TY - THES A1 - Forero Echeverry, Andrea Marcela T1 - Impact of Cadherin-13 deficiency on the brain serotonin system using mouse models and human iPSC-derived neurons T1 - Einfluss einer Cadherin-13 Defizienz auf das Serotonin-System des Gehirns unter Verwendung von Mausmodellen und humanen iPSC-abgeleiteten Neuronen N2 - Serotonin (5-hydroxytryptamine, 5-HT) is a neurotransmitter involved in early developmental processes such as cell proliferation, migration, and differentiation. Recent research in humans showed that the brain 5-HT system and CDH13 are interlinked in the genetics of neurodevelopmental disorders including attention- deficit/hyperactivity disorder and autism spectrum disorder (Lesch et al., 2008; Neale et al., 2008; Neale, Medland, Ripke, Anney, et al., 2010; Neale, Medland, Ripke, Asherson, et al., 2010; Sanders et al., 2011; Sanders et al., 2015; Zhou et al., 2008). This study introduces Cadherin-13 (CDH13), a cell adhesion protein, as a contributor to the development and function of the 5-HT system. Our experiments show that the absence of CDH13 increases the density of 5-HT neurons in the developing dorsal raphe (DR) and increases the 5-HT innervation of the prefrontal cortex in mouse embryonic stages. CDH13 is also observed in radial glial cells, an important progenitor cell type linked to neuronal migration. A three-dimensional reconstruction carried out with super-resolution microscopy, identifies 5-HT neurons intertwined with radial glial cells, and CDH13 clusters at contact points between these cells. This indicates a potential contribution of CDH13 to the migration of DR 5-HT neurons. As CDH13 is strongly expressed in 5-HT neurons, we asked whether the selective deletion of CDH13 from these cells is sufficient to generate the alterations observed in the Cdh13 constitutive knockout mouse line. In 5-HT conditional Cdh13 knockout mice (Cdh13 cKO) an increase in DR 5-HT neurons in the embryonic and adult brains is observed, as well as 5-HT hyperinnervation of cortical regions. Therefore, illustrating that the lack of CDH13 from 5-HT neurons alone impacts DR formation and serotonergic innervation. Behavioral testing conducted on Cdh13 cKO mice showed delayed learning in visuospatial learning and memory processing, as well as, changes in sociability parameters. To find out how CDH13 localizes in human 5-HT neurons, CDH13 was visualized in neurons that derived from human induced pluripotent stem cells (iPSC). Super-resolution microscopy confirmed CDH13 expression in a subgroup of induced human neurons positive for typical hallmarks of 5-HT neurons, such as expression of Tph2, the neuron-specific tryptophan hydroxylase, and synaptic structures. In summary, the work included in this thesis presents a detailed analysis of CDH13 expression and localization in the 5-HT system and shows that deletion of CDH13 from 5-HT neurons affects specific higher-order functions of the brain. N2 - Serotonin (5-Hydroxytryptamin, 5-HT) ist ein Neurotransmitter, der in frühe Entwicklungsprozesse involviert ist, wie beispielsweise Zellproliferation, Migration und Differenzierung. Aktuelle Forschungsergebnisse im Menschen zeigten eine Verbindung zwischen dem 5-HT System des Gehirns und CDH13 in der Genetik neurologischer Entwicklungsstörungen, wie die Aufmerksamkeitsdefizit-/Hyperaktivitätsstörung und die Autismus-Spektrum-Störung (Lesch et al., 2008; Neale, Medland, Ripke, Anney, et al., 2010; Neale, Medland, Ripke, Asherson, et al., 2010; Sanders et al., 2011; Sanders et al., 2015; Zhou et al., 2008). Diese Studie präsentiert Cadherin-13 (CDH13), ein Zelladhäsionsprotein, als einen Gegenspieler in der Entwicklung und Funktion des 5-HT Systems. Unsere Experimente zeigen, dass die Abwesenheit von CDH13 die Dichte der 5-HT Neuronen in dem sich entwickelnden dorsalen Raphe (DR) sowie die 5-HT Innervation des Präfrontalen Kortex in den embryonalen Stadien der Maus steigert. CDH13 wird auch in Radialen Gliazellen beobachtet, ein wichtiger Vorläuferzelltyp, der mit neuronaler Migration in Verbindung gebracht wurde. Eine 3-dimensionale Rekonstruktion, durchgeführt mit Superresolutions-Mikroskopie, identifiziert 5-HT Neuronen verflochten mit Radialen Gliazellen und CDH13 in den Kontaktpunkten zwischen diesen Zellen. Dies verdeutlicht eine potenzielle Rolle von CDH13 bei der Migration der DR 5-HT Neuronen. Da CDH13 eine starke Expression in den 5-HT Neuronen aufweist, fragten wir uns, ob die selektive Deletion von CDH13 in den Zellen ausreichend sei, um die in der konstitutiven Cdh13 Knockout-Mauslinie beobachteten Veränderung zu erzeugen. In 5-HT konditionalen Cdh13 Knockout-Mäusen (Cdh13 cKO) wurde eine Erhöhung der Anzahl der DR 5-HT Neuronen im embryonalen und adulten Gehirn sowie eine 5-HT Überinnervation der kortikalen Regionen beobachtet. Dies veranschaulicht, dass bereits ein Mangel an CDH13 in 5-HT Neuronen die DR-Ausbildung und serotonerge Innervation beeinflusst. Verhaltensversuche, die an Cdh13 cKO-Mäusen durchgeführt wurden, zeigten verspätetes Lernen im visuell-räumlichen Spektrum und der Gedächtnisverarbeitung sowie Veränderungen der Soziabilitätsparameter. Um herauszufinden, wie CDH13 in humanen 5-HT Neuronen lokalisiert ist, wurde CDH13 in aus humanen pluripotenten Stammzellen (iPSC) erzeugten Neuronen visualisiert. Superresolutions-Mikroskopie bestätigte eine CDH13 Expression in einer Untergruppe induzierter humaner Neuronen, die typische Merkmale von 5-HT Neuronen, wie etwa die Expression der Neuronen-spezifischen Tryptophan-Hydroxylase Tph2 und synaptische Strukturen, aufweisen. Zusammengefasst präsentiert diese Doktorarbeit eine detaillierte Analyse der CDH13 Expression und Lokalisation im 5-HT System und zeigt, dass eine Deletion von CDH13 in 5-HT Neuronen spezifische höhergradige Funktionen des Gehirns beeinflusst. KW - neurodevelopment KW - cadherin-13 KW - serotonin Y1 - 2020 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-216592 ER - TY - THES A1 - Kriegebaum, Claudia T1 - Spatio-temporal Expression Patterns of the Serotonin Synthesis Enzymes TPH1 and TPH2 and Effects of Acute Stress T1 - Regional-zeitliche Expressionsmuster der beiden Serotoninsynthese-Enzyme TPH1 und TPH2 und Effekte durch akuten Stress N2 - Several lines of evidence implicate a dysregulation of tryptophan hydroxylase (TPH)-dependent serotonin (5-HT) synthesis in emotions and stress and point to their potential relevance to the etiology and pathogenesis of various neuropsychiatric disorders. However, the differential expression pattern of the two isoforms TPH1 and TPH2 which encode two forms of the rate-limiting enzyme of 5-HT synthesis is controversial. Here, a comprehensive spatio-temporal analysis clarifies TPH1 and TPH2 expression during pre- and postnatal development of the mouse brain and in adult human brain as well as in peripheral organs including the pineal gland. Four different methods (real time PCR, in situ hybridization, immunohistochemistry and Western blot analysis) were performed to systematically control for tissue-, species- and isoform-specific expression on both the pre- and posttranslational level. TPH2 expression was consistently detected in the raphe nuclei, as well as in fibres in the deep pineal gland and in the gastrointestinal tract. Although TPH1 expression was found in these peripheral tissues, no significant TPH1 expression was detected in the brain, neither during murine development, nor in mouse and human adult brain. Also under conditions like stress and clearing the tissue from blood cells, no changes in expression levels were detectable. Furthermore, the reuptake of 5-HT into the presynaptic neuron by the serotonin transporter (SERT) is the major mechanism terminating the neurotransmitter signal. Thus, mice with a deletion in the Sert gene (Sert KO mice) provide an adequate model for human affective disorders to study lifelong modified 5-HT homeostasis in interaction with stressful life events. To further explore the role of TPH isoforms, Tph1 and Tph2 expression was studied in the raphe nuclei of Sert deficient mice under normal conditions as well as following exposure to acute immobilization stress. Interestingly, no statistically significant changes in expression were detected. Moreover, in comparison to Tph2, no relevant Tph1 expression was detected in the brain independent from genotype, gender and treatment confirming expression in data from native animals. Raphe neurons of a brain-specific Tph2 conditional knockout (cKO) model were completely devoid of Tph2-positive neurons and consequently 5-HT in the brain, with no compensatory activation of Tph1 expression. In addition, a time-specific Tph2 inducible (i) KO mouse provides a brain-specific knockdown model during adult life, resulting in a highly reduced number of Tph2-positive cells and 5-HT in the brain. Intriguingly, expression studies detected no obvious alteration in expression of 5-HT system-associated genes in these brain-specific Tph2 knockout and knockdown models. The findings on the one hand confirm the specificity of Tph2 in brain 5-HT synthesis across the lifespan and on the other hand indicate that neither developmental nor adult Tph2-dependent 5-HT synthesis is required for normal formation of the serotonergic system, although Tph1 does not compensate for the lack of 5-HT in the brain of Tph2 KO models. A further aim of this thesis was to investigate the expression of the neuropeptide oxytocin, which is primarily produced in the hypothalamus and released for instance in response to stimulation of 5-HT and selective serotonin reuptake inhibitors (SSRIs). Oxytocin acts as a neuromodulator within the central nervous system (CNS) and is critically involved in mediating pain modulation, anxiolytic-like effects and decrease of stress response, thereby reducing the risk for emotional disorders. In this study, the expression levels of oxytocin in different brain regions of interest (cortex, hippocampus, amygdala, hypothalamus and raphe nuclei) from female and male wildtype (WT) and Sert KO mice with or without exposure to acute immobilization stress were investigated. Results showed significantly higher expression levels of oxytocin in brain regions which are involved in the regulation of emotional stimuli (amygdala and hippocampus) of stressed male WT mice, whereas male Sert KO as well as female WT and Sert KO mice lack these stress-induced changes. These findings are in accordance with the hypothesis of oxytocin being necessary for protection against stress, depressive mood and anxiety but suggest gender-dependent differences. The lack of altered oxytocin expression in Sert KO mice also indicates a modulation of the oxytocin response by the serotonergic system and provides novel research perspectives with respect to altered response of Sert KO mice to stress and anxiety inducing stimuli. N2 - Durch zahlreiche Untersuchungen ist belegt, dass eine gestörte Tryptophan-Hydroxylase (TPH)-abhängige Serotonin (5-HT)-Synthese an einer veränderten emotionalen Reaktion sowie einer veränderten Stress-Antwort beteiligt ist und damit auch in der Ätiologie und Pathogenese psychischer Erkrankungen eine Rolle spielt. Dennoch werden nach wie vor die unterschiedlichen Expressionsmuster der beiden Isoformen TPH1 und TPH2, die für zwei Formen des Schrittmacherenzyms der 5-HT-Synthese kodieren, kontrovers diskutiert. Zentrales Anliegen dieser Arbeit ist daher eine Klärung der TPH1- und TPH2-Expression während der prä- und postnatalen Entwicklung des murinen Gehirns, sowie im adulten humanen Gehirn und in einigen peripheren Organen und der Zirbeldrüse. Durch die Verwendung von vier verschiedenen Methoden (Real time-PCR, In situ-Hybridisierung, Immunhistochemie und Westernblot-Analysen) wurde systematisch die Gewebs- und Isoform-spezifische Expression in Maus und Mensch auf prä- und posttranslationaler Ebene nachgewiesen. TPH2-Expression wurde Spezies-übergreifend in den Raphe-Kernen des Hirnstamms wie auch in Fasern zur Zirbeldrüse und im Gastrointestinaltrakt detektiert. Auch TPH1 konnte in diesen peripheren Organen (die Zirbeldrüse eingeschlossen) nachgewiesen werden, jedoch fand sich keine signifikante TPH1-Expression im Gehirn, weder während der Entwicklung des Maus-Gehirns noch im humanen und murinen adulten Gehirn. Auch durch veränderte Bedingungen wie der Entfernung von Blutzellen aus dem Gewebe oder der Anwendung von akutem Immobilisierungsstress konnte keine Änderung der Expression gemessen werden. Sert Knockout-Mäuse, stellen ein geeignetes Tiermodell für affektive Erkrankungen dar, insbesondere um eine lebenslang veränderte 5-HT-Homöostase in Verbindung mit belastenden Lebensereignissen zu untersuchen. Um die Bedeutung der TPH-Isoformen und deren korrekte Expression weiter zu untersuchen, wurde die Tph1- und Tph2-Expression in den Raphe-Kernen von Sert Knockout (KO)-Mäusen unter normalen Bedingungen und nach akutem Stress getestet. Interessanterweise konnten keine statistisch signifikanten Expressionsänderungen entdeckt werden. Mehr noch, relativ zu Tph2 konnte unabhängig von Behandlung, Geschlecht oder Genotyp keine relevante Tph1-Expression im Gehirn gemessen werden, was wiederum die Expressionsdaten aus nativen Tieren unterstützt. Die Raphe-Neurone eines Gehirn-spezifischen konditionalen Tph2 KO-Modells zeigten weder Tph2-positive Zellen noch 5-HT, wiesen aber auch keine kompensatorische Aktivierung der Tph1-Expression im Gehirn auf. Zusätzlich repräsentiert eine zeit-spezifische, induzierbare KO-Maus ein Gehirn-spezifisches Tph2 Knockdown-Modell ab dem Erwachsenenalter, das eine stark reduzierte Anzahl an Tph2-positiven Zellen und 5-HT im Gehirn aufweist. Expressionsuntersuchungen zeigten interessanterweise, dass diese Gehirn-spezifischen Tph2 Knockout- und Knockdown-Modelle keine sichtliche Änderung in der Expression von 5-HT-System-assoziierten Genen aufweisen. Diese Ergebnisse bestätigen zum einen, dass die 5-HT-Synthese im murinen Gehirn während der kompletten Lebensspanne ausschließlich durch Tph2 katalysiert wird und weisen außerdem darauf hin, dass eine Tph2-abhängige 5-HT-Synthese weder während der Entwicklung noch im Erwachsenalter für die Ausbildung eines normalen serotonergen Systems benötigt wird, obwohl Tph1 den Verlust des 5-HT-Vorkommens im Gehirn der Tph2 KO-Mäuse nicht kompensiert. Weiterhin beschäftigt sich diese Arbeit mit der Expression von Oxytocin, das hauptsächlich im Hypothalamus produziert. Oxytocin ist maßgeblich bei Angst-lösenden Effekten sowie einer verringerten Stressantwort beteiligt. In dieser Studie wurde die Expression von Oxytocin in verschiedenen Gehirnregionen (Cortex, Hippocampus, Amygdala, Hypothalamus und Raphe Nuclei) von weiblichen und männlichen Wildtyp- (WT) und Sert KO-Mäusen getestet, die entweder unter normalen Bedingungen gehalten wurden oder eine Stunde lang akutem Immobilisierungsstress ausgesetzt waren. Die Ergebnisse zeigten eine signifikant höhere Oxytocin-Expression in Gehirnregionen, die für die emotionale Reizverarbeitung zuständig sind (Amygdala und Hippocampus) in gestressten männlichen WT-Mäusen, während männliche Sert KO-Mäuse sowie weibliche WT- und Sert KO-Mäuse diese Stress-bedingten Unterschiede nicht aufwiesen. Diese Befunde sind im Einklang mit der Hypothese, dass Oxytocin eine schützende Rolle bei Stress, depressiver Stimmung und Angst übernimmt, weisen jedoch auf einen Geschlechterunterschied hin. Ferner legt das Fehlen einer veränderten Oxytocin-Expression in Sert KO-Mäusen eine Modulation der Oxytocin-Expression durch das serotonerge System nahe, was neue Forschungsperspektiven über eine veränderte Reaktion auf Stress und Angst-auslösende Reize in Sert KO-Mäusen eröffnet. KW - Serotonin KW - Neurotransmitter KW - Chemische Synthese KW - Stress KW - Enzym KW - Genexpression KW - Maus KW - serotonin KW - mouse KW - acute stress KW - gene expression KW - enzymatic synthesis Y1 - 2009 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-40839 ER -