathways. Moreover, upregulation of Adam10 and Adam17, the two major sheddases of Egfr ligands, was observed. I also could demonstrate the functionality of the growth factors by invitro analyses. Using the mitf::xmrk medaka model I could also show the upregulation of a subset of ligand genes, namely egf, areg, betacellulin (btc) and epigen (epgn) as well as upregulation of medaka egfrb in tumors from fish with metastatic melanoma. All these results converge to support an Xmrk-induced autocrine Egfr ligand loop. Interestingly, my in-vitro experiments with conditioned supernatant from medaka Egf- and Hbegf-producing cells revealed that not only Xiphophorus Egfrb, but also the pre-activated Xmrk could be further stimulated by the ligands. Altogether, I could show with in-vitro and in-vivo experiments that Xmrk is capable of inducing a functional autocrine Egfr ligand loop. These data confirm the importance of autocrine loops in receptor tyrosine kinase (RTK)-dependent cancer development and show the possibility for a constitutively active RTK to strengthen its oncogenic signaling by ligand binding.
N2  - Fische der Gattung Xiphophorus gehören zu den ältesten Tiermodellen für die Krebsforschung. Das im Xiphophorus-System für die Melanomentstehung verantwortliche Onkogen codiert für eine mutierte Version des epidermalen Wachstumsfaktorrezeptors (Egfr) und wird xmrk (für “Xiphophorus melanoma receptor kinase”) genannt. Die konstitutiven Aktivierungsmechanismen dieses Rezeptors und die daraus resultierenden aktivierten Signalwege sind bereits gut untersucht und charakterisiert. Dennoch war bisher unbekannt, ob Egfr-Liganden auch eine Rolle bei der Xmrk-vermittelten Melanomentstehung spielen. Um eine potenzielle Rolle dieser Egfr-Liganden im Xmrk-induzierten Melanom zu erforschen, habe ich zunächst die Evolution des Egfr/Egfr-Liganden-Systems in Teleostiern und Tetrapoden untersucht. Hierfür fokussierte ich mich im besonderen auf den Medaka- Fisch, der zum einen eine nahe evolutionäre Verwandtschaft zu Xiphophorus aufweist und zum anderen – im Gegensatz zu Xiphophorus - ein komplett sequenziertes und gut annotiertes Genom besitzt. Ich konnte alle sieben Egfr-Liganden in Medaka identifizieren und konnte weiterhin zeigen, dass die zwei Teleost-spezifischen Egfr-Kopien dieses Fisches ein unterschiedliches Expressionsmuster in adulten Geweben aufweisen, welches außerdem mit unterschiedlicher Egfr-Liganden-Expression einherging. Diese Daten sprechen für eine Subfunktionalisierung der Egfr-Funktionen in Medaka. Unsere phylogenetischen und Syntenie-Analysen unterstützen die Hypothese, dass nur ein einziges Egfr-Liganden-Gen des Chordaten-Vorfahren der genetische Ursprung für die zahlreichen Egfr-Liganden-Gene, die in heutigen Vertrebraten zu finden sind, darstellt. Ich konnte weiterhin zeigen, dass die an der Ligandenbindung beteiligten Domänen des Egfr nicht zwischen Tetrapoden und Teleostiern konserviert sind. Diese Daten sprechen somit gegen die Verwendung heterologer Liganden in Zellkulturexperimenten mit Fischzellen. Trotz der gut verstandenen Konsequenzen einer Xmrk-Expression auf die Pigmentzelle lässt sich die Xmrk-vermittelte Melanomentstehung in Xiphophorus relativ schwer in vivo untersuchen. In unserem Labor wurde daher kürzlich ein neues Tiermodell für Melanome entwickelt. Dabei handelt es sich um einen mitf::xmrk-transgenen Medaka. Diese Fische exprimieren xmrk unter der Kontrolle des Pigmentzell-spezifischen Mitf-Promoters. Während meiner Doktorarbeit trug ich zur molekularen Analyse der stabil transgenen Tiere bei und konnte zeigen, dass die Xmrk-vermittelte Signalgebung in mitf::xmrk-Medakas der von Xmrk-exprimierenden Xiphophorus-Fischen gleicht. Diese Daten, zusammen mit weiteren RNA-Expressions-, Protein- und histologischen Analysen, zeigten, dass die Expression von xmrk unter der Kontrolle eines Pigmentzellspezifischen Promoters ausreichend für die Melanomentstehung in Medaka ist. Eine Besonderheit dieses Melanommodelles ist die auffallend stereotype Tumorentstehung. Der Beginn der Hyperpigmentierung wird bereits in frühen Larvenstadien sichtbar und führt – je nach Fischlinie – anschließend zuverlässig zu extrakutanen Pigmentzelltumoren oder invasiven bzw. uvealen Melanomen. Um eine potenzielle Funktion der Egfr-Liganden für Xmrk-induzierte Melanome zu untersuchen, machte ich mir zwei Modellsysteme zunutze. Eines der beiden Modelle war der bereits oben erwähnte mitf::xmrk-transgene Medaka, das andere war ein in-vitro- Zellkultursystem, bei dem die EGF-induzierbare Xmrk-Chimäre HERmrk stabil in murinen Melanozyten exprimiert wird. Hier konnte ich zeigen, dass HERmrk-Aktivierung zu einer starken Genexpression der EGFR-Liganden Amphiregulin (Areg) und Heparin-binding EGFlike growth factor (Hbegf) in Melanozyten führte. Diese Regulierung war abhängig von den MAPK- und SRC-Signalwegen. Weiterhin wurde eine Induktion von Adam10 und Adam17, den zwei bedeutsamsten Proteasen zur Freisetzung von EGFR-Liganden (“Sheddasen”), festgestellt. Ich konnte die Funktionalität der so sezernierten Liganden durch in-vitro- Experimente nachweisen. Anhand des mitf::xmrk Medaka-Modelles konnte ich ebenfalls zeigen, dass sowohl mehrere Egfr-Ligandengene, nämlich egf, areg, betacellulin (btc) und epigen (epgn), als auch egfrb in Tumoren von Medaka-Fischen mit metastatischen Melanomen heraufreguliert wurden. All diese Daten lassen auf einen durch Xmrk induzierten autokrinen EGFR-Liganden-Loop schließen. Interessanterweise zeigte sich durch in-vitro- Experimente mit konditioniertem Überstand von Medaka Egf- und Hbegf-produzierenden Zellen, dass nicht nur Xiphophorus Egfrb, sondern auch das bereits aktivierte Xmrk durch beide Liganden weiter stimuliert werden konnte. Zusammengefasst zeigen meine in-vitro- und in-vivo-Daten, dass Xmrk in der Lage ist, einen funktionalen autokrinen Egfr-Liganden-Loop zu induzieren. Dieses Ergebnis unterstreicht die Bedeutung autokriner Loops in Rezeptortyrosinkinasen (RTK)-abhängiger Tumorentstehung und zeigt auf, dass selbst die onkogene Signalgebung prädimerisierter RTKs durch Ligandenbindung verstärkt werden kann.
KW  - Schwertkärpfling
KW  - Melanom
KW  - Epidermaler Wachstumsfaktor-Rezeptor
KW  - cancer
KW  - melanoma
KW  - fish model
KW  - EGFR
Y1  - 2010
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-51369
ER  - 
TY  - THES
A1  - Hart, Stefan
T1  - Characterisation of the molecular mechanisms of EGFR signal transactivation in human cancer
T1  - Charakterisierung der molekularen Mechanismen der EGFR-Transaktivierung in humanen Tumoren.
N2  - In a variety of established tumour cell lines, but also in primary mammary epithelial cells metalloprotease-dependent transactivation of the EGFR, and EGFR characteristic downstream signalling events were observed in response to stimulation with physiological concentrations of GPCR agonists such as the mitogens LPA and S1P as well as therapeutically relevant concentrations of cannabinoids. Moreover, this study reveals ADAM17 and HB-EGF as the main effectors of this mechanism in most of the cancer cell lines investigated. However, depending on the cellular context and GPCR agonist, various different members of the ADAM family are selectively recruited for specific ectodomain shedding of proAR and/or proHB-EGF and subsequent EGFR activation. Furthermore, biological responses induced by LPA or S1P such as migration in breast cancer and HNSCC cells, depend on ADAM17 and proHB-EGF/proAR function, respectively, suggesting that highly abundant GPCR ligands may play a role in tumour development and progression. Moreover, EGFR signal transactivation could be identified as the mechanistic link between cannabinoid receptors and the activation of mitogen activated protein kinases (MAPK) ERK1/2 as well as pro-survival Akt/PKB signalling. Depending on the cellular context, cannabinoid-induced signal cross-communication was mediated by shedding of proAmphiregulin and/or proHB-EGF by ADAM17. Most importantly, our data show that concentrations of THC comparable to those detected in the serum of patients after THC administration accelerate proliferation of cancer cells instead of apoptosis and thereby may contribute to cancer progression in patients.
N2  - Im Rahmen dieser Arbeit wurde gezeigt, dass in verschiedenen etablierten Tumorzelllinien, aber auch in primären Brustepithelzellen sowohl physiologische Konzentrationen von GPCR Liganden, wie z.B. den Mitogenen LPA und S1P, als auch therapeutische Konzentrationen von Cannabinoiden zur metalloproteaseabhängigen Aktivierung des EGFRs führen. Abhängig von diesem Mechanismus konnte die Aktivierung der mitogenen Ras/MAPK-Kaskade als auch des antiapoptotischen Akt/PKB Signalweges beobachtet werden. Untersuchungen mit Hilfe der siRNA-Technik oder dominant-negativen Konstrukten identifizierten ADAM17 sowie den EGFR-Liganden HB-EGF als wichtigste Komponenten dieses Signalweges. Abhängig vom Zellsystem konnte aber auch eine Beteiligung anderer Mitglieder der ADAM Familie sowie des EGFR-Liganden Amphiregulin nachgewiesen werden. Weiterhin konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, dass die durch LPA und S1P induzierten biologische Prozesse, wie z.B. die Migration in Brustkrebs- oder HNSCC-Zellen, vollständig von der Aktivität von ADAM17 und HB-EGF/AR abhängig waren. Außerdem konnte die ADAM17- und HB-EGF/AR-vermittelte EGFR-Transaktivierung als Bindeglied zwischen Cannabinoid-Rezeptoren und MAPK- und Akt-Aktivierung sowie erhöhter Zellproliferation identifiziert werden. Die Ergebnisse dieser Arbeit unterstreichen die Rolle der EGFR Signaltransaktivierung und dadurch induzierter biologischer Antworten wie Zellmigration oder –proliferation in Tumorzellen, und sollten darüber hinaus zu einer Neubewertung der Krebstherapie mit Cannabinoiden führen.
KW  - Epidermaler Wachstumsfaktor-Rezeptor
KW  - Krebs <Medizin>
KW  - Signaltransduktion
KW  - EGFR
KW  - GPCR
KW  - Transaktivierung
KW  - Krebs
KW  - Metalloprotease
KW  - EGFR
KW  - GPCR
KW  - transactivation
KW  - cancer
KW  - metalloprotease
Y1  - 2004
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-10067
ER  -