TY - THES A1 - Masota, Nelson Enos T1 - The Search for Novel Effective Agents Against Multidrug-Resistant Enterobacteriaceae T1 - Die Suche nach neuen wirksamen Wirkstoffen gegen multiresistente Enterobacteriaceae N2 - This thesis aimed at searching for new effective agents against Multidrug-Resistant Enterobacteriaceae. This is necessitated by the urgent need for new and innovative antibacterial agents addressing the critical priority pathogens prescribed by the World Health Organization (WHO). Among the available means for antibiotics discovery and development, nature has long remained a proven, innovative, and highly reliable gateway to successful antibacterial agents. Nevertheless, numerous challenges surrounding this valuable source of antibiotics among other drugs are limiting the complete realization of its potential. These include the availability of good quality data on the highly potential natural sources, limitations in methods to prepare and screen crude extracts, bottlenecks in reproducing biological potentials observed in natural sources, as well as hurdles in isolation, purification, and characterization of natural compounds with diverse structural complexities. Through an extensive review of the literature, it was possible to prepare libraries of plant species and phytochemicals with reported high potentials against Escherichia coli and Klebsiella pneumnoniae. The libraries were profiled to highlight the existing patterns and relationships between the reported antibacterial activities and studied plants’ families and parts, the type of the extracting solvent, as well as phytochemicals’ classes, drug-likeness and selected parameters for enhanced accumulation within the Gram-negative bacteria. In addition, motivations, objectives, the role of traditional practices and other crucial experimental aspects in the screening of plant extracts for antibacterial activities were identified and discussed. Based on the implemented strict inclusion criteria, the created libraries grant speedy access to well-evaluated plant species and phytochemicals with potential antibacterial activities. This way, further studies in yet unexplored directions can be pursued from the indicated or related species and compounds. Moreover, the availability of compound libraries focusing on related bacterial species serves a great role in the ongoing efforts to develop the rules of antibiotics penetrability and accumulation, particularly among Gram-negative bacteria. Here, in addition to hunting for potential scaffolds from such libraries, detailed evaluations of large pool compounds with related antibacterial potential can grant a better understanding of structural features crucial for their penetration and accumulation. Based on the scarcity of compounds with broad structural diversity and activity against Gram-negative bacteria, the creation and updating of such libraries remain a laborious but important undertaking. A Pressurized Microwave Assisted Extraction (PMAE) method over a short duration and low-temperature conditions was developed and compared to the conventional cold maceration over a prolonged duration. This method aimed at addressing the key challenges associated with conventional extraction methods which require long extraction durations, and use more energy and solvents, in addition to larger quantities of plant materials. Furthermore, the method was intended to replace the common use of high temperatures in most of the current MAE applications. Interestingly, the yields of 16 of 18 plant samples under PMAE over 30 minutes were found to be within 91–139% of those obtained from the 24h extraction by maceration. Additionally, different levels of selectivity were observed upon an analytical comparison of the extracts obtained from the two methods. Although each method indicated selective extraction of higher quantities or additional types of certain phytochemicals, a slightly larger number of additional compounds were observed under maceration. The use of this method allows efficient extraction of a large number of samples while sparing heat-sensitive compounds and minimizing chances for cross-reactions between phytochemicals. Moreover, findings from another investigation highlighted the low likelihood of reproducing antibacterial activities previously reported among various plant species, identified the key drivers of poor reproducibility, and proposed possible measures to mitigate the challenge. The majority of extracts showed no activities up to the highest tested concentration of 1024 µg/mL. In the case of identical plant species, some activities were observed only in 15% of the extracts, in which the Minimum Inhibitory Concentrations (MICs) were 4 – 16-fold higher than those in previous reports. Evaluation of related plant species indicated better outcomes, whereby about 18% of the extracts showed activities in a range of 128–512 μg/mL, some of the activities being superior to those previously reported in related species. Furthermore, solubilizing plant crude extracts during the preparation of test solutions for Antibacterial Susceptibility Testing (AST) assays was outlined as a key challenge. In trying to address this challenge, some studies have used bacteria-toxic solvents or generally unacceptable concentrations of common solubilizing agents. Both approaches are liable to give false positive results. In line with this challenge, this study has underscored the suitability of acetone in the solubilization of crude plant extracts. Using acetone, better solubility profiles of crude plant extracts were observed compared to dimethyl sulfoxide (DMSO) at up to 10 %v/v. Based on lacking toxicity against many bacteria species at up to 25 %v/v, its use in the solubilization of poorly water-soluble extracts, particularly those from less polar solvents is advocated. In a subsequent study, four galloylglucoses were isolated from the leaves of Paeonia officinalis L., whereby the isolation of three of them from this source was reported for the first time. The isolation and characterization of these compounds were driven by the crucial need to continually fill the pre-clinical antibiotics pipeline using all available means. Application of the bioautography-guided isolation and a matrix of extractive, chromatographic, spectroscopic, and spectrometric techniques enabled the isolation of the compounds at high purity levels and the ascertainment of their chemical structures. Further, the compounds exhibited the Minimum Inhibitory Concentrations (MIC) in a range of 2–256 µg/mL against Multidrug-Resistant (MDR) strains of E. coli and K. pneumonia exhibiting diverse MDR phenotypes. In that, the antibacterial activities of three of the isolated compounds were reported for the first time. The observed in vitro activities of the compounds resonated with their in vivo potentials as determined using the Galleria mellonella larvae model. Additionally, the susceptibility of the MDR bacteria to the galloylglucoses was noted to vary depending on the nature of the resistance enzymes expressed by the MDR bacteria. In that, the bacteria expressing enzymes with higher content of aromatic amino acids and zero or positive net charges were generally more susceptible. Following these findings, a plausible hypothesis for the observed patterns was put forward. The generally challenging pharmacokinetic properties of galloylglucoses limit their further development into therapeutic agents. However, the compounds can replace or reduce the use of antibiotics in livestock keeping as well as in the treatment of septic wounds and topical or oral cavity infections, among other potential uses. Using nature-inspired approaches, a series of glucovanillin derivatives were prepared following feasible synthetic pathways which in most cases ensured good yields and high purity levels. Some of the prepared compounds showed MIC values in a range of 128 – 512 μg/mL against susceptible and MDR strains of Klebsiella pneumoniae, Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus (MRSA) and Vancomycin-Resistant Enterococcus faecium (VRE). These findings emphasize the previously reported essence of small molecular size, the presence of protonatable amino groups and halogen atoms, as well as an amphiphilic character, as crucial features for potential antibacterial agents. Due to the experienced limited success in the search for new antibacterial agents using purely synthetic means, pursuing semi-synthetic approaches as employed in this study are highly encouraged. This way, it is possible to explore broader chemical spaces around natural scaffolds while addressing their inherent limitations such as solubility, toxicity, and poor pharmacokinetic profiles. N2 - Ziel dieser Arbeit war die Suche nach neuen wirksamen Antiinfektiva gegen multiresistente Enterobacteriaceae. Grund dafür ist der dringende Bedarf an neuen und innovativen antibakteriellen Wirkstoffen gegen die von der Weltgesundheitsorganisation (WHO) als vorrangig eingestuften Krankheitserreger. Unter den verfügbaren Methoden zur Entdeckung und Entwicklung von Antibiotika ist die Natur seit langem ein bewährtes, innovatives und äußerst zuverlässiges Mittel, um erfolgreich zu antibakteriellen Wirkstoffen zu gelangen. Dennoch stehen dieser wertvollen Quelle von Antibiotika und anderen Arzneimitteln zahlreiche Herausforderungen gegenüber, die die vollständige Ausschöpfung ihres Potenzials einschränken. Dazu gehören die Verfügbarkeit qualitativ hochwertiger Daten über die hochpotenten natürlichen Quellen, Einschränkungen bei den Methoden zur Herstellung und zum Screening von Rohextrakten, Engpässe bei der Reproduktion des in natürlichen Quellen beobachteten biologischen Potenzials sowie Hürden bei der Isolierung, Reinigung und Charakterisierung von Naturstoffen mit unterschiedlicher struktureller Komplexität. Mittels einer umfassenden Durchsicht der Literatur war es möglich, Bibliotheken mit Pflanzenarten und Phytochemikalien zu erstellen, die ein hohes Potenzial gegen Escherichia coli und Klebsiella pneumnonia aufweisen. Die Bibliotheken wurden profiliert, um die bestehenden Muster und Beziehungen zwischen den berichteten antibakteriellen Aktivitäten und den untersuchten Pflanzenfamilien und -teilen, der Art des Extraktionslösungsmittels sowie den Klassen der Phytochemikalien, der Wirkstoffähnlichkeit und ausgewählten Parametern für eine verstärkte Akkumulation in den gramnegativen Bakterien aufzuzeigen. Darüber hinaus wurden Motivationen, Ziele, die Rolle traditioneller Methoden und andere wichtige experimentelle Aspekte beim Screening von Pflanzenextrakten auf antibakterielle Aktivitäten identifiziert und diskutiert. Auf der Grundlage der strengen Aufnahmekriterien bieten die erstellten Bibliotheken einen schnellen Zugang zu gut bewerteten Pflanzenarten und Phytochemikalien mit potenziellen antibakteriellen Aktivitäten. Auf diese Weise können weitere Studien in noch unerforschten Richtungen mit den angegebenen oder ähnlichen Arten und Verbindungen durchgeführt werden. Darüber hinaus spielt die Verfügbarkeit von Substanzbibliotheken, die sich auf verwandte Bakterienarten konzentrieren, eine große Rolle bei den laufenden Bemühungen, die Regeln für die Penetration und Akkumulation von Antibiotika zu entwickeln, insbesondere bei gramnegativen Bakterien. Neben der Suche nach potenziellen Molekülgerüsten aus solchen Bibliotheken können detaillierte Bewertungen großer Pools von Verbindungen mit antibakteriellem Potenzial ein besseres Verständnis der strukturellen Merkmale ermöglichen, die für ihre Penetration und Akkumulation entscheidend sind. Da es kaum Verbindungen mit breiter struktureller Vielfalt und Aktivität gegen gramnegative Bakterien gibt, ist die Erstellung und Aktualisierung solcher Bibliotheken nach wie vor ein mühsames, aber wichtiges Unterfangen. Es wurde eine schnelle mikrowellenunterstützte Extraktionsmethode unter Druck (PMAE) und bei niedrigen Temperaturen entwickelt und mit der herkömmlichen Kaltmazeration mit längerer andauernd verglichen. Mit der PMAE-Methode sollten die wichtigsten Probleme herkömmlicher Extraktionsmethoden gelöst werden, die eine lange Extraktionsdauer erfordern, mehr Energie und Lösungsmittel verbrauchen und zudem größere Mengen an Pflanzenmaterial benötigen. Darüber hinaus sollte die Methode die übliche Verwendung hoher Temperaturen in den meisten der derzeitigen MAE-Anwendungen ersetzen. Interessanterweise lag die Ausbeute von 16 der 18 Pflanzenproben bei der 30-minütigen PMAE zwischen 91 und 139 % der jenigen, die bei der 24-stündigen Extraktion durch Mazeration erzielt wurde. Darüber hinaus wurden bei einem analytischen Vergleich der mit den beiden Methoden gewonnenen Extrakte unterschiedliche Selektivitätsgrade festgestellt. Obwohl jede Methode eine selektive Extraktion größere Mengen oder zusätzlicher Arten bestimmter Phytochemikalien anzeigte, wurde bei der Mazeration eine etwas größere Anzahl an Verbindungen beobachtet. Die Anwendung dieser PMAE-Methode ermöglicht eine effiziente Extraktion einer großen Anzahl von Proben, wobei hitzeempfindliche Verbindungen geschont werden und die Wahrscheinlichkeit von Kreuzreaktionen zwischen Phytochemikalien minimiert wird. Die weitere Untersuchung von Pflanzenextraktionen haben die geringe Reproduzierbarkeit von antibakteriellen Aktivitäten, die zuvor für verschiedene Pflanzenarten berichtet wurden, aufgedeckt, die Hauptursachen für die schlechte Reproduzierbarkeit identifiziert und mögliche Maßnahmen zur Minimierung dieser Herausforderung vorgeschlagen. Die Mehrheit der Extrakte zeigte bis zur höchsten getesteten Konzentration von 1024 µg/ml keine Aktivitäten. Bei identischen Pflanzenarten wurden nur bei 15 % der Extrakte gewisse Aktivitäten beobachtet, wobei die minimalen Hemmkonzentrationen (MHK) um das Vier- bis 16-fache höher waren als in früheren Berichten. Die Auswertung verwandter Pflanzenarten zeigte geringfügig bessere Ergebnisse, wobei etwa lagen 18 % der Extrakte Aktivitäten in einem Bereich von 128-512 µg/ml aufwiesen; dabei einige der Aktivitäten über denen, die zuvor bei verwandten Arten berichtet wurden. Darüber hinaus wurde die Löslichkeit von Pflanzenrohextrakten bei der Herstellung von Testlösungen für die Bestimmung der Antimikrobischen Suszeptibilität (AST) als eine der größten Herausforderungen bezeichnet. Bei dem Versuch, diese Herausforderung zu bewältigen, wurden in einigen Studien bakterientoxische Lösungsmittel oder allgemein inakzeptable Konzentrationen gängiger Lösungsvermittler verwendet. Beide Ansätze können zu falsch-positiven Ergebnissen führen. Deshalb hat diese Studie die Eignung von Aceton für die Solubilisierung von Pflanzenrohextrakten unterstrichen. Bei Verwendung von Aceton wurden eine bessere Löslichkeit der Pflanzenrohextrakten im Vergleich zu Dimethylsulfoxid (DMSO) bei bis zu 10 % v/v beobachtet. Aufgrund der fehlenden Toxizität gegen viele Bakterienarten bei bis zu 25 % v/v wird die Verwendung von Aceton für die Solubilisierung schwer wasserlöslicher Extrakte, insbesondere solcher aus weniger polaren Lösungsmitteln, befürwortet. In der nachfolgenden Untersuchung wurden vier Galloylglucosen aus den Blättern von Paeonia officinalis L. isoliert, wobei von drei Substanzen aus dieser Quelle zum ersten Mal berichtet wurde. Die Isolierung und Charakterisierung dieser Verbindungen wurden durch die dringende Notwendigkeit vorangetrieben, die präklinische Antibiotika-Pipeline mit allen verfügbaren Methoden zu füllen. Die Anwendung der bioautographisch gesteuerten Isolierung und einer Matrix aus extraktiven, chromatographischen, spektroskopischen und spektrometrischen Techniken ermöglichte die Isolierung der Verbindungen mit hohem Reinheitsgrad und die Bestimmung ihrer chemischen Strukturen. Darüber hinaus wiesen die Verbindungen minimale Hemmkonzentrationen (MHK) in einem Bereich von 2-256 µg/ml gegen multiresistente (MDR) Stämme von E. coli und K. pneumonia auf, die verschiedene MDR-Phänotypen aufweisen. Über die antibakteriellen Aktivitäten von drei der isolierten Verbindungen wurde zum ersten Mal berichtet. Die beobachteten In-vitro-Aktivitäten der Verbindungen stimmten mit ihren In-vivo-Potenzialen überein, die anhand des Galleria mellonella-Larvenmodells ermittelt wurden. Darüber hinaus wurde festgestellt, dass die Empfindlichkeit der MDR-Bakterien gegenüber den Galloylglucosen von der Art der von den MDR-Bakterien exprimierten Resistenzenzyme abhängt. So waren die Bakterien, die Enzyme mit einem höheren Gehalt an aromatischen Aminosäuren und null oder positiven Nettoladungen exprimieren, im Allgemeinen anfälliger. Nach diesen Erkenntnissen wurde eine plausible Hypothese für die beobachteten Muster aufgestellt. Die allgemein schwierigen pharmakokinetischen Eigenschaften von Galloylglucosen schränken ihre weitere Entwicklung als therapeutischen Wirkstoffen ein. Die Verbindungen können jedoch den Einsatz von Antibiotika in der Tierhaltung sowie bei der Behandlung von septischen Wunden und Infektionen der Haut oder der Mundhöhle ersetzen oder reduzieren, neben anderen potenziellen Anwendungen. Mit von der Natur inspirierten Ansätzen wurde eine Reihe von Glucovanillin-Derivaten synthetisch hergestellt. Einige der neuen Verbindungen wiesen MHK-Werte im Bereich von 128 - 512 μg/ml gegen empfindliche und MDR-Stämme von Klebsiella pneumoniae, Methicillin-resistentem Staphylococcus aureus (MRSA) und Vancomycin-resistentem Enterococcus faecium (VRE) auf. Diese Ergebnisse unterstreichen die bereits früher berichtete Bedeutung einer kleinen Molekülgröße, des Vorhandenseins protonierbarer Aminogruppen und Halogenatome sowie eines amphiphilen Charakters als entscheidende Merkmale für potenzielle antibakterielle Wirkstoffe. Da die Suche nach neuen antibakteriellen Wirkstoffen mit rein synthetischen Mitteln bisher nur begrenzt erfolgreich war, sind halbsynthetische Ansätze, wie sie in dieser Studie verwendet wurden, sehr zu empfehlen. Auf diese Weise ist es möglich, größere chemische Räume um natürliche Molekülgerüste herum zu erforschen und gleichzeitig deren inhärente Einschränkungen wie Löslichkeit, Toxizität und schlechte pharmakokinetische Profile zu überwinden. KW - Enterobacteriaceae KW - Pflanzen KW - Synthese KW - Multidrugresistant KW - Plant extracts KW - Isolation and Characterization KW - Microwave Assisted Extraction KW - Nature-Insipired Synthesis KW - Reproducibility challenges KW - Library of Phytochemicals KW - Library of plant species KW - Plants KW - Characterization KW - Synthesis Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-302632 ER - TY - THES A1 - Ganskih, Sabina T1 - Dissecting the functional interplay between SARS-CoV-2 viral RNAs and the host proteome T1 - Charakterisierung der funktionalen Interaktionen zwischen SARS-CoV-2 RNA und dem Wirtszellproteom N2 - The recent pandemic has reminded the public that basic research in virology is pivotal for human health. Understanding the mechanisms of successful viral replication and the role of host factors can help to combat viral infections and prevent future pandemics. Our lab has published the first SARS-CoV-2 RNA-protein interaction atlas, laying the foundation to investigate the interplay between viral RNA and host RNA binding proteins (RBP). Based on this, my project created the largest collection of binding profiles of host and viral RBPs on SARS-CoV-2 RNA to date. This revealed the host protein SND1 as the first human RBP that specifically binds negative sense viral RNA at the 5´ end, a region associated with viral transcription initiation. The binding profile shares similarities with the viral RBP nsp9, which binds the 5´ ends of positive and negative sense SARS-CoV-2 RNA. Depletion of SND1 shows reduced levels of viral RNA revealing it as a proviral host factor. To decode the underlying molecular mechanism, I characterized the protein-protein interactions of SND1 in SARS-CoV-2 infected and uninfected cells. Infection remodels the protein interactors of SND1 from general RNA biology to membrane association and viral RNA synthesis. Upon infection, SND1 specifically interacts with nsp9, the RBP that shares the same binding region on the negative strand of SARS-CoV-2 RNA. Recent work demonstrates that nsp9 is NMPylated in vitro suggesting a functional role of nsp9 in priming of viral RNA synthesis. I was able to show that nsp9 is covalently linked to the 5´ ends of SARS-CoV-2 RNA during infection of human cells. Analysing the covalent bond of nsp9 with the viral RNA on nucleotide level shows close proximity to the initiation sites of viral RNA synthesis, suggesting that nsp9 acts as a protein-primer of SARS-CoV-2 RNA synthesis. SND1 modulates the distribution of nsp9 on the viral RNA, since depletion of SND1 results in imbalanced occupancy of nsp9 at the 5´ends of viral RNA. This study is the first to provide evidence for the priming mechanism of SARS-CoV-2 in authentic viral replication and further reveals how this mechanism is modulated by the host RBP SND1. Detailed knowledge about priming of viral RNA synthesis can help to find targeted antivirals that could be used to fight coronaviral infections. N2 - Die letzte Pandemie zeigte erneut, das Grundlagenforschung im Bereich der Virologie essentiell für die Gesundheit des Menschen ist. Das Wissen über Schlüsselelemente erfolgreicher viraler Replikation und der Relevanz humaner Proteine darin kann helfen Infektionen zu bekämpfen und künftige Pandemien zu verhindern. Unser Labor publizierte das erste SARS-CoV-2 RNA Protein-Interaktom und legte dabei den Grundstein für die Forschung am Zwischenspiel viraler RNA und humanen RNA Bindeproteinen (RBPs). Basierend darauf, generierte mein Projekt die bislang größte Sammlung an Bindeprofilen humaner sowie viraler RBPs auf der SARS-CoV-2 RNA. Dabei zeigte sich der Wirtsfaktor SND1 als das erste human RBP das in der Lage ist den Negativstrang der viral RNA zu binden, spezifisch an dessen 5´ Ende welches mit der Transkriptionsinitiierung assoziiert ist. Diese Bindestelle ist ähnlich zu dem viralen RBP nsp9, welches die 5´ Enden der positiv und negativ RNA bindet. Das Fehlen von SND1 in der Wirtszelle führt zu reduzierten Mengen viraler RNA und impliziert daher einen proviralen Einfluss von SND1. Um den zugrundeliegenden molekularen Mechanismus zu verstehen, betrachtete ich die Protein-Protein Interaktionen von SND1 in SARS-CoV-2 infizierten und uninfizierten Zellen. Dabei zeigte sich, dass durch die Infektion die Interaktionspartner von SND1 von genereller RNA Biologie zu Membranassoziierung sowie viraler RNA Synthese verschiebt. Mit Infektion der Zelle interagiert SND1 spezifisch mit nsp9, das RBP welches dieselbe Binderegion am Negativstrang mit SND1 auf der SARS-CoV-2 RNA teilt. Neuste in vitro Studien zeigen, dass nsp9 NMPyliert wird und deuten damit eine Relevanz von nsp9 in Priming an. Ich konnte im Kontext authentischer viraler Replikation zeigen, dass nsp9 kovalent an die 5´ Enden der SARS-CoV-2 RNA gebunden ist. Bei genauerer Untersuchung der kovalenten Bindung von nsp9 an der viralen RNA auf Nukleotidebene zeigt, dass diese Nahe der Initiationsstelle der Transkription liegen, was eine Relevanz von nsp9 als Protein-Primer in der SARS-CoV-2 RNA Synthese impliziert. Die Richtige Verteilung von nsp9 auf der viralen RNA wird von SND1 moduliert, da Abwesenheit von SND1 zu einem Ungleichgewicht von nsp9 an den 5´ Enden führt. XII Diese Studie ist die Erste, die Evidenzen für den Primingmechanismus von SARS-CoV-2 in authentischer viraler Replikation zeigt und wie diese durch SND1 moduliert wird. Detailliertes Wissen über das Priming viraler RNA Synthese kann dabei helfen gezielte nach antiviralen Substanzen zu suchen, die dabei helfen könnten Infektionen durch Coronaviren zu bekämpfen. KW - SARS-CoV-2 KW - RNA-Protein Interaktom KW - RNA-protein interactome Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-346486 ER - TY - THES A1 - Bauer, Christian T1 - Towards ecological and efficient electrochemical energy storage in supercapacitors and sodium ion batteries using onion-like carbon T1 - Ökologische und effiziente elektrochemische Energiespeicherung in Superkondensatoren und Natriumionen-Batterien mit Kohlenstoff-Nanozwiebeln N2 - In this thesis, the usage of onion-like carbon (OLC) for energy storage applications was researched regarding sustainability, performance and processability. This work targets to increase the scientific understanding regarding the role of OLC in electrodes and to facilitate a large-scale production, which is the foundation for commercial application. Research was devoted to increase the knowledge in the particular field, to yield synergistic approaches and a shared value regarding sustainability and performance. N2 - Im Rahmen dieser Arbeit wurde die Verwendung von Onion-like Carbon (OLC) als Aktivmaterial zur Energiespeicherung untersucht. Die Arbeit zielte darauf ab, das wissenschaftliche Verständnis der Rolle von OLC im Kontext der elektrochemischen Energiespeicherung zu verbessern. Hierfür wurde an den Prozessschritten und Verfahren gearbeitet, um OLC-basierte Elektroden erfolgreich in Superkondensatoren und Pseudokondensatoren zu verwenden. Auch der Einsatz von OLC als Aktivmaterial für Natriumionenbatterien wurde erforscht, wobei sich das Material in dieser Anwendung als Aktivmaterial ungeeignet erwies. Die Bearbeitungen dieser Fragestellungen war darauf ausgerichtet, das Wissen in diesem Bereich zu erweitern, synergetische Ansätze für Problemlösungen zu finden und einen Mehrwert in Bezug auf Nachhaltigkeit, Performance und Prozessierbarkeit zu schaffen. KW - Elektrochemie KW - Chemie KW - Anode KW - Kohlenstoff KW - Superkondensator KW - OLC KW - SIB KW - PEDOT KW - Supercap Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-317956 ER - TY - THES A1 - Sun, Aili T1 - Effect of Tjap1 knock-down on blood-brain barrier properties under normal and hypoxic conditions T1 - Auswirkung des Tjap1-Knockdowns auf die Eigenschaften der Blut-Hirn-Schranke unter normalen und hypoxischen Bedingungen N2 - Stroke is one of the leading causes of mortality and disability worldwide. The blood-brain barrier (BBB) plays an important role in maintaining brain homeostasis by tightly regulating the exchange of substances between circulating blood and brain parenchyma. BBB disruption is a common pathologic feature of stroke and traumatic brain injury. Understanding the cellular and molecular events that affect the BBB after ischaemic brain injury is important to improve patient prognosis. We have previously shown that microRNA-212/132 is elevated in hypoxic brain microvascular endothelial cells and acts through suppressing the expression of direct microRNA-212/132 target genes with function at the BBB: claudin-1, junctional adhesion molecule 3 (Jam3) and tight-junction associated protein 1 (Tjap1). While the role of claudin-1 and Jam3 at the BBB is well known, the role of Tjap1 is still unclear. The aim of this work was therefore to characterize the role of Tjap1 in brain endothelial cells using a knock-down (KD) approach in established murine in vitro BBB models cEND and cerebEND. Tjap1 KD was established by stable transfection of a plasmid expressing shRNA against Tjap1. The successful downregulation of Tjap1 mRNA and protein was demonstrated by qPCR and Western blot. Tjap1 KD resulted in impaired barrier properties of endothelial cells as shown by lower TEER values and higher paracellular permeability. Interestingly, the Tjap1 KD cells showed lower cell viability and proliferation but migrated faster in a wound healing assay. In the tube formation assay, Tjap1 KD cell lines showed a lower angiogenic potential due to a significantly lower tube length and number as well as a lower amount of branching points in formed capillaries. Tjap1 KD cells showed changes in gene and protein expression. The TJ proteins claudin-5, Jam3 and ZO-1 were significantly increased in Tjap1 KD cell lines, while occludin was strongly decreased. In addition, efflux pump P-glycoprotein was downregulated in Tjap1 KD cells. Oxygen-glucose deprivation (OGD) is a method to mimic stroke in vitro. Brain endothelial cell lines treated with OGD showed lower barrier properties compared to cells cultured under normal condition. These effects were more severe in Tjap1 KD cells, indicating active Tjap1 involvement in the OGD response in brain microvascular endothelial cells. We thus have shown that Tjap1 contributes to a tight barrier of the BBB, regulates cell viability and proliferation of endothelial cells, suppresses their migration and promotes new vessel formation. This means that Tjap1 function is important for mature BBB structure in health and disease. N2 - Schlaganfall ist weltweit eine der häufigsten Ursachen für Mortalität und Behinderung. Die Blut-Hirn-Schranke (BHS) spielt eine wichtige Rolle bei der Aufrechterhaltung der Gehirnhomöostase, indem sie den Stoffaustausch zwischen dem zirkulierenden Blut und dem Gehirnparenchym streng reguliert. Eine Störung der BHS ist ein gemeinsames pathologisches Merkmal von Schlaganfällen und traumatischen Hirnverletzungen. Um die Prognose der Patientinnen und Patienten zu verbessern, ist es wichtig, die zellulären und molekularen Ereignisse zu verstehen, die sich nach einer ischämischen Hirnverletzung auf die BHS auswirken. Wir haben zuvor gezeigt, dass microRNA-212/132 in hypoxischen mikrovaskulären Endothelzellen erhöht ist und durch die Unterdrückung der Expression direkter Zielgene mit Funktion and der BHS wirkt. Zu den Zielgenen von microRNA-212/132 gehören: Claudin-1, Junctional Adhesion Molecule 3 (Jam3) und Tight Junction Associated Protein 1 (Tjap1). Während die Rolle von Caludin-1 und Jam3 and der BHS gut bekannt ist, ist die Rolle von Tjap1 noch unklar. Ziel dieser Arbeit war es daher, die Rolle von Tjap1 in Endothelzellen mithilfe eines Knock-down (KD)-Ansatzes in etablierten murinen In-vitro-BHS-Modellen zu charakterisieren. Tjap1-KD wurde durch stabile Transfektion eines Plasmids etabliert, das shRNA gegen Tjap1 exprimiert. Die erfolgreiche Herunterregulierung von Tjap1-mRNA und -Protein wurde durch qPCR und Western Blot nachgewiesen. Tjap1-KD führte zu einer Beeinträchtigung der Barriereeigenschaften von Endothelzellen, was sich in niedrigeren TEER-Werten und einer höheren parazellulären Permeabilität wiederspiegelte. Interessanterweise zeigten die Tjap1-KD-Zellen in einem Wundheilungstest eine geringere Zelllebensfähigkeit und Proliferation, wanderten jedoch schneller. Im tube formation assay zeigten Tjap1-KD-Zelllinien ein geringeres Angiogenese-Potential durch eine signifikant geringere Anzahl der gebildeten Kapillaren. Tjap-1-KD-Zellen zeigten Veränderungen in der Gen- und Proteinexpression. Die TJ-Proteinen Claudin-5, Jam3 und ZO-1 waren in Tjap1-KD-Zelllinien signifikant erhöht, während Occludin stark verringert war. Darüber hinaus wurde P-Glykoprotein in Tjap1-KD-Zellen herunterreguliert. Sauerstoff-Glukose-Entzug (eng. oxygen/glucose-deprivation, OGD) ist eine Methode zur Nachahmung eines Schlaganfall in vitro. Mit OGD behandelte Endothelzelllinien zeigten im Vergleich zu unter normalen Bedingungen kultivierten Zellen geringere Barriereeigenschaften. Diese Effekte waren in Tjap1-KD-Zellen schwerwiegender, was auf eine aktive Beteiligung von Tjap1 an der OGD-Antwort in Endothelzellen hinweist. Wir haben gezeigt, dass Tjap1 zu einer dichten Barriere der BHS beiträgt, die Zellviabilität und die Proliferation von Endothelzellen reguliert, deren Migration unterdrückt und die Bildung neuer Gefäße fördert. Dies bedeutet, dass die Tjap1-Funktion für die reife BHS-Struktur unter physiologischen und pathophysiologischen Bedingungen wichtig ist. KW - Schlaganfall KW - Blut-Hirn-Schranke KW - blood-brain barrier KW - Tjap1 KW - oxygen/glucose deprivation KW - stroke Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-346450 ER - TY - THES A1 - Gralke, Verena Maria T1 - The Impact of Media Literacy in Adolescence and Young Adulthood. - Correlative and Experimental Investigations on the Influence of Media Literacy on Cognitive and Political Variables, and on Knowledge Acquisition from Media – T1 - Der Einfluss von Medienkompetenz auf Jugendliche und junge Erwachsene. - Korrelative und experimentelle Studien zu dem Einfluss von Meidenkompetenz auf kognitive und politische Variablen, sowie auf die Lernwirksamkeit von Medien. - N2 - This thesis consists of three studies investigating the influence media literacy has on political variables, cognitive variables, and learning. Adolescents from 13 years of age and young adults are included in the studies. This thesis is divided into three chapters. Study I and II are one comprehensive study, but will be presented separately for better readability. Chapter I provides the reader with background knowledge for the original studies presented in chapter II includes information about media use, different conceptualizations of media literacy and its development over the lifetime, as well as media literacy’s impact on cognitive and political variables. Additionally, current literature on the comparison of the learning outcomes of different kinds of texts (written, auditory, and audiovisual) is presented, with a differentiation between text-based information and inferences. In chapter II, the original studies are placed in the current state of research and presented in detail. In chapter III, a critical discussion of the studies is conducted, and a general model of the influence media literacy has on the investigated cognitive and political factors is presented, followed by a conclusion of the research. The theoretical foundation of this thesis is three models of media literacy proposed by Groeben (2002, 2004), Hobbs (1997), and Potter (1998, 2016). These three models are similar in that they define media literacy as a multifactorial construct with skills that develop further in the course of life. Their ideas are integrated and developed further, leading to our own model of media literacy. It encompasses five scales: media sign literacy, distinction between reality and fiction, knowledge of media law, knowledge of media effects, and production skills. Thereupon, the assessment tool Würzburg Media Literacy Test (WMK; Würzburger Medienkompetenztest) is designed. There is evidence that media use and media literacy influence socio-political factors. Young adults name the internet as the main source of information on political topics (see Pasek et al., 2006), and knowledge demonstrably fosters political participation (Delli Carpini & Keeter, 1996). However, the kind of participation activity regarded is important (Quintelier & Vissers, 2008), as sometimes real-life participation is supplemented by online activities (Quan-Haase & Wellman, 2002). Media literacy is the key to evaluating the quality of information from media. Whether or not a direct link between media literacy and political interest exists has, as far as I know, not yet been investigated. Several studies have shown that precursors and subcomponents of media literacy have the capacity to influence cognitive variables. For instance, children with higher media sign literacy possess better reading proficiency (Nieding et al., 2017) and are better at collecting information and drawing inferences from hypermedia and films (Diergarten et al., 2017) as compared to children with low literacy. These precursors and subcomponents are more efficient in processing medial sign systems, reducing cognitive load, and consequently, liberating cognitive capacity for other mental tasks (Sweller, 1988). Paino and Renzulli (2012) showed that highly computer-proficient adolescents exhibit better mathematics and reading abilities. Different types of media influence the learning process differently, and the learning process can be enhanced by combining these different types of media, if the material is prepared according to the research findings and Mayer’s (2002) cognitive theory of multimedia learning. Similarly, a reduction in cognitive load takes place and more resources can be invested in the learning process itself (Mayer & Moreno, 2003; Sweller, 1988). It is not easy to answer the question of whether one medium is superior for learning to another. Generally, adults learn best from written texts (e.g., Byrne & Curtis, 2000), and audiovisual and auditory texts are comparable (e.g., Hayes et al., 1986); however, there is little research regarding the comparison of the latter two. Study I examined whether media literacy has a positive impact on interest in politics and the political self-concept. A sample of 101 13-to 20-year-olds was drawn. The control variables were intelligence, socio-economic status (SES), openness to experiences, perspective-taking, age, and sex. Additionally, an evaluation of the WMK was conducted, which indicated good construct validity and excellent overall reliability. Media literacy was positively associated with interest in politics, political self-concept, and perspective-taking but not with openness. In hierarchical regressions and path analysis, a direct influence of media literacy and openness on interest in politics could be found. Political self-concept was solely influenced by interest in politics. Although media literacy had no direct influence on political self-concept, it influenced its precursor interest in politics and was thus expected to have distal influence. The results of the first study confirm previous findings (e.g., Vecchione & Caprara, 2009), where political self-concept is regarded as a precursor of political participation. In conclusion, the findings of study I suggested that by stimulating political interest, media literacy could, mediated through political self-concept, foster political participation. Study II (which was conducted on the same sample as study I) was concerned with the question of whether highly media-literate adolescent and young adult participants exhibit better academic skills (mathematics; reading) and academic achievement (grades) compared to less media-literate participants. Additionally, to obtain information about potential development during adolescence, a group of 50 13-year-olds was compared with a group of 51 19-year-olds in terms of their media literacy. The control variables were intelligence, SES, sex, and age. The results showed that a significant development of media literacy took place during adolescence (∆M = .17), agreeing with Potter’s (1998, 2013) development theory of media literacy. Media literacy was significantly correlated with reading skills and school grades. Regarding adults, media literacy was also significantly correlated with mathematical skills; the association was greater than that with reading skills. However, no connection with mathematical skills was found for adolescents. To control for the influence of age and intelligence, which were both associated with media literacy, hierarchical regressions and path analyses were conducted. The results revealed that media literacy had a greater impact on grades and academic abilities than intelligence. These results are in line with those obtained by Paino and Renzulli (2012). Study III investigated whether media literacy helps young adults to better learn from three kinds of media, a written, an auditory, and an audio-visual text, and which medium achieves the best learning results. Three groups of 91 young adults were compared (written, auditory, and audio-visual text) in terms of their learning outcomes. These outcomes were conceptualized as directly stated information in the text (assessed by text-based questions) and inferential learning (inference questions). A computer-based short version of the WMK was applied to assess media literacy, which should be optimized in the future. The control variables were intelligence, verbal ability, media usage, prior knowledge, and SES. In hierarchical regression, media literacy turned out to be a significant predictor of text inferences, even when other relevant variables, such as intelligence, were controlled for. Inferences foster the building of the situation model, which is believed by many authors to be true comprehension of a text (Zwaan & Radvansky, 1998). The outcomes of study III support Ohler’s (1994) assumption that media literacy fosters the creation of a more elaborated situational model. Text-based questions were only influenced by prior knowledge. As assumed by Potter (1998, 2016), the media literacy of young adults in the Western world suffices to extract relevant facts from educational learning material. Both subjects were best in the written text condition for text-based and inference question results. Audiovisual and auditory texts showed no significant differences. The written text condition did not excel in the auditory text condition for inferences. The results accord with those obtained by, for instance, Byrne and Curtis (2000). Taken together, these studies show that media literacy can influence several cognitive and political variables. It stimulates political interest, reading comprehension, school grades, and mathematical abilities in young adults, as well as drawing inferences from different kinds of texts. Additionally, media literacy develops further during adolescence. N2 - Diese Doktorarbeit besteht aus drei Studien, welche den Einfluss von Medienkompetenz auf politische Variablen, kognitive Variablen und auf Lernen untersuchen. Hierzu wurden Jugendliche ab 13 Jahren und junge Erwachsene rekrutiert. Bei Studie I und II handelt es sich um eine groß angelegte Studie, welche der Lesbarkeit wegen als separate Untersuchungen dargestellt wird. Diese Doktorarbeit ist in drei Kapitel unterteilt. Das erste Kapitel liefert das notwendige Hintergrundwissen für die originären Forschungsstudien des zweiten Kapitels. Dies beinhaltet Informationen zur Mediennutzung, unterschiedlichen Konzeptionen von Medienkompetenz und deren Entwicklung im Verlauf des Lebens, sowie der Einfluss von Medienkompetenz auf kognitive und politische Variablen. Darüber hinaus wird die aktuelle Literatur zur Lernwirksamkeit verschiedener Textarten (schriftlich, auditiv, audiovisuell) dargelegt, wobei zwischen Textoberfläche und Inferenzen unterschieden wird. Im zweiten Kapitel werden die originären Studien zunächst in die aktuelle Literatur eingeordnet und darauffolgend detailliiert dargestellt. Im dritten Kapitel erfolgen anschließend die kritische Diskussion der Studien, sowie mein Versuch, ein übergreifendes Wirkungsmodell der Medienkompetenz auf die untersuchten kognitiven und politischen Faktoren zu entwerfen. Zum Schluss versuche ich ein finales Fazit meiner Forschung zu ziehen. Als theoretische Grundlage dieser Dissertation dienen die drei Modelle der Mediakompetenz von Groeben (2002, 2004), Hobbs (1997), und Potter (1998, 2016). Alle haben gemeinsam, dass sie Mediankompetenz als multifaktoriell, mit sich über die Lebenszeit weiterentwickelnden Fertigkeiten, konzeptualisieren. Die Ideen dieser Modelle wurden integriert und zu einem eigenen Modell der Mediankompetenz weiterentwickelt. Es beinhaltet fünf Skalen: Mediale Zeichenkompetenz, Realitäts-Fiktionsunterscheidung, Wissen über Medienrecht, Wissen über Medieneffekte, und Produktionsfertigkeiten. Hieraus wurde das Erhebungsinstrument WMK (Würzburger Medienkompetenztest) entwickelt. Es gibt Hinweise, dass Mediennutzung und –kompetenz politische Faktoren beeinflussen. Junge Erwachsene nennen das Internet als primäre Informationsquelle über Politik (z.B. Pasek, Kenski, Romer & Jamieson, 2006), wobei Wissen nachweißlich politische Teilhabe fördert (Delli Carpini & Keeter, 1996). Hier kommt es jedoch darauf an, wie politische Partizipation definiert wird (z.B. Quintelier & Vissers, 2008), da lebensweltliche Partizipation auch durch Online-Aktivitäten ersetzt werden kann (Quan-Haase & Wellman, 2002). Medienkompetenz stellt den Schlüssel zur Bewertung der Qualität von Informationen aus den Medien dar. Ob allerdings eine direkte Verbindung zwischen Medienkompetenz und Politikinteresse besteht, wurde meines Wissens bisher noch nicht untersucht. Es wurde bereits in mehreren Studien gezeigt, dass Vorläuferfähigkeiten und Teilkomponenten von Medienkompetenz kognitive Variablen positiv beeinflussen. So weißen beispielsweise Kinder mit höherer medialer Zeichenkompetenz im Vergleich zu Altersgenossen mit geringer medialer Zeichenkompetenz bessere Lesefertigkeiten auf (Nieding et al., 2017) und können besser Informationen und Inferenzen aus Hypertexten und Filmen ziehen (Diergarten et al., 2017). Dies könnte darin begründet liegen, dass diese Kinder mediale Zeichen effizienter verarbeiten und hierdurch die kognitive Belastung reduzieren, was ihnen mehr Kapazität für andere kognitive Aufgaben freiräumt (Sweller, 1988). Paino und Renzulli (2012) konnten zeigen, dass adoleszente Schüler mit hoher Computerkompetenz bessere mathematische und Lesefertigkeiten aufweisen. Verschiedene Medien beeinflussen das Lernen unterschiedlich und der Lernprozess kann durch die Kombination von Medien verbessert werden, wenn diese den Prinzipien der Kognitiven Theorie des Multimedialen Lernens von Mayer (2002) folgt. Hierdurch kommt es ebenso zu einer Reduktion der kognitiven Belastung, wodurch mehr Ressourcen in den Lernprozess investiert werden können (Sweller, 1988, Mayer & Moreno, 2003). Die Frage nach der generellen Überlegenheit eines Lernmediums lässt sich nicht pauschal beantworten. Im Allgemeinen lernen Erwachsene am besten von geschriebenen Texten (z.B. Byrne & Curtis, 2000), auditive und audiovisuelle Texte liegen gleichauf (Hayes, Kelly, & Mandel, 1986). Allerdings existieren wenige Studien, die sich mit einem Vergleich der beiden letzteren befassen. Die erste Studie dieser Dissertation untersuchte, ob sich Medienkompetenz positiv auf das Politikinteresse und das politische Selbstkonzept, auswirkt. Es wurde eine Stichprobe von 101 13- bis 20-Jährigen gezogen. Als Kontrollvariablen wurden Intelligenz, sozio-ökonomischer Status, Offenheit für Erfahrungen, Perspektivenübernahme, Alter und Geschlecht berücksichtigt. Zusätzlich fand eine Evaluation des WMK statt, welche gute Ergebnisse bezüglich seiner Konstruktvalidität und eine exzellente Gesamtrealiabilität ergab. Medienkompetenz korrelierte positiv mit Politikinteresse, dem politische Selbstkonzept und Perspektivenübernahme, aber nicht mit Offenheit für Erfahrungen. Hierarchische Regressionen und Pfadanalysen ergaben einen direkten Einfluss der Medienkompetenz und Offenheit auf das Politikinteresse. Das politische Selbstkonzept wurde nur durch das Politikinteresse beeinflusst. Auch wenn Medienkompetenz sich nicht direkt auf das politische Selbstkonzept auswirkte, so hat es doch dessen Vorläufer Politikinteresse modifiziert und könnte so distal wirken. Die Befunde dieser Studie bestätigen früherer Ergebnisse (z.B. Vecchione & Caprara, 2009), wenn man das politische Selbstkonzept als Vorläufer politischer Partizipation auffasst. Die Resultate von Deary und Kollegen (2008), dass intelligentere Menschen mehr Politikinteresse und politische Partizipation berichten, konnten nicht repliziert werden. Möglicherweise spielt hier das Bildungsniveau, vor allem verbale Fähigkeiten und eine Ausbildung in Sozialwissenschaften, eine größere Rolle als Intelligenz (vgl. Hillygus, 2005). Zusammenfassend zeigten die Ergebnisse von Studie I, dass Medienkompetenz durch die Förderung von Politikinteresse, vermittelt über das politische Selbstkonzept, politische Partizipation begünstigen kann. Studie II, welche an der gleichen Stichprobe wie Studie I durchgeführt wurde, befasste sich mit der Frage, ob Jugendliche und junge Erwachsene mit hoher Medienkompetenz, verglichen mit solchen mit geringer Medienkompetenz, bessere akademische Fertigkeiten (Mathematik; Lesen) und akademische Leistungen (Noten) aufweisen. Darüber hinaus wurde eine Gruppe von 50 13-Jährigen mit einer Gruppe von 51 19-Jährigen bezüglich ihrer Medienkompetenz verglichen, um eine Aussage über potentielle Veränderungen in der Pubertät treffen zu können. Als Kontrollvariablen dienten Intelligenz, sozio-ökonomischer Status, Alter und Geschlecht. Die Ergebnisse zeigten, dass in Übereinstimmung mit Potters (1998, 2013) Entwicklungstheorie der Medienkompetenz während der Adoleszenz eine signifikante Zunahme der Medienkompetenz stattfand (∆M = .17). Es ergaben sich Korrelationen von Medienkompetenz mit mathematischen und Lesefertigkeiten und mit Schulnoten. Bei den Erwachsenen fand sich auch ein signifikanter Zusammenhang mit mathematischen Fertigkeiten, welcher höher als der mit Lesefertigkeiten war. Bei den Jugendlichen fand sich keine Verbindung zwischen Medienkompetenz und mathematischen Fertigkeiten. Um den Einfluss des Alters und der Intelligenz, welche beide mit Medienkompetenz korrelierten, zu kontrollieren, wurden hierarchische Regressionen und Pfadanalysen angewandt. Analog zu Paino und Renzullis (2012) Studie ergaben sie, dass Medienkompetenz einen größeren Einfluss auf die Schulnoten und akademischen Fertigkeiten hatte als Intelligenz. In der dritten Studie wurde untersucht, ob Medienkompetenz jungen Erwachsenen dabei hilft, besser von drei verschiedenen Textarten zu lernen. Es wurden ein schriftlicher, ein auditiver und ein audiovisueller Text bezüglich der jeweiligen Lernwirksamkeit untersucht. Als Lernergebnisse wurden das direkte Textwissen durch textbasierte Fragen, sowie das Inferenzwissen durch Inferenzfragen, erfasst. Es wurde eine Stichprobe von insgesamt 91 jungen Erwachsenen in drei Gruppen aufgeteilt und bezüglich ihrer Lernergebnisse verglichen. Eine Gruppe erhielt den schriftlichen, die zweite den auditiven und die dritte den audiovisuellen Text. Eine computerbasierte Kurzversion des WMK wurde zur Messung der Medienkompetenz eingesetzt, welche sich als optimierungsfähig herausstellte. Zusätzlich wurden Intelligenz, verbale Fähigkeiten, Mediennutzung, Vorwissen und SÖS als Kontrollvariablen erhoben. Die Auswertung durch hierarchische Regressionen ergab, dass Medienkompetenz ein signifikanter Prädiktor für Textinferenzen darzustellen scheint, selbst wenn andere relevante Variablen, wie etwa die Intelligenz, statistisch kontrolliert werden. Inferenzen unterstützen den Aufbau eines Situationsmodells, welches oft als wirkliches Textverständnis aufgefasst wird (z.B. Zwaan & Radvansky, 1998). Die Ergebnisse der dritten Studie unterstützen Ohlers (1994) Annahme, dass Medienkompetenz den Aufbau eines elaborierteren Situationsmodells fördert. Die textbasierten Fragen wurden nur durch das Vorwissen vorhergesagt. Möglicherweise trifft Potters (1998, 2016) Annahme zu, dass Erwachsene in der westlichen Welt über ausreichend basale Medienkompetenz verfügen, um relevante Informationen aus Lernmaterialien herauszuziehen. Die Versuchsteilnehmer schnitten bei den textbasierten und den Inferenzfragen am besten bei dem schriftlichen Text ab. Der schriftliche Text zeigte bei den Inferenzfragen keine signifikante Überlegenheit im Vergleich zu dem auditiven Text. Der audiovisuelle und der auditive Text erzielten für beide Fragensorten vergleichbare Ergebnisse. Die Ergebnisse stimmen mit der Literatur überein (z.B. Byrne & Curtis, 2000). Zusammenfassend zeigten die Studien, dass Medienkompetenz die Fähigkeit hat verschiedene kognitive und nicht-kognitive Variablen zu beeinflussen. Es stimuliert Politikinteresse, verbessert Perspektivenübernahme, Leseverständnis, mathematische Fähigkeiten bei Erwachsenen, Schulnoten und die Bildung von Inferenzen von unterschiedlichen Textarten. Medienkompetenz scheint sich in der Adoleszenz weiterzuentwickeln. KW - Media Literacy KW - Knowledge Acquisition KW - Development KW - Lernwirksamkeit KW - Medienkompetenz KW - Wissenserwerb KW - Entwicklung KW - Schulerfolg KW - Academic Skills Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-346018 ER - TY - THES A1 - Philipp, Marius Balthasar T1 - Quantifying the Effects of Permafrost Degradation in Arctic Coastal Environments via Satellite Earth Observation T1 - Quantifizierung der Effekte von Permafrost Degradation in Arktischen Küstenregionen mittels Satelliten-gestützter Erdbeobachtung N2 - Permafrost degradation is observed all over the world as a consequence of climate change and the associated Arctic amplification, which has severe implications for the environment. Landslides, increased rates of surface deformation, rising likelihood of infrastructure damage, amplified coastal erosion rates, and the potential turnover of permafrost from a carbon sink to a carbon source are thereby exemplary implications linked to the thawing of frozen ground material. In this context, satellite earth observation is a potent tool for the identification and continuous monitoring of relevant processes and features on a cheap, long-term, spatially explicit, and operational basis as well as up to a circumpolar scale. A total of 325 articles published in 30 different international journals during the past two decades were investigated on the basis of studied environmental foci, remote sensing platforms, sensor combinations, applied spatio-temporal resolutions, and study locations in an extensive review on past achievements, current trends, as well as future potentials and challenges of satellite earth observation for permafrost related analyses. The development of analysed environmental subjects, utilized sensors and platforms, and the number of annually published articles over time are addressed in detail. Studies linked to atmospheric features and processes, such as the release of greenhouse gas emissions, appear to be strongly under-represented. Investigations on the spatial distribution of study locations revealed distinct study clusters across the Arctic. At the same time, large sections of the continuous permafrost domain are only poorly covered and remain to be investigated in detail. A general trend towards increasing attention in satellite earth observation of permafrost and related processes and features was observed. The overall amount of published articles hereby more than doubled since the year 2015. New sources of satellite data, such as the Sentinel satellites and the Methane Remote Sensing LiDAR Mission (Merlin), as well as novel methodological approaches, such as data fusion and deep learning, will thereby likely improve our understanding of the thermal state and distribution of permafrost, and the effects of its degradation. Furthermore, cloud-based big data processing platforms (e.g. Google Earth Engine (GEE)) will further enable sophisticated and long-term analyses on increasingly larger scales and at high spatial resolutions. In this thesis, a specific focus was put on Arctic permafrost coasts, which feature increasing vulnerability to environmental parameters, such as the thawing of frozen ground, and are therefore associated with amplified erosion rates. In particular, a novel monitoring framework for quantifying Arctic coastal erosion rates within the permafrost domain at high spatial resolution and on a circum-Arctic scale is presented within this thesis. Challenging illumination conditions and frequent cloud cover restrict the applicability of optical satellite imagery in Arctic regions. In order to overcome these limitations, Synthetic Aperture RADAR (SAR) data derived from Sentinel-1 (S1), which is largely independent from sun illumination and weather conditions, was utilized. Annual SAR composites covering the months June–September were combined with a Deep Learning (DL) framework and a Change Vector Analysis (CVA) approach to generate both a high-quality and circum-Arctic coastline product as well as a coastal change product that highlights areas of erosion and build-up. Annual composites in the form of standard deviation (sd) and median backscatter were computed and used as inputs for both the DL framework and the CVA coastal change quantification. The final DL-based coastline product covered a total of 161,600 km of Arctic coastline and featured a median accuracy of ±6.3 m to the manually digitized reference data. Annual coastal change quantification between 2017–2021 indicated erosion rates of up to 67 m per year for some areas based on 400 m coastal segments. In total, 12.24% of the investigated coastline featured an average erosion rate of 3.8 m per year, which corresponds to 17.83 km2 of annually eroded land area. Multiple quality layers associated to both products, the generated DL-coastline and the coastal change rates, are provided on a pixel basis to further assess the accuracy and applicability of the proposed data, methods, and products. Lastly, the extracted circum-Arctic erosion rates were utilized as a basis in an experimental framework for estimating the amount of permafrost and carbon loss as a result of eroding permafrost coastlines. Information on permafrost fraction, Active Layer Thickness (ALT), soil carbon content, and surface elevation were thereby combined with the aforementioned erosion rates. While the proposed experimental framework provides a valuable outline for quantifying the volume loss of frozen ground and carbon release, extensive validation of the utilized environmental products and resulting volume loss numbers based on 200 m segments are necessary. Furthermore, data of higher spatial resolution and information of carbon content for deeper soil depths are required for more accurate estimates. N2 - Als Folge des Klimawandels und der damit verbundenen „Arctic Amplification“ wird weltweit eine Degradation des Dauerfrostbodens (Permafrost) beobachtet, welche schwerwiegende Auswirkungen auf die Umwelt hat. Erdrutsche, erhöhte Oberflächen- verformungsraten, eine zunehmende Wahrscheinlichkeit von Infrastrukturschäden, verstärkte Küstenerosionsraten und die potenzielle Umwandlung von Permafrost von einer Kohlenstoffsenke in eine Kohlenstoffquelle sind dabei beispielhafte Auswirkun- gen im Zusammenhang mit dem Auftauen von gefrorenem Bodenmaterial. In diesem Kontext ist die Satelliten-gestützte Erdbeobachtung ein wirkmächtiges Werkzeug zur Identifizierung und kontinuierlichen Überwachung relevanter Prozesse und Merkmale auf einer kostengünstigen, langfristigen, räumlich expliziten und operativen Basis und auf einem zirkumpolaren Maßstab. Insgesamt 325 Artikel, die in den letzten zwei Jahrzehnten in 30 verschiedenen internationalen Zeitschriften veröffentlicht wurden, wurden auf Basis der adressierten Umweltschwerpunkte, Fernerkundungsplattformen, Sensorkombinationen, angewand- ten raum-zeitlichen Auflösungen und den Studienorten in einem umfassenden Überblick über vergangene Errungenschaften und aktuelle Trends untersucht. Zusätzlich wur- den zukünftige Potenziale und Herausforderungen der Satelliten-Erdbeobachtung für Permafrost-bezogene Analysen diskutiert. Auf die zeitliche Entwicklung der un- tersuchten Umweltthemen, eingesetzten Sensoren und Satelliten-Plattformen sowie die Zahl der jährlich erscheinenden Artikel wurde detailliert eingegangen. Studien zu atmosphärischen Eigenschaften und Prozessen, wie etwa der Freisetzung von Treibhaus- gasemissionen, waren stark unterrepräsentiert. Deutliche geografische Schlüssel-Gebiete, auf welche sich der Großteil der Studien konzentrierte, konnten in Untersuchungen zur räumlichen Verteilung der Studienorte identifiziert werden. Gleichzeitig sind große Teile des kontinuierlichen Permafrost-Gebiets nur spärlich abgedeckt und müssen noch im Detail untersucht werden. Es wurde ein allgemeiner Trend zu einer zunehmenden Aufmerksamkeit bezüglich der Satelliten-gestützten Erdbeobachtung von Permafrost und verwandten Prozessen und Merkmalen beobachtet. Die Gesamtzahl der veröf- fentlichten Artikel hat sich dabei seit dem Jahr 2015 mehr als verdoppelt. Neue Quellen für Satellitendaten, wie beispielweise die Sentinel-Satelliten und die Methane Remote Sensing LiDAR Mission (Merlin), sowie neuartige methodische Ansätze, wie Datenfusion und Deep Learning, werden dabei voraussichtlich unser Verständnis bzgl. des thermischen Zustands und der Verteilung von Permafrost-Vorkommen sowie die Auswirkungen seines Auftauens verbessern. Darüber hinaus werden Cloud-basierte Big-Data-Verarbeitungsplattformen (z.B. Google Earth Engine (GEE)) anspruchsvolle und langfristige Analysen in immer größeren Maßstäben und mit hoher räumlicher Auflösung erleichtern. In dieser Arbeit wurde ein besonderer Fokus auf arktische Permafrost-Küsten gelegt, die eine zunehmende Vulnerabilität gegenüber Umweltparametern wie dem Auftauen von gefrorenem Boden aufweisen und daher von verstärkten Erosionsraten betroffen sind. Ein neuartiger Ansatz zur Quantifizierung der arktischen Küstene- rosion innerhalb des Permafrost-Gebiets mit hoher räumlicher Auflösung und auf zirkum-arktischem Maßstab wird in dieser Dissertation präsentiert. Schwierige Be- leuchtungsbedingungen und häufige Bewölkung schränken die Anwendbarkeit optischer Satellitenbilder in arktischen Regionen ein. Um diese Einschränkungen zu überwinden, wurden Synthetic Aperture RADAR (SAR) Daten von Sentinel-1 (S1) verwendet, die weitgehend unabhängig von Sonneneinstrahlung und Wetterbedingungen sind. Jährli- che SAR-Komposite, welche die Monate Juni bis September abdecken, wurden mit einem Deep Learning (DL)-Ansatz und einer Change Vector Analysis (CVA)-Methode kombiniert, um sowohl ein qualitativ hochwertiges und zirkum-arktisches Küstenli- nienprodukt als auch ein Produkt für die Änderungsraten (Erosion und küstennahe Aggregation von Sedimenten) der Küste zu generieren. Jährliche Satelliten-Komposite in Form von der Standardabweichung (sd) und des Medians der SAR Rückstreuung wurden hierbei berechnet und als Eingabedaten sowohl für den DL-Ansatz als auch für die Quantifizierung der CVA-basierten Küstenänderung verwendet. Das endgül- tige DL-basierte Küstenlinienprodukt deckt insgesamt 161.600 km der arktischen Küstenlinie ab und wies eine Median-Abweichung von ±6,3 m gegenüber den ma- nuell digitalisierten Referenzdaten auf. Im Zuge der Quantifizierung von jährlichen Küstenveränderungen zwischen 2017 und 2021 konnten Erosionsraten von bis zu 67 m pro Jahr und basierend auf 400 m Küstenabschnitten identifiziert werden. Insgesamt wiesen 12,24% der untersuchten Küstenlinie eine durchschnittliche Erosionsrate von 3,8 m pro Jahr auf, was einer jährlichen erodierten Landfläche von 17,83 km2 entspricht. Mehrere Qualitäts-Datensätze, die beiden Produkten zugeordnet sind, wurden auf Pixelbasis bereitgestellt, um die Genauigkeit und Anwendbarkeit der präsentierten Daten, Methoden und Produkte weiter einordnen zu können. Darüber hinaus wurden die extrahierten zirkum-arktischen Erosionsraten als Grund- lage in einem experimentellen Ansatz verwendet, um die Menge an Permafrost-Verlust und Kohlenstofffreistzung als Konsequenz der erodierten Permafrost-Küsten abzu- schätzen. Dabei wurden Informationen zu Permafrost-Anteil, Active Layer Thickness (ALT), Höhenmodellen und der Menge an im Boden gespeichertem Kohlenstoff mit den oben genannten Erosionsraten kombiniert. Während der präsentierte experimentelle Ansatz einen wertvollen Ausgangspunkt für die Quantifizierung des Volumenverlusts von gefrorenem Boden und der Kohlenstofffreisetzung darstellt, ist eine umfassende Validierung der verwendeten Umweltprodukte und der resultierenden Volumenzah- len erforderlich. Zusätzlich werden für genauere Abschätzungen Daten mit höherer räumlicher Auflösung und Informationen zum Kohlenstoffgehalt für tiefere Bodentiefen benötigt. KW - Dauerfrostboden KW - Synthetische Apertur KW - Deep learning KW - Erosion KW - Satellit KW - Synthetic Aperture RADAR KW - Circumpolar KW - Arctic KW - Permafrost KW - Satellite Earth Observation KW - Change Vector Analysis Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-345634 ER - TY - THES A1 - Muth, Felicitas Vanessa T1 - Step by step: Sense of agency for complex action-event sequences T1 - Schritt für Schritt: Sense of Agency in komplexen Handlungs-Effekt Sequenzen N2 - From simply ringing a bell to preparing a five-course menu, human behavior commonly causes changes in the environment. Such episodes where an agent acts, thereby causing changes in their environment constitute the sense of agency. In this thesis four series of experi-ments elucidate how the sense of agency is represented in complex action-event sequences, thereby bridging a gap between basic cognitive research and real-life practice. It builds upon extensive research on the sense of agency in unequivocal sequences consisting of single ac-tions and distinct, predominantly auditory, outcomes. Employing implicit as well as explicit measures, the scope is opened up to multi-step sequences. The experiments show that it is worthwhile devoting more research to complex action-event sequences. With a newly introduced auditory measure (Chapter II), common phenomena such as temporal binding and a decrease in agency ratings following distorted feedback were replicated in multi-step sequences. However, diverging results between traditional implicit and explicit measures call for further inspection. Multisensory integration appears to gain more weight when multiple actions have to be performed to attain a goal leading to more accurate representations of the own actions (Chapter III). Additionally, freedom of choice (Chapter III) as well as early spatial ambiguity altered the perceived timing of outcomes, while late spatial ambi-guity (Chapter IV) and the outcome’s self-relevance did not (Chapter V). The data suggests that the cognitive system is capable of representing multi-step action-event sequences implicitly and explicitly. Actions and sensory events show a temporal attraction stemming from a bias in the perception of outcomes. Explicit knowledge about causing an event-sequence facilitates neither feelings of control nor taking authorship. The results corroborate current theorizing on the un-derpinnings of temporal binding and the divergence between traditional implicit and explicit measures of the sense of agency. Promising avenues for further research include structured analyses of how much inferred causality contributes to implicit and explicit measures of agency as well as finding alternative measures to capture conceptual as well as non-conceptual facets of the agency experience with one method. N2 - Vom Läuten einer Klingel bis hin zum Kochen eines Fünf-Gänge Menüs – menschliches Handeln verändert die Umwelt. Situationen, in denen eine Person handelt und so Veränderungen in ihrer Umgebung bewirkt, konstituieren den Sense of Agency. Diese Arbeit präsentiert vier Experimentalreihen, die die Repräsentation des Sense of Agency in komplexen Handlungs-Ereignis-Sequenzen erforschen und so eine Brücke zwischen kognitiver Grundla-genforschung und Alltagspraxis schlagen. Aufbauend auf umfangreicher Forschung zum Sense of Agency in Sequenzen aus einzelnen Handlungen und eindeutigen, vorwiegend auditiven Handlungseffekten wird der Forschungsbereich durch Einsatz impliziter sowie expliziter Maße auf mehrschrittige Sequenzen erweitert. Mittels eines neuen auditiven Maßes (Kapitel II) wurden gängige Phänomene wie Temporal Binding und die Abnahme von Agency Ratings nach verfremdetem Feedback in mehrschrittigen Sequenzen repliziert. Müssen mehrere Handlungen ausgeführt werden, um ein Ziel zu erreichen, scheint multisensorische Integration stärker ins Gewicht zu fallen, was zu genaueren Repräsentationen der eigenen Handlungen führt (Kapitel III). Darüber hinaus veränderten Wahl-freiheit (Kapitel III) und frühe räumliche Ambiguität das wahrgenommene Timing von Hand-lungseffekten, späte räumliche Ambiguität (Kapitel IV) sowie Selbstrelevanz des Handlungsef-fekts taten dies nicht (Kapitel V). Die Daten deuten darauf hin, dass das kognitive System mehrschrittige Handlungs-Ereignis-Sequenzen sowohl implizit als auch explizit repräsentieren kann. Die zeitliche Kompression von Handlungs-Ereignis-Sequenzen ist auf eine Verzerrung der Wahrnehmung von Handlungseffekten zurückzuführen. Explizites Wissen über die Verursa-chung von Ereignis-Folgen fördert weder Kontrollerleben noch das Gefühl eigener Autoren-schaft. Die Ergebnisse bestätigen den derzeitigen Diskurs über die Grundlagen von Temporal Binding und die Divergenz zwischen den traditionellen impliziten und expliziten Maßen des Sense of Agency. Strukturierte Analysen zum Beitrag von Kausalität zu Sense of Agency sowie die Ent-wicklung alternativer Methoden zur Erfassung konzeptueller wie nicht-konzeptueller Facetten des Sense of Agency mit einem Maß würden zur Weiterentwicklung des Forschungsbereichs beitragen. KW - Psychologie KW - Experimentelle Psychologie KW - Mensch-Maschine-Kommunikation KW - Sense of agency KW - Temporal binding KW - Feelings of agency KW - Judgements of agency KW - Multisensory integration KW - Causality KW - Handlungserleben KW - Cognitive control KW - Kognitive Psychologie KW - Handlungsregulation KW - Kognitionspsychologie KW - Handlungssteuerung Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-307569 ER - TY - THES A1 - Meiser, Elisabeth T1 - Single-molecule dynamics at a bottleneck: a systematic study of the narrow escape problem in a disc T1 - Einzelmoleküldynamik an einem Engpass: Eine systematische Untersuchung des Narrow Escape Problems in einer Scheibe N2 - Diffusion facilitates numerous reactions within the biological context of a cell. It is remarkable how the cost-efficient random process of Brownian motion promotes fast reactions. From the narrow escape theory, it is possible to determine the mean first passage time of such processes based on their reaction space and diffusion coefficient. The narrow escape theory of Brownian particles is characterized by a confining domain with reflective boundaries and a small reaction site. In this thesis, the mean first passage time was systematically tested in a disc as a function of the escape opening size in vitro and in silico. For the in vitro experiments, a model system of patterned supported-lipid bilayers (SLB) was established. Such a model is prepared by a combined colloid metalization approach, where a gold scaffold on glass facilitates assembly of SLB patches of distinct sizes through vesicle fusion. The model setup was evaluated and found to match all necessary requirements to test the nar- row escape problem in vitro. In particular, the reflectivity of the boundaries, the unhindered, free diffusion of the tracer lipids, and the distinct area were assessed. Observed results of the mean first passage time agreed with the theory of the narrow escape problem. There was excellent agreement in both absolute values and across a range of small escape opening sizes. Additionally, I developed a straightforward method, a correction factor, to calculate the mean first passage time from incomplete experimental traces. By re-scaling the mean first passage time to the fraction of particles that escaped, I was able to overcome the lifetime limitations of fluorescent probes. Previously inaccessible measurements of the mean first passage time relying on fluorescent probes will be made possible through this approach. The in vitro experiments were complemented with various in silico experiments. The latter were based on random walk simulations in discs, mimicking the in vitro situation with its uncertainties. The lifetime of single particles was either set sufficiently long to allow all particles to escape, or was adjusted to meet the lifetime limitations observed in the in vitro experiments. A comparison of the mean first passage time from lifetime-unlimited particles to the corrected, lifetime-limited particles did support the use of the correction factor. In agreement with the narrow escape theory, it was experimentally found that the mean first passage time is independent of the start point of the particle within the domain. This is when the particle adheres to a minimum distance to the escape site. In general, the presented random walk simulations do accurately represent the in vitro experiments in this study. The required hardware for the establishment of an astigmatism-based 3D system was installed in the existing microscope. The first attempts to analyze the obtained 3D imaging data gave insight into the potential of the method to investigate molecule dynamics in living trypanosome cells. The full functionality will be realized with the ongoing improvement of image analysis outside of this thesis. N2 - Diffusion erleichtert zahlreiche Reaktionen im biologischen Kontext einer Zelle. Es ist bemerkenswert, wie der kosteneffiziente Zufallsprozess der Brownschen Bewegung schnelle Reaktionen fördert. Mit Hilfe der Narrow Escape Theorie kann die mittlere erste Durchgangszeit (mean first passage time) solcher Prozesse auf der Grundlage ihres Reaktionsraums und des Diffusionskoeffizienten bestimmt werden. Die Narrow Escape Theorie von Brownschen Teilchen wird durch einen begrenzten Bereich mit reflektierenden Grenzen und einen kleinen Reaktionsraum gekennzeichnet. In dieser Arbeit wurde die mittlere erste Durchgangszeit in einer Scheibe systematisch als Funktion der Größe der Fluchtöffnung in vitro und in silico untersucht. Fur die in vitro-Experimente wurde ein Modellsystem aus strukturierten, Glas gestützten Lipiddoppelschichten (SLB) erstellt. Dieses Modell wurde durch einen kombinierten Kolloid-Metallisierungsansatz hergestellt, bei dem eine strukturierte Goldschicht auf Glas die Bildung von SLB-Scheiben unterschiedlicher Größe durch die Vesikelfusion ermöglicht. Es wurde festgestellt, dass das Modell alle Anforderungen erfüllt, um das Narrow escape problem in vitro zu testen. Insbesondere wurde das Reflexionsvermögen der Grenzen, die ungehinderte, freie Diffusion der Lipide und die Präzision der Fläche bewertet. Die beobachteten Ergebnisse der mittleren ersten Durchgangszeit stimmen mit der NEP-Theorie ̈uberein. Es besteht eine hervorragende ̈Ubereinstimmung sowohl bei den absoluten Werten als auch systematisch ̈uber einen Bereich von kleinen Fluchtöffnungsgrößen. Außerdem zeige ich eine einfache Methode, einen Korrekturfaktor, zur Berechnung der mittleren ersten Durchgangszeit aus unvollstandigen Lipid Trajektorien des Experimentes. Indem ich die mittlere erste Durchgangszeit auf den Anteil der entkommenen Par- tikel skalierte, konnte ich die Einschränkungen der Lebensdauer von fluoreszenten Farbstoffen ausgleichen. Mit dieser Technik werden bisher unzugängliche Messungen der mittleren ersten Durchgangszeit auf der Grundlage von fluoreszenten Farbstoffen möglich. In einem umfassenden Ansatz wurden die in vitro-Experimente durch verschiedene in silico-Experimente ergänzt. Letztere basierten auf Random- Walk-Simulationen in Scheiben, die die in vitro-Situation mit ihren Unsicherheiten nachahmten. Die Lebensdauer einzelner Partikel wurde entweder so lang angesetzt, dass alle Partikel entkommen konnten, oder sie wurde so angepasst, dass sie den in den in vitro-Experimenten beobachteten Lebensdauerbeschränkungen entsprach. Ein Vergleich der mittleren ersten Durchgangszeit von unsterblichen Partikeln mit den korrigierten, lebensdauerbegrenzten Partikeln hat die Verwendung des Korrekturfaktors bestätigt. In ̈Ubereinstimmung mit der Narrow Escape Theorie wurde experimentell festgestellt, dass die mittlere erste Durchgangszeit unabhängig vom Startpunkt des Teilchens innerhalb der Domäne ist. Dies ist dann der Fall, wenn das Teilchen einen Mindestabstand zur Austrittsstelle einhält. Im Allgemeinen bilden die vorgestellten Random-Walk-Simulationen die in dieser Studie durchgeführten Experimente genau ab. Die erforderliche Hardware für die Einrichtung eines auf Astigmatismus basierenden 3D-Systems wurde in ein vorhandenes Mikroskop eingebaut. Erste Versuche, die gewonnenen 3D-Bilddaten zu analysieren, gaben einen Einblick in das Potenzial der Methode zur Untersuchung der Moleküldynamik im lebenden Trypanosom. Die volle Funktionalität wird mit der laufenden Verbesserung der Bildanalyse außerhalb dieser Arbeit realisiert werden. Ein Teil der Ergebnisse und Methoden dieser Dissertation wurde zur Veröffentlichung unter dem Titel ’Experiments in micro-patterned model membranes support the narrow escape theory’ eingereicht. KW - Freies Molekül KW - Kolloid KW - Bimolekulare Lipidschicht KW - Mikroskopie KW - Brownsche Bewegung KW - Narrow escape problem KW - mean first passage time KW - single-molecule localization microscopy KW - single particle tracking KW - Random-walk simulations Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-319650 ER - TY - THES A1 - Majumder, Snigdha T1 - Selective inhibition of NFAT in mouse and human T cells by CRISPR/Cas9 to ameliorate acute Graft-versus-Host Disease while preserving Graft-versus-Leukemia effect T1 - Selektive Hemmung von NFAT in murinen und humanen T-Zellen durch CRISPR/Cas9 zur Linderung der akuten Graft-versus-Host-Erkrankung bei gleichzeitigem Erhalt des Graft-versus-Leukemia-Effekts N2 - Allogenic hematopoietic stem cell transplantation (allo-HCT) is a curative therapy for the treatment of malignant and non-malignant bone marrow diseases. The major complication of this treatment is a highly inflammatory reaction known as Graft-versus-Host Disease (GvHD). Cyclosporin A (CsA) and tacrolimus are used to treat GvHD which limits inflammation but also interferes with the anticipated Graft-versus-Leukemia (GvL) effect. These drugs repress conventional T cells (Tcon) along with regulatory T cells (Treg), which are important for both limiting GvHD and supporting GvL. Both of these drugs inhibit calcineurin (CN), which dephosphorylates and activates the nuclear factor of activated T-cells (NFAT) family of transcription factors. Here, we make use of our Cd4cre.Cas9+ mice and developed a highly efficient non-viral CRISPR/Cas9 gene editing method by gRNA-only nucleofection. Utilizing this technique, we demonstrated that unstimulated mouse T cells upon NFATc1 or NFATc2 ablation ameliorated GvHD in a major mismatch mouse model. However, in vitro pre-stimulated mouse T cells could not achieve long-term protection from GvHD upon NFAT single-deficiency. This highlights the necessity of gene editing and transferring unstimulated human T cells during allo-HCT. Indeed, we established a highly efficient ribonucleoprotein (RNP)-mediated CRISPR/Cas9 gene editing for NFATC1 and/or NFATC2 in pre-stimulated as well as unstimulated primary human T cells. In contrast to mouse T cells, not NFATC1 but NFATC2 deficiency in human T cells predominantly affected proinflammatory cytokine production. However, either NFAT single-knockout kept cytotoxicity of human CD3+ T cells untouched against tumor cells in vitro. Furthermore, mouse and human Treg were unaffected upon the loss of a single NFAT member. Lastly, NFATC1 or NFATC2-deficient anti-CD19 CAR T cells, generated with our non-viral ‘one-step nucleofection’ method validated our observations in mouse and human T cells. Proinflammatory cytokine production was majorly dependent on NFATC2 expression, whereas, in vitro cytotoxicity against CD19+ tumor cells was undisturbed in the absence of either of the NFAT members. Our findings emphasize that NFAT single-deficiency in donor T cells is superior to CN-inhibitors as therapy during allo-HCT to prevent GvHD while preserving GvL in patients. N2 - Die allogene hämatopoetische Stammzelltransplantation (allo-HCT) ist eine kurative Therapie zur Behandlung bösartiger und nicht bösartiger Knochenmarkerkrankungen. Die Hauptkomplikation dieser Behandlung ist eine hochgradige Entzündungsreaktion, die als Graft-versus-Host-Disease (GvHD) bekannt ist. Zur Behandlung der GvHD werden Cyclosporin A (CsA) und Tacrolimus eingesetzt, die die Entzündung eindämmen, aber auch den gewünschten Graft-versus-Leukämie-Effekt (GvL) beeinträchtigen. Diese Medikamente unterdrücken sowohl konventionelle T-Zellen (Tcon) als auch regulatorische T-Zellen (Treg), die sowohl für die Begrenzung der GvHD, als auch für die Unterstützung der GvL wichtig sind. Beide Medikamente hemmen Calcineurin (CN), das die Transkriptionsfaktoren der Familie der Nuclear Factor of Activated T-Cells (NFAT) dephosphoryliert und aktiviert. Hier nutzten wir unsere Cd4cre.Cas9+-Mäuse und entwickelten eine hocheffiziente, nicht-virale CRISPR/Cas9-Geneditierungsmethode mittels reiner gRNA-Nukleofektion. Mithilfe dieser Technik konnten wir zeigen, dass unstimulierte T-Zellen der Maus nach Ablation von NFATc1 oder NFATc2 die GvHD in einem Major-Mismatch-Mausmodell mildern. In vitro vorstimulierte T-Zellen von Mäusen konnten jedoch keinen langfristigen Schutz vor GvHD bei NFAT-Einzeldefizienz erreichen. Dies unterstreicht die Notwendigkeit der Gen-Editierung und des Transfers unstimulierter menschlicher T-Zellen während einer allo-HCT. In der Tat konnten wir ein hocheffizientes Ribonukleoprotein (RNP)-vermitteltes CRISPR/Cas9 gene-editing für NFATC1 und/oder NFATC2 nicht nur in vorstimulierten, sondern auch in unstimulierten primären menschlichen T-Zellen etablieren. Im Gegensatz zu T-Zellen von Mäusen wirkte sich der Mangel an NFATC2, nicht aber so sehr an NFATC1, in menschlichen T-Zellen überwiegend auf die Produktion proinflammatorischer Zytokine aus. Bei beiden NFAT-Single-Knockouts blieb jedoch die Zytotoxizität menschlicher CD3+ T-Zellen gegen Tumorzellen in vitro unangetastet. Darüber hinaus wurden die Treg von Maus und Mensch durch den Verlust eines einzelnen NFAT-Mitglieds nicht beeinträchtigt. Schließlich bestätigten NFATC1- oder NFATC2-defiziente Anti-CD19-CAR-T-Zellen, die mit unserer nicht-viralen "Ein-Schritt-Nukleofektionsmethode" erzeugt wurden, unsere Beobachtungen zu T-Zellen von Maus und Mensch. Die Produktion proinflammatorischer Zytokine hing hauptsächlich von der NFATC2-Expression ab, während die In-vitro-Zytotoxizität gegen CD19+-Tumorzellen in Abwesenheit eines der beiden NFAT-Mitglieder ungestört war. Unsere Ergebnisse unterstreichen, dass der Mangel eines einzelnen NFAT-Mitglieds in Spender-T-Zellen einer Therapie mit CN-Inhibitoren während einer allo-HCT überlegen ist. Hier könnten wir eine GvHD verhindern und gleichzeitig den GvL-Effekt in allo-HCT-Patienten erhalten. KW - Allogenic hematopoietic stem cell transplantation KW - CRISPR/Cas9 KW - Graft-versus-host-disease KW - Graft-versus-leukemia KW - allografts KW - CRISPR/Cas-Methode Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-293256 ER - TY - THES A1 - Obid, Nada T1 - EMG activity of masticatory muscles of patients with different bruxism grades during tasks with submaximal controlled force T1 - Elektromyographie der Kaumuskulatur unter kontrollierter Beißkraft N2 - The main objective of this study was to test whether subjects with different degrees of bruxism differ regarding EMG parameters and whether CES intervention affects those parameters. The hypothesis was that CES influences EMG parameters and after its’ cessation, all EMG parameters return to baseline (exposure–response relationship). For this purpose, forty subjects were examined, 16 men and 24 women, matched for age and gender and assigned randomly in the intervention (N=20) and control group (N=20). The procedure was as follows: 1-week inactive GC (N=40), 2 weeks inactive/active GC (N=20/N=20), 2 weeks inactive GC (N=40). Each interval was followed by a surface EMG recording from eight muscle parts (right and left anterior -, medial -, and posterior masseter and right and left anterior temporalis) under force-controlled feedback (BiteFork®) with three submaximal bite forces. The resulting EMG activity is expressed as RMS % MVC and RMS at MVC. The statistics is performed with t-test, one-way rmANOVA, and Friedman rmANOVA on ranks, according to the distribution of the data. The significance level was set at p≤0.05. The results generated from the within-groups and between-groups comparison were mostly not statistically significant and could therefore not offer clinically relevant conclu-sions. However, it cannot be excluded that a higher submaximal bite force and an extended intervention interval would have rendered different outcomes. The insufficient study sample resulted in a low observed power which makes the findings prone to Type II er-ror. It can be concluded that this study did not find any substantiating differences be-tween the EMG values of participants with various bruxism activity and that CES could not influence the studied EMG parameters in the two weeks intervention time. Our hypothesis which supposes that subjects with high and low bruxism activity differ in RMS % MVC could not be verified. However, with the gained knowledge, it is recom-mended to further elaborate a definite bruxism diagnosis by using portable EMG devices. N2 - Das Hauptziel dieser Studie bestand darin zu prüfen, ob sich Probanden mit unterschie-dlichem Bruxismusgrad hinsichtlich der EMG-Parameter unterscheiden und darüber hinaus, ob bedingte elektrische Stimulation diese beeinflusst. Die Hypothese lautete, dass die bedingte elektrische Stimulation die EMG-Parameter beeinflusst und nach Ein-stellung alle EMG-Parameter zum Ausgangswert zurückkehren. Zu diesem Zweck wurden vierzig Probanden untersucht (16 Männer und 24 Frauen), die nach Alter und Geschlecht gematcht und zufällig in die Interventions- (N=20) und die Kontrollgruppe (N= 20) eingeteilt wurden. Das Studienprotokoll begann mit einer Woche inaktivem GC (N=40), gefolgt von zwei Wochen inaktivem/aktivem GC (N=20/N=20) und endete mit zwei Wochen inaktivem GC (N=40). Nach jedem Intervall erfolgte eine Ober-flächen-EMG-Aufzeichnung der acht Muskelpartien (rechter und linker anteriorer -, medi-aler - und posteriorer Masseter, sowie rechter und linker anteriorer Temporalis) unter Kraft-kontrolliertem Feedback (BiteFork®). Die statistische Auswertung erfolgte mittels t-Test, einseitiger rmANOVA und Friedman rmANOVA, je nach Verteilung der Daten. Das Signifikanzniveau wurde auf p ≤ 0,05 festgelegt. Die Ergebnisse aus den Vergleichen waren statistisch nicht signifikant und konnten da-her keine klinisch relevanten Schlussfolgerungen liefern. Dennoch kann nicht ausgeschlossen werden, dass eine höhere Beißkraft und ein länge-res Interventionsintervall zu anderen Ergebnissen führen könnten. Die kleine Stichprobe führte zu einer geringen Teststärke, wodurch ein Risiko für einen Fehler 2. Art besteht. Es lässt sich schlussfolgern, dass diese Studie keine begründeten Unterschiede zwi-schen den EMG-Werten von Teilnehmern unterschiedlicher Bruxismusaktivität gefunden hat, und außerdem, dass die bedingte elektrische Stimulation in dem zweiwöchigen In-tervall zu keiner Veränderung der EMG-Parameter geführt hat. Unsere Hypothese, dass sich Probanden mit hoher und niedriger Bruxismusaktivität im EMG (RMS % MVC) voneinander unterscheiden, konnte nicht verifiziert werden. KW - Bruxismus KW - Elektromyographie KW - Fragebogen KW - contingent electrical stimulation KW - bedingte elektrische Stimulation KW - Klinische Studie Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-345883 ER - TY - THES A1 - Hauptstein, Niklas T1 - Site directed molecular design and performances of Interferon-α2a and Interleukin-4 bioconjugates with PEG alternative polymers T1 - Seitenspezifisches molekulares Design und Eigenschaften von Interferon-α2a und Interleukin-4 Biokonjugaten mit PEG alternativen Polymeren N2 - Serum half-life elongation as well as the immobilization of small proteins like cytokines is still one of the key challenges for biologics. This accounts also for cytokines, which often have a molecular weight between 5 and 40 kDa and are therefore prone to elimination by renal filtration and sinusoidal lining cells. To solve this problem biologics are often conjugated to poly(ethylene glycol) (PEG), which is the gold standard for the so called PEGylation. PEG is a synthetic, non-biodegradable polymer for increasing the hydrodynamic radius of the conjugated protein to modulate their pharmacokinetic performance and prolong their therapeutic outcome. Though the benefits of PEGylation are significant, they also come with a prize, which is a loss in bioactivity due to steric hindrance and most often the usage of heterogeneous bioconjugation chemistries. While PEG is a safe excipient in most cases, an increasing number of PEG related side-effects, such as immunological responses like hypersensitivity and accelerated blood clearance upon repetitive exposure occur, which highlights the need for PEG alternative polymers, that can replace PEG in such cases. Another promising method to significantly prolong the residence time of biologics is to immobilize them at a desired location. To achieve this, the transglutaminase (TG) Factor XIIIa (FXIIIa), which is an important human enzyme during blood coagulation can be used. FXIIIa can recognize specific peptide sequences that contain a lysine as substrates and link them covalently to another peptide sequence, that contains a glutamine, forming an isopeptide bond. This mechanism can be used to link modified proteins, which have a N- or C-terminal incorporated signal peptide by mutation, to the extracellular matrix (ECM) of tissues. Additionally, both above-described methods can be combined. By artificially introducing a TG recognition sequence, it is possible to attach an azide group containing peptide site-specifically to the TG, recognition sequence. This allows the creation of a site-selective reactive site at the proteins N- or C-terminus, which can then be targeted by cyclooctyne functionalized polymers, just like amber codon functionalized proteins. This thesis has focused on the two cytokines human Interferon-α2a (IFN-α2a) and human, as well as murine Interleukin-4 (IL-4) as model proteins to investigate the above-described challenges. IFN-α2a has been chosen as a model protein because it is an approved drug since 1986 in systemic applications against some viral infections, as well as several types of cancer. Furthermore, IFN-α2 is also approved in three PEGylated forms, which have different molecular weights and use different conjugation techniques for polymer attachment. This turns it into an ideal candidate to compare new polymers against the gold standard PEG. Interleukin-4 (IL-4) has been chosen as the second model protein due to its similar size and biopotency. This allows to compare found trends from IFN-α2a with another bioconjugate platform and distinguish between IFN-α2a specific, or general trends. Furthermore, IL-4 is a promising candidate for clinical applications as it is a potent anti-inflammatory protein, which polarizes macrophages from the pro-inflammatory M1 state into the anti-inflammatory M2 state. N2 - Die Verlängerung der Serum-Halbwertszeit sowie die Immobilisierung kleiner Proteine wie Zytokine ist nach wie vor eine der größten Herausforderungen für Biologika. Dies gilt auch für Zytokine, die häufig ein Molekulargewicht zwischen 5 und 40 kDa haben und daher leicht durch die Nierenfiltration und sinusoidale Endothelzellen eliminiert werden können. Um dieses Problem zu lösen, werden Biologika häufig an Poly(ethylenglykol) (PEG) konjugiert, das den Goldstandard für die so genannte PEGylierung darstellt. PEG ist ein synthetisches, biologisch nicht abbaubares Polymer, das den hydrodynamischen Radius des konjugierten Proteins vergrößert, um die pharmakokinetische Leistung zu modulieren und die therapeutische Wirkung zu verlängern. Obwohl die Vorteile der PEGylierung beträchtlich sind, haben sie auch ihren Preis, nämlich einen Verlust an Bioaktivität aufgrund sterischer Hindernisse und meist die Verwendung heterogener Biokonjugationstechniken. Obwohl PEG in den meisten Fällen ein sicherer Hilfsstoff ist, treten immer mehr PEG-bedingte Nebenwirkungen auf, wie z. B. immunologische Reaktionen wie Überempfindlichkeit und beschleunigter Abbau bei wiederholter Exposition, was den Bedarf an alternativen PEG-Polymeren unterstreicht, die PEG in solchen Fällen ersetzen können. Eine weitere vielversprechende Methode, um die Verweildauer von Biologika deutlich zu verlängern, besteht darin, sie an einem gewünschten Ort zu immobilisieren. Dazu kann die Transglutaminase (TG) Faktor XIIIa (FXIIIa) verwendet werden, die ein wichtiges menschliches Enzym bei der Blutgerinnung ist. FXIIIa kann bestimmte Peptidsequenzen, die ein Lysin enthalten, als Substrate erkennen und sie kovalent an eine andere Peptidsequenz, die ein Glutamin enthält, binden, wobei eine Isopeptidbindung entsteht. Dieser Mechanismus kann benutzt werden um modifizierte Proteine, welche durch Mutation ein N- oder C-terminal eingebautes Signalpeptid besitzen, mit der extrazellularen Gewebematrix (ECM) zu verknüpfen. Diese Arbeit konzentriert sich auf die beiden Zytokine humanes Interferon-α2a (IFN-α2a) und humanes sowie murines Interleukin-4 (IL-4) als Modellproteine, um die oben beschriebenen Herausforderungen zu untersuchen. IFN-α2a wurde als Modellprotein ausgewählt, weil es seit 1986 ein zugelassenes Medikament für die systemische Anwendung gegen einige Virusinfektionen und verschiedene Krebsarten ist. Darüber hinaus ist IFN-α2 auch in drei PEGylierten Formen zugelassen, die unterschiedliche Molekulargewichte haben und verschiedene Konjugationstechniken für die Polymeranbindung verwenden. Dies macht es zu einem idealen Kandidaten für den Vergleich neuer Polymere mit dem Goldstandard PEG. Interleukin-4 (IL-4) wurde als zweites Modellprotein gewählt, da es eine ähnliche Größe und Biopotenz aufweist. Dies ermöglicht es, die von IFN-α2a gefundenen Trends mit einer anderen Biokonjugat-Plattform zu vergleichen und zwischen IFN-α2a-spezifischen und allgemeinen Trends zu unterscheiden. Darüber hinaus ist IL-4 ein vielversprechender Kandidat für klinische Anwendungen, da es ein starkes entzündungshemmendes Protein ist, das Makrophagen vom entzündungsfördernden M1-Zustand in den entzündungshemmenden M2-Zustand polarisiert. KW - Cytokine KW - Interferon KW - Konjugation KW - Polymere KW - Interleukin 4 KW - Bioconjugate KW - Polyglycerol KW - poly(2-ethyl-2-oxazoline) KW - Polyethylenglykole Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-296911 ER - TY - THES A1 - Mahlmeister, Bernhard T1 - Twisted Rylene Bisimides for Organic Solar Cells and Strong Chiroptical Response in the Near Infrared T1 - Kernverdrillte Rylenbisimide für organische Solarzellen und starke chirooptische Eigenschaften im Nahinfrarot N2 - The chirality of the interlocked bay-arylated perylene motif is investigated upon its material prospect and the enhancement of its chiroptical response to the NIR spectral region. A considerable molecular library of inherently chiral perylene bisimides (PBIs) was utilized as acceptors in organic solar cells to provide decent device performances and insights into the structure-property relationship of PBI materials within a polymer blend. For the first time in the family of core-twisted PBIs, the effects of enantiopurity on the device performance was thoroughly investigated. The extraordinary structural sensitivity of CD spectroscopy served as crucial analytical tool to bridge the highly challenging gap between molecular properties and device analytics by proving the excitonic chirality of a helical PBI dimer. The chirality of this perylene motif could be further enhanced on a molecular level by both the expansion and the enhanced twisting of the π-scaffold to achieve a desirable strong chiroptical NIR response introducing a new family of twisted QBI-based nanoribbons. These achievements could be substantially further developed by expanding this molecular concept to a supramolecular level. The geometrically demanding supramolecular arrangement necessary for the efficient excitonic coupling was carefully encoded into the molecular design. Accordingly, the QBIs could form the first J-type aggregate constituting a fourfold-stranded superhelix of a rylene bisimide with strong excitonic chirality. Therefore, this thesis has highlighted the mutual corroboration of experimental and theoretical data from the molecular to the supramolecular level. It has demonstrated that for rylene bisimide dyes, the excitonic contribution to the overall chiroptical response can be designed and rationalized. This can help to pave the way for new organic functional materials to be used for chiral sensing or chiral organic light-emitting devices. N2 - Die Chiralität des verzahnten Bucht-arylierten Perylenmotivs wurde im Hinblick auf seine Materialanwendung sowie die Verstärkung seiner chiroptischen Eigenschaften im NIR-Spektralbereich untersucht. Eine umfangreiche Molekülbibliothek von inhärent chiralen PBIs wurde als NFAs in OSCs verwendet, um sowohl gute Solarzelleneffizienzen sowie Einblicke in die Struktur-Eigenschafts-Beziehung von PBI Materialien innerhalb einer Polymermischung zu erhalten. Zum ersten Mal wurden für kernverdrillte PBIs die Auswirkungen der Enantiomerenreinheit auf die Effizienz von organischen Dünnfilmbauteilen untersucht. Die außerordentliche strukturelle Empfindlichkeit der CD Spektroskopie diente als entscheidendes Analysewerkzeug, um die hoch anspruchsvolle Lücke zwischen der Analytik molekularer Eigenschaften und der Bauteilanalytik zu schließen, indem die exzitonische Chiralität eines helikalen PBI-Dimers nachgewiesen wurde. Die Chiralität dieses Perylenmotivs konnte auf molekularer Ebene weiter verstärkt werden, indem das π-Gerüst sowohl erweitert als auch stärker verdrillt wurde, um wünschenswert starke chiroptische Eigenschaften im NIR-Bereich zu erzielen und so eine neue Molekülfamilie kernverdrillter QBIs zu definieren. Diese Errungenschaften konnten durch die Ausweitung dieses molekularen Konzepts auf eine supramolekulare Ebene noch erheblich weiterentwickelt werden. Die geometrisch anspruchsvolle supramolekulare Anordnung, die für die effiziente exzitonische Kopplung erforderlich ist, wurde sorgfältig in das molekulare Design kodiert. Dementsprechend stellt das präsentierte QBI in seiner vierfach versetzt gestapelten Superhelix das erste Rylenbisimid-J-Aggregat dar, welches eine starke exzitonische Chiralität zeigt. Somit hat die Arbeit hat die gegenseitige Bestätigung von experimentellen und theoretischen Daten von der molekularen bis hin zur supramolekularen Ebene herausgestellt und gezeigt, dass für Rylenbisimid-Farbstoffe der exzitonische Beitrag zu den chiroptischen Eigenschaften konzipiert, synthetisch realisiert und quantenmechanisch verstanden werden kann. Dies kann den Weg für neue organische Funktionsmaterialien ebnen, die für chirale Sensoren oder Licht emittierende Bauteile verwendet werden können. KW - Molekül KW - Chiralität KW - Exziton KW - Organische Solarzelle KW - Supramolekulare Chemie KW - organic solar cell KW - non-fullerene acceptor KW - perylene bisimide KW - quaterrylene bisimide KW - inherent chirality KW - excitonic chirality KW - supramolecular chemistry KW - self-assembly KW - near infrared chirality Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-346106 ER - TY - THES A1 - Fuchs, Manuela T1 - Global discovery and functional characterization of Hfq-associated sRNA-target networks in \(C.\) \(difficile\) T1 - Globale Identifizierung und funktionelle Charakterisierung von Hfq-assoziierten sRNA-Zielnetzwerken in \(C.\) \(difficile\) N2 - In this work, dRNA-seq (differential RNA sequencing) and RNAtag-seq were applied to first define the global transcriptome architecture of C. difficile, followed by Hfq RIP-seq (RNA immunoprecipitation followed by RNA-seq) and RIL-seq (RNA interaction by ligation and sequencing) to characterize the Hfq-mediated sRNA interactome on a transcriptome-wide scale. These approaches resulted in the annotation of > 60 novel sRNAs. Notably, it not only revealed 50 Hfq-bound sRNAs, but also > 1000 mRNA-sRNA interactions, confirming Hfq as a global RNA matchmaker in C. difficile. Similar to its function in Gram-negative species, deletion of Hfq resulted in decreased sRNA half-lives, providing evidence that Hfq affects sRNA stability in C. difficile. Finally, several sRNAs and their function in various infection relevant conditions were characterized. The sRNA nc085 directly interacts with the two-component response regulator eutV, resulting in regulation of ethanolamine utilization, an abundant intestinal carbon and nitrogen source known to impact C. difficile pathogenicity. Meanwhile, SpoY and SpoX regulate translation of the master regulator of sporulation spo0A in vivo, thereby affecting sporulation initiation. Furthermore, SpoY and SpoX deletion significantly impacts C. difficile gut colonization and spore burden in a mouse model of C. difficile infection. N2 - Der anaerobe Gram-positive humanpathogene Erreger Clostridioides difficile (C. difficile) gilt als Hauptursache für nosokomiale Antibiotika-assoziierte Diarrhöe. Verschiedene Virulenzfaktoren und -eigenschaften beeinflussen das Fortschreiten und den Schweregrad der Krankheit, darunter Toxinexpression und Sporenbildung. Kleine regulatorische RNAs (sRNAs) sind bekannte post- transkriptionelle Regulatoren von Virulenz- und Stress-assoziierten Stoffwechselwegen in vielen pathogenen Bakterien. In Gram-negativen Arten wird sRNA-abhängige post-transkriptionelle Regulierung häufig durch das RNA-Chaperon Hfq vermittelt, welches die sRNA-mRNA- Basenpaarung erleichtert. Trotz ihrer Bedeutung in Gram-negativen Bakterien ist vergleichsweise wenig über die verschiedenen Aspekte der post-transkriptionellen Regulation in Gram-positiven Arten bekannt. Erste Daten deuten auf eine wichtige Funktion von Hfq bei der Regulierung verschiedener infektionsassoziierter Signalwege in C. difficile hin, sowie auf die Existenz eines umfangreichen post-transkriptionellen Netzwerks. Eine globale Identifizierung von Hfq- assoziierten RNAs und deren Einfluss auf die Virulenz von und Kolonisierung durch C. difficile ist jedoch bisher noch nicht erfolgt. In dieser Arbeit wurde dRNA-seq (differentielle RNA-Sequenzierung) und RNAtag-seq angewandt, um zunächst die globale Transkriptom-Architektur von C. difficile zu definieren. Anschließend wurde Hfq RIP-seq (RNA-Immunpräzipitation gefolgt von RNA-seq) und RIL-seq (RNA-Interaktion durch Ligation und Sequenzierung) durchgeführt, um das Hfq-vermittelte sRNA-Interaktom auf globaler Ebene zu charakterisieren. Diese Ansätze führten zur Annotation von > 60 neuen sRNAs. Darüber hinaus wurden 50 Hfq-gebundene sRNAs, sowie > 1000 mRNA- sRNA-Interaktionen identifiziert, wodurch Hfq als globaler RNA-Matchmaker in C. difficile bestätigt wurde. Analog zu seiner Funktion in Gram-negativen Arten, führte die Deletion von Hfq zu verringerten sRNA-Halbwertszeiten, was darauf hindeutet, dass Hfq die sRNA-Stabilität in C. difficile beeinflusst. Schließlich wurden mehrere sRNAs und ihre Funktion unter verschiedenen infektionsrelevanten Bedingungen charakterisiert. Die sRNA nc085 interagiert direkt mit dem Zweikomponenten-Regulator eutV, was zu einer Regulierung der Ethanolaminverwertung führt. Als häufig vorkommenden Kohlenstoff- und Stickstoffquelle im Darm, kann Ethanolamin die Pathogenität von C. difficile beeinflussen. SpoY und SpoX regulieren dagegen die Translation des Hauptregulators der Sporulation spo0A in vivo und damit die Sporulationsinitiation. Darüber hinaus hat die Deletion von SpoY und SpoX signifikante Auswirkungen auf die Besiedlung des Darms mit C. difficile sowie die Sporenbelastung in einem Mausmodell der C. difficile-Infektion. Insgesamt liefert diese Arbeit Beweise für eine umfassende Hfq-abhängige post-transkriptionelle Regulierung, die die Physiologie und Virulenz eines Gram-positiven Erregers beeinflusst. Auch wenn mit dieser Arbeit die Charakterisierung der sRNA-vermittelten Regulation in C. difficile gerade erst begonnen hat, können die RIL-seq-Daten als Grundlage für zukünftige mechanistische Studien der RNA-basierten Genregulation in C. difficile herangezogen werden. KW - Clostridium difficile KW - Non-coding RNA KW - Small RNA KW - RNA-bindendes Protein KW - Sporulation KW - post-transcriptional regulation KW - anaerobe KW - Gram-positive KW - differential RNA-seq KW - transcriptional termination site KW - Hfq KW - RIL-seq KW - Spo0A KW - RNS-Bindungsproteine KW - Sporenbildung Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-345982 ER - TY - THES A1 - Fusi, Lorenza T1 - Crosstalk between the MEK5/ERK5 and PKB/FoxO pathways: underlying mechanism and its relevance for vasoprotection and tumorigenesis T1 - Interaktion zwischen dem MEK5/ERK5-Signalweg und der PKB/FoxO Signalkaskade: zugrunde liegender Mechanismus und seine Relevanz für Gefäßerhalt und Tumorgenese N2 - Forkhead box O transcription factors are a family of proteins involved in cellular processes downstream of the Insulin-PI3K-PKB pathway. In response to extra- or intracellular stresses, for example starvation or oxidative stress, FoxOs are required to direct cell cycle progression and apoptosis. In endothelial cells, they induce apoptosis, and their deregulation is linked to diseases involving the insulin pathway, such as diabetes. FoxOs also exhibit a complex role in tumour transformation: here their main function is to suppress tumorigenesis. In both physiological and cancer contexts, FoxO activation leads to the transcription of some general targets, such as p27kip1 or IGFBP1. The FoxOs can also induce tissue-specific genes, as ANGPT2 and BIM in the endothelium. In endothelial cells, another pathway with a pivotal function is the MEK5/ERK5 MAPK signalling way. Its activation promotes cell survival and proliferation in stressful conditions, e.g., when blood vessels are exposed to the shear forces exerted by the blood stream. Furthermore, recent data described ERK5 as a kinase directing tumour resistance upon therapy-induced stress. Comparing their reported roles in various tumours and in the endothelium, FoxO proteins and the MEK5/ERK5 MAPK cascade appear to exert opposite functions. First non-published data confirmed the hypothesis that FoxO factors are subject to a negative modulation by the MEK5/ERK5 pathway. Hence, one goal of this PhD project was to further characterise this crosstalk at molecular level. The major mechanism of FoxO regulation is the balance among several post translational modifications, such as phosphorylation, acetylation, and ubiquitination. Most importantly, the PKB dependent phosphorylation of FoxOs negatively controls their activity, and it is critical for their subcellular localization. Therefore, the regulation of FoxO localization as mechanism of ERK5 dependent suppression was studied, but the results presented in this thesis argue against this hypothesis. However, additional experiments are required to explore the impact of ERK5 activity on FoxO post-translational modifications. FoxO activity can also be modulated by the interaction with other proteins, which in turn could explain general- and tissue-specific gene expression. Thus, another objective of this work was to investigate FoxO3-interactome in endothelial cells and the impact of MEK5/ERK5 activation on it. As published in (Fusi et al. 2022) and presented here, this analysis unveiled TRRAP as new FoxO bound protein in several cell types. Moreover, the interaction did not rely on the capacity of the FoxOs to bind their consensus DNA sequences at the promoter of target genes. Functional data demonstrated that TRRAP is required for FoxO-dependent gene transcription in endothelial and osteosarcoma cells. In addition, TRRAP expression in the endothelium is important for FoxO induced apoptosis. In summary, the interaction between FoxO factors and TRRAP revealed a new regulatory mechanism of FoxO-dependent gene transcription. It remains to be analysed whether the MEK5/ERK5 cascade may exert its suppressive effect on FoxO activity by interfering with their binding to TRRAP and whether such a mechanism may be relevant for tumorigenesis. N2 - Forkhead-Box-O-Proteine sind eine Familie von Transkriptionsfaktoren, die an verschiedenen zellulären Prozessen stromabwärts des Insulin-PI3K-PKB-Signalwegs beteiligt sind. Als Reaktion auf extra- oder intrazelluläre Stressfaktoren, wie Wachstumsfaktorentzug oder oxidativen Stress, werden die FoxOs benötigt, um Zellzyklusprogression und Apoptose zu regulieren. In Endothelzellen induzieren sie Apoptose und ihre Fehlregulation ist mit Krankheiten, bei denen der Insulinsignalweg involviert ist, wie etwa Diabetes mellitus, verbunden. FoxOs spielen auch eine komplexe Rolle bei der Tumortransformation: Hier besteht ihre Hauptfunktion darin, die Tumorentstehung zu unterdrücken. Sowohl im physiologischen als auch im Kontext von Krebs führt die FoxO-Aktivierung zur Transkription verschiedener allgemeiner Zielgene, wie p27kip1, BIM oder IGFBP1. Die FoxOs können aber auch gewebespezifische Gene, wie zum Beispiel ANGPT2 im Endothel, induzieren. Ein weiterer Signalweg mit wichtiger Funktion in Endothelzellen ist der MEK5/ERK5-MAPK Signalweg. Seine Aktivierung fördert das Überleben und Wachstum von Zellen unter Stressbedingungen, wie z. B. wenn Blutgefäße durch den Blutstrom Schubspannungskräften ausgesetzt sind. Darüber hinaus zeigen neuere Daten, dass ERK5 auch an der Tumorresistenzentwicklung unter therapieinduziertem Stress beteiligt ist. Ein Vergleich der bekannten Rolle beider Signalwege im Endothel und bei der Tumorgenese, impliziert eine mutmaßlich gegensätzliche Funktion von FoxO Proteinen und der MEK5/ERK5-MAPK Kaskade. Erste unveröffentlichte Daten stützen die Hypothese, dass FoxO Faktoren einer Negativregulation durch MEK5/ERK5 unterliegen. Ein Ziel dieses Promotionsprojekts, war es daher diesen Zusammenhang auf molekularer Ebene näher zu charakterisieren. Die FoxO-Regulierung ist primär das Zusammenspiel mehrerer posttranslationaler Modifikationen wie Phosphorylierung, Acetylierung und Ubiquitinierung. Der wichtigste Regulationsmechanismus ist dabei die inhibitorische Phosphorylierung durch die Kinase PKB, welche die transkriptionelle FoxO-Aktivität hemmt und deren subzelluläre Lokalisierung ins Zytoplama fördert. Daher wurde zunächst der Einfluss von ERK5 auf die FoxO-Lokalisierung untersucht. Die Daten dieser Arbeit sprechen gegen einen Einfluss von der ERK5 Aktivität auf FoxO Lokalisation, doch sind zusätzliche Experimente erforderlich, um dessen Wirkung auf das Muster der posttranslationalen Modifikation der FoxOs zu klären. FoxO-Aktivität kann auch durch die Interaktion mit anderen Proteinen moduliert werden, die wiederum auch die allgemeine und gewebespezifische Genexpression steuern könnten. Ein weiteres Ziel dieser Arbeit war es daher, das FoxO3-Interaktom in Endothelzellen und den Einfluss forcierter MEK5/ERK5-Aktivierung darauf zu untersuchen. Wie in (Fusi et al. 2022) gezeigt und hier vorgestellt, führte diese Analyse zur Identifikation von TRRAP als neuem generellen FoxO Bindepartner. Die zelltypunabhängige Interaktion beider Proteine beruhte dabei nicht auf der Fähigkeit der FoxOs direkt an ihre Konsensus-DNA-Sequenzen in den Promotoren ihrer Zielgene zu binden. Funktionelle Daten zeigten nachfolgend, dass TRRAP entscheidend zur FoxO abhängigen Gentranskription in Endothel- und Osteosarkomzellen beiträgt. Darüber hinaus ist TRRAP im Endothel für die effiziente Apoptoseinduktion durch FoxOs wichtig. Zusammenfassend offenbarte die Interaktion zwischen FoxO-Faktoren und TRRAP einen neuen Regulationsmechanismus der FoxO-abhängigen Gentranskription. Es bleibt zu prüfen, ob die MEK5/ERK5 Kaskade FoxOs dadurch hemmt, dass sie die Bindungsfähigkeit von FoxO an TRRAP stört, und ob die beobachtete FoxO-TRRAP Interaktion auch im Kontext der Tumorgenese von Bedeutung ist. KW - Endothel KW - MAP-Kinase KW - Apoptosis KW - FoxO transcription factors KW - MEK5/ERK5 cascade KW - TRRAP KW - Crosstalk KW - Forkhead-Box-Proteine KW - Endothelium KW - Forkhead Transcription Factors Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-296769 ER - TY - THES A1 - Steinfatt, Tim Alexander T1 - Modulation of regulatory T cells for the immunotherapy of inflammatory diseases and cancer T1 - Modulation regulatorischer T-Zellen zur Immuntherapie von inflammatorischen Krankheiten und Krebs N2 - Regulatory T cells (Tregs) are the masters of immune regulation controlling inflammation and tolerance, tissue repair and homeostasis. Multiple immunological diseases result from altered Treg frequencies and Treg dysfunction. We hypothesized that augmenting Treg function and numbers would prevent inflammatory disease whereas inhibiting or depleting Tregs would improve cancer immunotherapy. In the first part of this thesis, we explored whether in vivo activation and expansion of Tregs would impair acute graft-versus-host disease (aGvHD). In this inflammatory disease, Tregs are highly pathophysiological relevant and their adoptive transfer proved beneficial on disease outcome in preclinical models and clinical studies. IL-2 has been recognized as a key cytokine for Treg function. Yet, attempts in translating Treg expansion via IL-2 have remained challenging, due to IL-2s extremely broad action on other cell types including effector T cells, NK cells, eosinophils and vascular leakage syndrome, and importantly, due to poor pharmacokinetics in vivo. We addressed the latter issue using an IL-2-IgG-fusion protein (irrIgG-IL-2) with improved serum retention and demonstrated profound Treg expansion in vivo in FoxP3-luciferase reporter mice. Further, we augmented Treg numbers and function via the selective-TNF based agonists of TNFR2 (STAR2). Subsequently, we tested a next-generation TNFR2 agonist, termed NewSTAR, which proved even more effective. TNFR2 stimulation augmented Treg numbers and function and was as good as or even superior to the IL-2 strategy. Finally, in a mouse model of aGvHD we proved the clinical relevance of Treg expansion and activation with irrIgG-IL-2, STAR2 and NewSTAR. Notably, the TNFR2 stimulating constructs were outstanding as we observed not the IL-2 prototypic effects on other cell populations and no severe side effects. In the second part of this thesis, we explored Tregs in pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) and developed targeting strategies. Among several tumor entities in which Tregs impact survival, preclinical and clinical data demonstrated their negative role on PDAC. In our studies we employed the orthotopic syngeneic Panc02 model in immunocompetent mice. Based on flow cytometric analysis of the tumor microenvironment we propose TIGIT and TNFRSF members as novel therapeutic targets. Surprisingly, we found that blocking TNFR2 did not interfere with intratumoral Treg accumulation. However, we decreased the highly abundant intratumoral Tregs when we disrupted the tumor extracellular matrix. In PDAC, Treg manipulation alone did not lead to tumor regression and we propose that an additional immune boost may be necessary for efficient tumor immune surveillance and cancer clearance. This contrasts with aGvHD, in which Treg manipulation alone was sufficient to improve disease outcome. Conclusively, we demonstrated the enormous medical benefit of Treg manipulation. Our promising data obtained with our newly developed powerful tools highlight the potential to translate our findings into clinical practice to therapeutically target human Tregs in patients. With novel TNFR2 agonists (STAR2, NewSTAR) we augmented Treg numbers and function as (or even more) effectively than with IL-2, without causing adverse side effects. Importantly, exogenous in vivo Treg expansion protected mice from aGvHD. For the therapy of PDAC, we identified novel targets on Tregs, notably TIGIT and members of the TNFRSF. We demonstrated that altering the extracellular tumor matrix can efficiently disrupt the Treg abundance in tumors. These novel targeting strategies appear as attractive new treatment options and they may benefit patients suffering from inflammatory disease and cancer in the future. N2 - Regulatorische T-Zellen (Tregs) gelten als die Meister der Immunregulation und entscheiden über Entzündungen und Immuntoleranz, Geweberegeneration und -homöostase. Eine Vielzahl von immunologischen Erkrankungen resultiert aus Veränderung der Treg-Anzahl oder ihrer Funktion. Wir stellten die Hypothese auf, dass Steigerung der Treg-Frequenz und Funktion entzündliche Erkrankungen verhindert und dass eine Treg-Depletion die Immuntherapie gegen Krebs unterstützt. Im ersten Teil dieser Studie untersuchten wir, ob eine exogene Aktivierung und Expansion von Tregs in vivo eine akute Graft-versus-Host-Reaktion (aGvHD) therapeutisch verhindern oder abschwächen kann. Für dieses Krankheitsbild sind Tregs pathologisch hochrelevant und präklinische Modelle sowie klinische Studien zeigen, dass ein adoptiver Treg-Transfer sich positiv auf das Auftreten bzw. den Verlauf des Immunsyndroms auswirkt. IL-2 ist ein Schlüsselzytokin für die Funktion der Tregs. Dennoch bleibt die klinische Entwicklung eine große Herausforderung, da IL-2 eine breite Wirkung auf weitere Zelltypen wie Effektor T Zellen, NK-Zellen, eosinophile Granulozyten und Endothelzellen hat. Dadurch können schwerwiegende Nebenwirkungen auftreten, wie zum Beispiel das gefürchtete Vascular-Leak-Syndrom oder eine Eosinophilie. Ein weiteres großes Hindernis für den klinischen Einsatz von IL-2 stellt auch die schlechte in vivo Pharmakokinetik von IL-2 dar. Diese adressierten wir durch die Fusion von IL-2 mit einem IgG (irrIgG-IL-2), wodurch die Serumretention deutlich verbessert werden konnte. Durch die Applikation von irrIgG-IL-2 konnten wir Tregs in vivo in FoxP3-Reportermäusen expandieren. IrrIgG-IL2 verbesserte auch die Funktionen und Anzahl der Tregs, ähnlich wie der selektive, TNF-basierte Agonist des TNFR2 (STAR2). Die nächste Generation von STAR2 (NewSTAR) hatte sogar noch einen größeren Effekt auf Tregs in vivo und war STAR2 überlegen. Exogene TNFR2-Stimulation zeigte vergleichbare (oder sogar bessere) Effekte auf die Tregs in vivo wie IL-2-Stimulation ohne, dass unerwünschte Nebenwirkungen zu beobachten waren. Die medizinische Relevanz dieser Treg-Agonisten zeigte sich in der in vivo Treg-Aktivierung und -Expansion mittels irrIgG-IL-2, STAR2 und NewSTAR in einem präklinischen aGvHD Modell. Herausragend war die exogene TNFR2 Stimulation, da die für IL-2 typischen Effekte auf andere Immunzellen nicht zu beobachten waren. Im zweiten Teil dieser Arbeit untersuchten wir Tregs im duktalen Adenokarzinom des Pankreas (PDAC) zur Entwicklung neuner therapeutischer Targeting-Strategien. Unter den vielen Tumorentitäten in welchen Tregs das Überleben beeinflussen, zeigen besonders die präklinischen und klinischen Daten im PDAC ihre negative Rolle. Für unsere Studien verwendeten wir das orthotope, syngene Panc02 Modell in immunkompetenten Mäusen. Mit Hilfe der Durchflusszytometrie analysierten wir das Tumormikromilieu und präsentieren TIGIT und Mitglieder der TNFRSF als neue therapeutische Targets. Eine Blockade des TNFR2 reduzierte nicht die intratumorale Akkumulation von Tregs. Jedoch gelang es durch Manipulation der extrazellulären Tumormatrix deutlich die Anzahl an Tregs im Tumor zu reduzieren. Allerdings reichte im PDAC die Treg-Manipulation allein nicht zur Tumorregression aus und wir postulieren, dass eine weitere Verstärkung der Immunantwort nötig ist, um eine Tumorregression bzw. -kontrolle zu erreichen. Zusammenfassend zeigten wir das hohe therapeutische Potenzial der Manipulation von Tregs in vivo und stellen wirkungsvolle Strategien zu ihrer Umsetzung vor. Mit neuartigen TNFR2 Agonisten (STAR2, NewSTAR) konnten wir die Funktion und Anzahl der Tregs verstärken. Der Effekt war genauso gut (oder sogar besser) wie nach IL-2 Stimulation, jedoch ohne unerwünschte Nebenwirkungen. Bemerkenswert war der therapeutische Nutzen zur Verhinderung der aGvHD nach allogener Stammzelltransplantation. Als neue therapeutische Targets im PDAC identifizierten wir TIGIT und Mitglieder der TNFRSF. Durch Veränderung der extrazellulären Tumormatrix gelang es uns die Anzahl der tumorinfiltrierenden Tregs zu reduzieren. Diese neuen Behandlungsstrategien erscheinen als höchst attraktive Therapieoptionen, welche Patienten mit Entzündungserkrankungen bzw. mit einer Krebsdiagnose in Zukunft nutzen könnten. KW - Immunotherapy KW - ModulationTregs Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-192600 ER - TY - THES A1 - Reuter, Christian Steffen T1 - Development of a tissue-engineered primary human skin infection model to study the pathogenesis of tsetse fly-transmitted African trypanosomes in mammalian skin T1 - Entwicklung eines primären humanen Hautinfektionsmodells basierend auf Gewebezüchtung zur Erforschung der Pathogenese von Tsetsefliegen-übertragenen Afrikanischen Trypanosomen in der Säugetierhaut N2 - Many arthropods such as mosquitoes, ticks, bugs, and flies are vectors for the transmission of pathogenic parasites, bacteria, and viruses. Among these, the unicellular parasite Trypanosoma brucei (T. brucei) causes human and animal African trypanosomiases and is transmitted to the vertebrate host by the tsetse fly. In the fly, the parasite goes through a complex developmental cycle in the alimentary tract and salivary glands ending with the cellular differentiation into the metacyclic life cycle stage. An infection in the mammalian host begins when the fly takes a bloodmeal, thereby depositing the metacyclic form into the dermal skin layer. Within the dermis, the cell cycle-arrested metacyclic forms are activated, re-enter the cell cycle, and differentiate into proliferative trypanosomes, prior to dissemination throughout the host. Although T. brucei has been studied for decades, very little is known about the early events in the skin prior to systemic dissemination. The precise timing and the mechanisms controlling differentiation of the parasite in the skin continue to be elusive, as does the characterization of the proliferative skin-residing trypanosomes. Understanding the first steps of an infection is crucial for developing novel strategies to prevent disease establishment and its progression. A major shortcoming in the study of human African trypanosomiasis is the lack of suitable infection models that authentically mimic disease progression. In addition, the production of infectious metacyclic parasites requires tsetse flies, which are challenging to keep. Thus, although animal models - typically murine - have produced many insights into the pathogenicity of trypanosomes in the mammalian host, they were usually infected by needle injection into the peritoneal cavity or tail vein, bypassing the skin as the first entry point. Furthermore, animal models are not always predictive for the infection outcome in human patients. In addition, the relatively small number of metacyclic parasites deposited by the tsetse flies makes them difficult to trace, isolate, and study in animal hosts. The focus of this thesis was to develop and validate a reconstructed human skin equivalent as an infection model to study the development of naturally-transmitted metacyclic parasites of T. brucei in mammalian skin. The first part of this work describes the development and characterization of a primary human skin equivalent with improved mechanical properties. To achieve this, a computer-assisted compression system was designed and established. This system allowed the improvement of the mechanical stability of twelve collagen-based dermal equivalents in parallel through plastic compression, as evaluated by rheology. The improved dermal equivalents provided the basis for the generation of the skin equivalents and reduced their contraction and weight loss during tissue formation, achieving a high degree of standardization and reproducibility. The skin equivalents were characterized using immunohistochemical and histological techniques and recapitulated key anatomical, cellular, and functional aspects of native human skin. Furthermore, their cellular heterogeneity was examined using single-cell RNA sequencing - an approach which led to the identification of a remarkable repertoire of extracellular matrix-associated genes expressed by different cell subpopulations in the artificial skin. In addition, experimental conditions were established to allow tsetse flies to naturally infect the skin equivalents with trypanosomes. In the second part of the project, the development of the trypanosomes in the artificial skin was investigated in detail. This included the establishment of methods to successfully isolate skin-dwelling trypanosomes to determine their protein synthesis rate, cell cycle and metabolic status, morphology, and transcriptome. Microscopy techniques to study trypanosome motility and migration in the skin were also optimized. Upon deposition in the artificial skin by feeding tsetse, the metacyclic parasites were rapidly activated and established a proliferative population within one day. This process was accompanied by: (I) reactivation of protein synthesis; (II) re-entry into the cell cycle; (III) change in morphology; (IV) increased motility. Furthermore, these observations were linked to potentially underlying developmental mechanisms by applying single-cell parasite RNA sequencing at five different timepoints post-infection. After the initial proliferative phase, the tsetse-transmitted trypanosomes appeared to enter a reversible quiescence program in the skin. These quiescent skin-residing trypanosomes were characterized by very slow replication, a strongly reduced metabolism, and a transcriptome markedly different from that of the deposited metacyclic forms and the early proliferative trypanosomes. By mimicking the migration from the skin to the bloodstream, the quiescent phenotype could be reversed and the parasites returned to an active proliferating state. Given that previous work has identified the skin as an anatomical reservoir for T. brucei during disease, it is reasonable to assume that the quiescence program is an authentic facet of the parasite's behavior in an infected host. In summary, this work demonstrates that primary human skin equivalents offer a new and promising way to study vector-borne parasites under close-to-natural conditions as an alternative to animal experimentation. By choosing the natural transmission route - the bite of an infected tsetse fly - the early events of trypanosome infection have been detailed with unprecedented resolution. In addition, the evidence here for a quiescent, skin-residing trypanosome population may explain the persistence of T. brucei in the skin of aparasitemic and asymptomatic individuals. This could play an important role in maintaining an infection over long time periods. N2 - Zahlreiche Arthropoden wie Stechmücken, Zecken, Wanzen und Fliegen sind Überträger für krankheitserregende Parasiten, Bakterien und Viren. Hierzu gehört der einzellige Parasit Trypanosoma brucei (T. brucei), welcher durch Tsetsefliegen übertragen wird und die Afrikanische Trypanosomiasis bei Menschen und Tieren verursacht. Der Entwicklungszyklus des Parasiten in der Fliege ist komplex und endet in der Speicheldrüse mit der Differenzierung in das metazyklische Lebensstadium. Diese metazyklischen Formen werden durch den Biss der blutsaugenden Tsetsefliege in die dermale Hautschicht des Säugetierwirts injiziert. Die zellzyklusarretierten metazyklischen Formen werden in der Dermis aktiviert und der Widereintritt in den Zellzyklus sowie die Differenzierung zu proliferativen Trypanosomen eingeleitet. Anschließend breitet sich der Parasit systemisch im Säugetierwirt aus. Obwohl T. brucei bereits seit Jahrzehnten erforscht wird, ist nur sehr wenig über das frühe Infektionsgeschehen in der Haut bekannt. Der genaue Zeitpunkt und die Mechanismen, die der Differenzierung des Parasiten in der Haut zugrunde liegen, sind unbekannt. Ebenso wurden die proliferativen Trypanosomen in der Haut bisher nur unzureichend charakterisiert. Das Verständnis über die ersten Schritte einer Infektion ist jedoch von entscheidender Bedeutung für die Entwicklung von neuen Strategien, die die Krankheitsentstehung und deren Fortschreiten verhindern sollen. Ein großes Hindernis bei der Erforschung der humanen Afrikanischen Trypanosomiasis ist der Mangel an geeigneten Infektionsmodellen, die den Krankheitsverlauf authentisch nachbilden. Außerdem werden für die Erzeugung der infektiösen metazyklischen Parasiten Tsetsefliegen benötigt, die aufwändig zu züchten sind. Tiermodelle haben es ermöglicht - hauptsächlich Mäuse -, viele Erkenntnisse über die Pathogenese von Trypanosomen im Säugetierwirt zu erlangen. Allerdings wurden diese überwiegend durch Nadelinjektion in den Bauchraum oder die Kaudalvene infiziert, wodurch die Haut als erste Eintrittspforte umgangen wurde. Darüber hinaus lassen Tiermodelle nicht immer Rückschlüsse auf den Infektionsverlauf beim Menschen zu. Zusätzlich erschwert die geringe Anzahl von metazyklischen Parasiten, die von Tsetsefliegen injiziert werden, die Isolation, Nachweis und Untersuchung im tierischen Wirt. Das Ziel der vorliegenden Arbeit war es, ein rekonstruiertes menschliches Hautäquivalent zu entwickeln und als Infektionsmodell zu validieren, um die Entwicklung von natürlich übertragenen metazyklischen Parasiten von T. brucei in der Säugetierhaut zu untersuchen. Der erste Teil dieser Arbeit beschreibt die Entwicklung und Charakterisierung eines primären menschlichen Hautäquivalents mit verbesserten mechanischen Eigenschaften. Zu diesem Zweck wurde ein computergesteuertes Kompressionssystem entworfen und hergestellt. Dieses System ermöglichte die gleichzeitige Verbesserung der mechanischen Stabilität von zwölf kollagenbasierten dermalen Äquivalenten durch plastische Kompression, die mittels Rheologie evaluiert wurden. Die verbesserten dermalen Äquivalente dienten als Fundament für die Erzeugung der Hautäquivalente und reduzierten deren Kontraktion und Gewichtsverlust während der Gewebebildung. Dadurch wurde ein hohes Maß an Standardisierung und Reproduzierbarkeit erreicht. Die Hautäquivalente wurden durch immunhistochemische und histologische Techniken charakterisiert und bildeten wichtige anatomische, zelluläre und funktionelle Aspekte der nativen menschlichen Haut nach. Des Weiteren wurde die zelluläre Heterogenität durch Einzelzell-RNA-Sequenzierung untersucht. Mit dieser Technik wurde ein umfangreiches Spektrum an extrazellulären Matrix-assoziierten Genen identifiziert, die von verschiedenen Zellsubpopulationen in der künstlichen Haut exprimiert werden. Zusätzlich wurden experimentelle Bedingungen etabliert, damit Tsetsefliegen eingesetzt werden konnten, um die Hautäquivalente auf natürlichem Weg mit Trypanosomen zu infizieren. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde die Entwicklung der Trypanosomen in der künstlichen Haut im Detail untersucht. Dies umfasste die Etablierung von Methoden zur erfolgreichen Isolierung der Trypanosomen aus der Haut, um deren Proteinsyntheserate, Zellzyklus- und Stoffwechselstatus, sowie Morphologie und Transkriptom zu bestimmen. Zusätzlich wurden Mikroskopietechniken zur Untersuchung der Trypanosomenmotilität und migration in der Haut optimiert. Nach der Injektion in die künstliche Haut durch Tsetsefliegen wurden die metazyklischen Parasiten schnell aktiviert und etablierten innerhalb eines Tages eine proliferative Population. Dieser Entwicklungsprozess wurde begleitet von (I) einer Reaktivierung der Proteinsynthese, (II) einem Wiedereintritt in den Zellzyklus, (III) einer Veränderung der Morphologie und (IV) einer erhöhten Motilität. Des Weiteren wurden diese Beobachtungen mit potentiell zugrundeliegenden entwicklungsbiologischen Mechanismen in Verbindung gebracht, indem eine Einzelzell RNA-Sequenzierung der Trypanosomen zu fünf verschiedenen Zeitpunkten nach der Infektion durchgeführt wurde. Nach der ersten proliferativen Phase traten die Tsetse-übertragenen Trypanosomen in der Haut in ein reversibles Ruhestadium ein. Diese ruhenden Trypanosomen waren durch eine sehr langsame Zellteilung, einen stark reduzierten Stoffwechsel und ein Transkriptom gekennzeichnet, dass sich deutlich von dem der injizierten metazyklischen Formen und der ersten proliferativen Trypanosomen unterschied. Durch Nachahmung der Migration von der Haut in den Blutkreislauf konnte dieser Phänotyp reaktiviert werden und die Parasiten kehrten in einen aktiven, proliferierenden Zustand zurück. Unter Berücksichtigung, dass vorangegangene Forschungsarbeiten die Haut als anatomisches Reservoir für T. brucei während des Krankheitsverlaufs identifiziert haben, ist anzunehmen, dass das Ruheprogramm eine authentische Facette im Verhalten des Parasiten in einem infizierten Wirt darstellt. Zusammenfassend zeigt diese Arbeit, das primäre menschliche Hautäquivalente eine neue und vielversprechende Möglichkeit bieten, vektorübertragene Parasiten unter naturnahen Bedingungen als Alternative zu Tierversuchen zu untersuchen. Durch die Verwendung des natürlichen Infektionsweges - dem Biss einer infizierten Tsetsefliege -, konnten die frühen Prozesse einer Trypanosomen-Infektion mit noch nie dagewesener Detailtiefe nachvollzogen werden. Des Weiteren könnte der hier erbrachte Nachweis einer ruhenden, hautresidenten Trypanosomen-Population die Persistenz von T. brucei in der Haut von aparasitämischen und asymptomatischen Personen erklären. Dies könnte eine wichtige Rolle bei der Aufrechterhaltung einer Infektion über lange Zeiträume spielen. KW - Trypanosoma brucei KW - Tissue Engineering KW - Trypanosomiasis KW - 3D-Zellkultur KW - Transkriptomanalyse KW - developmental differentiation KW - skin equivalent KW - artificial human skin KW - single-cell RNA sequencing KW - quiescence Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-251147 ER - TY - THES A1 - Gotthard, Hannes T1 - Targeting Colorectal Cancer Stem Cells with Hemibodies T1 - Eliminierung von Krebsstammzellen des kolorektalen Karzinoms mithilfe von Hemibodies N2 - The cancer stem cell hypothesis is a cancer development model which elicited great interest in the last decades stating that cancer heterogeneity arises from a stem cell through asymmetrical division. The Cancer Stem Cell subset is described as the only population to be tumorigenic and having the potential to renew. Conventional therapy often fails to eradicate CSC resulting in tumor relapse. Consequently, it is of great inter-est to eliminate this subset of cells to provide the best patient outcome. In the last years several approaches to target CSC were developed, one of them being immunotherapeu-tic targeting with antibodies. Since markers associated with CSC are also expressed on normal stem cells or healthy adjacent tissue in colorectal cancer, dual targeting strate-gies are preferred over targeting only a single antigen. Subsequently, the idea of dual targeting two CSC markers in parallel by a newly developed split T cell-engaging anti-body format termed as Hemibodies emerged. In a preliminary single cell RNA sequenc-ing analysis of colorectal cancer cells CD133, CD24, CD166 and CEA were identified as suitable targets for the combinatorial targeting strategy. Therefore, this study focused on trispecific and trivalent Hemibodies comprising a split binding moiety against CD3 and a binding moiety against either CD133, CD24, CD166 or CEA to overcome the occurrence of resistance and to efficiently eradicate all tumor cells including the CSC compartment. The study showed that the Hemibody combinations CD133xCD24, CD133xCD166 and CD133xCEA are able to eliminate double positive CHO cells with high efficacy while having a high specificity indicated by no killing of single antigen positive cells. A thera-peutic window ranging between one to two log levels could be achieved for all combina-tions mentioned above. The combinations CD133xCD24 and CD133xCD166 further-more proved its efficacy and specificity on established colorectal cancer cell lines. Be-sides the evaluation of specificity and efficacy the already introduced 1st generation of Hemibodies could be improved into a 2nd generation Hemibody format with increased half-life, stability and production yield. In future experiments the applicability of above-mentioned Hemibodies will be proven on patient-derived micro tumors to also include variables like tumor microenvironment and infiltration. N2 - In den letzten Jahrzenten wurde neben der klonalen Evolution ein weiteres Modell zur Krebsentstehung und dessen Heterogenität entwickelt: die Krebsstammzellhypothe-se. Diese Hypothese besagt, dass die Heterogenität eines Tumors durch asymmetri-sche Teilung von sogenannten Krebsstammzellen entsteht. Nur diese sind tumorigen und in der Lage Metastasen zu bilden. Außerdem werden Krebsstammzellen als re-sistent gegen konventionelle Therapien beschrieben, weshalb es nach einer anfängli-chen Tumorregression oft zu einem Rezidiv durch erneutes Auswachsen von zurück-bleibenden Krebsstammzellen kommt. Deshalb ist es von großem Interesse genau diese Population abzutöten, um eine erfolgreiche Therapie zu gewährleisten. In den letzten Jahren wurden zahlreiche Medikationen entwickelt, um Krebsstammzellen ge-zielt anzugreifen. Ein vielversprechender Ansatz ist hierbei die immuntherapeutische Adressierung mittels Antikörpern gegen Krebsstammzellmarkern. Einzelne Marker sind allerdings auch auf normalen Stammzellen und gesundem Gewebe exprimiert, weshalb Therapien, die auf mindestens zwei verschiedene Oberflächenproteine ab-zielen, erfolgsversprechender sind. In dieser Arbeit wurde ein neues T-Zell rekrutie-rendes Antikörperformat entwickelt, sogenannte Hemibodies. Hierbei handelt es sich um ein trispezifisches und trivalentes Format, bestehend aus jeweils zwei Fragmen-ten. Jedes Fragment besteht aus einer Bindedomäne gegen ein Krebsstammzellmar-ker und einer geteilten Bindedomäne gegen CD3. Durch Bindung beider Fragmente an einen Stammzellmarker kommt es zur Komplementierung der geteilten anti-CD3 Domäne und zur T-Zellrekrutierung. Der erste Teil der Arbeit befasst sich mit der bioin-formatischen Analyse von Einzelzell-RNA-Daten des kolorektalen Karzinoms (KRK) zur Identifizierung von potentiellen Krebsstammzellmarkern. Dabei konnten die Ober-flächenproteine CD24, CD133, CD166 und CEA und besonders deren Kombination als geeignete Zielstrukturen identifiziert werden. Die gegen oben genannte Antigene gerichteten Hemibodies zeigten in den Kombinationen CD133xCD24, CD133xCD166 und CD133xCEA auf doppelt positiven CHO-Zellen eine hohe Effektivität. Außerdem konnte die Spezifität durch ein Ausbleiben von Zelltod auf einzel-positiven CHO Zellen bewiesen werden. Die Kombinationen CD133xCD24 und CD133xCD166 konnten Effektivität und Spezifität auch auf etablierten Krebszellen zeigen. Die oben genann-ten Kombinationen waren in einem therapeutischen Fenster von ein bis zwei Logstu-fen funktional. Neben der Testung verschiedener Hemibody-Kombinationen konnten die bereits publizierten Hemibodies der ersten Generation in ein neues Format der zweiten Generation weiterentwickelt werden. Das neue Format zeigte eine verbesser-te Halbwertszeit, Stabilität und Produzierbarkeit. In zukünftigen Experimenten werden die in der Thesis benutzten Hemibodies auf Mikrotumoren getestet, um weitere Vari-ablen, die die Effektivität und Spezifität beeinflussen zu ermitteln. KW - Monoklonaler bispezifischer Antikörper KW - Antikörper KW - T-Lymphozyt KW - Immunreaktion KW - Dickdarmkrebs KW - Hemibody KW - Hemibodies KW - Colorectal Cancer KW - trispecific KW - T-cell engager KW - dual targeting KW - Bispecific T-cell engager KW - stem cells KW - Kolorektales Karzinom Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-303090 ER - TY - THES A1 - Schlauersbach, Jonas T1 - The bile-drug-excipient interplay T1 - Das Galle-Arzneistoff-Hilfsstoff Wechselspiel N2 - The bile system in vertebrates is an evolutionary conserved endogenous solubilization system for hydrophobic fats and poorly water-soluble vitamins. Bile pours out from the gallbladder through the common bile duct into the duodenum triggered by cholecystokinin. Cholecystokinin is released from enteroendocrine cells after food intake. The small intestine is also the absorption site of many orally administered drugs. Most emerging drug candidates belong to the class of poorly water-soluble drugs (PWSDs). Like hydrophobic vitamins, these PWSDs might as well be solubilized by bile. Therefore, this natural system is of high interest for drug formulation strategies. Simulated intestinal fluids containing bile salts (e.g., taurocholate TC) and phospholipids (e.g., lecithin L) have been widely applied over the last decade to approximate the behavior of PWSDs in the intestine. Solubilization by bile can enhance the oral absorption of PWSDs being at least in part responsible for the positive “food effect”. The dissolution rate of PWSDs can be also enhanced by the presence of bile. Furthermore, some PWSDs profit from supersaturation stabilization by bile salts. Some excipients solubilizing PWSDs seemed to be promising candidates for drug formulation when investigated in vitro without bile. When tested in vivo, these excipients reduced the bioavailability of drugs. However, these observations have been hardly examined on a molecular level and general links between bile interaction in vitro and bioavailability are still missing. This thesis investigated the interplay of bile, PWSDs, and excipients on a molecular level, providing formulation scientists a blueprint for rational formulation design taking bile/PWSD/excipient/ interaction into account. The first chapter focus on an in silico 1H nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy-based algorithm for bile/drug interaction prediction. Chapter II to IV report the impact of excipients on bioavailability of PWSDs interacting with bile. At last, we summarized helpful in vitro methods for drug formulation excipient choice harnessing biopharmaceutic solubilization in chapter V. Chapter I applies 1H NMR studies with bile and drugs on a large scale for quantitative structure-property relationship analysis. 141 drugs were tested in simulated intestinal media by 1H NMR. Drug aryl-proton signal shifts were correlated to in silico calculated molecular 2D descriptors. The probability of a drug interacting with bile was dependent on its polarizability and lipophilicity, whereas interaction with lipids in simulated intestinal media components was dependent on molecular symmetry, lipophilicity, hydrogen bond acceptor capability, and aromaticity. The probability of a drug to interact with bile was predictive for a positive food effect. This algorithm might help in the future to identify a bile and lipid interacting drug a priori. Chapter II investigates the impact of excipients on bile and free drug fraction. Three different interaction patterns for excipients were observed. The first pattern defined excipients that interacted with bile and irreversibly bound bile. Therefore, the free drug fraction of bile interacting drugs increased. The second pattern categorized excipients that formed new colloidal entities with bile which had a high affinity to bile interacting drugs. These colloids trapped the drug and decreased the free drug fraction. The last excipient pattern described excipients that formed supramolecular structures in coexistence with bile and had no impact on the free drug fraction. These effects were only observed for drugs interacting with bile (Perphenazine and Imatinib). Metoprolol’s free drug fraction, a compound not interacting with bile, was unaffected by bile or bile/excipient interaction. We hypothesized that bile/excipient interactions may reduce the bioavailability of bile interacting drugs. Chapter III addresses the hypothesis from chapter II. A pharmacokinetic study in rats revealed that the absorption of Perphenazine was reduced by bile interacting excipients due to bile/excipient interaction. The simultaneous administration of excipient patterns I and II did not further reduce or enhance Perphenazine absorption. Conversely, the absorption of Metoprolol was not impacted by excipients. This reinforced the hypothesis, that drugs interacting with bile should not be formulated with excipients also interacting with bile. Chapter IV further elaborates which in vitro methods using simulated intestinal fluids are predictive for a drug’s pharmacokinetic profile. The PWSD Naporafenib was analyzed in vitro with simulated intestinal fluids and in presence of excipients regarding solubility, supersaturation, and free drug fraction. Naporafenib showed a strong interaction with TC/L from simulated bile. Assays with TC/L, but not without identified one excipient as possibly bioavailability reducing, one as supersaturation destabilizing, and the last as bile not interacting and supersaturation stabilizing excipient. A pharmacokinetic study in beagle dogs outlined and confirmed the in vitro predictions. The Appendix summarizes in vivo predictive methods as presented in chapter I to IV and rationalizes experimental design paving the way towards a biopharmaceutic excipient screening. The first presented preliminary decision tree is transformed into a step-by-step instruction. The presented decision matrix might serve as a blueprint for processes in early phase drug formulation development. In summary, this thesis describes how a drug can be defined as bile interacting or non-interacting and gives a guide as well how to rate the impact of excipients on bile. We showed in two in vivo studies that bile/excipient interaction reduced the bioavailability of bile interacting drugs, while bile non-interacting drugs were not affected. We pointed out that the bile solubilization system must be incorporated during drug formulation design. Simulated gastrointestinal fluids offer a well-established platform studying the fate of drugs and excipients in vivo. Therefore, rational implementation of biopharmaceutic drug and excipient screening steers towards efficacy of oral PWSD formulation design. N2 - Das Gallensystem in Wirbeltieren ist ein evolutionär konserviertes endogenes Solubilisierungssystem für hydrophobe Fette und schwer wasserlösliche Vitamine. Ausgelöst durch Cholecystokinin wird Galle aus der Gallenblase durch den Hauptgallengang in den Zwölffingerdarm ausgeschüttet. Cholecystokinin wird zum Beispiel nach der Nahrungsaufnahme aus enteroendokrinen Zellen freigesetzt. Der Dünndarm ist auch der Ort, an dem viele oral verabreichte Arzneimittel aufgenommen werden. Die meisten neuen Arzneimittelkandidaten gehören zur Klasse der schlecht wasserlöslichen Arzneimittel (poorly water-soluble drugs: PWSDs). Galle kann auch wie bei hydrophoben Vitaminen die Löslichkeit von PWSDs verbessern. Daher ist dieses natürliche System von großem Interesse für Arzneimittelformulierungsstrategien. Simulierte Darmflüssigkeiten, die Gallensalze (z.B. Taurocholat TC) und Phospholipide (Lecithin L) enthalten, wurden in den letzten Jahren häufig verwendet, um das Verhalten von PWSDs im Darm zu simulieren. Die Löslichkeitsverbesserung durch Galle kann die orale Absorption von PWSDs erhöhen, was ein möglicher Grund für den sogenannten positiven "Nahrungsmitteleffekt" darstellt. Auch die Auflösungsgeschwindigkeit von PWSD kann durch die Anwesenheit von Galle verbessert werden. Darüber hinaus profitieren einige PWSDs von der Stabilisierung der Übersättigung durch Gallensalze. Einige Hilfsstoffe, die die Löslichkeit von PWSDs stark erhöhten, schienen vielversprechende Kandidaten für die Arzneimittelformulierung zu sein, wenn sie in vitro ohne Galle untersucht wurden. In vivo getestet, verringerten diese Hilfsstoffe jedoch die Bioverfügbarkeit. Diese Beobachtungen wurden bisher kaum auf molekularer Ebene untersucht, und allgemeine Zusammenhänge zwischen der Interaktion mit der Galle in vitro und der Bioverfügbarkeit fehlen bisher. In dieser Arbeit wurde das Zusammenspiel von PWSD, Hilfsstoffen und Galle auf molekularer Ebene untersucht, um Formulierungswissenschaftlern einen Entwurf für ein rationales Formulierungsdesign zu liefern, das die Wechselwirkung zwischen PWSD, Hilfsstoffen und Galle berücksichtigt. Das erste Kapitel befasst sich mit einem auf 1H-Kernspinresonanzspektroskopie (1H NMR) basierenden in-silico-Algorithmus zur Vorhersage von Wechselwirkungen zwischen Galle und Arzneimittel. Die Kapitel II bis IV zeigen die Auswirkungen von Hilfsstoffen auf die Bioverfügbarkeit von PWSDs, die mit der Galle interagieren. Schließlich haben wir in Kapitel V hilfreiche in-vitro-Methoden für die Auswahl von Hilfsstoffen in Arzneimittelformulierungen zusammengefasst, die die biopharmazeutische Solubilisierung nutzen. In Kapitel I werden 1H-NMR-Studien mit Galle und Arzneimitteln in großem Maßstab zur quantitativen Analyse der Struktur-Eigenschafts-Beziehung durchgeführt. 141 Arzneimittel wurden in simulierten Darmmedien mittels 1H-NMR untersucht. Die Aryl-Proton-Signalverschiebungen der Arzneimittel wurden mit in silico berechneten molekularen Deskriptoren korreliert. Die Wahrscheinlichkeit, dass ein Arzneimittel mit Galle interagiert, hing von seiner Polarisierbarkeit und Lipophilie ab, während die Interaktion mit Lipiden in simulierten Darmmedienkomponenten von der molekularen Symmetrie, Lipophilie, der Fähigkeit Wasserstoffbrückenbindungen einzugehen, und der Aromatizität abhing. Die Wahrscheinlichkeit, dass ein Arzneimittel mit Galle interagiert, war prädiktiv für einen positiven Nahrungsmitteleffekt. Dieser Algorithmus könnte in Zukunft dabei helfen, ein mit Galle und Lipiden interagierendes Arzneimittel a priori zu identifizieren. In Kapitel II wird der Einfluss von Hilfsstoffen auf die Galle und den Anteil des freien Arzneimittels untersucht. Es wurden drei verschiedene Interaktionsmuster für Hilfsstoffe beobachtet. Das erste Muster interagiert mit der Galle und bindet die Galle irreversibel. Dadurch erhöhte sich der Anteil des freien Wirkstoffs. Das zweite Muster von Hilfsstoffen bildete mit der Galle neue kolloidale Strukturen, die eine hohe Affinität zum Arzneimittel hatten. Diese Kolloide schlossen den Wirkstoff ein und verringerten den Anteil des freien Wirkstoffs. Das letzte Hilfsstoffmuster bildete supramolekulare Strukturen in Koexistenz mit der Galle und hatte keinen Einfluss auf den Anteil des freien Arzneistoffes. Diese Auswirkungen wurden nur bei Arzneimitteln beobachtet, die mit der Galle interagieren (Perphenazin und Imatinib). Der Anteil des freien Wirkstoffs Metoprolol, der nicht mit der Galle interagiert, wurde durch die Interaktion von Galle oder Galle/Hilfsstoff nicht beeinflusst. Wir stellten die Hypothese auf, dass Wechselwirkungen zwischen Galle und Hilfsstoffen die Bioverfügbarkeit von Arzneimitteln, die mit der Galle interagieren, verringern können. Kapitel III befasst sich mit der Hypothese aus Kapitel II. Eine pharmakokinetische Studie an Ratten ergab, dass die Absorption von Perphenazin durch mit der Galle interagierende Hilfsstoffe aufgrund einer Wechselwirkung zwischen Galle und Hilfsstoff verringert wurde. Die gleichzeitige Verabreichung der Hilfsstoffmuster I und II führte nicht zu einer weiteren Verringerung oder Erhöhung der Perphenazin-Resorption. Umgekehrt wurde die Absorption von Metoprolol durch die Hilfsstoffe nicht beeinträchtigt. Dies bestätigt die Hypothese, dass Arzneimittel, die mit Galle interagieren, nicht mit Hilfsstoffen formuliert werden sollten, die ebenfalls mit Galle interagieren. In Kapitel IV wird näher erläutert, welche in-vitro-Methoden für das pharmakokinetische Profil eines Arzneimittels aussagekräftig sind. Das PWSD Naporafenib wurde in vitro mit simulierten Darmflüssigkeiten und in Gegenwart von Hilfsstoffen hinsichtlich Löslichkeit, Übersättigung und freiem Wirkstoffanteil analysiert. Naporafenib zeigte eine starke Wechselwirkung mit TC/L aus simulierter Galle. Bei Untersuchungen mit TC/L, aber nicht ohne TC/L, wurde ein Hilfsstoff als möglicherweise bioverfügbarkeitsvermindernd, ein Hilfsstoff als die Übersättigung destabilisierend und der letzte als nicht mit der Galle interagierender und die Übersättigung stabilisierender Hilfsstoff identifiziert. In einer pharmakokinetischen Studie an Beagle-Hunden wurden die in-vitro-Vorhersagen bestätigt. Der Anhang fasst die in den Kapiteln I bis IV vorgestellten in-vivo-Vorhersagemethoden zusammen und rationalisiert die Versuchsplanung, die den Weg für ein biopharmazeutisches Hilfsstoffscreening ebnet. Der vorgestellte vorläufige Entscheidungsbaum wird in eine Schritt-für-Schritt-Anleitung umgewandelt. Die vorgestellte Entscheidungsmatrix soll in den Prozess der frühen Phase der Entwicklung von Arzneimittelformulierungen implementiert werden können. Zusammenfassend wird in dieser Arbeit beschrieben, wie ein Arzneimittel als Galle interagierend oder nicht interagierend definiert werden kann, und es wird ein Leitfaden für die Bewertung der Auswirkungen von Hilfsstoffen auf Galle gegeben. Wir haben in zwei In-vivo-Studien gezeigt, dass die Interaktion zwischen Galle und Hilfsstoff die Bioverfügbarkeit von Arzneistoffen, die mit der Galle interagieren, verringert, während Arzneistoffe, die nicht mit der Galle interagieren, davon nicht betroffen waren. Wir wiesen darauf hin, dass das Solubilisierungssystem der Galle bei der Entwicklung von Arzneimittelformulierungen berücksichtigt werden muss. Simulierte gastrointestinale Flüssigkeiten bieten eine gut etablierte Plattform zur Untersuchung von Arzneistoffen und Hilfsstoffen in vivo. Die rationelle Umsetzung des biopharmazeutischen Screenings von Arzneimitteln und Hilfsstoffen führt daher zu einem wirksamen Formulierungsdesign von oralen, schwer wasserlöslichen Arzneistoffen. KW - Solubilisation KW - Pharmazeutischer Hilfsstoff KW - NMR-Spektroskopie KW - Bioverfügbarkeit KW - formulation development KW - Formulierungsentwicklung KW - in vitro/in vivo correlation KW - in vitro/in vivo Korrelation KW - molecular modeling KW - molekulares Modellieren KW - animal studies KW - Tierversuche KW - Galle Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-296537 ER - TY - THES A1 - Landwehr, Laura-Sophie T1 - Steroid Hormones and Cancer Immunity - learning from Adrenocortical Carcinoma T1 - Steroidhormone und Tumorimmunität im Nebennierenrindenkarzinom N2 - Adrenocortical carcinoma (ACC) is a rare, but highly aggressive endocrine malignancy. Tumor-related hypercortisolism is present in 60 % of patients and associated with worse outcome. While cancer immunotherapies have revolutionized the treatment of many cancer entities, the results of initial studies of different immune checkpoint inhibitors in ACC were heterogeneous. Up to now, five small clinical trials with a total of 121 patients have been published and demonstrated an objective response in only 17 patients. However, one of the studies, by Raj et al., reported a clinically meaningful disease control rate of 52 % and a median overall survival of almost 25 months suggesting that a subgroup of ACC patients may benefit from immunotherapeutic approaches. Following the hypothesis that some ACCs are characterized by a glucocorticoid-induced T lymphocytes depletion, several studies were performed as part of the presented thesis. First, the immune cell infiltration in a large cohort of 146 ACC specimens was investigated. It was demonstrated for the first time, and against the common assumption, that ACCs were infiltrated not only by FoxP3+ regulatory T cells (49.3 %), but also that a vast majority of tumor samples was infiltrated by CD4+ TH cells (74 %) and CD8+ cytotoxic T cells (84.3 %), albeit the immune cell number varied heterogeneously and was rather low (median: 7.7 CD3+ T cells / high power field, range: 0.1-376). Moreover, the presence of CD3+-, CD4+- and CD8+ ACC-infiltrating lymphocytes was associated with an improved recurrence-free (HR: 0.31 95 % CI 0.11-0.82) and overall survival (HR: 0.47 96 % CI 0.25-0.87). Particularly, patients with tumor-infiltrating CD4+ TH cells without glucocorticoid excess had a significantly longer overall survival compared to patients with T cell-depleted ACC and hypercortisolism (121 vs. 27 months, p = 0.004). Hence, the impact of glucocorticoids might to some extent be responsible for the modest immunogenicity in ACC as hypercortisolism was reversely correlated with the number of CD4+ TH cells. Accordingly, CD3+ T cells co-cultured with steroidogenic NCI-H295R ACC cells demonstrated in vitro an enhanced anti-tumoral cytotoxicity by secreting 747.96 ±225.53 pg/ml IFN-γ in a therapeutically hormone-depleted microenvironment (by incubation with metyrapone), versus only 276.02 ±117.46 pg/ml IFN-γ in a standard environment with glucocorticoid excess. Other potential biomarkers to predict response to immunotherapies are the immunomodulatory checkpoint molecules, programmed cell death 1 (PD-1) and its ligand PD-L1, since both are targets of antibodies used therapeutically in different cancer entities. In a subcohort of 129 ACCs, expressions of both molecules were heterogeneous (PD-1 17.4 %, range 1-15; PD-L1 24.4 %, range 1 - 90) and rather low. Interestingly, PD-1 expression significantly influenced ACC patients´ overall (HR: 0.21 95 % CI 0.53-0.84) and progression- free survival (HR: 0.30 95 % CI 0.13-0.72) independently of established factors, like ENSAT tumor stage, resection status, Ki67 proliferation index and glucocorticoid excess, while PD-L1 had no impact. In conclusion, this study provides several potential explanations for the heterogeneous results of the immune checkpoint therapy in advanced ACC. In addition, the establishment of PD-1 as prognostic marker can be easily applied in routine clinical care, because it is nowadays anyway part of a detailed histo-pathological work-up. Furthermore, these results provide the rationale and will pave the way towards a combination therapy using immune checkpoint inhibitors as well as glucocorticoid blockers. This will increase the likelihood of re-activating the immunological anti-tumor potential in ACC. However, this will have to be demonstrated by additional preclinical in vivo experiments and finally in clinical trials with patients. N2 - Das Nebennierenrindenkarzinom (ACC) ist ein seltenes, aber äußerst aggressives endokrines Malignom. Ein tumorbedingter Hyperkortisolismus liegt bei 60 % der Patienten vor und ist mit einer schlechteren Prognose assoziiert. Während Krebsimmuntherapien die Behandlung vieler Krebsentitäten revolutioniert haben, waren die Ergebnisse der ersten Studien zu verschiedenen Immun-Checkpoint-Inhibitoren beim ACC heterogen. Die fünf klinischen Studien mit insgesamt 121 Patienten zeigten ein objektives Ansprechen bei nur 17 Patienten. Eine Studie von Raj et al. berichtete über eine klinisch bedeutsame Krankheitskontrollrate von 52 % und ein medianes Gesamtüberleben von fast 25 Monaten. Diese beträchtliche Anti-Tumor-Aktivität legt nahe, dass eine Subgruppe von ACC-Patienten von immuntherapeutischen Ansätzen profitieren könnte. Der Hypothese folgend, dass einige ACCs durch eine Glukokortikoid-induzierte T Lymphozyten-Depletion gekennzeichnet sind, wurden im Rahmen der vorliegenden Arbeit mehrere Studien durchgeführt. Zunächst wurde die Immunzellinfiltration in einer großen Kohorte von 146 ACC-Proben untersucht. Entgegen der verbreiteten Annahme konnte erstmals gezeigt werden, dass ACCs nicht nur von FoxP3+ regulatorischen T Zellen (49,3 %), sondern die Mehrheit der ACCs von CD4+ TH (74 %) und CD8+ zytotoxischen T Zellen (84,3 %) infiltriert wurde, wenngleich die Immunzellanzahl heterogen und eher gering war (7,7 CD3+ T Zellen/HPF). Darüber hinaus war die Präsenz von CD3+-, CD4+- und CD8+ ACC-infiltrierenden Lymphozyten mit einem rezidivfreien (HR:0,31;95%CI0,11-0,82) und verbesserten Gesamtüberleben (HR:0,47;95%CI 0,25-0,87) assoziiert. Insbesondere Patienten mit tumorinfiltrierenden CD4+ TH Zellen ohne Glukokortikoid-Überschuss hatten im Vergleich zu Patienten mit T Zell-depletiertem ACC und Hyperkortisolismus ein signifikant län- geres Gesamtüberleben (121 vs. 27 Monate; p = 0.004). Daher könnte die Wirkung von Glukokortikoiden für die moderate Immunogenität verantwortlich sein, da Hyperkortisolismus umgekehrt mit der Zahl der CD4+ TH Zellen korreliert war. Dementsprechend zeigten CD3+ T Zellen, die mit steroid-produzierenden NCI-H295R ACC-Zellen co-kultiviert wurden, in vitro eine erhöhte anti-tumorale Zytotoxizität in einem durch Metyrapon-induzierten Mikromilieu ohne Glukokortikoide im Vergleich zu einem Glukokortikoid- Überschuss (IFN-γ Sekretion: 747,96 pg/ml vs. 276,02 pg/ml). Andere potenzielle Biomarker zur Vorhersage des Ansprechens auf Immuntherapien sind die immunmodulatorischen Checkpoint-Moleküle, Programmed cell death 1 (PD-1) und sein Ligand PD-L1, da beide Ziele von Antikörpern sind, die therapeutisch bei verschiedenen Krebsentitäten eingesetzt werden. In einer Subkohorte von 129 ACCs waren die Expressionen beider Moleküle heterogen (PD-1 17,4 %, PD-L1 24,4 %). Interessanterweise beeinflusste die PD-1-Expression signifikant das Gesamtüberleben (HR: 0,21; 95 % CI 0,53-0,84) und das progressionsfreie Überleben (HR: 0,30; 95 % CI 0,13-0.72) unabhängig von etablierten Faktoren, wie dem ENSAT Tumorstadium, Resektionsstatus, Ki67 Proliferationsindex und Glukokortikoid-Überschuss, während PD-L1 keinen Einfluss hatte. Zusammenfassend liefert diese Studie mehrere mögliche Erklärungen für die heterogenen Ergebnisse der Immun-Checkpoint-Therapie bei fortgeschrittenem ACC. Darüber hinaus ist die Etablierung von PD-1 als prognostischer Marker anwendbar als Teil einer detaillierten histo-pathologischen Untersuchung. Zudem liefern diese Ergebnisse die Rationale und ebnen den Weg für eine Kombinationstherapie von Immun-Check- point-Inhibitoren sowie Anti-Glukokortikoiden, um die Wahrscheinlichkeit einer Reaktivierung des immu- nologischen Anti-Tumor-Potenzials beim ACC zu erhöhen. Dies muss jedoch durch zusätzliche präklinische in vivo Experimente und schließlich in klinischen Studien mit Patienten nachgewiesen werden. KW - Steroidhormon KW - Nebenniere KW - Krebs KW - Immuntherapie KW - Immunsuppression KW - Immune Checkpoint Therapy KW - Immune System KW - T Lymphocyte KW - T Helper Cell KW - Glucocorticoids KW - Cytotoxic T cell KW - Programmed Cell Death 1 KW - Programmed Cell Death Ligand 1 KW - Adrenocortical Carcinoma KW - Nebennierenrindenkarzinom Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-251895 ER - TY - THES A1 - Weinmann, Joshua T1 - Chemical Modifications of Quinolone Amides Against African Trypanosomiasis: Balancing Solubility, Bioactivity, and Cytotoxicity T1 - Chemische Modifikationen von Chinolonamiden gegen die Afrikanische Trypanosomiasis: Eine Balance zwischen Löslichkeit, Bioaktivität und Zytotoxizität N2 - The human African trypanosomiasis is a neglected tropical disease, which is caused by the protozoan Trypanosoma brucei and transmitted by the bite of the tsetse fly. An untreated infection leads to death. However, only a few drugs with significant drawbacks are currently available for treatment. In this thesis, quinolone amides with an antitrypanosomal activity were synthesized and their biological and physicochemical properties were measured. New structure-activity relationships and a promising lead structure were discovered. N2 - Die Humane Afrikanische Trypanosomiasis ist eine vernachlässigte Tropenkrankheit, die durch das Protozoon Trypanosoma brucei verursacht und durch den Stich der Tsetsefliege übertragen wird. Eine unbehandelte Infektion führt zum Tod. Für die Behandlung stehen derzeit jedoch nur wenige Medikamente mit erheblichen Nebenwirkungen zur Verfügung. In dieser Arbeit wurden Chinolonamide mit einer antitrypanosomalen Aktivität synthetisiert und ihre biologischen und physikochemischen Eigenschaften ermittelt. Es wurden neue Struktur-Wirkungs-Beziehungen und eine vielversprechende Leitstruktur entdeckt. KW - Trypanosomiase KW - Chinolon <2-> KW - Löslichkeit KW - Chemische Synthese KW - Biologische Aktivität KW - human African trypanosomiasis KW - Quinolone Amides KW - Synthesis KW - Cytotoxicity KW - Solubility KW - Humane Afrikanische Trypanosomiasis KW - Chinolonamide KW - Zytotoxizität KW - Synthese KW - Cytotoxizität Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-296599 ER - TY - THES A1 - Schliermann [geb. Stratmann], Anna Theresa T1 - The Role of FGF Receptor 2 in GDF5 mediated Signal Transduction T1 - Die Rolle des FGF Rezeptors 2 in GDF5-vermittelter Signaltransduktion N2 - Bone morphogenetic proteins (BMPs) are involved in various aspects of cell-cell communication in complex life forms. They act as morphogens, help differentiate different cell types from different progenitor cells in development, and are involved in many instances of intercellular communication, from forming a body axis to healing bone fractures, from sugar metabolism to angiogenesis. If the same protein or protein family carries out many functions, there is a demand to regulate and fine-tune their biological activities, and BMPs are highly regulated to generate cell- and context-dependent outcomes. Not all such instances can be explained yet. Growth/differentiation factor (GDF)5 (or BMP14) synergizes with BMP2 on chondrogenic ATDC5 cells, but antagonizes BMP2 on myoblastic C2C12 cells. Known regulators of BMP2/GDF5 signal transduction failed to explain this context-dependent difference, so a microarray was performed to identify new, cell-specific regulatory components. One identified candidate, the fibroblast growth factor receptor (FGFR)2, was analyzed as a potential new co-receptor to BMP ligands such as GDF5: It was shown that FGFR2 directly binds BMP2, GDF5, and other BMP ligands in vitro, and FGFR2 was able to positively influence BMP2/GDF5-mediated signaling outcome in cell-based assays. This effect was independent of FGFR2s kinase activity, and independent of the downstream mediators SMAD1/5/8, p42/p44, Akt, and p38. The elevated colocalization of BMP receptor type IA and FGFR2 in the presence of BMP2 or GDF5 suggests a signaling complex containing both receptors, akin to other known co-receptors of BMP ligands such as repulsive guidance molecules. This unexpected direct interaction between FGF receptor and BMP ligands potentially opens a new category of BMP signal transduction regulation, as FGFR2 is the second receptor tyrosine kinase to be identified as BMP co-receptor, and more may follow. The integration of cell surface interactions between members of the FGF and BMP family especially may widen the knowledge of such cellular communication mechanisms which involve both growth factor families, including morphogen gradients and osteogenesis, and may in consequence help to improve treatment options in osteochodnral diseases. N2 - Bone morphogenetic proteins (BMPs) sind oft an interzellulärer Kommunikation beteiligt. Sie sind Morphogene, spielen eine Rolle in der Differenzierung von zahlreichen Zelltypen aus verschiedenen Vorgängerzellen während der Entwicklung, und sind an vielen weiteren Beispielen der Zell-Zell-Kommunikation beteiligt: von der Formation einer Körperachse bis hin zur Heilung von Knochenbrüchen, vom Zuckermetabolismus bis zur Angiogenese. Wann immer dasselbe Protein oder dieselbe Proteinfamilie so viele Funktionen erfüllt, bedarf es der Regulation und Feinabstimmung ihrer diversen biologischen Aktivitäten, und BMPs sind zu dem Erzielen zell- und kontextspezifischer Effekte in ihrer Wirkung entsprechend stark reguliert. Nicht in allen Fällen sind die Mechanismen solcher Regulation bisher bekannt. Growth/differentiation factor (GDF)5 (oder BMP14) agiert mit BMP2 auf den chondrogenen ATDC5 Zellen synergistisch, aber antagonisiert BMP2 auf den myoblastischen C2C12 Zellen. Diese kontextabhängige Diskrepanz konnte mithilfe der bekannten Regulatoren von BMP2/GDF5-mediierten Signalen nicht erklärt werden. Daher wurde ein Microarray durchgeführt, um neue, zellspezifische regulatorische Proteine zu identifizieren. Einer der identifizierten Kandidaten, fibroblast growth factor receptor (FGFR)2, wurde auf eine potentielle Funktion als neuer Korezeptor für BMP Liganden wie GDF5 analysiert: Es konnte gezeigt werden, dass FGFR2 BMP2, GDF5 und andere BMP Liganden in vitro direkt binden und die biologische Aktivität von BMP2 und GDF5 in Zellkultursystemen positiv beeinflussen konnte. Diese Beobachtungen waren unabhängig von der Kinaseaktivität des FGFR2, und unabhängig von den intrazellulären Mediatoren SMAD1/5/8, p42/p44, Akt und p38. Die erhöhte Kolokalisation von FGFR2 mit dem BMP Rezeptor IA in der Präsenz von BMP2 oder GDF5 weist darauf hin, dass der entsprechende Signalkomplex möglicherweise beide Rezeptoren gleichzeitig enthält; ähnlich, wie das für andere bekannte Korezeptoren von BMP Liganden wie etwa den repulsive guidance molecules der Fall ist. Die unerwartete direkte Interaktion von einem FGF Rezeptor mit BMP-Liganden ist möglicherweise nur ein Beispiel für einen generelleren Mechanismus. Tatsächlich ist FGFR2 bereits die zweite Rezeptortyrosinkinase, die als BMP-Korezeptor identifiziert wurde, und es ist möglich, dass es noch mehr gibt. Speziell im Bezug auf die FGF-BMP Interaktion bergen die hier dargestellten Ergebnisse Potential zu neuen Erkenntnissen. Die Proteinfamilien dieser beiden Wachstumsfaktoren sind häufiger an demselben zellulären Mechanismen beteiligt; etwa an der Entstehung von Morphogengradienten in der Entwicklung oder an der Osteogenese. Die Interaktion der FGF und BMP Proteinfamilien auf der Zelloberfläche könnte eine wertvolle Ergänzung zu der Untersuchung ihres Zusammenspiels im Zellinneren sein, und könnte in diesem Zusammenhang sogar langfristig die Behandlungsmöglichkeiten von osteochondralen Erkrankungen erweitern. KW - Molekularbiologie KW - FGF signaling KW - BMP signaling Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-192889 ER - TY - THES A1 - Alzheimer, Mona T1 - Development of tissue-engineered three-dimensional infection models to study pathogenesis of \(Campylobacter\) \(jejuni\) T1 - Entwicklung dreidimensionaler Infektionsmodelle basierend auf Gewebezüchtung zur Erforschung der Pathogenese von \(Campylobacter\) \(jejuni\) N2 - Infectious diseases caused by pathogenic microorganisms are one of the largest socioeconomic burdens today. Although infectious diseases have been studied for decades, in numerous cases, the precise mechanisms involved in the multifaceted interaction between pathogen and host continue to be elusive. Thus, it still remains a challenge for researchers worldwide to develop novel strategies to investigate the molecular context of infectious diseases in order to devise preventive or at least anti-infective measures. One of the major drawbacks in trying to obtain in-depth knowledge of how bacterial pathogens elicit disease is the lack of suitable infection models to authentically mimic the disease progression in humans. Numerous studies rely on animal models to emulate the complex temporal interactions between host and pathogen occurring in humans. While they have greatly contributed to shed light on these interactions, they require high maintenance costs, are afflicted with ethical drawbacks, and are not always predictive for the infection outcome in human patients. Alternatively, in-vitro two-dimensional (2D) cell culture systems have served for decades as representatives of human host environments to study infectious diseases. These cell line-based models have been essential in uncovering virulence-determining factors of diverse pathogens as well as host defense mechanisms upon infection. However, they lack the morphological and cellular complexity of intact human tissues, limiting the insights than can be gained from studying host-pathogen interactions in these systems. The focus of this thesis was to establish and innovate intestinal human cell culture models to obtain in-vitro reconstructed three-dimensional (3D) tissue that can faithfully mimic pathogenesis-determining processes of the zoonotic bacterium Campylobacter jejuni (C. jejuni). Generally employed for reconstructive medicine, the field of tissue engineering provides excellent tools to generate organ-specific cell culture models in vitro, realistically recapitulating the distinctive architecture of human tissues. The models employed in this thesis are based on decellularized extracellular matrix (ECM) scaffolds of porcine intestinal origin. Reseeded with intestinal human cells, application of dynamic culture conditions promoted the formation of a highly polarized mucosal epithelium maintained by functional tight and adherens junctions. While most other in-vitro infection systems are limited to a flat monolayer, the tissue models developed in this thesis can display the characteristic 3D villi and crypt structure of human small intestine. First, experimental conditions were established for infection of a previously developed, statically cultivated intestinal tissue model with C. jejuni. This included successful isolation of bacterial colony forming units (CFUs), measurement of epithelial barrier function, as well as immunohistochemical and histological staining techniques. In this way, it became possible to follow the number of viable bacteria during the infection process as well as their translocation over the polarized epithelium of the tissue model. Upon infection with C. jejuni, disruption of tight and adherens junctions could be observed via confocal microscopy and permeability measurements of the epithelial barrier. Moreover, C. jejuni wildtype-specific colonization and barrier disruption became apparent in addition to niche-dependent bacterial localization within the 3D microarchitecture of the tissue model. Pathogenesis-related phenotypes of C. jejuni mutant strains in the 3D host environment deviated from those obtained with conventional in-vitro 2D monolayers but mimicked observations made in vivo. Furthermore, a genome-wide screen of a C. jejuni mutant library revealed significant differences for bacterial factors required or dispensable for interactions with unpolarized host cells or the highly prismatic epithelium provided by the intestinal tissue model. Elucidating the role of several previously uncharacterized factors specifically important for efficient colonization of a 3D human environment, promises to be an intriguing task for future research. At the frontline of the defense against invading pathogens is the protective, viscoelastic mucus layer overlying mucosal surfaces along the human gastrointestinal tract (GIT). The development of a mucus-producing 3D tissue model in this thesis was a vital step towards gaining a deeper understanding of the interdependency between bacterial pathogens and host-site specific mucins. The presence of a mucus layer conferred C. jejuni wildtype-specific protection against epithelial barrier disruption by the pathogen and prevented a high bacterial burden during the course of infection. Moreover, results obtained in this thesis provide evidence in vitro that the characteristic corkscrew morphology of C. jejuni indeed grants a distinct advantage in colonizing mucous surfaces. Overall, the results obtained within this thesis highlight the strength of the tissue models to combine crucial features of native human intestine into accessible in-vitro infection models. Translation of these systems into infection research demonstrated their ability to expose in-vivo like infection outcomes. While displaying complex organotypic architecture and highly prismatic cellular morphology, these tissue models still represent an imperfect reflection of human tissue. Future advancements towards inclusion of human primary and immune cells will strive for even more comprehensive model systems exhibiting intricate multicellular networks of in-vivo tissue. Nevertheless, the work presented in this thesis emphasizes the necessity to investigate host-pathogen interactions in infection models authentically mimicking the natural host environment, as they remain among the most vital parts in understanding and counteracting infectious diseases. N2 - In der heutigen Zeit tragen insbesondere durch pathogene Mikroorganismen ausgelöste Infektionskrankheiten zur sozioökonomischen Belastung bei. Obwohl bereits jahrzehntelang an der Entstehung von Infektionskrankheiten geforscht wird, bleiben in zahlreichen Fällen die genauen Mechanismen, welche an den vielfältigen Interaktionen zwischen Pathogen und Wirt beteiligt sind, unbeschrieben. Gerade deshalb bleibt es für Wissenschaftler weltweit eine Herausforderung, neue Strategien zur Untersuchung des molekularen Kontexts von Infektionskrankheiten zu entwickeln, um präventive oder zumindest anti-infektive Maßnahmen ergreifen zu können. In den meisten Fällen ist jedoch das Fehlen geeigneter Infektionsmodelle, mit denen der Krankheitsverlauf im Menschen authentisch nachgestellt werden kann, eines der größten Hindernisse um detailliertes Wissen darüber gewinnen zu können wie bakterielle Pathogene die Krankheit auslösen. Zahlreiche Studien sind dabei auf Tiermodelle angewiesen, um die komplexen zeitlichen Abläufe zwischen Wirt und Pathogen im menschlichen Körper nachzuahmen. Während diese Modelle in hohem Maß dazu beigetragen haben, Aufschluss über diese Abläufe zu geben, sind sie doch sehr kostenintensiv, mit ethischen Bedenken behaftet und können nicht immer die Folgen einer Infektion im menschlichen Patienten vorhersagen. Seit Jahrzehnten werden daher alternativ in-vitro 2D Zellkultursysteme eingesetzt, um den Verlauf von Infektionskrankheiten zu erforschen, welche die Bedingungen im menschlichen Wirt wiederspiegeln sollen. Diese auf Zelllinien basierenden Modelle sind essentiell in der Entdeckung von Virulenzfaktoren diverser Pathogene, aber auch in der Aufklärung von wirtsspezifischen Abwehrmechanismen. Dennoch fehlt ihnen die morphologische und zelluläre Komplexität von intaktem menschlichen Gewebe. Dadurch sind die Erkenntnisse, die mit diesen Systemen über Infektionsverläufe gewonnen werden können, limitiert. Die vorgelegte Arbeit konzentriert sich auf die Etablierung und Weiterentwicklung intestinaler, humaner Zellkulturmodelle, um dreidimensionales Gewebe in vitro zu rekonstruieren mit dem Ziel, Pathogenese-beeinflussende Prozesse des zoonotischen Bakteriums C. jejuni nachzustellen. Das Fachgebiet der Gewebezüchtung wird üblicherweise für rekonstruktive Medizin eingesetzt und bietet exzellente Mittel zur in-vitro Herstellung organspezifischer Zellkulturmodelle, welche die unverkennbare Mikroarchitektur humanen Gewebes realistisch nachempfinden können. Die in dieser Arbeit verwendeten Modelle basieren auf einem extrazellulären Matrixgerüst, das aus der Dezellularisierung von Schweinedarm gewonnen wurde. Durch die Wiederbesiedelung mit human Kolonzellen und der Kultivierung unter dynamischen Bedingungen entwickelte sich ein hochpolarisiertes mucosales Epithel, das durch funktionale Zell-Zell-Kontakte (tight und adherens junctions) aufrechterhalten wird. Während andere in-vitro Infektionssysteme meist durch die Präsenz einer flachen Zellschicht limitiert werden, entwickelt das in dieser Arbeit eingeführte Gewebemodell die für den menschlichen Dünndarm charakteristische Architektur aus Villi und Krypten. Zunächst wurden experimentelle Bedingungen für die Infektion eines zuvor entwickelten, statisch kultivierten Dünndarmmodells mit C. jejuni etabliert. Dies beinhaltete die erfolgreiche Isolierung koloniebildender Einheiten, die Messung der epithelialen Barrierefunktion, sowie immunhistochemische und histologische Färbetechniken. Dadurch konnte die Anzahl der Bakterien sowie deren Translokalisierung über das polarisierte Epithel während des Infektionsprozesses nachvollzogen werden. Außerdem konnte die Beeinträchtigung von Zell-Zell-Kontakten durch konfokale Mikroskopie und Permeabilitätsmessungen der epithelialen Barriere beobachtet werden. Neben der Bestimmung der Kolonisierungsrate von C. jejuni Isolaten und der dadurch hervorgerufenen spezifischen Zerstörung der epithelialen Barriere konnten die Bakterien auch innerhalb der 3D Mikroarchitektur des Gewebemodells lokalisiert werden. Außerdem konnte im Rahmen der 3D Gewebeumgebung beobachtet werden, dass Pathogenese-relevante Phänotypen von C. jejuni Mutantenstämmen im Vergleich zu konventionellen in-vitro 2D Zellschichten abwichen, diese aber dafür mit den in-vivo gemachten Beobachtungen übereinstimmten. Darüber hinaus wies die genomweite Suche einer C. jejuni Mutantenbibliothek signifikante Unterschiede zwischen bakteriellen Faktoren, die für die Interaktion mit nicht polarisierten Wirtszellen oder dem hochprismatischen Epithel des Gewebemodells bedeutsam oder entbehrlich waren, auf. Die Aufklärung der Funktion einiger bisher nicht charakterisierter Faktoren, die zu einer effizienten Kolonisierung menschlichen Gewebes beitragen, verspricht eine faszinierende Aufgabe für die zukünftige Forschung zu werden. Die vorderste Verteidigungslinie gegen eindringende Pathogene bildet die schützende, viskoelastische Mukusschicht, die mukosale Oberflächen entlang des menschlichen Gastrointestinaltrakts überzieht. Mit der Entwicklung eines mukusproduzierenden Gewebemodells in der hier vorgelegten Arbeit gelang ein entscheidender Schritt zur Erforschung der Wechselbeziehungen zwischen bakteriellen Pathogenen und wirtsspezifischen Muzinen. Während des Infektionsverlaufs wurde das unterliegende Epithel durch die Anwesenheit der Mukusschicht vor der Zerstörung durch die Mikroben geschützt und eine erhöhte bakterielle Belastung verhindert. Darüber hinaus liefern die Resultate dieser Arbeit einen in-vitro Nachweis für den bakteriellen Vorteil einer spiralförmigen Morphologie, um muköse Oberflächen zu besiedeln. Zusammenfassend unterstreicht diese Arbeit das Potential der hier entwickelten Gewebemodelle, entscheidende Eigenschaften des menschlichen Darms in einem leicht zugänglichen in-vitro Infektionsmodell zu vereinigen. Der Einsatz dieser Modelle im Rahmen der Infektionsforschung bewies deren Fähigkeit in-vivo beobachtete Infektionsverläufe widerzuspiegeln. Während diese Infektionsmodelle bereits organotypische Architektur und hochprismatische Zellmorphologie aufweisen, ist ihre Darstellung von menschlichem Gewebe noch nicht perfekt. Durch den Einsatz von humanen Primär- und Immunzellen wird es in Zukunft möglich sein, noch umfassendere Modellsysteme zu entwickeln, die komplexe multizelluläre Netzwerke von in-vivo Geweben aufweisen. Nichtsdestotrotz verdeutlicht die hier vorgelegte Arbeit wie wichtig es ist, die Interaktionen zwischen Wirt und Pathogen innerhalb von Infektionsmodellen zu erforschen, welche die natürliche Wirtsumgebung wiedergeben. Dies spielt eine entscheidende Rolle, um die Entstehung von Infektionskrankheiten nachvollziehen und ihnen entgegenwirken zu können. KW - Campylobacter jejuni KW - Tissue Engineering KW - Small RNA KW - 3D tissue model KW - Bacterial infection KW - 3D Gewebemodelle KW - Bakterielle Infektion KW - 3D cell culture KW - Infection models Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-193440 ER - TY - THES A1 - Schmidt, Sebastian T1 - A closer look at long-established drugs: enantioselective protein binding and stability studies T1 - Lang-etablierte Arzneistoffe genauer unter die Lupe genommen: Enantioselektive Proteinbindung und Stabilitätsstudien N2 - The aim of this work was to investigate older, established drugs. The extent of the protein binding of chiral ephedra alkaloids to AGP and of ketamine to albumin was determined. Since enantiomers of these drugs are individual available, the focus was on possible enantioselective binding and structural moieties involved in the binding. Previously published work suggested that ephedrine and pseudoephedrine can bind stereoselectively to proteins other than albumin in serum. For the determination of the extent of protein binding, the established ultrafiltration with subsequent chiral CE analysis was used. To determine the influence of basicity on binding, the drugs methylephedrine and norephedrine were also analyzed. Drug binding to AGP increased with increasing basicity as follows: norephedrine < methylephedrine < ephedrine < pseudoephedrine. pKaff was determined both graphically using the Klotz plot and mathematical indicating a low affinity of the ephedra alkaloids to AGP. Using STD-NMR spectroscopy experiments the aromatic protons and the C-CH3 side chain were shown to be most strongly involved in binding, which could be confirmed by molecular docking experiments in more detail. For all drugs, van der Waals-, π π , cationic interactions, hydrogen bonds, and a formation of a salt bridge were observed. The individual enantiomers showed no significant differences and thus the binding of ephedra alkaloids to AGP is not significant. In contrast to the ephedra alkaloids, the possible enantioselective binding to albumin was investigated for R and S ketamine. Again, ultrafiltration followed by CE analysis was performed. The binding of ketamine to one main binding site could be identified. A non-linear fit was used for the determination of pKaff. Using the NMR methods STD-NMR, waterLOGSY-NMR, and CPMG-NMRspectroscopy: the aromatic protons as well as the protons of the NCH3 methyl group showed the largest signal intensity changes, while the cyclohexanone protons showed the smallest changes. pKaff was also determined by the change in the chemical shift at different drug-protein ratios. These obtained values confirm the values obtained from ultrafiltration. Based on this, ketamine is classified as a low-affinity ligand to albumin. There were no significant differences between the individual enantiomers and thus the binding of ketamine to albumin is not a stereoselective process. Using statistical design of experiments an efficient chiral CE method for determining the extent of protein binding of R and S ketamine to albumin was developed and validated according to ICH Q2 (R1) guideline. The stability of ketamine was also investigated because a yellowish discoloration of an aqueous solution of ketamine developed under heat. XRPD investigations showed the same crystal structure for all batches examined. An untargeted screening using LC HRMS as well as LC UV measurements showed no degradation of ketamine or the presence of impurities in stress and non-stressed ketamine solutions, confirming the stability of ketamine under the stress conditions investigated. The lower the quality of the water used in the stress tests, the more intense the yellow discoloration occurred. The impurity or the mechanism that causes the yellow discoloration could not be identified. N2 - Ziel dieser Arbeit war es ältere, etablierte Arzneistoffe zu untersuchen. Das Ausmaß der Proteinbindung von chiralen Ephedra-Alkaloiden an AGP und von Ketamin an Albumin wurde bestimmt. Da Enantiomere dieser Wirkstoffe individuell verfügbar sind, lag der Fokus auf möglichen enantioselektiven Bindungen und strukturellen Funktionalitäten, die an der Bindung beteiligt sind. Zuvor veröffentlichte Arbeiten deuteten darauf hin, dass Ephedrin und Pseudoephedrin stereoselektiv an andere Proteine als Albumin im Serum binden können. Zur Bestimmung des Ausmaßes der Proteinbindung wurde die etablierte Ultrafiltration mit anschließender chiraler CE-Analyse eingesetzt. Um den Einfluss der Basizität auf die Bindung zu bestimmen, wurden auch die Wirkstoffe Methylephedrin und Norephedrin analysiert. Die Bindung des Wirkstoffs an AGP nahm mit zunehmender Basizität wie folgt zu: Norephedrin < Methylephedrin < Ephedrin < Pseudoephedrin. pKaff wurde sowohl grafisch mit Hilfe des Klotz-Plots als auch mathematisch bestimmt, was auf eine geringe Affinität der Ephedra-Alkaloide zu AGP hinweist. Mittels STD-NMR Spektroskopie Experimenten konnte gezeigt werden, dass die aromatischen Protonen und die C-CH3-Seitenkette am stärksten an der Bindung beteiligt sind, was durch molekulare Docking-Experimente detailliert bestätigt werden konnte. Für alle Wirkstoffe wurden van-der-Waals-, π π , kationische Wechselwirkungen, Wasserstoffbrückenbindungen und die Bildung einer Salzbrücke beobachtet. Die einzelnen Enantiomere zeigten keine signifikanten Unterschiede, so dass die Bindung von Ephedra-Alkaloiden an AGP nicht signifikant ist. Im Gegensatz zu den Ephedra-Alkaloiden wurde die mögliche enantioselektive Bindung an Albumin für R und S Ketamin untersucht. Auch hier wurde eine Ultrafiltration mit anschließender CE-Analyse durchgeführt. Die Bindung von Ketamin an eine Hauptbindungsstelle konnte identifiziert werden. Für die Bestimmung von pKaff wurde eine nichtlineare Anpassung verwendet. Mit den NMR-Methoden STD-NMR, waterLOGSY NMR und CPMG-NMR Spektroskopie zeigten sowohl die aromatischen Protonen als auch die Protonen der NCH3-Methylgruppe die größten Änderungen der Signalintensität, während die Cyclohexanon-Protonen die geringsten Änderungen afuwiesen. pKaff wurde auch durch die Änderung der chemischen Verschiebung bei verschiedenen Wirkstoff-Protein-Verhältnissen bestimmt. Die Werte bestätigen die durch die Ultrafiltration erhaltenen Werte. Auf dieser Grundlage wird Ketamin als Ligand mit niedriger Affinität zu Albumin eingestuft. Es zeigten sich keine signifikanten Unterschiede zwischen den einzelnen Enantiomeren und somit ist die Bindung von Ketamin an Albumin kein stereoselektiver Prozess. Mit Hilfe der statistischen Versuchsplanung wurde eine effiziente chirale CE-Methode zur Bestimmung des Ausmaßes der Proteinbindung von R und S Ketamin an Albumin entwickelt und gemäß der ICH Q2 (R1) Richtlinie validiert. Die Stabilität von Ketamin wurde ebenfalls untersucht, da sich unter Hitze eine gelbliche Verfärbung einer wässrigen Ketaminlösung entwickelte. XRPD-Untersuchungen zeigten für alle untersuchten Chargen die gleiche Kristallstruktur. Ein nicht zielgerichtetes Screening mittels LC HRMS sowie LC UV-Messungen zeigte keinen Abbau von Ketamin oder das Vorhandensein von Verunreinigungen in Stress- und nicht gestressten Ketaminlösungen, was die Stabilität von Ketamin unter den untersuchten Bedingungen bestätigt. Je schlechter die Qualität des in den Stresstests verwendeten Wassers war, desto intensiver trat die Gelbverfärbung auf. Die Verunreinigung oder der Mechanismus, der die gelbe Verfärbung verursacht, konnte nicht identifiziert werden. KW - Proteinbindung KW - Ephedrin KW - Ketamin KW - Stabilitätsstudien KW - Arzneistoffanalytik KW - Enantioselektivität Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-345945 ER - TY - THES A1 - Spitzel, Marlene T1 - The impact of inflammation, hypoxia, and vasculopathy on pain development in the α-galactosidase A mouse model of Morbus Fabry T1 - Der Einfluss von Inflammation, Hypoxie und Vaskulopathie auf die Schmerzentwicklung des Morbus Fabry-spezifischen α-Galaktosidase A Mausmodells N2 - Fabry disease (FD), an X-linked lysosomal storage disorder, is caused by variants in the gene α-galactosidase A (GLA). As a consequence, the encoded homonymous enzyme GLA is not produced in sufficient amount or does not function properly. Subsequently, globotriaosylceradmide (Gb3), the target substrate of GLA, starts accumulating in several cell types, especially neurons and endothelial cells. FD patients suffer from multiorgan symptoms including cardiomyopathy, nephropathy, stroke, and acral burning pain. It is suggested that the impact of pathological Gb3 accumulation, inflammatory and hypoxic processes, and vasculopathy are contributing to the specific FD pain phenotype. Thus, we investigated the role of inflammation, hypoxia, and vasculopathy on molecular level in dorsal root ganglia (DRG) of the GLA knockout (KO) mouse model. Further, we investigated pain-like characteristics of GLA KO mice at baseline (BS), after capsaicin administration, and after repeated enzyme replacement therapy (ERT) administration for a period of 1.5 years. Acquired data showed disturbances in immune response markers represented by downregulated inflammation-associated genes and lower numbers of CD206+ macrophages in DRG of GLA KO mice. Hypoxic mechanisms were active in DRG of GLA KO mice reflected by increased gene expression of hypoxia- and DNA damage-associated targets, higher numbers of hypoxia-inducible factor 1α-positive (HIF1α+) and carbonic anhydrase 9-positive (CA9+) neurons in DRG of GLA KO mice, and DRG neuronal HIF1α cytosolic-nuclear translocation in GLA KO mice. Vascularization in DRG of GLA KO mice was reduced including lower numbers of blood vessel branches and reduced total blood vessel length. Pain-like behavior of the GLA KO mouse model revealed no mechanical hypersensitivity at BS but age-dependent heat hyposensitivity, which developed also age-matched wild type (WT) mice. Capsaicin administration under isoflurane anesthesia did not elicit the development of nocifensive behavior in GLA KO mice after mechanical or heat stimulation. Repeated ERT administration did not show a clear effect in GLA KO mice in terms of restored heat hyposensitivity to BS paw withdrawal latencies. In summary, we demonstrated the impact of disturbed immune response markers, active hypoxic mechanisms, and reduced vascularization on molecular FD pathophysiology. N2 - Morbus Fabry (M. Fabry oder Fabry disease, FD) ist eine X-chromosomal vererbte, lysosomale Speichererkrankung, die durch Varianten im Gen α-Galaktosidase A (GLA) verursacht wird. Das durch GLA kodierte gleichnamige Enzym GLA kann somit nicht in ausreichender Menge produziert werden oder erhält nicht die volle Funktionalität. Als Folge akkumuliert das Glykosphingolipid Globotriaosylceramid (Gb3), welches das Zielsubstrat von GLA ist und durch dieses Enzym normalerweise abgebaut wird. Gb3 Akkumulationen sind in verschiedenen Zelltypen zu finden, jedoch bevorzugt in Neurone und Endothelzellen. FD-Patienten leiden unter Symptome, die verschiedene Organe betreffen, insbesondere Kardiomyopathien, Nephropathien, Schlaganfälle, und brennende Schmerzen in den Extremitäten. Es wird vermutet, dass neben dem pathologischen Einfluss der Gb3 Ablagerungen auch inflammatorische und hypoxische Prozesse und Vaskulopathien zum spezifischen FD-Schmerzphänotyps beitragen. Daher wurde die Rolle der Inflammation, Hypoxie und Vaskulopathie auf molekularer Ebene in Spinalganglien (dorsal root ganglion, DRG) eines FD-spezifischen GLA knockout (KO) Mausmodells untersucht. Des Weiteren wurde der Schmerz-ähnliche Phänotyp in GLA KO Mäusen unter nativen Bedingungen, nach Capsaicingabe und unter Enzymersatztherapie (enzyme replacement therapy, ERT) während einer Dauer von 1,5 Jahren untersucht. Unsere erhobenen Daten zeigten eine Beeinträchtigung von Faktoren der Immunantwort, die sich durch herunterregulierter Genexpression Inflammations-assoziierter Gene und einer geringeren Anzahl an CD206+ Makrophagen in DRG von GLA KO Mäusen nachweisen ließ. Zu aktiven Hypoxiemechanismen trugen eine hochregulierte Genexpression Hypoxie- und DNA-Schäden-assoziierter Gene, eine höhere Anzahl an hypoxia-inducible factor 1α-positiver (HIF1α+) und carbonic anhydrase 9-positiver (CA9+) Neurone in DRG von GLA KO Mäusen, und die DRG neuronale HIF1α Translokation zwischen Zytosol und Nukleus bei. Die Vaskularisierung der DRG in GLA KO Mäusen war reduziert zusätzlich zu der geringeren Anzahl an Blutgefäßverzweigungen und einer Reduzierung der gesamten Blutgefäßlänge. Die Untersuchungen des nativen Schmerz-ähnlichen Verhaltens der GLA KO Mäuse zeigte keine Entwicklung mechanischer Hypersensitivität, während sich eine Hitzehyposensitivität mit steigendem Alter der Tiere entwickelte, die sich auch in altersangepassten Wildtyp (WT) Mäusen zeigte. Eine Capsaicingabe unter Isoflurannarkose zeigte keine erhöhte Sensitivität der GLA KO Mäuse nach mechanischer oder Hitzestimulation. Wiederholte ERT-Gaben zeigten keine Verbesserung der Hitzehyposensitivität auf ein natives Niveau der Pfotenrückzuglatenz. Wir konnten den Einfluss beeinträchtigter Faktoren der Immunantwort, aktiver Hypoxieprozesse und reduzierter Vaskularisierung in DRG von GLA KO Mäusen auf die molekulare FD-Pathophysiologie zeigen. KW - Fabry disease KW - GLA KO mouse model KW - molecular mechanism KW - Fabry-Krankheit KW - Morbus Fabry Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-345794 ER - TY - THES A1 - Rüttger, Lennart T1 - Regulatory T cells limit antiviral CD8 T cell responses through IL-2 competition T1 - Regulatorische T-Zellen limitieren antivirale CD8 T-Zellantworten durch IL-2 Konkurrenz N2 - Regulatory T cells (Treg) are critical immune cells to ensure immune homeostasis. Treg do so by establishing tolerance to self-antigens as well as food-derived antigens. Additionally, they fine-tune immune responses to limit the damage caused by inevitable inflammation during the resolution of an ongoing infection or anti-tumor response. Despite countless efforts to gain a detailed understanding of the mechanisms Treg utilize to regulate adaptive immune responses, in vivo evidence is rather limited. We were interested in the cell-cell interactions of Treg and their spatio-temporal dynamics during a viral infection. We sought to address Interleukin-2 (IL-2) competition as a viable mechanism to control anti-viral CD8 T cell responses. We used intra-vital 2-photon imaging to analyze the interactions between Treg and activated T cells during viral infection. Additionally, we performed multiple loss- and gain-of-function experiments, addressing the IL-2 active signaling of CD8, CD4, and regulatory T cells to understand the competitive sensing of IL-2. Finally, we performed single-cell RNA sequencing to understand the cell-intrinsic differences in Treg caused by infection. We found that IL-2 competition by Treg limits the CD8 T cell response and can alter the differentiation of CD8 T cells. Furthermore, we show that Treg do not arrest in proximity to CD8 T cells for prolonged periods and therefore are unlikely to regulate CD8 T cells via contact-dependent mechanisms previously proposed. Our data support an area control model in which Treg scavenge IL-2 while actively migrating through the LN, constantly limiting access to IL-2. Establishing CD4 T cells as the major source of IL-2 during the later phases of infection, we provide direct evidence that Treg compete with CD8 T cells for CD4-derived IL-2. Finally, we show that IL-2 limitation is in correlation with CD25 expression levels and has an impact on the differentiation of CD8 T cells. Altering the differentiation of CD8 T cells to increase effector or memory functions has huge implications in clinical treatments, e.g ’checkpoint immunotherapy’. Especially in scenarios like checkpoint immunotherapy, where an efficient expansion of CD8 T cells is vital to the success of the treatment, it is invaluable to understand the spatio-temporal dynamics of Treg. Not only can the expansion phase be optimized, but also side effects can be better controlled by ensuring the adequate timing of treatments and boosting the anti-inflammatory response after the initial establishment of CD8 T cells. On top of this, the gained understanding of the regulatory mechanism of Treg can help to enhance the efficacy of autoimmune disorder treatments. Overall, this study addressed highly relevant questions in the Treg field and answered aspects of Treg regulation, refining their mode of action and the spatio-temporal dynamics during viral infection, providing evidence for IL-2 competition as a major regulatory mechanism controlling antiviral CD8 T cell responses. N2 - Regulatorische T Zellen (Treg) sind wichtige Immunzellen die der Aufrechterhaltung der Homöostase dienen. Sie induzieren tolerogene Immunantworten gegenüber Antigenen des eigenen Körpers und erlauben uns die Aufnahme von harmlosen ’Fremdantigenen’ aus unserer Nahrung, indem Sie unerwünschte Immunantworten unterdrücken. Zusätzlich ermöglichen Treg eine Feinabstimmung der adaptiven Immunantwort, indem sie die Entzündungsreaktion und die damit einhergehende Gewebeschädigung minimieren, zeitgleich aber die Expansion von Effektorzellen angepasst an das Infektionsgeschehen erlauben. So kann der Erreger schnellstmöglich bekämpft werden, ohne dass die Integrität des Gewebes beeinträchtigt wird und die Gewebefunktion aufrechterhalten werden kann. Viele wissenschaftliche Studien haben sich bereits mit den Regulationsmechanismen von Treg beschäftigt. Es werden heutzutage unzählige Mechanismen beschrieben, die in den meisten Fällen jedoch auf Ergebnissen aus Zellkulturexperimenten beruhen und somit häufig unzureichend belegt sind. Aus diesem Grund wollten wir sowohl das zeitliche als auch räumliche Verhalten von regulatorischen T Zellen im Laufe einer viralen Infektion genauer untersuchen und dabei vor allem Zell-Zell Interaktionen analysieren. Besonderes Augenmerk lag dabei auf dem zuvor beschriebenen Mechanismus der Interleukin-2 (IL-2) Konkurrenz. Dieser zeichnet sich dadurch aus, dass regulatorische T Zellen IL-2, ein wichtiges Zytokin für das Überleben von Effektorzellen, aufnehmen und somit die vorhandene Menge an IL-2 beeinflussen können. Dies geschieht in ständiger Konkurrenz zu Zellen der adaptiven Immunantwort. Wir haben Zell-Zell Interaktionen von Treg mit ihren potenziellen Konkurrenten mithilfe von intravitaler Mikroskopie, im Laufe einer viralen Infektion untersucht. Außerdem haben wir verschiedene ’gain’-und ’loss-of-function’ Experimente durchgeführt, um die IL-2 Konkurrenz zwischen CD8, CD4 und regulatorischen T Zellen besser verstehen zu können. Zusätzlich haben wir das Transkriptom von Treg in zwei verschiedenen Kontexten, Infektion und Homöostase, mittels einer Einzelzellanalyse miteinander verglichen. Wir konnten zeigen, dass Treg dazu in der Lage sind antivirale T Zellantworten allein durch IL-2 Konkurrenz zu modulieren. Hierbei wird nicht nur die Anzahl, sondern auch die Differenzierung von zytotoxischen T Zellen beeinflusst. Dabei haben wir festgestellt, dass Treg während der Immunantwort in Lymphknoten migratorisch aktiv bleiben und keine langen (> 15 min) Zell-Zell Interaktionen mit aktivierten CD8 T Zellen oder dendritischen Zellen eingehen. Dies deutet auf einen primär kontaktunabhängigen Regulationsmechanismus bei der Steuerung von antiviralen T Zellantworten hin. Abschließend konnten wir zeigen, dass CD8 T Zellen während ihrer Expansionsphase stark auf von CD4 T Zellen produziertes IL-2 angewiesen sind. CD4 T Zellen stellen in dieser Phase der Infektion die Hauptquelle von IL-2 dar. So können Treg den Zugang von CD8 T Zellen zu der Hauptquelle von IL-2 räumlich soweit begrenzen, dass dies die Expansion und Differenzierung der CD8 T Zellpopulation nachhaltig beeinflusst. Diese Studie beantwortet relevante Fragen zur Funktionsweise von regulatorischen T Zellen während einer viralen Infektion und zeigt vor allem die räumlichen und zeitlichen Komponenten der Regulation im Detail auf. Diese Studie zeigt, dass IL-2 Konkurrenz einen Hauptregulationsmechanismus von regulatorischen T Zellen darstellen und CD8 T Zellantworten unabhängig regulieren kann. Dies ermöglicht die (Weiter-)Entwicklung und Präzisierung von klinischen Anwendungen und Therapieansätzen zur Bekämpfung von Krebs- und Autoimmunerkrankungen. Besonders für die Expansion von zytotoxischen T Zellen, welche bei der ’Checkpoint’ Immuntherapie zur Behandlung von soliden Tumoren von besonderer Bedeutung ist, ist das Verständnis der Funktionsweise von regulatorischen T Zellen für den Erfolg der Behandlung entscheidend. KW - Regulatorischer T-Lymphozyt KW - Interleukin 2 KW - Treg KW - IL-2 Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-296747 ER - TY - THES A1 - Kowalski, Alexander Anton T1 - Multi-orbital quantum phenomena: from magnetic impurities to lattice models with strong Hund's coupling T1 - Mehrorbital-Quantenphänomene: von magnetischen Störstellen zu Gittermodellen mit starker Hundscher Kopplung N2 - Strong correlations caused by interaction in systems of electrons can bring about unusual physical phenomena due to many-body quantum effects that cannot properly be captured by standard electronic structure methods like density functional theory. In this thesis, we apply the state-of-the-art continuous-time quantum Monte Carlo algorithm in hybridization expansion (CT-HYB) for the strongly correlated multi-orbital Anderson impurity model (AIM) to the solution of models of magnetic impurities on metallic surfaces and, via dynamical mean-field theory (DMFT), to the solution of a lattice model, the multi-orbital Hubbard model with Hund's coupling. A concise introduction to the theoretical background focuses on information directly relevant to the understanding of applied models, methods, and the interpretation of results. It starts with a discussion of the AIM with its parameters and its solution in the path integral formalism, the basis of the CT-HYB algorithm. We consider its derivation and implementation in some detail before reviewing the DMFT approach to correlated lattice models and the interpretation of the single-particle Green's function. We review two algorithmic developments for the CT-HYB algorithm that help to increase the performance of calculations especially in case of a complex structure of the interaction matrix and allow the precise calculation of self-energies and vertex functions also at intermediate and higher frequencies. Our comparative analysis of Kondo screening in the cobalt on copper impurity system points out the importance of an accurate interaction matrix for qualitatively correct Kondo temperatures and the relevance of all d-orbitals in that case. Theoretical modeling of cobalt impurities in copper "atomic wires" fails to reproduce variations and partial absence of Kondo resonances depending on the wire size. We analyze the dependence of results on parameters and consider possible reasons for the discrepancy. Different Kondo temperatures of iron adatoms adsorbed on clean or oxygen-reconstructed niobium in the normal state are qualitatively reproduced, with the adsorption distance identified as major factor and implications for the superconducting state pointed out. Moving on to lattice problems, we demonstrate the connection between Hund's coupling, shown to cause first-order character of the interaction-driven Mott transition at half-filling in the two-orbital Hubbard model, and a phase separation zone ending in a quantum critical point at finite doping. We touch on similarities in realistic models of iron-pnictide superconductors. We analyze the manifestation of the compressibility divergence at the finite-temperature critical points away from half-filling in the eigenbasis of the two-particle generalized susceptibility. A threshold for impurity susceptibility eigenvalues that indicates divergence of the DMFT lattice compressibility and distinguishes thermodynamic stability and instability of DMFT solutions is determined. N2 - Wechselwirkungsbedingt stark korrelierte Elektronensysteme können wegen Mehrteilcheneffekten ungewöhnliche Physik aufweisen, die Standardmethoden für elektronische Struktur wie die Dichtefunktionaltheorie nicht erfassen. Diese Dissertation handelt von der Anwendung des Quanten-Monte Carlo Algorithmus in kontinuierlicher Zeit mit Reihenentwicklung in der Hybridisierung (CT-HYB), aktuellster Stand der Technik für das stark korrelierte Anderson-Modell für Störstellen (AIM), auf magnetische Adatome auf Metalloberflächen und, im Rahmen der dynamischen Molekularfeldtheorie (DMFT), auf das Mehrorbital-Hubbard-Modell mit Hundscher Kopplung. Eine kurze Einführung fokussiert den für das Verständnis der Modelle, Methoden, und Interpretationen relevanten theoretischen Hintergrund. Sie beginnt mit dem AIM, seinen Parametern, und seiner Lösung im Pfadintegralformalismus, welche Grundlage des CT-HYB Algorithmus ist. Wir betrachten dessen Herleitung und Implementation im Detail, bevor wir einen Überblick über den DMFT-Zugang zu korrelierten Gittermodellen und die Interpretation der Einteilchen-Greenschen Funktion geben. Wir berichten von zwei algorithmischen Entwicklungen für CT-HYB, die helfen, die Geschwindigkeit der Rechnungen besonders in Fällen einer lokalen Wechselwirkung komplexer Form zu erhöhen und die präzise Berechnung von Selbstenergien und Vertexfunktionen auch bei mittleren und höheren Frequenzen erlauben. Unsere Analyse der Kondo-Abschirmung in Kobalt-Adatomen auf Kupfer weist auf die Bedeutung einer akkuraten Wechselwirkungsmatrix für korrekte Kondo-Temperaturen und die Relevanz aller d-Orbitale hin. Die Variation der Kondo-Resonanz von Kobalt in "atomaren Drähten" aus Kupfer mit der Anzahl der Atome kann unsere theoretische Modellierung nicht nachvollziehen. Wir untersuchen die Abhängigkeit der Ergebnisse von Parametern und diskutieren mögliche Ursachen. Kondo-Temperaturen von Eisen-Adatomen auf sauberer oder Sauerstoff-rekonstruierter Niob-Oberfläche werden im Normalzustand qualitativ reproduziert, der Adsorptionsabstand als wichtiger Faktor identifiziert, und auf die Folgen für den supraleitenden Zustand hingewiesen. Wir wenden uns dem Hubbard-Modell eines Gitters mit zwei Orbitalen pro Platz zu und zeigen den Zusammenhang zwischen Hundscher Kopplung, Ursache der Diskontinuität des Mott-Übergangs bei halber Füllung, und einer Phasenseparationszone endend in einem quantenkritischen Punkt bei endlicher Dotierung. Wir reißen Parallelen in realistischeren Eisenpniktid-Modellen an. Zuletzt sehen wir, wie sich die Kompressibilitätsdivergenz an den kritischen Punkten bei endlicher Temperatur abseits halber Füllung in den Eigenwerten der verallgemeinerten lokalen Suszeptibilität ausprägt und bestimmen für sie eine Schwelle, an der die DMFT-Gitterkompressibilität divergiert und deren Unterschreitung eine thermodynamisch instabile DMFT-Lösung anzeigt. KW - Starke Kopplung KW - Mott-Übergang KW - Kondo-Effekt KW - Dynamische Molekularfeldtheorie KW - Magnetische Störstelle KW - strong electronic correlations KW - Hubbard model KW - Anderson impurity model Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-345878 ER - TY - THES A1 - Brown, Helena Charlotte T1 - Investigating the role of the platelet receptor C-type lectin-like receptor 2 in models of thrombosis T1 - Untersuchungen zur Rolle des Thrombozytenrezeptors CLEC-2 (C- type lectin-like receptor 2) in Thrombosemodellen N2 - Platelets have a key physiological role in haemostasis however, inappropriate thrombus formation can lead to cardiovascular diseases such as myocardial infarction or stroke. Although, such diseases are common worldwide there are comparatively few anti-platelet drugs, and these are associated with an increased risk of bleeding. Platelets also have roles in thrombo-inflammation, immuno-thrombosis and cancer, in part via C-type lectin-like receptor 2 (CLEC-2) and its ligand podoplanin. Although CLEC-2 contributes to these diseases in mice, as well as to thrombus stability, it is unclear whether CLEC-2 has similar roles in humans, particularly as human CLEC-2 (hCLEC-2) cannot be investigated experimentally in vivo. To investigate hCLEC-2 in vivo, we generated a humanised CLEC-2 mouse (hCLEC-2KI) model, as well as a novel monoclonal antibody, HEL1, that binds to a different site than an existing antibody, AYP1. Using these antibodies, we have provided proof of principle for the use of hCLEC-2KI mice to test potential therapeutics targeting hCLEC-2, and shown for the first time that hCLEC-2 can be immunodepleted, with little effect on haemostasis. However, our results have also suggested that there are species differences in the role of CLEC-2 in arterial thrombosis. We further confirmed this using human blood where blocking CLEC-2 ligand binding had no effect on thrombosis, whereas we confirmed a minor role for mouse CLEC-2 in thrombus stability. We also investigated the effect of blocking CLEC-2 signalling using the Bruton’s tyrosine kinase inhibitor PRN473 on CLEC-2 mediated immuno-thrombosis in a Salmonella typhimurium infection model. However, no effect on thrombosis was observed suggesting that CLEC-2 signalling is not involved. Overall, our results suggest that there may be differences in the role of human and mouse CLEC-2, at least in arterial thrombosis, which could limit the potential of CLEC-2 as an anti-thrombotic target. However, it appears that the interaction between CLEC-2 and podoplanin is conserved and therefore CLEC-2 could still be a therapeutic target in immuno-thrombosis, thrombo-inflammation and cancer. Furthermore, any potential human specific therapeutics could be investigated in vivo using hCLEC-2KI mice. N2 - Thrombozyten sind ein wichtiger Bestandteil der Hämostase, können allerdings durch die Bildung eines Blutgerinnsels auch kardiovaskuläre Krankheitsbilder wie Myokardinfarkte oder Schlaganfälle hervorrufen. Obwohl diese Erkrankungen weltweit zu den führenden Todesursachen zählen, gibt es vergleichsweise wenig Thrombozyteninhibitoren und die bislang verfügbaren Wirkstoffe gehen mit einem erhöhten Blutungsrisiko einher. Darüber hinaus spielen Thrombozyten auch bei thrombo-inflammatorischen oder malignen Erkrankungen eine Rolle und sind maßgeblich an Entzündungs-vermittelten Thrombosen (Immunothrombosen) beteiligt. Daten aus Mausmodellen legen nahe, dass die Interaktion zwischen dem Thrombozytenrezeptor CLEC-2 (C-type lectin-like receptor 2) und seinem Liganden Podoplanin von Bedeutung für diese Krankheitsbilder, und die Thrombusstabilität ist. Allerdings ist bislang unklar, ob CLEC-2 im Menschen eine ähnliche Rolle spielt, da die Rolle des menschlichen CLEC-2 (hCLEC-2) in diesen Prozessen bislang nicht experimentell in vivo erforscht werden kann. Um hCLEC-2 in vivo zu erforschen, haben wir Mäuse generiert, die humanes CLEC-2 exprimieren (hCLEC-2KI), sowie einen neuen, monoklonalen Antikörper (HEL1) entwickelt, der an eine andere Bindungsstelle als der zuvor generierter Antikörper (AYP1) bindet. Mit Hilfe dieser Antikörper haben wir erstmalig gezeigt, dass hCLEC-2KI Mäuse geeignet sind, um potenzielle Therapeutika zu testen, die auf hCLEC-2 abzielen. Des Weiteren konnten wir erstmalig zeigen, dass auch hCLEC-2 immunodepletiert werden kann und dass der Verlust des Rezeptors in zirkulierenden Thrombozyten die Hämostase nur minimal beeinträchtigt. Allerdings deuten unsere Ergebnisse auch darauf hin, dass es hinsichtlich der Bedeutung CLEC-2 für die arterielle Thrombose artspezifische Unterschiede gibt: Während Maus CLEC-2 zur Stabilität der Thromben beiträgt, hatte die Blockade der Ligandenbindungsstelle von hCLEC-2 keinen Einfluss auf Thrombose. Des Weiteren wurde mit Hilfe des Bruton’s tyrosine kinase Inhibitors PRN473 der Effekt einer Blockierung des CLEC-2 Signalwegs auf die durch CLEC-2 hervorgerufene Immuno-Thrombose in einem Salmonella typhimurium Infektionsmodel erforscht. Da jedoch keine Effekte nachgewiesen werde konnten, schlussfolgern wir, dass der CLEC-2 Signalweg nicht in diesen Prozess involviert ist. Insgesamt deuten unsere Ergebnisse darauf hin, dass es Unterschiede in der Rolle von CLEC-2 zwischen Mensch und Maus gibt, zumindest im Kontext der arteriellen Thrombose, was das Potenzial von CLEC-2 als antithrombotisches Ziel einschränken könnte. Da allem Anschein nach die Interaktion zwischen CLEC-2 und Podoplanin konserviert ist, könnte CLEC-2 dennoch als Therapeutikum für Thrombo-Inflammation, Immunothrombose und Krebsbildungen genutzt werden. Des Weiteren könnten für den Menschen entwickelte Therapieansätze mit Hilfe von hCLEC-2KI Mäusen in vivo untersucht werden. KW - Thrombozyt KW - Thrombose KW - Platelet KW - Thrombosis KW - Rezeptor Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-293108 ER - TY - THES A1 - Rudloff, Jan Philipp T1 - Post-Truth Epistemic Beliefs Rooted in the Dark Factor of Personality Predict Irrational Cognition and Behavior T1 - Postfaktische epistemische Überzeugungen und der Dunkle Faktor der Persönlichkeit sagen irrationale Kognitionen und Verhaltensweisen vorher N2 - Conspiracy theories and fake news are receiving wide media coverage and their proliferation has motivated academic research on the driving factors irrational cognition and behavior. This dissertation focuses on individuals' beliefs about knowledge and knowing, which are commonly referred to as epistemic beliefs. The term post-truth epistemic beliefs is proposed and defined as a strong trust in one’s intuition, a low need to align opinions with evidence, and the strong conviction that truth is a matter of power. Across six online studies, a mediation model is proposed and tested. It includes the core of all dark traits, the Dark Factor of Personality (D), as an antecedent of post-truth epistemic beliefs, and irrational cognition and behavior as consequences. Manuscript #1 comprises four studies showing that post-truth epistemic beliefs are rooted in D and predict increased endorsement of COVID-19 conspiracy theories as well as less engagement in health-protective behavior against COVID-19. Manuscript #2 includes a US nationally representative study suggesting that post-truth epistemic beliefs and D predict a lower probability of having been vaccinated against COVID-19. Manuscript #3 presents a repeated measures experiment indicating that the nexus of D and post-truth epistemic beliefs also predicts less discernment between fake and accurate news. These findings highlight a major insight and a serious challenge for rational communication: Some individuals deliberately disregard (scientific) evidence and rational decision-making. Against this background, the need to foster the epistemological development of students and educators is emphasized. N2 - Verschwörungstheorien und Fake News werden in den Medien lebhaft diskutiert und haben zu einem verstärkten Interesse wissenschaftlicher Forschung an den Risikofaktoren für irrationale Überzeugungen und irrationales Verhalten beigetragen. Die vorliegende Dissertation konzentriert sich in diesem Zusammenhang auf individuelle Überzeugungen darüber, was Wissen ist und wie es entsteht, welche als epistemische Überzeugungen bezeichnet werden. In dieser Arbeit wird der Begriff der postfaktischen epistemischen Überzeugungen verwendet – für ein starkes Vertrauen in die eigene Intuition, ein geringes Bedürfnis, Meinungen mit Beweisen abzugleichen und die Überzeugung, dass Wahrheit eine Frage von Macht ist. Ein Mediationsmodell wird über sechs Online-Studien hinweg vorgeschlagen und getestet. Es enthält den Kern aller dunklen Persönlichkeitsmerkmale, den Dunklen Faktor der Persönlichkeit (D), als Prädiktor von postfaktischen epistemischen Überzeugungen und irrationale Überzeugungen und irrationales Verhalten als deren Folgen. Manuskript 1 umfasst vier Studien, die zeigen, dass postfaktische epistemische Überzeugungen mit D verbunden sind und eine verstärkte Befürwortung von COVID-19-Verschwörungstheorien sowie ein verringertes Schutzverhalten bezüglich COVID-19 vorhersagen. Manuskript 2 enthält eine für die USA repräsentative Studie, die zeigt, dass postfaktische epistemische Überzeugungen und D vorhersagen, dass mit geringerer Wahrscheinlichkeit eine COVID-19-Schutzimpfung in Anspruch genommen wurde. Manuskript 3 enthält ein Experiment mit Messwiederholung, das zeigt, dass der Nexus aus D und postfaktischen epistemischen Überzeugungen vorhersagt, dass Menschen weniger zwischen falschen und wahren Nachrichten unterscheiden. Diese Ergebnisse liefern eine wichtige Erkenntnis, die eine ernsthafte Herausforderung für rationale Kommunikation aufzeigt: Einige Menschen lehnen bewusst (wissenschaftliche) Beweise und rationale Entscheidungen ab. Vor diesem Hintergrund wird die Notwendigkeit verdeutlicht, die epistemologische Entwicklung von Lernenden und Lehrenden verstärkt zu fördern. KW - Verschwörungstheorie KW - Desinformation KW - Falschmeldung KW - Fake News KW - Epistemische Überzeugungen KW - Dunkle Persönlichkeitsmerkmale Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-344782 ER - TY - THES A1 - Li, Kunkun T1 - Dissecting the interconnection of Ca\(^{2+}\) and pH signaling in plants with a novel biosensor for dual imaging T1 - Untersuchung der Verknüpfung von Ca\(^{2+}\) und pH-Signalen in Pflanzen mit einem neuartigen Biosensor für duale Bildgebung N2 - Calcium ion (Ca2+) and protons (H+) are both regarded as second messengers, participating in plant growth and stress mechanisms. However, H+ signals in plant physiology are less well investigated compared to Ca2+ signals. If interconnections between these two second messengers exist remains to be uncovered because appropriate imaging tools to monitor Ca2+ and H+ simultaneously in the same cell as well as accurate bioinformatics analysis remain to be developed. To overcome this problem and unravel the role and possible interconnection of Ca2+ and H+ in plants, a new biosensor named CapHensor was developed and optimized to visualize intracellular Ca2+ and H+ changes simultaneously and ratiometrically in the same cell. The CapHensor consisted of an optimized green fluorescent pH sensor (PRpHluorin) and an established red fluorescent Ca2+ sensor (R-GECO1) that were combined in one construct via a P2A sequence. A P2A self-cleavage site between the two sensors allowed to express equal amounts but spatially separated sensors, which enabled artifact-free and ratiometric imaging of cellular Ca2+ and pH side-by-side. The function of the CapHensor was verified in pollen tubes, since they possess standing Ca2+ and pH gradients. We found better imaging quality and the signal-to-noise ratio to be enhanced in live-cell imaging when two R-GECO1 proteins were fused in tandem within the CapHensor construct. To guarantee exclusive subcellular localization and avoid mixed signals from different compartments, Nuclear Export Sequence (NES) and Nuclear Localization Sequence (NLS) were used to target PRpHluorin and R-GECO1 to distinct compartments. After optimization and verification its function, CapHensor was successfully expressed in different cell types to investigate the role of Ca2+ and H+ signals to control polar growth of pollen tube, stomatal movement or leaf defense signaling. Results obtained in the past indicated both Ca2+ gradients and pH gradients in pollen tubes play roles in polar growth. However, the role and temporal relationship between the growth process and changes in Ca2+ and pH have not been conclusively resolved. Using CapHensor, I found cytosolic acidification at the tip could promote and alkalization to suppress growth velocity in N. tabacum pollen tubes, indicating that cytosolic H+ concentrations ([H+]cyt) play an important role in regulation pollen tubes growth despite the accompanied changes in cytosolic Ca2+ concentrations ([Ca2+]cyt). Moreover, growth correlated much better with the tip [H+]cyt regime than with the course of the tip [Ca2+]cyt regime. However, surprisingly, tip-focused [Ca2+]cyt andII [H+]cyt oscillations both lagged behind growth oscillations approximately 33 s and 18 s, respectively, asking for a re-evaluation of the role that tip [Ca2+]cyt may play in pollen tube growth. Live-cell CapHensor imaging combined with electrophysiology uncovered that oscillatory membrane depolarization correlated better with tip [H+]cyt oscillations than with tip [Ca2+]cyt oscillations, indicative for a prominent role of [H+]cyt to also control electrogenic membrane transport. Using CapHensor, reading out cellular movement at the same time enabled to provide a precise temporal and spatial resolution of ion signaling events, pointing out a prominent role of [H+]cyt in pollen tube tip growth. For leaf cells, a special CapHensor construct design had to be developed, containing additional NES localization sequences to avoid overlapping of fluorescense signals from the nucleus and the cytosol. Once this was achieved, the role of Ca2+ and pH changes in guard cells, another typical single-cell system was investigated. Cytosolic pH changes have been described in stomatal movement, but the physiological role of pH and the interaction with changing Ca2+ signals were still unexplored. Combining CapHensor with the here developed technique to monitor stomatal movement in parallel, the role of Ca2+ and H+ in stomatal movement was studied in detail and novel aspects were identified. The phytohormone ABA and the bacterial elicitor flagellin (flg22) are typical abiotic and biotic stresses, respectively, to trigger stomatal closure. What kind of Ca2+ and H+ signals by ABA and flg22 are set-off in guard cells and what their temporal relationship and role for stomatal movement is were unknown. Similar [Ca2+]cyt increases were observed upon ABA and flg22 triggered stomatal closure, but [H+]cyt dynamics differed fundamentally. ABA triggered pronounced cytosolic alkalization preceded the [Ca2+]cyt responses significantly by 57 s while stomata started to close ca. 205 s after phytohormone application. With flg22, stomatal closure was accompanied only with a mild cytosolic alkalization but the [Ca2+]cyt response was much more pronounced compared to the ABA effects. Where the cytosolic alkalization originates from was unclear but the vacuole was speculated to contribute in the past. In this thesis, vacuolar pH changes were visualized by the dye BCECF over time, basically displaying exactly the opposite course of the concentration shift in the vacuole than observed in the cytosol. This is indicative for the vacuolar pH dynamics to be coupled strongly to the cytosolic pH changes. In stomatal closure signalling, reactive oxygen species (ROS) were proposed to play a major role, however, only very high concentration of H2O2 (> 200 µM), which resulted in the loss of membrane integrity, induced stomatal closure. Unexpectedly, physiological concentrations of ROS led to cytosolic acidificationIII which was associated with stomatal opening, but not stomatal closure. To study the role of [H+]cyt to steer stomatal movement in detail, extracellular and intracellular pH variations were evoked in N. tabacum guard cells and their behaviour was followed. The results demonstrated cytosolic acidification stimulated stomatal opening while cytosolic alkalization triggered stomatal closure accompanied by [Ca2+]cyt elevations. This demonstrated pH regulation to be an important aspect in stomatal movement and to feed-back on the Ca2+-dynamics. It was remarkable that cytosolic alkalization but not [Ca2+]cyt increase seemed to play a crucial role in stomatal closure, because more pronounced cytosolic alkalization, evoked stronger stomatal closure despite similar [Ca2+]cyt increases. Increases in [Ca2+]cyt, which are discussed as an early stomatal closure signal in the past, could not trigger stomatal closure alone in my experiments, even when extremely strong [Ca2+]cyt signals were triggered. Regarding the interaction between the two second messengers, [Ca2+]cyt and [H+]cyt were negatively correlated most of the times, which was different from pollen tubes showing positive correlation of [Ca2+]cyt and [H+]cyt regimes. [Ca2+]cyt elevations were always associated with a cytosolic alkalization and this relationship could be blocked by the presence of vanadate, a plasma membrane H+-pump blocker, indicating plasma membrane H+-ATPases to contribute to the negative correlation of [Ca2+]cyt and [H+]cyt. To compare with guard cells, cytosolic and nuclear versions of CapHensor were expressed in N. benthamiana mesophyll cells, a multicellular system I investigated. Mesophyll cell responses to the same stimuli as tested in guard cells demonstrated that ABA and H2O2 did not induce any [Ca2+]cyt and [H+]cyt changes while flg22 induced an increase in [Ca2+]cyt and [H+]cyt, which is different from the response in guard cells. I could thus unequivocally demonstrate that guard cells and mesophyll cells do respond differently with [Ca2+]cyt and [H+]cyt changes to the same stimuli, a concept that has been proposed before, but never demonstrated in such detail for plants. Spontaneous Ca2+ oscillations have been observed for a long time in guard cells, but the function or cause is still poorly understood. Two populations of oscillatory guard cells were identified according to their [Ca2+]cyt and [H+]cyt phase relationship in my study. In approximately half of the oscillatory cells, [H+]cyt oscillations preceded [Ca2+]cyt oscillations whereas [Ca2+]cyt was the leading signal in the other half of the guard cells population. Strikingly, natural [H+]cyt oscillations were dampened by ABA but not by flg22. This effect could be well explained by dampening of vacuolar H+ oscillations in the presence of ABA, but not through flg22. Vacuolar pH contributes to spontaneous [H+]cyt oscillations and ABA but not flg22 can block the interdependence of naturalIV [Ca2+]cyt and [H+]cyt signals. To study the role of [Ca2+]cyt oscillations in stomatal movement, solutions containing high and low KCl concentrations were applied aiming to trigger [Ca2+]cyt oscillations. The triggering of [Ca2+]cyt oscillations by this method was established two decades ago leading to the dogma that [Ca2+]cyt increases are the crucial signal for stomatal closure. However, I found stomatal movement by this method was mainly due to osmotic effects rather than [Ca2+]cyt increases. Fortunately, through this methodology, I found a strong correlation between cytosolic pH and the transport of potassium across the plasma membrane and vacuole existed. The plasma membrane H+-ATPases and H+-coupled K+ transporters were identified as the cause of [H+]cyt changes, both very important aspects in stomata physiology that were not visualized experimentally before. Na+ transport is also important for stomatal regulation and leaves generally since salt can be transported from the root to the shoot. Unlike well-described Ca2+- dependent mechanisms in roots, how leaves process salt stress is not at all understood. I applied salt on protoplasts from leaves, mesophyll cells and guard cells and combined live-cell imaging with Vm recordings to understand the transport and signaling for leaf cells to cope with salt stress. In both, mesophyll and guard cells, NaCl did not trigger Ca2+-signals as described for roots but rather triggered Ca2+ peaks when washing salt out. However, membrane depolarization and pronounced alkalinization were very reliably triggered by NaCl, which could presumably act as a signal for detoxification of high salt concentrations. In line with this, I found the vacuolar cation/H+ antiporter NHX1 to play a role in sodium transport, [H+]cyt homeostasis and the control of membrane potential. Overexpression of AtNHX1 enabled to diminish [H+]cyt changes and resulted in a smaller depolarization responses druing NaCl stress. My results thus demonstrated in contrast to roots, leaf cells do not use Ca2+-dependent signalling cascades to deal with salt stress. I could show Na+ and K+ induced [H+]cyt and Vm responses and Cl- transport to only have a minor impact. Summing all my results up briefly, I uncovered pH signals to play important roles to control pollen tube growth, stomatal movement and leaf detoxification upon salt. My results strongly suggested pH changes might be a more important signal than previously thought to steer diverse processes in plants. Using CapHensor in combination with electrophysiology and bioinformatics tools, I discovered distinct interconnections between [Ca2+]cyt and [H+]cyt in different cell types and distinct [Ca2+]cyt and [H+]cyt signals are initiated through diverse stimuli and environmental cues. The CapHensor will be very useful in the future to further investigate the coordinated role of Ca2+ and pH changes in controlling plant physiology. N2 - Kalziumionen (Ca2+) und Protonen (H+) werden beide als Botenstoffe angesehen, die am Pflanzenwachstum und an Mechanismen zur Stressbewältigung beteiligt sind. In der Pflanzenphysiologie sind H+-Signale jedoch im Vergleich zu Ca2+-Signalen weniger gut untersucht. Die Frage, ob zwischen diesen beiden Botenstoffen Zusammenhänge bestehen, muss noch geklärt werden, da geeignete bildgebende Verfahren zur gleichzeitigen Aufzeichnung von Ca2+ und H+ Signalen sowie eine genaue bioinformatische Analyse noch entwickelt werden müssen. Um dieses Problem zu überwinden und die Rolle und möglichen Zusammenhang von Ca2+ und H+ Signalen in Pflanzen zu entschlüsseln, wurde ein neuer Biosensor namens CapHensor entwickelt und optimiert, um intrazelluläre Ca2+- und H+-Veränderungen gleichzeitig und ratiometrisch zu untersuchen. Der CapHensor bestand aus einem optimierten grün fluoreszierenden pH-Sensor (PRpHluorin) und einem etablierten rot fluoreszierenden Ca2+-Sensor (R-GECO1), die über eine P2A-Sequenz in einem Konstrukt kombiniert wurden. Eine sogenannte P2A-„self-cleavage site“ zwischen den beiden Sensoren ermöglichte die Expression gleicher Mengen, aber räumlich getrennter Sensoren, was eine artefaktfreie und ratiometrische Darstellung von zellulärem Ca2+ und pH nebeneinander ermöglichte. Die Funktion des CapHensors wurde in Pollenschläuchen verifiziert, da diese einen ständigen Ca2+- und pH-Gradienten aufweisen. Wir stellten fest, dass die Qualität der Bildaufnahmen und das Signal-Rausch-Verhältnis bei der Bildgebung in lebenden Zellen verbessert wurden, wenn zwei R-GECO1-Proteine innerhalb des CapHensor-Konstrukts translational fusioniert wurden. Um eine ausschließliche zytosolische Lokalisierung zu gewährleisten und gemischte Signale aus verschiedenen Kompartimenten zu vermeiden, wurden sogenannte „Nuclear Export Sequence“ (NES) und die „Nuclear Localization Sequence“ (NLS) verwendet, um PRpHluorin und R-GECO1 in unterschiedlichen Kompartimente zu lokalisieren. Nach der Optimierung und Überprüfung seiner Funktionsweise wurde CapHensor erfolgreich in verschiedenen Zelltypen exprimiert, um die Rolle von Ca2+- und H+-Signalen bei der Kontrolle des polaren Wachstums von Pollenschläuchen, die Stomabewegung oder Abwehrmechanismen der Blätter zu untersuchen. Die in der Vergangenheit erzielten Ergebnisse deuten darauf hin, dass sowohl der Ca2+-Gradient als auch der pH-Gradient in Pollenschläuchen eine Rolle beim polaren Wachstum spielen, wobei dem Ca2+-Gradient zum Teil die Hauptrolle zugesprochen wird. Die Rolle und die zeitlicheVI Beziehung zwischen dem Wachstumsprozess und den Veränderungen von Ca2+ und pH sind jedoch noch nicht abschließend geklärt. Mit Hilfe von CapHensor fand ich heraus, dass eine zytosolische Ansäuerung an der Spitze die Wachstumsgeschwindigkeit in N. tabacumPollenschläuchen fördern und eine Alkalisierung die Wachstumsgeschwindigkeit unterdrücken kann, was darauf hindeutet, dass die zytosolische H+-Konzentration ([H+]cyt) trotz der damit einhergehenden Veränderungen der zytosolischen Ca2+-Konzentration ([Ca2+]cyt) eine wichtige Rolle bei der Regulierung des Wachstums von Pollenschläuchen spielt. Außerdem korrelierte das Wachstum viel besser mit dem [H+]cyt-Verlauf an der Spitze als mit dem Verlauf des [Ca2+]cytSignals. Überraschenderweise hinkten jedoch sowohl die [Ca2+]cyt- als auch die [H+]cytOszillationen an der Spitze den Wachstumsoszillationen um etwa 33 s bzw. 18 s hinterher, so dass die Rolle von [Ca2+]cyt an der Spitze für das Wachstum des Pollenschlauchs neu bewertet werden muss. Die CapHensor-Bildgebung an lebenden Zellen in Kombination mit Elektrophysiologie ergab, dass die oszillierende Membrandepolarisation besser mit den [H+]cyt-Oszillationen an der Spitze korrelierte als mit den [Ca2+]cyt-Oszillationen, was darauf hindeutet, dass [H+]cyt auch eine wichtige Rolle bei der Kontrolle des elektrogenen Membrantransports spielt. Mit Hilfe des CapHensors und dem gleichzeitigen Auslesen der Zellbewegungen konnte eine präzise zeitliche und räumliche Auflösung der Ereignisse erzielt werden, was auf eine herausragende Rolle von [H+]cyt beim Wachstum der Pollenschlauchspitze hinweist. Für den Einsatz des CapHensors in Blattzellen musste ein spezielles CapHensor-Konstrukt entwickelt werden, das zusätzliche NES-Lokalisierungssequenzen enthielt, um eine Überlappung der Fluoreszenzsignale aus dem Zellkern und dem Zytosol zu vermeiden. Nachdem dies erreicht war, wurde die Rolle von Ca2+- und pH-Änderungen in Schließzellen, einem gut beschriebenen Einzelzellsystem, untersucht. Veränderungen des zytosolischen pH-Werts wurden bei der Bewegung von Stomata in früheren Studien beschrieben, aber die physiologische Rolle dieser Veränderungen und die Interaktion mit sich verändernden Ca2+-Signalen waren noch unerforscht. Der Einsatz von CapHensor zusammen mit der von mir entwickelten Technik zur parallelen Erfassung der Stomatabewegung hat unser Verständnis der Rolle von Ca2+ und H+ bei der Stomatabewegung erheblich verbessert. Das Phytohormon ABA und der bakterielle Elicitor Flagellin (flg22) sind typische abiotische bzw. biotische Stressfaktoren, die das Schließen der Stomata auslösen. Welche Art von Ca2+- und H+-Signalen in den Schließzellen durch ABA und flg22 ausgelöst werden und in welchem zeitlichen Zusammenhang sie stehen und welche Rolle sieVII für die Bewegung der Stomata spielen, war bisher unbekannt. Bei der durch ABA und flg22 ausgelösten Schließung der Stomata wurde ein Anstieg von [Ca2+]cyt beobachtet, aber die Dynamik von [H+]cyt unterschied sich grundlegend und zeigte eine andere Dynamik. ABA löste eine ausgeprägte zytosolische Alkalisierung aus, die der [Ca2+]cyt-Antwort um 57 s deutlich vorausging, während die Spaltöffnungen erst ca. 205 s danach anfingen zu schliessen. Bei Flg22 ging das Schließen der Spaltöffnungen nur mit einer leichten zytosolischen Alkalisierung einher, aber die Ca2+-Reaktion war im Vergleich zur ABA-Reaktion viel ausgeprägter. Woher die zytosolische Alkalisierung stammt, war unklar, aber in der Vergangenheit wurde spekuliert, dass die Vakuole dazu beiträgt. In dieser Arbeit wurden vakuoläre pH-Änderungen mit Hilfe des Farbstoffs BCECF über die Zeit verfolgt, wobei die Konzentrationsverschiebung in der Vakuole im Grunde genommen genau den umgekehrten Verlauf aufwies als im Zytosol beobachtet. Dies deutet darauf hin, dass die Dynamik des vakuolären pH-Wertes stark an die Änderungen des zytosolischen pHWertes gekoppelt ist. Aus der Literatur ist bekannt, dass reaktive Sauerstoffspezies (ROS) bei der Signalgebung für das Schließen der Stomata eine wichtige Rolle spielen. Als ich jedoch definierte H2O2-Mengen auf die Zellen applizierte, führten nur unphysiologosch hohe H2O2-Konzentrationen (> 200 µM), die zu einem Verlust der Membranintegrität führten, zum Schließen der Stomata. Unerwarteterweise führten physiologische Konzentrationen von ROS zu einer Ansäuerung des Zytosols, die mit der Öffnung der Stomata, aber nicht mit der Schließung der Stomata in Verbindung gebracht wurde. Um die Rolle von [H+]cyt bei der Steuerung der stomatären Bewegung im Detail zu untersuchen, wurden extrazelluläre und intrazelluläre pH-Änderungen in N. tabacumSchließzellen hervorgerufen um deren Verhalten bei pH-Änderungen zu untersuchen. Die Ergebnisse zeigten, dass eine zytosolische Ansäuerung die Öffnung der Stomata stimuliert, während eine zytosolische Alkalisierung die Schließung der Stomata auslöst, begleitet von einem Anstieg von [Ca2+]cyt. Dies beweist, dass die pH-Regulierung ein wichtiger Aspekt der stomatären Bewegung darstellt und auf die Ca2+-Dynamik einwirkt. Bemerkenswert war, dass die zytosolische Alkalisierung und nicht der Ca2+-Anstieg eine entscheidende Rolle bei der Schließung der Stomata zu spielen schien, da eine stärkere zytosolische Alkalisierung trotz eines ähnlichen [Ca2+]cyt - Anstiegs eine stärkere Schließung der Stomata hervorrief. Erhöhungen von [Ca2+]cyt, die in der Vergangenheit als frühes Stomataschließungssignal diskutiert wurden, konnten in meinen Experimenten den Stomataschluß nicht allein auslösen, selbst wenn extrem starke Ca2+-Signale ausgelöst wurden. Was die Interaktion zwischen den beiden Botenstoffen anbelangt, so warenVIII [Ca2+]cyt und [H+]cyt meist negativ miteinander korreliert, was sich von den Pollenschläuchen unterschied, die eine positive Korrelation zwischen [Ca2+]cyt und [H+]cyt aufwiesen. Ca2+- Erhöhungen waren immer mit einer Alkalisierung des Zytosols verbunden, und diese Beziehung konnte durch die Anwesenheit von Vanadat, ein H+-Pumpen Blocker blockiert werden, was darauf hindeutet, dass die H+-ATPasen der Plasmamembran zu der negativen Korrelation von [Ca2+]cyt und [H+]cyt beitragen. Im Vergleich zu den CapHensor-Reaktionen bei Schließzellen wurden zytosolische und Zellkern-lokalisierende Versionen von CapHensor in Mesophyllzellen von N. benthamiana, einem von uns untersuchten multizellulären System, exprimiert. Die Reaktionen der Mesophyllzellen auf die gleichen Stimuli wie bei den Schließzellen zeigten, dass ABA und H2O2 keine Veränderungen von [Ca2+]cyt und [H+]cyt hervorrufen, während flg22 einen Anstieg von [Ca2+]cyt und [H+]cyt bewirkt, der sich von der Reaktion in Schließzellen unterscheidet. Damit konnte ich eindeutig nachweisen, dass Schließ- und Mesophyllzellen in Bezug auf [Ca2+]cyt- und [H+]cyt-Änderungen sehr unterschiedlich auf dieselben Stimuli reagieren, ein Konzept, das zwar schon früher vorgeschlagen, aber noch nie so detailliert für Pflanzen nachgewiesen wurde. Ein Phänomen, das seit langem in Schließzellen beobachtet wird, dessen Funktion oder Ursache aber noch nicht verstanden ist, sind regelmäßige Ca2+-Oszillationen, die spontan auftreten. Interessanterweise wurden zwei Populationen von oszillierenden Schließzellen anhand ihrer [Ca2+]cyt- und [H+]cyt-Phasenbeziehung identifiziert. Bei etwa der Hälfte der oszillierenden Zellen gingen die [H+]cyt-Oszillationen den [Ca2+]cyt-Oszillationen voraus, während in der anderen Hälfte der Schließzellenpopulation [Ca2+]cyt das vorangehende Signal war. Auffallend ist, dass die natürlichen [H+]cyt-Oszillationen durch ABA gedämpft wurden, nicht aber durch flg22. Dieser Effekt lässt sich gut durch die Dämpfung der vakuolären H+-Oszillationen in Gegenwart von ABA erklären, aber nicht durch flg22, das ich mit BCECF sichtbar gemacht habe. Es zeigte sich, dass sowohl der vakuoläre pH-Wert zu spontanen [H+]cyt-Oszillationen beiträgt als auch, dass ABA, nicht aber flg22, den Zusammenhang der natürlichen [Ca2+]cyt- und [H+]cyt-Signale blockieren kann. Um die Rolle der [Ca2+]cyt-Oszillationen bei der Bewegung der Stomata zu untersuchen, wurden Lösungen mit hohen und niedrigen KCl-Konzentrationen verwendet, um [Ca2+]cyt-Oszillationen auszulösen. Das Auslösen von Ca2+-Oszillationen nach dieser Methode wurde in Studien vor zwei Jahrzehnten etabliert, und die Ergebniss daraus haben zu dem Dogma geführt, dass der Anstieg von [Ca2+]cyt das entscheidende Signal für die Schließung von Stomata ist. Ich habe jedoch herausgefunden, dass die Bewegung der Stomata mit dieser Methode hauptsächlich auf osmotischeIX Effekte und nicht auf die Auswirkungen der [Ca2+]cyt-Erhöhungen zurückzuführen waren. Glücklicherweise fand ich mit dieser Methode heraus, dass es eine starke Korrelation zwischen dem zytosolischen pH-Wert und dem Kaliumtransport über die Plasmamembran und die Vakuole gibt. Die H+-ATPasen der Plasmamembran und die H+-gekoppelten K+-Transporter wurden als Ursache für die pH-Änderungen identifiziert, beides sehr wichtige Aspekte in der Stomaphysiologie, die zuvor nicht experimentell sichtbar gemacht werden konnten. Der Transport von Natriumionen (Na+) ist für die Regulierung der Stomata und der Adaption von Blättern bei Salzstress wichtig, da Salz von der Wurzel zum Spross transportiert werden kann. Im Gegensatz zu den gut beschriebenen Ca2+-abhängigen Na+-Transportmechanismen in den Wurzeln ist überhaupt nicht bekannt, wie Blätter Salzstress verarbeiten. Ich habe Salz auf Protoplasten von Blättern, Mesophyllzellen und Schießzellen appliziert und „Live-Cell-Imaging“ mit Aufzeichnungen der Membranspannung kombiniert, um den Transport und die Signalreizweiterleitung bei Salzstress in Blättern zu verstehen. Sowohl in Mesophyll- als auch in Schließzellen löste NaCl keine Ca2+-Signale aus, wie sie für Wurzeln beschrieben wurden, sondern führte beim Auswaschen von Salz zu [Ca2+]cyt-Transienten. Eine Membrandepolarisation und eine ausgeprägte Alkalisierung wurden jedoch sehr zuverlässig durch NaCl ausgelöst, was vermutlich als Signal für die Entgiftung von hohen Salzkonzentrationen dienen könnte. Im Einklang damit konnte ich zeigen, dass der vakuoläre Kationen/H+-Antiporter NHX1 eine Rolle beim Natriumtransport, der zytosolischen pH-Homöostase und der Kontrolle des Membranpotenzials spielt. Die Überexpression von AtNHX1 ermöglichte es, [H+]cyt-Veränderungen zu vermindern und führte zu einer geringeren Depolarisationsreaktion unter NaCl-Stress. Meine Ergebnisse zeigen somit, dass Blattzellen im Gegensatz zu Wurzeln keine Ca2+-abhängigen Signalkaskaden nutzen, um mit Salzstress umzugehen, und ich konnte zeigen, dass Na+ und K+ die [H+]cyt- und Membranspannungs-Reaktionen auslöst und der Cl--Transport nur einen geringen Einfluss hat. Zusammenfassend habe ich festgestellt, dass pH-Signale eine wichtige Rolle bei der Kontrolle des Wachstums von Pollenschläuchen spielen, sowie bei der Bewegung der Stomata und der Entgiftung der Blätter durch Salz beteiligt sind. Meine Ergebnisse deuten stark darauf hin, dass pH-Änderungen ein wichtigeres Signal für die Steuerung verschiedener Prozesse in Pflanzen sein könnten als bisher angenommen. Durch den Einsatz des CapHensors in Kombination mit elektrophysiologischen und bioinformatischen Methoden konnte ich feststellen, dass in verschiedenen Zelltypen unterschiedliche Zusammenhänge zwischen [Ca2+]cyt und [H+]cyt bestehenX und dass unterschiedliche [Ca2+]cyt- und [H+]cyt-Signale durch verschiedene Stimuli und Umweltreize ausgelöst werden. Der CapHensor wird in Zukunft sehr nützlich sein, um die koordinierte Rolle von Ca2+- und pH-Änderungen bei der Steuerung der Pflanzenphysiologie weiter zu untersuchen. KW - Calcium KW - pH KW - live-cell imaging KW - pollen tubes KW - guard cells KW - mesophyll cells KW - Pflanzen KW - Biosensor KW - Bilderzeugung Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-249736 ER - TY - THES A1 - Baumgärtner, Kiana Jasmin T1 - Spectroscopic Investigation of the Transient Interplay at Hybrid Molecule-Substrate Interfaces after Photoexcitation: Ultrafast Electronic and Atomic Rearrangements T1 - Spektroskopische Untersuchung des dynamischen Zusammenspiels an hybriden Molekül-Substrat Grenzflächen: Ultraschnelle Elektronen- und Atombewegungen N2 - This thesis is aimed at establishing modalities of time-resolved photoelectron spectroscopy (tr-PES) conducted at a free-electron laser (FEL) source and at a high harmonic generation (HHG) source for imaging the motion of atoms, charge and energy at photoexcited hybrid organic/inorganic interfaces. Transfer of charge and energy across interfaces lies at the heart of surface science and device physics and involves a complex interplay between the motion of electrons and atoms. At hybrid organic/inorganic interfaces involving planar molecules, such as pentacene and copper(II)-phthalocyanine (CuPc), atomic motions in out-of-plane direction are particularly apparent. Such hybrid interfaces are of importance to, e.g., next-generation functional devices, smart catalytic surfaces and molecular machines. In this work, two hybrid interfaces – pentacene atop Ag(110) and copper(II)-phthalocyanine (CuPc) atop titanium disulfide (1T-TiSe2) – are characterized by means of modalities of tr-PES. The experiments were conducted at a HHG source and at the FEL source FLASH at Deutsches Elektronen-Synchrotron DESY (Hamburg, Germany). Both sources provide photon pulses with temporal widths of ∼ 100 fs and thus allow for resolving the non-equilibrium dynamics at hybrid interfaces involving both electronic and atomic motion on their intrinsic time scales. While the photon energy at this HHG source is limited to the UV-range, photon energies can be tuned from the UV-range to the soft x-ray-range at FLASH. With this increased energy range, not only macroscopic electronic information can be accessed from the sample’s valence and conduction states, but also site-specific structural and chemical information encoded in the core-level signatures becomes accessible. Here, the combined information from the valence band and core-level dynamics is obtained by performing time- and angle-resolved photoelectron spectroscopy (tr-ARPES) in the UV-range and subsequently performing time-resolved x-ray photoelectron spectroscopy (tr-XPS) and time-resolved photoelectron diffraction (tr-XPD) in the soft x-ray regime in the same experimental setup. The sample’s bandstructure in energy-momentum space and time is captured by a time-of-flight momentum microscope with femtosecond temporal and sub-Ångström spatial resolutions. In the investigated systems, out-of-equilibrium dynamics are traced that are connected to the transfer of charge and energy across the hybrid interfaces. While energetic shifts and complementary population dynamics are observed for molecular and substrate states, the shapes of involved molecular orbitals change in energy-momentum space on a subpicosecond time scale. In combination with theory support, these changes are attributed to iiiatomic reorganizations at the interface and transient molecular structures are reconstructed with sub-Ångström precision. Unique to the material combination of CuPc/TiSe2, a structural rearrangement on the macroscopic scale is traced simultaneously: ∼ 60 % of the molecules undergo a concerted, unidirectional in-plane rotation. This surprising observation and its origin are detailed in this thesis and connected to a particularly efficient charge transfer across the CuPc/TiSe2 interface, resulting in a charging of ∼ 45 % of CuPc molecules. N2 - Das Ziel der vorliegenden Doktorarbeit ist es, die Bewegung von Atomen, Ladungsträgern und Energie an organisch/anorganischen Grenzschichten fernab des thermischen Gleichgewichts zu visualisieren und deren Wechselwirkung zu entschlüsseln. Dies wird experimentell mittels zeitaufgelöster Photoemissionsexperimente an einer Freien-Elektronen-LaserQuelle und an einer Höher-Harmonischen-Quelle verwirklicht. Ladungs- und Energietransfer zwischen organisch/anorganischen Grenzschichten sind zentrale Komponenten für die Funktion Molekül-basierter Anwendungen, wie z.B. katalytische Oberflächen, elektronische Schalt- und Speichergeräte oder molekulare Maschinen. Sie stellen einen dynamischen Prozess dar, der sich in einem Wechselspiel aus der Bewegung von Elektronen zwischen beiden Schichten und atomaren Bewegungen innerhalb beider Schichten äußert. Planare Moleküle, wie Pentacen oder Kupfer(II)-Phthalocyanin (CuPc), eignen sich besonders um solche atomaren Bewegungen zu untersuchen, da diese aufgrund geringer Rückstellkräfte senkrecht zur Molekülebene besonders ausgeprägt sein können. In dieser Arbeit werden Ladungs- und Energietransferprozesse an zwei ausgewählten Grenzschichten untersucht: Pentacen auf Silber (Ag(110)) und CuPc auf Titan Diselenid (1T-TiSe2). Zeitaufgelöste Photoemissionsexperimente (tr-PES) wurden an einer HöherHarmonischen-Quelle und an dem Freien-Elektronen-Laser FLASH (Deutsches Elektronen-Synchrotron DESY, Hamburg, Deutschland) durchgeführt. Beide Lichtquellen liefern Photonenpulse mit einer Halbwertsbreite von etwa 100 fs und sind daher geeignet, um Nicht-Gleichgewichtsprozesse zeitlich aufzulösen, die auf der Bewegung von sowohl Elektronen als auch Atomen basieren. Die gewählte Höher-Harmonische-Quelle liefert Photonenenergien im UV-Bereich. Bei FLASH hingegen können die Photonenenergien variabel vom UV-Bereich bis hin zum Weichröntgenbereich erzeugt werden. Dieser erweiterte Energiebereich ermöglicht es, zusätzlich zur elektronischen Dynamik im Valenzbereich, auch Dynamiken kernnaher Zustände zu beobachten. Mithilfe dreier Modalitäten von zeitaufgelöster Photoemission – zeit- und winkelaufgelöste Photoelektronenspektroskopie (tr-ARPES), zeitaufgelöste Röntgenphotoelektronenspektroskopie (tr-XPS) und zeitaufgelöste Röntgenphotoelektronen-Diffraktion (tr-XPD) – werden sowohl die elektronischen als auch strukturellen Dynamiken der Grenzschicht rekonstruiert. Dabei dient tr-ARPES im UV-Bereich zur Charakterisierung der makroskopischen elektronischen Eigenschaften und tr-XPS und tr-XPD im Weichröntgenbereich dienen zur Analyse lokaler chemischer und struktureller Eigenschaften. Alle Messungen wurden unter denselben experimentellen Beidingungen durchgeführt und mithilfe eines Flugzeit-Impulsmikroskops konnte die transiente Bandstruktur mit einer Ortauflösung im Sub-Ångström-Bereich und einer Zeitauflö- sung im Femtosekunden-Bereich aufgenommen werden. In beiden untersuchten Systemen werden elektronische und strukturelle Prozesse an der Molekül–Substrat Grenzfläche beobachtet, die durch einen Ladungs- und Energietransfer in Folge optischer Anregung erklärt werden. Dieser Transfer äußert sich elektronisch durch ein Befüllen des Substrat-Leitungsbands und einem zeitgleichen Entleeren der MolekülValenzorbitale. Strukturelle Veränderungen, wie die Adsorptionshöhe oder intramolekulare Atompositionen, werden aus den sich zeitgleich verformenden Molekül-Valenzorbitalen rekonstruiert. Speziell für CuPc/TiSe2 wird ein effektiver Ladungstransfer beobachtet, wodurch 375 fs nach optischer Anregung ∼ 45 % der Moleküle einfach positiv geladen vorliegen. Diese Ladungstrennung zwischen den sich wie ein Schachbrett anordnenden positivgeladenen und neutralen Molekülen sowie dem Substrat führt zu einer Modulation des Oberflächenpotentials, welche eine energetische Verschiebung aller Grenzflächenzustände bedingt und intramolekulare Strukturveränderungen sowie eine makroskopische Reorganisation des Molekülfilms zur Folge hat: ∼ 60 % der Moleküle drehen sich innerhalb von ∼ 375 fs synchron auf dem Substrat und nehmen nach ∼ 1800 fs wieder ihre Ausgangsposition ein. Diese überraschende Beobachtung sowie die Ursache werden detaillierter in der vorliegenden Arbeit diskutiert und in den Kontext aktueller Forschung an "molekularen Schaltern" gebracht. KW - ARPES KW - Pump-Probe-Technik KW - Übergangsmetalldichalkogenide KW - Orbital KW - Molekül KW - orbital tomography KW - time-resolved KW - free electron laser KW - charge transfer KW - molecular movie Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-330531 ER - TY - THES A1 - Lüttig, Julian Konstantin T1 - Coherent Higher-Order Spectroscopy: Investigating Multi-Exciton Interaction T1 - Kohärente Spektroskopie höherer Ordnung: Untersuchung der multi-exzitonen Wechselwirkung N2 - The goal of this thesis was the development and application of higher-order spectroscopic techniques. In contrast to ordinary pump–probe (PP) and two-dimensional (2D) spectroscopy, higher-order coherently detected spectroscopic methods measure a polarization that has an order of nonlinearity higher than three. The key idea of the techniques in this thesis is to isolate the higher-order signals from the lower-order signals either by their excitation frequency or by their excitation intensity dependence. Due to the increased number of interactions in higher-order spectroscopy, highly excited states can be probed. For excitonic systems such as aggregates and polymers, the fifth-order signal allows one to directly measure exciton–exciton annihilation (EEA). In polymers and aggregates, the exciton transport is not connected to a change of the absorption and can therefore not be investigated with conventional third-order techniques. In contrast, EEA can be used as a probe to study exciton diffusion in these isonergetic systems. As a part of this thesis, anisotropy in fifth-order 2D spectroscopy was investigated and was used to study geometric properties in polymers. In 2D spectroscopy, the multi-quantum signals are separated from each other by their spectral position along the excitation axis. This concept can be extended systematically to higher signals. Another approach to isolate multi-quantum signals in PP spectroscopy utilizes the excitation intensity. The PP signal is measured at specific excitation intensities and linear combinations of these measurements result in different signal contributions. However, these signals do not correspond to clean nonlinear signals because the higher-order signals contaminate the lower-order multi-quantum signals. In this thesis, a correction protocol was derived that uses the isolated multiquantum signals, both from 2D spectroscopy and from PP spectroscopy, to remove the contamination of higher-order signals resulting in clean nonlinear signals. Using the correction on the third-order signal allows one to obtain annihilation-free signals at high excitation intensities, i.e., with high signal-to-noise ratio. Isolation and correction in PP and 2D spectroscopy were directly compared by measuring the clean third-order signals of squaraine oligomers at high excitation intensities. Furthermore, higher-order PP spectroscopy was used to isolate up to the 13th nonlinear order of squaraine polymers. The demonstrated spectroscopic techniques represent general procedures to isolate clean signals in terms of perturbation theory. The technique of higher-order PP spectroscopy needs only small modifications of ordinary PP setups which opens the field of higher-order spectroscopy to the broad scientific community. The technique to obtain clean nonlinear signals allows one to systematically increase the number of interacting (quasi)particles in a system and to characterize their interaction energies and dynamics. N2 - Das Ziel dieser Arbeit war die Entwicklung and Anwendung von spektroskopischen Techniken höherer Ordnung. Im Gegensatz zu herkömmlicher Anrege-Abfrage- und zweidimensionalen (2D) Spektroskopie, wird in kohärenzdetektierten spektroskopischen Methoden höherer Ordnung eine Polarisation gemessen, die höher als drei ist. Die Schlüsselidee der Techniken dieser Arbeit ist die Trennung Signale höherer Ordnung von den Signalen niedrigerer Ordnung, entweder durch ihre Anregungsfrequenz oder durch ihre Abhängigkeit zur Anregungsintensität. Durch die erhöhte Anzahl an Interaktionen in der Spektroskopie höherer Ordnung können auch hoch angeregte Zustände untersucht werden. Für exzitonische Systeme wie Aggregate und Polymere erlaubt das Signal fünfter Ordnung die direkte Messung der Exziton-Exziton-Annihilierung (EEA). In Polymeren und Aggregaten ist der Exziton-Transport nicht mit einer Änderung des Absoprtionsspektrums verbunden und kann daher nicht mit konventionellen Techniken dritter Ordnung untersucht werden. Im Gegensatz dazu kann EEA, die mit Spektroskopie fünfter Ordnung gemessen wird, als Sonde verwendet werden, um Exziton-Diffusion zu untersuchen. Als ein Teil dieser Arbeit wurde die Anisotropie in der 2D-Spektroskopie fünfter Ordnung untersucht, und es wurde gezeigt, dass diese geometrische Eigenschaften von Polymeren bestimmen kann. In der 2D-Spektroskopie werden die sogenannten Multiquantensignale durch ihre Position entlang der Anregungsachse von anderen Signalen getrennt. Dieses Konzept kann systematisch zu höheren Signalen erweitert werden, die durch ihre spezifische Anregungsfrequenz in dem 2D-Spektrum isoliert werden. Ein anderer Ansatz, um Multiquantensignale in der Anrege-Abfrage-Spektroskopie zu isolieren, nutzt die Anregungsintensität. Das Anrege-Abfrage-Signal wird bei spezifischen Anregungsintensitäten gemessen und Linearkombinationen dieser Messungen resultieren in verschiedenen Signalbeiträgen. Allerdings entsprechen diese Signale nicht reinen nichtlinearen Signalen, weil die Signale höherer Ordnung die Multiquantensignale niedriger Ordnung kontaminieren. In dieser Arbeit wurde ein Korrekturprotokoll entwickelt, das die isolierten Multiquantensignale sowohl in der 2D- als auch in Anrege-Abfrage-Spektroskopie nutzt, um die Kontamination durch Signale höherer Ordnung zu entfernen. Die Anwendung dieser Korrektur auf das Signal dritter Ordnung erlaubt es, annihilierungsfreie Signale bei hoher Anregungsintensität, d.h. mit hohem Signal-zu-Rausch-Verhältnis zu erhalten. Isolation und Korrektur in Anrege-Abfrage- und 2D-Spektroskopie wurden direkt miteinander verglichen, indem das kontaminierungsfreie Signal dritter Ordnung von Squarain-Oligomeren bei hoher Anregungsintensität gemessen wurde. Des Weiteren wurde Anrege-Abfrage-Spektroskopie höherer Ordnung eingesetzt, um nichtlineare Signale bis zur 13ten Ordnung in Squarain-Polymeren zu isolieren. Die gezeigten spektroskopischen Techniken stellen allgemeine Verfahren zur Isolierung verschiedener Signale im Sinne der Störungstheorie dar. Die Technik der Anrege-Abfrage-Spektroskopie höherer Ordnung erfordert nur geringfügige Änderungen an gewöhnlichen Anrege-Abfrage-Experimenten und erlaubt es, die Spektroskopie höherer Ordnung in vielen weiteren wissenschaftlichen Gebieten anzuwenden. Der Ansatz kontaminierungsfreier nichtlinearer Signale gibt die Möglichkeit, die Anzahl der wechselwirkenden Teilchen systematisch zu erhöhen und ihre Wechselwirkungsenergien und Dynamiken zu messen. KW - Coherent Multidimensional Spectroscopy KW - Nichtlineare Spektroskopie KW - Ultrakurzzeitspektroskopie KW - Exziton KW - Squaraine KW - Exciton–exciton annihilation KW - Exziton-Exziton-Annihilierung KW - Electronic spectroscopy KW - Elektronische Spektroskopie KW - Pump–probe spectroscopy KW - Anrege-Abfrage-Spektroskopie Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-293182 ER - TY - THES A1 - Ye, Liqing T1 - RNA-RNA interactions in viral genome packaging T1 - RNA-RNA-Interaktionen bei der viralen Genomverpackung N2 - RNA is one of the most abundant macromolecules and plays essential roles in numerous biological processes. This doctoral thesis consists of two projects focusing on RNA structure and RNA-RNA interactions in viral genome packaging. In the first project I developed a method called Functional Analysis of RNA Structure (FARS-seq) to investigate structural features regulating genome dimerization within the HIV-1 5’UTR. Genome dimerization is a conserved feature of retroviral replication and is thought to be a prerequisite for binding to the viral structural protein Pr55Gag during genome packaging. It also plays a role in genome integrity and evolution through recombination, and is linked to a structural switch that may regulate genome packaging and translation within cells. Despite its importance for HIV-1 replication, the RNA signals regulating genome dimerization, and the molecular mechanism leading to the selection of the genome dimer over the monomer for packaging are incompletely understood. The FARS-seq method combines RNA structural information obtained by chemical probing with single nucleotide resolution profiles of RNA function obtained by mutational interference. In this way, we found nucleotides that were critical for dimerization, especially within the well-characterized dimerization motif within stem-loop 1 (SL1). We also found stretches of nucleotides that enhanced genome dimerization upon mutation, suggesting their role in negatively regulating dimerization. A structural analysis identified distinct structural signatures within monomeric and dimeric RNA. The dimeric conformation displayed the canonical transactivation response (TAR), PolyA, primer binding site (PBS), and SL1-SL3 stem-loops, and contained a long range U5-AUG interaction. Unexpectedly, in monomeric RNA, SL1 was reconfigured into long- and short-range base-pairings with PolyA and PBS, respectively. Intriguingly, these base pairings concealed the palindromic sequence needed for dimerization and disrupted the internal loop in SL1 previously shown to contain the major packaging motif for Pr55Gag. We therefore rationally introduced mutations into PolyA and PBS, and showed how these regions regulate genome dimerization, and the binding of Pr55Gag in vitro, as well as genome packaging into virions. These findings give insights into late stages of the HIV-1 life cycle and a mechanistic explanation for the link between RNA dimerization and packaging. In the second project, I developed a proximity ligation and high-throughput sequencing-based method, RNA-RNA seq, which can measure direct (RNA-RNA) and indirect (protein-mediated) interactions. In contrast to existing methods, RNA-RNA seq is not limited by specific protein or RNA baits, nor to a particular crosslinking reagent. The genome of influenza A virus contains eight segments, which assemble into a “7+1” supramolecular complex. However, the molecular details of genome assembly are poorly understood. Our goal is to use RNA-RNA seq to identify the sites of interaction between the eight genomic RNAs of influenza, and to use this information to define the quaternary RNA architecture of the genome. We showed that RNA-RNA seq worked on model substrates, like the HIV-1 Dimerization Initiation Site (DIS) RNA and purified ribosome, as well as influenza A virus infected cells. N2 - RNA ist eines der am häufigsten vorkommenden Makromoleküle und spielt bei allen biologischen Prozessen eine wesentliche Rolle. Diese Doktorarbeit besteht aus zwei Projekten, die sich auf die RNA-Struktur und RNA-RNA-Interaktionen bei der viralen Genomverpackung konzentrieren. Im ersten Projekt habe ich eine Methode namens Functional Analysis of RNA Structure (FARS-seq) entwickelt, um strukturelle Merkmale zu untersuchen, die die Genom-Dimerisierung innerhalb des HIV-1 5'UTR regulieren. Die Genomdimerisierung ist ein konserviertes Merkmal der retroviralen Replikation und gilt als Voraussetzung für die Bindung an das virale Strukturprotein Pr55Gag während der Genomverpackung. Sie spielt auch eine Rolle bei der Genomintegrität und -evolution durch Rekombination und ist mit einem strukturellen Schalter verbunden, der die Genomverpackung und -translation in Zellen regulieren kann. Trotz der Bedeutung für die HIV-1-Replikation sind die RNA-Signale welche die Genom-Dimerisierung regulieren, und der molekulare Mechanismus der zur Auswahl des Genom-Dimers gegenüber dem Monomer für die Verpackung führt, nur unvollständig verstanden. FARS-seq kombiniert RNA-Strukturinformationen, die durch chemisches Sondieren gewonnen werden, mit Profilen der RNA-Funktion in Einzelnukleotid-Auflösung, die durch Mutationsinterferenz gewonnen werden. Auf diese Weise fanden wir Nukleotide, die für die Dimerisierung kritisch sind, insbesondere innerhalb des gut charakterisierten Dimerisierungsmotivs von stem-loop 1 (SL1). Wir fanden auch Nukleotidabschnitte, die bei Mutation die Dimerisierung des Genoms verstärkten, was auf ihre Rolle bei der negativen Regulierung der Dimerisierung hindeutet. Eine Strukturanalyse ergab zudem unterschiedliche strukturelle Signaturen innerhalb der RNA von Monomeren und Dimeren. Die dimere Konformation wies die kanonische Transaktivierungsantwort (TAR), PolyA, die Primerbindestelle (PBS) und SL1-SL3-stem loops auf und enthielt eine weitreichende U5-AUG-Interaktion. Unerwarteterweise interagierte SL1 in monomerer RNA mit dem weit entfernten PolyA Signal und der nahegelegenen PBS. Interessanterweise verbargen diese Basenpaarungen die für die Dimerisierung erforderliche palindromische Sequenz und unterbrachen die interne Schleife in SL1, von der zuvor gezeigt wurde, dass sie das Hauptverpackungsmotiv für Pr55Gag enthält. Wir haben daher auf rationale Weise Mutationen in PolyA und PBS eingeführt und gezeigt, wie diese Regionen die Dimerisierung des Genoms und die Bindung von Pr55Gag in vitro sowie die Verpackung des Genoms in Virionen regulieren. Diese Ergebnisse geben Einblicke in späte Stadien des HIV-1-Lebenszyklus und eine mechanistische Erklärung für die Verbindung zwischen RNA-Dimerisierung und Verpackung. Im zweiten Projekt entwickelte ich eine auf Proximity Ligation und Hochdurchsatz-Sequenzierung basierende Methode, RNA-RNA seq, mit der direkte (RNA-RNA) und indirekte (proteinvermittelte) Wechselwirkungen gemessen werden können. Im Gegensatz zu bestehenden Methoden ist RNA-RNA seq nicht durch spezifische Protein- oder RNA Crosslink-Reagenzien eingeschränkt. Das Genom des Influenza-A-Virus besteht aus acht Segmenten, die zu einem supramolekularen "7+1"-Komplex assemblieren. Die molekularen Details des Genomaufbaus sind jedoch kaum bekannt. Unser Ziel ist es, mit Hilfe von RNA-RNA seq die Interaktionsstellen zwischen den acht genomischen RNAs des Influenza-Virus zu identifizieren und somit die quaternäre RNA-Architektur des Genoms zu definieren. Wir haben gezeigt, dass RNA-RNA seq an Modellsubstraten wie der HIV Dimerization Initiation Site (DIS) RNA und gereinigtem Ribosom sowie an mit dem Influenza-A-Virus infizierten Zellen funktioniert. KW - RNS-Viren KW - RNA-RNA interactions KW - Virus infection KW - viral genome packaging Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-296361 ER - TY - THES A1 - Kohl, Patrick Laurenz T1 - The buzz beyond the beehive: population demography, parasite burden and limiting factors of wild-living honeybee colonies in Germany T1 - Das Summen fern des Bienenstocks: Populationsdemographie, Parasitenlast und limitierende Faktoren wildlebender Honigbienenvölker in Deutschland N2 - The western honeybee (Apis mellifera) is widely known as the honey producer and pollinator managed by beekeepers but neglected as a wild bee species. Central European honeybee populations have been anthropogenically disturbed since about 1850 through introgression and moderate artificial selection but have never been truly domesticated due to a lack of mating control. While their decline in the wild was historically attributed to the scarcity of nesting cavities, a contemporary view considers the invasion of the parasitic mite Varroa destructor in the 1970s as the major driver. However, there are no longitudinal population data available that could substantiate either claim. Based on the insight that introduced European honeybees form viable wild populations in eastern North America and reports on the occurrence of wild-living colonies from various European countries, we systematically studied the ecology of wild-living honeybees in Germany. First, we investigated whether wild-living honeybees colonising German forests form a self-sustaining population. Second, we asked how the parasite burden of wild-living colonies relates to that of managed colonies. And third, we explored whether the winter mortality of wild-living colonies is associated with parasite burden, nest depredation, or the lack of resources on the landscape scale. Between 2017 and 2021, we monitored listed trees with black woodpecker cavities for honeybees in the managed forests of three study regions (Swabian Alb, counties Coburg and Lichtenfels, county Weilheim-Schongau). Continuity of occupation was determined using microsatellite genetic markers. Wild-living colonies predictably colonised forests in summer, when about 10% of all cavities were occupied. The annual colony survival rate and colony lifespan (based on N=112 colonies) were 10.6% and 0.6 years, with 90% of colonies surviving summer (July–September), 16% surviving winter (September–April), and 72% surviving spring (April–July). The average maximum and minimum colony densities were 0.23 (July) and 0.02 (April) colonies per km^2. During the (re-)colonisation of forests in spring, swarms preferred cavities that had already been occupied by other honeybee colonies. We estimate the net reproductive rate of the population to be R0= 0.318, meaning that it is currently not self-sustaining but maintained by the annual immigration of swarms from managed hives. The wild-living colonies are feral in a behavioural sense. We compared the occurrence of 18 microparasites among feral colonies (N=64) and managed colonies (N=74) using qPCR. Samples were collected in four regions (the three regions mentioned above and the city of Munich) in July 2020; they consisted of 20 workers per colony captured at flight entrances. We distinguished five colony types representing differences in colony age and management histories. Besides strong regional variation, feral colonies consistently hosted fewer microparasite taxa (median: 5, range 1–8) than managed colonies (median: 6, range 4–9) and had different parasite communities. Microparasites that were notably less prevalent among feral colonies were Trypanosomatidae, Chronic bee paralysis virus, and Deformed wing viruses A and B. In the comparison of five colony types, parasite burden was lowest in newly founded feral colonies, intermediate in overwintered feral colonies and managed nucleus colonies, and highest in overwintered managed colonies and hived swarms. This suggests that the natural mode of colony reproduction by swarming, which creates pauses in brood production, and well-dispersed nests, which reduce horizontal transmission, explain the reduced parasite burden in feral compared to managed colonies. To explore the roles of three potential drivers of feral colony winter mortality, we combined colony observations gathered during the monitoring study with data on colony-level parasite burden, observations and experiments on nest depredation, and landscape analyses. There was no evidence for an effect of summertime parasite burden on subsequent winter mortality: colonies that died (N=57) did not have a higher parasite burden than colonies that survived (N=10). Camera traps (N=15) installed on cavity trees revealed that honeybee nests are visited by a range of vertebrate species throughout the winter at rates of up to 10 visits per week. Four woodpecker species, great tits, and pine martens acted as true nest depredators. The winter survival rate of colonies whose nest entrances were protected by screens of wire mesh (N=32) was 50% higher than that of colonies with unmanipulated entrances (N=40). Analyses of land cover maps revealed that the landscapes surrounding surviving colonies (N=19) contained on average 6.4 percentage points more resource-rich cropland than landscapes surrounding dying colonies (N=94). We estimate that tens of thousands of swarms escape from apiaries each year to occupy black woodpecker cavities and other hollow spaces in Germany and that feral colonies make up about 5% of the regional honeybee populations. They are unlikely to contribute disproportionately to the spread of bee diseases. Instead, by spatially complementing managed colonies, they contribute to the pollination of wild plants in forests. Honeybees occupying tree cavities likely have various effects on forest communities by acting as nest site competitors or prey, and by accumulating biomass in tree holes. Nest depredation (a consequence of a lack of well-protected nest sites) and food resource limitation seem to be more important than parasites in hampering feral colony survival. The outstanding question is how environmental and intrinsic factors interact in preventing population establishment. Nest boxes with movable frames could be used to better study the environmental drivers of feral colonies’ mortality. Pairs of wild (self-sustaining) and managed populations known to exist outside Europe could provide answers to whether modern apiculture creates honeybee populations maladapted to life in the wild. In Europe, large continuous forests might represent evolutionary refuges for wild honeybees. N2 - Die Honigbiene (Apis mellifera) ist als Nutztier weitbekannt, doch als Wildtier vernachlässigt. Seit etwa 1850 sind ihre Populationen in Mitteleuropa durch Introgression und moderate künstliche Selektion vom Menschen beeinflusst. Die Art wurde jedoch aufgrund fehlender Paarungskontolle nie wirklich domestiziert. Früher wurde der Rückgang wildlebender Honigbienen dem Verlust geeigneter Nistplätze zugeschrieben. Heute wird meist die Bienenmilbe Varroa destructor als Hauptursache angenommen. Es gibt allerdings keine Langzeitdaten, welche diese Annahmen stützen könnten. Basierend auf der Erkenntnis, dass eingeführte Honigbienen in Nordamerika stabile wilde Populationen bilden, und aufgrund von Berichten über das Vorkommen wildlebender Bienenvölker in verschiedenen Ländern Europas, widmeten wir uns dem systematischen Studium wildlebender Honigbienen in Deutschland. Zunächst untersuchten wir, ob waldbewohnende Bienenvölker eine selbsterhaltende Population bilden. Zweitens stellten wir die Frage, inwiefern sich wildlebende und imkerlich gehaltene Völker in ihrer Parasitenlast unterscheiden. Drittens testeten wir, ob Winterverluste wildlebender Bienenvölker mit Parasitendruck, Nestprädation oder mangelndem Nahrungsangebot auf Landschaftsebene in Verbindung stehen. In Wirtschaftswäldern dreier Untersuchungsgebiete (Schwäbische Alb, Landkreise Coburg und Lichtenfels, Landkreis Weilheim-Schongau) kontrollierten wir zwischen 2017 und 2021 bekannte Höhlenbäume des Schwarzspechts auf Besiedlung durch Honigbienen. Das Überleben einzelner Bienenvölker wurde zusätzlich mittels Analyse von Mikrosatelliten DNA überprüft. Nach verlässlichem Muster besiedelten Honigbienen jeden Sommer etwa 10% der Baumhöhlen. Die jährliche Überlebensrate und die Lebenserwartung der Völker (N=112) betrugen 10,6% und 0,6 Jahre, wobei 90% den Sommer (Juli–September), 16% den Winter (September–April) und 72% das Frühjahr (April–Juli) überlebten. Die durchschnittliche maximale (Juli) und minimale (April) Koloniedichte betrug 0,23 bzw. 0,02 Bienenvölker pro km^2. Während der (Wieder)Besiedlung von Wäldern im Frühjahr bevorzugten Bienenschwärme solche Baumhöhlen, welche zuvor schon von Bienen besiedelt worden waren. Die Nettoreproduktionsrate der wildlebenden Population wird auf R0= 0,318 geschätzt, was bedeutet, dass diese zurzeit nicht selbsterhaltend ist, sondern durch die jährliche Einwanderung von Bienenschwärmen aus der Imkerei aufrechterhalten wird. Wir untersuchten wildlebende (N=64) und imkerlich gehaltene Bienenvölker (N=74) auf den Befall mit 18 verschiedenen Mikroparasiten mittels qPCR. Die Proben stammten aus den drei oben genannten Gebieten sowie aus dem Stadtgebiet von München. Eine Probe bestand aus 20 Arbeiterinnen, welche am Flugloch gefangen wurden. Wir unterschieden fünf Kolonietypen aufgrund des Alters (jünger oder älter als ein Jahr) und der unmittelbaren Geschichte der Bewirtschaftung durch Imkerinnen und Imker. Abgesehen von regionalen Unterschieden in der Parasitenlast waren wildlebende Völker mit einer geringeren Anzahl Parasitentaxa befallen (Median: 5, Spanne: 1–8) als imkerlich gehaltene Völker (Median: 6, Spanne: 4–9) und wiesen eine veränderte Zusammensetzung von Parasiten auf. Seltener bei wildlebenden Bienenvölkern waren besonders Trypanosomatidae, das Chronische-Paralysevirus, sowie die Flügeldeformationsviren A und B. Im Vergleich der fünf Kolonietypen war die Parasitenlast bei neu gegründeten wildlebenden Völkern am geringsten, intermediär bei überwinterten wildlebenden Völkern und Brutablegern, und am höchsten bei überwinterten Wirtschaftsvölkern und bei durch Schwärme gegründeten imkerlich gehaltenen Völkern. Dies deutet darauf hin, dass das Schwärmen (Entstehung von Brutpausen) sowie die größere Distanz zwischen Nestern (Verminderung der horizontalen Krankheitsübertragung) die geringere Parasitenlast wildlebender Bienenvölker erklären. Wir kombinierten Beobachtungen zum Winterüberleben aus dem Monitoring mit Daten zur Parasitenlast, mit Beobachtungen und Experimenten zur Nestprädation und mit Landschaftsanalysen. Es ergab sich kein Hinweis auf einen Zusammenhang zwischen Parasitenlast im Sommer und anschließendem Überwinterungserfolg: Völker, welche den Winter nicht überlebten (N=57), hatten zuvor keine höhere Parasitenlast als solche, welche den Winter überlebten (N=10). Kamerafallen (N=15) offenbarten, dass Honigbienennester im Winter von einer Vielzahl von Vögeln und Säugern mit bis zu 10 Besuchen pro Woche heimgesucht werden. Vier Spechtarten, Kohlmeisen und Baummarder wurden als echte Nestplünderer identifiziert. Bienenvölker, deren Nesteingang mit Maschendraht geschützt war (N=32), hatten eine 50% höhere Winterüberlebensrate als Völker ohne Schutz (N=40). Die Analyse von Landnutzungskarten zeigte, dass sich Bienenvölker, welche den Winter überlebten (N=19), in Landschaften mit durchschnittlich 6,4% höherem Anteil von Ackerflächen befanden als solche, die den Winter nicht überlebten (N=94). Wir schätzen, dass in Deutschland jährlich zehntausende Schwärme von Bienenständen entfliehen, um sich in Spechthöhlen oder anderen Hohlräumen anzusiedeln. Der Anteil wildlebender Völker an der Gesamtbienenpopulation beträgt im Sommer etwa 5%. Sie spielen vermutlich eine untergeordnete Rolle bei der Verbreitung von Bienenkrankheiten. Durch die Ergänzung imkerlich gehaltener Völker in Waldgebieten tragen sie zur Bestäubung waldbewohnender Pflanzenarten bei. Die Besiedlung von Baumhöhlen sollte vielseitige Auswirkungen auf Lebensgemeinschaften im Wald haben: Bienenvölker konkurrieren um Nistplätze, sind reiche Beute im Winter und akkumulieren organisches Material. Nestprädation (eine Folge des Mangels an sicheren Nisthöhlen) und Ressourcenlimitierung spielen offenbar derzeit eine größere Rolle als Parasiten bei der Erklärung von Winterverlusten. Eine offene Frage ist, inwiefern Umwelt und genetische Dispositionen die Etablierung wilder Honigbienenpopulationen verhindern. Künstliche Nistkästen könnten genutzt werden, um die Rolle von Umweltfaktoren genauer zu untersuchen. Populationen wilder Honigbienen außerhalb Europas könnten Erkenntnisse dazu liefern, inwiefern sich die moderne Imkerei auf die Anpassungen der Honigbienen als Wildtier auswirkt. In Europa könnten große zusammenhängende Waldgebiete als evolutionäre Refugien für wilde Honigbienen dienen. KW - Biene KW - Insektensterben KW - Wald KW - Spechte KW - Imkerei KW - wild honey bees KW - swarming KW - tree cavity KW - monitoring KW - bee diseases KW - Wilde Honigbienen KW - Bienenschwarm KW - Baumhöhle KW - Monitoring KW - Bienenkrankheiten KW - Nisthöhle Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-330327 ER - TY - THES A1 - Dhillon, Maninder Singh T1 - Potential of Remote Sensing in Modeling Long-Term Crop Yields T1 - Potenzial der Fernerkundung für die Modellierung Langfristiger Ernteerträge N2 - Accurate crop monitoring in response to climate change at a regional or field scale plays a significant role in developing agricultural policies, improving food security, forecasting, and analysing global trade trends. Climate change is expected to significantly impact agriculture, with shifts in temperature, precipitation patterns, and extreme weather events negatively affecting crop yields, soil fertility, water availability, biodiversity, and crop growing conditions. Remote sensing (RS) can provide valuable information combined with crop growth models (CGMs) for yield assessment by monitoring crop development, detecting crop changes, and assessing the impact of climate change on crop yields. This dissertation aims to investigate the potential of RS data on modelling long-term crop yields of winter wheat (WW) and oil seed rape (OSR) for the Free State of Bavaria (70,550 km2), Germany. The first chapter of the dissertation describes the reasons favouring the importance of accurate crop yield predictions for achieving sustainability in agriculture. Chapter second explores the accuracy assessment of the synthetic RS data by fusing NDVIs of two high spatial resolution data (high pair) (Landsat (30 m, 16-days; L) and Sentinel-2 (10 m, 5–6 days; S), with four low spatial resolution data (low pair) (MOD13Q1 (250 m, 16-days), MCD43A4 (500 m, one day), MOD09GQ (250 m, one-day), and MOD09Q1 (250 m, 8-days)) using the spatial and temporal adaptive reflectance fusion model (STARFM), which fills regions' cloud or shadow gaps without losing spatial information. The chapter finds that both L-MOD13Q1 (R2 = 0.62, RMSE = 0.11) and S-MOD13Q1 (R2 = 0.68, RMSE = 0.13) are more suitable for agricultural monitoring than the other synthetic products fused. Chapter third explores the ability of the synthetic spatiotemporal datasets (obtained in chapter 2) to accurately map and monitor crop yields of WW and OSR at a regional scale. The chapter investigates and discusses the optimal spatial (10 m, 30 m, or 250 m), temporal (8 or 16-day) and CGMs (World Food Studies (WOFOST), and the semi-empiric light use efficiency approach (LUE)) for accurate crop yield estimations of both crop types. Chapter third observes that the observations of high temporal resolution (8-day) products of both S-MOD13Q1 and L-MOD13Q1 play a significant role in accurately measuring the yield of WW and OSR. The chapter investigates that the simple light use efficiency (LUE) model (R2 = 0.77 and relative RMSE (RRMSE) = 8.17%) that required fewer input parameters to simulate crop yield is highly accurate, reliable, and more precise than the complex WOFOST model (R2 = 0.66 and RRMSE = 11.35%) with higher input parameters. Chapter four researches the relationship of spatiotemporal fusion modelling using STRAFM on crop yield prediction for WW and OSR using the LUE model for Bavaria from 2001 to 2019. The chapter states the high positive correlation coefficient (R) = 0.81 and R = 0.77 between the yearly R2 of synthetic accuracy and modelled yield accuracy for WW and OSR from 2001 to 2019, respectively. The chapter analyses the impact of climate variables on crop yield predictions by observing an increase in R2 (0.79 (WW)/0.86 (OSR)) and a decrease in RMSE (4.51/2.57 dt/ha) when the climate effect is included in the model. The fifth chapter suggests that the coupling of the LUE model to the random forest (RF) model can further reduce the relative root mean square error (RRMSE) from -8% (WW) and -1.6% (OSR) and increase the R2 by 14.3% (for both WW and OSR), compared to results just relying on LUE. The same chapter concludes that satellite-based crop biomass, solar radiation, and temperature are the most influential variables in the yield prediction of both crop types. Chapter six attempts to discuss both pros and cons of RS technology while analysing the impact of land use diversity on crop-modelled biomass of WW and OSR. The chapter finds that the modelled biomass of both crops is positively impacted by land use diversity to the radius of 450 (Shannon Diversity Index ~0.75) and 1050 m (~0.75), respectively. The chapter also discusses the future implications by stating that including some dependent factors (such as the management practices used, soil health, pest management, and pollinators) could improve the relationship of RS-modelled crop yields with biodiversity. Lastly, chapter seven discusses testing the scope of new sensors such as unmanned aerial vehicles, hyperspectral sensors, or Sentinel-1 SAR in RS for achieving accurate crop yield predictions for precision farming. In addition, the chapter highlights the significance of artificial intelligence (AI) or deep learning (DL) in obtaining higher crop yield accuracies. N2 - Die genaue Überwachung von Nutzpflanzen als Reaktion auf den Klimawandel auf regionaler oder feldbezogener Ebene spielt eine wichtige Rolle bei der Entwicklung von Agrarpolitiken, der Verbesserung der Ernährungssicherheit, der Erstellung von Prognosen und der Analyse von Trends im Welthandel. Es wird erwartet, dass sich der Klimawandel erheblich auf die Landwirtschaft auswirken wird, da sich Verschiebungen bei den Temperaturen, Niederschlagsmustern und extremen Wetterereignissen negativ auf die Ernteerträge, die Bodenfruchtbarkeit, die Wasserverfügbarkeit, die Artenvielfalt und die Anbaubedingungen auswirken werden. Die Fernerkundung (RS) kann in Kombination mit Wachstumsmodellen (CGM) wertvolle Informationen für die Ertragsbewertung liefern, indem sie die Entwicklung von Pflanzen überwacht, Veränderungen bei den Pflanzen erkennt und die Auswirkungen des Klimawandels auf die Ernteerträge bewertet. Ziel dieser Dissertation ist es, das Potenzial von RS-Daten für die Modellierung langfristiger Ernteerträge von Winterweizen (WW) und Ölraps (OSR) für den Freistaat Bayern (70.550 km2 ), Deutschland, zu untersuchen. Das erste Kapitel der Dissertation beschreibt die Gründe, die für die Bedeutung genauer Ernteertragsvorhersagen für die Nachhaltigkeit in der Landwirtschaft sprechen. Das zweite Kapitel befasst sich mit der Bewertung der Genauigkeit der synthetischen RS Daten durch die Fusion der NDVIs von zwei Daten mit hoher räumlicher Auflösung (hohes Paar) (Landsat (30 m, 16 Tage; L) und Sentinel-2 (10 m, 5-6 Tage; S) mit vier Daten mit geringer räumlicher Auflösung (niedriges Paar) (MOD13Q1 (250 m, 16 Tage), MCD43A4 (500 m, ein Tag), MOD09GQ (250 m, ein Tag) und MOD09Q1 (250 m, 8 Tage)) unter Verwendung des räumlich und zeitlich adaptiven Reflexionsfusionsmodells (STARFM), das Wolken- oder Schattenlücken in Regionen füllt, ohne räumliche Informationen zu verlieren. In diesem Kapitel wird festgestellt, dass sowohl L-MOD13Q1 (R2 = 0,62, RMSE = 0,11) als auch S-MOD13Q1 (R2 = 0,68, RMSE = 0,13) für die Überwachung der Landwirtschaft besser geeignet sind als die anderen fusionierten synthetischen Produkte. Im dritten Kapitel wird untersucht, inwieweit die (in Kapitel 2 gewonnenen) synthetischen raum-zeitlichen Datensätze geeignet sind, die Ernteerträge von WW und OSR auf regionaler Ebene genau zu kartieren und zu überwachen. Das Kapitel untersucht und diskutiert die optimalen räumlichen (10 m, 30 m oder 250 m),zeitlichen (8 oder 16 Tage) und CGMs (World Food Studies (WOFOST) und den semi-empirischen Ansatz der Lichtnutzungseffizienz (LUE)) für genaue Ertragsschätzungen beider Kulturarten. Im dritten Kapitel wird festgestellt, dass die Beobachtung von Produkten mit hoher zeitlicher Auflösung (8 Tage) sowohl des S-MOD13Q1 als auch des L-MOD13Q1 eine wichtige Rolle bei der genauen Messung des Ertrags von WW und OSR spielt. In diesem Kapitel wird untersucht, dass das einfache Modell der Lichtnutzungseffizienz (LUE) (R2 = 0,77 und relativer RMSE (RRMSE) = 8,17 %), das weniger Eingabeparameter zur Simulation des Ernteertrags benötigt, sehr genau, zuverlässig und präziser ist als das komplexe WOFOST-Modell (R2 = 0,66 und RRMSE = 11,35 %) mit höheren Eingabeparametern. In Kapitel vier wird der Zusammenhang zwischen der raum-zeitlichen Fusionsmodellierung mit STRAFM und der Ertragsvorhersage für WW und OSR mit dem LUE-Modell für Bayern von 2001 bis 2019 untersucht. Das Kapitel stellt den hohen positiven Korrelationskoeffizienten (R) = 0,81 und R = 0,77 zwischen dem jährlichen R2 der synthetischen Genauigkeit und der modellierten Ertragsgenauigkeit für WW bzw. OSR von 2001 bis 2019 fest. In diesem Kapitel werden die Auswirkungen der Klimavariablen auf die Ertragsvorhersagen analysiert, wobei ein Anstieg des R2 (0,79 (WW)/0,86 (OSR)) und eine Verringerung des RMSE (4,51/2,57 dt/ha) festgestellt werden, wenn der Klimaeffekt in das Modell einbezogen wird. Das fünfte Kapitel deutet darauf hin, dass die Kopplung des LUE-Modells mit dem Random-Forest-Modell (RF) den relativen mittleren quadratischen Fehler (RRMSE) von -8 % (WW) und -1,6 % (OSR) weiter reduzieren und das R2 um 14,3 % (sowohl für WW als auch für OSR) erhöhen kann, verglichen mit Ergebnissen, die nur auf LUE beruhen. Das gleiche Kapitel kommt zu dem Schluss, dass die satellitengestützte Pflanzenbiomasse, die Sonneneinstrahlung und die Temperatur die einflussreichsten Variablen bei der Ertragsvorhersage für beide Kulturarten sind. In Kapitel sechs wird versucht, sowohl die Vor- als auch die Nachteile der RS-Technologie zu erörtern, indem die Auswirkungen der unterschiedlichen Landnutzung auf die modellierte Biomasse von WW und OSR analysiert werden. In diesem Kapitel wird festgestellt, dass die modellierte Biomasse beider Kulturen durch die Landnutzungsvielfalt bis zu einem Radius von 450 (Shannon Diversity Index ~0,75) bzw. 1050 m (~0,75) positiv beeinflusst wird. In diesem Kapitel werden auch künftige Auswirkungen erörtert, indem festgestellt wird, dass die Einbeziehung einiger abhängiger Faktoren (wie die angewandten Bewirtschaftungsmethoden, die Bodengesundheit, die Schädlingsbekämpfung und die Bestäuber) die Beziehung zwischen den mit RS modellierten Ernteerträgen und der biologischen Vielfalt verbessern könnte. Im siebten Kapitel schließlich wird die Erprobung neuer Sensoren wie unbemannte Luftfahrzeuge, hyperspektrale Sensoren oder Sentinel-1 SAR in der RS erörtert, um genaue Ertragsvorhersagen für die Präzisionslandwirtschaft zu erreichen. Darüber hinaus wird in diesem Kapitel die Bedeutung der künstlichen Intelligenz (KI) oder des Deep Learning (DL) für die Erzielung einer höheren Genauigkeit der Ernteerträge hervorgehoben. KW - Accurate crop monitoring KW - Ernteertrag KW - Datenfusion KW - Landwirtschaft / Nachhaltigkeit KW - Winterweizen KW - Climate change KW - Remote sensing (RS) KW - Crop growth models (CGMs) KW - Synthetic RS data KW - Spatiotemporal fusion KW - Crop yield estimations KW - Light use efficiency (LUE) model KW - Random forest (RF) model KW - Land use diversity Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-330529 N1 - die originale ursprüngliche Dissertation finden Sie hier: https://doi.org/10.25972/OPUS-32258 ER - TY - THES A1 - Scheitl, Carolin P. M. T1 - In vitro selected ribozymes for RNA methylation and labeling T1 - In vitro selektierte Ribozyme für Methylierung und Markierung von RNA N2 - The focus of this work was the development and application of highly efficient RNA catalysts for the site-specific modification of RNA with special focus on methylation. In the course of this thesis, the first methyltransferase ribozyme (MTR1), which uses m6G as the methyl group donor was developed and further characterized. The RNA product was identified as the natural modification m1A. X-Ray crystallography was used to solve the 3D structure of the ribozyme, which directly suggested a plausible reaction meachnism. The MTR1 ribozyme was also successfully repurposed for a nucleobase transformation reaction of a purine nucleoside. This resulted in a formyl-imidazole moiety directly on the intact RNA, which was directly used for further bioconjugation reactions. Finally, additional selections and reselections led to the identification of highly active alkyltransferase ribozymes that can be used for the labeling of various RNA targets N2 - Der Schwerpunkt dieser Arbeit lag auf der Entwicklung sowie Anwendung hocheffizienter RNA-Katalysatoren für die positionsspezifische Modifikation von RNA mit besonderem Fokus auf Methylierungen. Im Rahmen dieser Arbeit wurde das erste Methyltransferase-Ribozym (MTR1), das m6G als Methylgruppendonor verwendet, entwickelt und näher charakterisiert. Das RNA-Produkt wurde als die natürliche Modifikation m1A identifiziert. Mit Hilfe der Röntgenkristallographie wurde des Weiteren die 3D-Struktur des Ribozyms aufgeklärt, was direkt auf ein plausibles Reaktionsmuster schließen ließ. Das MTR1-Ribozym wurde zudem erfolgreich für eine Nukleobasen-Transformationsreaktion eines Purins verwendet, bei der eine Formyl-Imidazol-Einheit direkt an der intakten RNA gebildet wird. Dieses Reaktionsprodukt wurde für positionsgenaue Biokonjugationsreaktionen verwendet. Schließlich führten zusätzliche Selektionen und weitere Reselektionen zur Identifizierung hochaktiver Alkyltransferase-Ribozyme, die für die Markierung verschiedener Ziel-RNAs verwendet werden können. KW - RNA labeling KW - Methyltransferase KW - Methylierung KW - Ribozym KW - SELEX Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-330049 ER - TY - THES A1 - Grundke, Andrea T1 - Head and Heart: On the Acceptability of Sophisticated Robots Based on an Enhancement of the Mind Perception Dichotomy and the Uncanny Valley of Mind T1 - Herz und Kopf: Zur Akzeptanz von elaborierten Robotern anhand einer Weiterentwicklung der Mind-Perception-Dichotomie und des Uncanny Valleys of Mind N2 - With the continuous development of artificial intelligence, there is an effort to let the expressed mind of robots resemble more and more human-like minds. However, just as the human-like appearance of robots can lead to feelings of aversion to such robots, recent research has shown that the apparent mind expressed by machines can also be responsible for their negative evaluations. This work strives to explore facets of aversion evoked by machines with human-like mind (uncanny valley of mind) within three empirical projects from a psychological point of view in different contexts, including the resulting consequences. In Manuscript #1, the perspective of previous work in the research area is reversed and thus shows that humans feel eeriness in response to robots that can read human minds, a capability unknown from human-human interaction. In Manuscript #2, it is explored whether empathy for a robot being harmed by a human is a way to alleviate the uncanny valley of mind. A result of this work worth highlighting is that aversion in this study did not arise from the manipulation of the robot’s mental capabilities but from its attributed incompetence and failure. The results of Manuscript #3 highlight that status threat is revealed if humans perform worse than machines in a work-relevant task requiring human-like mental capabilities, while higher status threat is linked with a higher willingness to interact, due to the machine’s perceived usefulness. In sum, if explanatory variables and concrete scenarios are considered, people will react fairly positively to machines with human-like mental capabilities. As long as the machine’s usefulness is palpable to people, but machines are not fully autonomous, people seem willing to interact with them, accepting aversion in favor of the expected benefits. N2 - Mit der stetigen Weiterentwicklung von künstlicher Intelligenz besteht das Bestreben, das ausgedrückte Bewusstsein von Robotern dem menschlichen Bewusstsein immer mehr nachzubilden. Die Forschung hat dargelegt, dass das augenscheinlich von Maschinen ausgedrückte Bewusstsein für negative Bewertungen verantwortlich sein kann (Uncanny Valley of Mind). Dieser Befund soll aus psychologischer Perspektive in verschiedenen Kontexten inklusive der daraus resultierenden Konsequenzen genauer betrachtet werden. Mit Manuskript #1 wird die Perspektive bisheriger Arbeiten in dem Forschungsgebiet umgekehrt und gezeigt, dass Menschen Unheimlichkeit gegenüber Robotern empfinden, die scheinbar menschliche Gedanken lesen können, was aus der Mensch-Mensch-Interaktion unbekannt ist. In Manuskript #2 wird der Frage nachgegangen, ob Empathie für einen von einem Menschen verletzt werdenden Roboter eine Möglichkeit ist, das Uncanny Valley of Mind abzuschwächen. Ein hervorzuhebendes Resultat dieser Arbeit ist, dass Aversion in dieser Studie nicht durch die Manipulation der Bewusstseinszustände des Roboters aufgekommen ist, sondern durch dessen attribuierte Inkompetenz und sein Versagen. Die Ergebnisse von Manuskript #3 zeigen, dass Statusbedrohung auftritt, wenn Menschen bei einer arbeitsrelevanten Aufgabe, die menschenähnliche mentale Fähigkeiten erfordert, schlechter abschneiden als Maschinen. Es wird auf die wahrgenommene Nützlichkeit der Maschine Bezug genommen um zu erklären, dass höhere Statusbedrohung mit höherer Bereitschaft zur Interaktion assoziiert ist. Zusammenfassend reagieren Menschen recht positiv auf Maschinen mit menschenähnlichen mentalen Fähigkeiten, sobald erklärende Variablen und konkrete Szenarien mitberücksichtigt werden. Solange die Nützlichkeit der Maschinen deutlich gemacht wird, diese aber nicht vollkommen autonom sind, scheinen Menschen gewillt zu sein, mit diesen zu interagieren und dabei Gefühle von Aversion zugunsten der antizipierten Vorteile in Kauf zu nehmen. KW - Humanoider Roboter KW - Künstliche Intelligenz KW - Mensch-Maschine-Kommunikation KW - Uncanny Valley of Mind KW - Eeriness KW - Empathy KW - Status Threat KW - Perceived Usefulness KW - Mensch-Maschine-Interaktion Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-330152 ER - TY - THES A1 - Franz, Anemone T1 - Determining the prevalence and morbidity of \(Schistosoma\), soil-transmitted-helminths and intestinal protozoa in orphans and street children in Mwanza city, Northern Tanzania T1 - Prävalenz von Schistosomiasis, Soil-transmitted helminths und Protozoen bei Strassen- und Waisenkindern in Mwanza city, Tanzania N2 - The present study investigates the infection rates of parasites, morbidity, and the living conditions of street children and orphans in Mwanza city, northern Tanzania. A high percentage of orphans and street children in Mwanza city is infected with one or more parasites. A significantly higher rate of infections with S. mansoni in street children as compared with orphans could be observed. The prevalence of S. mansoni determined by POC CCA test was 65.9% for orphans and 94.5% for street children. 19.2% of the orphans tested positive for S. mansoni in Kato Katz. Of the street children, 77.1% showed positive test results in Kato-Katz. Only 1.3% of the orphans stated in the questionnaire that they use the lake to wash, whereas 91.1% of the street children named the lake as at least one of their options for washing. Protozoal infections used as a marker for hygiene were at a comparable level for both groups. Microscopy showed positive results for G. intestinalis in 8.2% and for E. histolytica/dispar in 23% of orphans and 8.1% for G. intestinalis, and 23.8% for E. histolytica/dispar in street children. Through ultrasonography, we observed no signs of severe PPF and only a few mild PPF patterns. Most street children use the lake to wash and often do not have access to adequate sanitation. However, everyone in the study group indicated having access to safe drinking water. Overall, we found the general hygienic conditions for both groups to be inadequate. With the help of simple public health measures, like improve sanitation and regular mass drug administration, the overall situation would likely be considerably improved. N2 - Die vorliegende Studie untersucht Infektionen mit verschiedenen Parasiten, die Morbidität und Lebensbedingungen von Straßenkindern und Waisen in Mwanza, einer Stadt im Norden Tansanias. Ein hoher Prozentsatz von Waisen und Straßenkindern in Mwanza leidet an Infektionen mit einem oder mehreren Parasiten. Es konnte eine signifikant höhere Rate von Infektionen mit S. mansoni bei Straßenkindern im Vergleich zu Waisen festgestellt werden. Die Prävalenz von Infektionen mit S. mansoni, ermittelt durch POC-CCA-Tests, betrug 65,9% bei Waisen und 94,5% bei Straßenkindern. 19,2% der Waisen waren im Kato-Katz- Test S. mansoni positiv. Bei den Straßenkindern zeigten 77,1% positive Testergebnisse im Kato-Katz-Test. Nur 1,3% der Waisen gaben in dem Fragebogen an, den See zum Waschen zu benutzen, während es 91,1% bei den Straßenkindern waren. Protozoeninfektionen, die als Marker für die Hygieneumstände, unter denen die Kinder leben verwendet wurden, waren bei beiden Gruppen auf vergleichbarem Niveau. Die Mikroskopie zeigte positive Ergebnisse für G. intestinalis bei 8,2% und für E. histolytica/dispar bei 23% der Waisen und bei 8,1% für G. intestinalis und 23,8% für E. histolytica/dispar bei den Straßenkindern. Durch Ultraschall konnten keine Anzeichen für schwere PPF festgestellt werden, und nur bei wenigen Kindern zeigten sich leichte PPF-Muster. Die meisten Straßenkinder benutzen den See um sich zu waschen und haben oft keinen Zugang zu angemessener Sanitärversorgung. Alle Teilnehmer der Studie gaben jedoch an, Zugang zu sicherem Trinkwasser zu haben. Insgesamt stellten wir fest, dass die allgemeinen hygienischen Bedingungen für beide Gruppen unzureichend sind. Mit Hilfe einfacher öffentlicher Gesundheitsmaßnahmen, wie bessere sanitäre Einrichtungen und regelmäßige Entwurmung, könnte die Gesamtsituation für Straßen- und Waisenkinder erheblich verbessert werden. KW - Schistosomiasis KW - Soil-transmitted helminths KW - Protozoa KW - Street children KW - Orphans KW - Tanzania KW - Bilharziose KW - Protozoen Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-329487 ER - TY - THES A1 - Riemens, Renzo J. M. T1 - Neuroepigenomics in Alzheimer’s disease: The single cell ADds T1 - Neuroepigenomik bei der Alzheimer-Krankheit: Die Einzelzell ADds N2 - Die Forschung, die in dieser Arbeit zusammengestellt wird, kann in zwei Teile geteilt werden. Der erste Teil, bestehend aus vier Kapiteln, konzentriert sich auf die Rolle der epigenetischen Dysregulation in der Ätiopathophysiologie der sporadischen Alzheimer-Krankheit (sAD). Neben Einblicken in die neuesten Entwicklungen in neuroepigenomischen Studien zu dieser Krankheit geht der erste Teil der Arbeit auch auf verbleibende Herausforderungen ein und gibt einen Ausblick auf mögliche Entwicklungen auf diesem Gebiet. Der zweite Teil, der drei weitere Kapitel umfasst, konzentriert sich auf die Anwendung von auf induzierten pluripotenten Stammzellen (iPSC) basierenden Krankheitsmodellen für das Studium der AD, einschließlich, aber nicht beschränkt auf mechanistische Studien zur epigenetischen Dysregulation unter Verwendung dieser Plattform. Neben der Skizzierung der bisherigen Forschung mit iPSC-basierten Modellen für sAD gibt der zweite Teil der Arbeit auch Einblicke in die Gewinnung krankheitsrelevanter Nervenkulturen auf Basis der gezielten Differenzierung von iPSCs und beinhaltet darüber hinaus einen experimentellen Ansatz für den Aufbau eines solchen Modellsystems. N2 - The research that is compiled in this thesis can be divided in two parts. The first part, consisting of four chapters, is centered around the role of epigenetic dysregulation in the etiopathophysiology of sporadic alzheimer's disease (sAD). In addition to providing insights into the most recent developments in neuroepigenomic studies of this disease, the first part of the thesis also touches upon remaining challenges, and provides a future outlook on possible developments in the field. The second part, which includes three more chapters, is focused on the application of induced pluripotent stem cell (iPSC)-based disease models for the study of AD, including but not limited to mechanistic studies on epigenetic dysregulation using this platform. Aside from outlining the research that has been conducted using iPSC-based models for sAD to date, the second part of the thesis also provides insights into the acquisition of disease-relevant neural cultures based on directed differentiation of iPSCs, and furthermore includes an experimental approach for the establishment of such a model system. KW - Epigenetik KW - Alzheimerkrankheit KW - Neuroepigenomics KW - Alzheimer's disease Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-254574 SN - 978-94-6423-524-1 ER - TY - THES A1 - Grüner, Julia T1 - Pathogenesis of anti-paranodal autoantibodies in peripheral neuropathies T1 - Pathogenese anti-paranodaler Autoantikörper bei peripheren Neuropathien N2 - Autoantibodies against proteins of the node of Ranvier have been identified in a subset of patients with chronic inflammatory demyelinating polyradiculoneuropathy (CIDP). Main antigens targeted by autoantibodies are the paranodal proteins contactin 1 (CNTN1), neurofascin (NF) 155 or contactin associated protein (Caspr) as well as the nodal NF186. Several studies investigated the role of anti-paranodal autoantibodies in the pathophysiology of CIDP leading to the current knowledge that immunoglobulin G (IgG)4 deposition leads to detachment of myelin from the axon at the paranodes. However, many questions remain unsolved. Thus, autoantibodies against NF155 have been well studied and their pathogenicity has been proven in an animal model in vivo. However, in some patients, autoantibodies against all isoforms of NF are detectable. These anti-pan-NF autoantibodies occur more rarely and lead to a very severe clinical phenotype. As the pathogenesis of patient-derived autoantibodies against pan-NF has never been investigated in vivo before, we used an animal model to study the effect of acute exposure to anti-pan-NF IgG3 by intraneural injections to the rat sciatic nerve. In addition, we used anti-NF155 IgG4 from a seropositive patient. Behavioral testings as well as nerve conduction studies did not re- veal any deficits after injected neither for anti-NF155 nor for anti-pan-NF autoantibodies. This leads to the suspicion that the disease is more likely induced by a chronic process. A common symptom in patients with anti-CNTN1 associated neuropathy is sensory ataxia and therefore, an involvement of dorsal root ganglia (DRGs) is hypothesized. We show that sera from anti-CNTN1 positive patients specifically bind to DRG neurons in vitro and reduce surface expression of CNTN1. This is most probably due to internalization mediated by coexisting IgG3 although IgG4 is the predominant subclass of autoantibodies. As it is known that CNTN1 interacts with the β1 subunit of specific sodium channels we analyzed channel expression and sodium currents of DRG neurons after incubation with anti-CNTN1 positive patients’ sera. We identified reduced sodium currents after long-term treatment with patients’ material although surface channel expression remained stable. We therefore concluded that CNTN1 might influence channel properties indirectly through auxiliary β1 subunits. Moreover, we suggest an involvement of DRG neurons in the pathogenesis of anti-CNTN1 associated CIDP as medium-large size neurons are more affected than small neurons. However, the exact mechanism of how anti-CNTN1 autoantibodies influence sodium channels should be subject of further studies. Furthermore, preliminary results indicate that the epitope for anti-CNTN1 autoantibodies from seropositive patients might be associated with distinct clinical features. We could show that autoantibodies might be either directed against a conformational epitope as binding is prevented after deletion of the first immunoglobulin (Ig) domain of CNTN1 or against the fibronectin type III (FnIII) domains. Strikingly, both patients with FnIII do- main specificity had very high titers of anti-CNTN1 autoantibodies and a chronic disease progression, whereas patients binding to a conformational epitope or to the Ig domains are related to a relapsing-remitting or even monophasic disease course. However, these results need to be further confirmed before a clear statement can be made. In conclusion, the present study contributes to elucidate the pathogenesis of peripheral neuropathies associated with anti-paranodal autoantibodies. However, further studies are required including a higher number of patients as well as considering effects on structures like DRGs besides the node of Ranvier to fully understand the disease mechanisms. N2 - Autoantikörper gegen Proteine des Ranvierschen Schnürrings wurden bei einer Untergruppe von Patienten mit chronisch inflammatorischer demyelinisierender Polyradikuloneuropathie (CIDP) identifiziert. Antigene, gegen die sich die Autoantikörper hauptsächlich richten, sind die paranodalen Proteine Contactin 1 (CNTN1), Neurofascin (NF) 155 oder das Contactin-assoziierte Protein (Caspr) sowie das nodal exprimierte NF186. Mehrere Studien untersuchten die Rolle von anti-paranodalen Autoantikörpern in der Pathophysiologie der CIDP, was zu der aktuellen Erkenntnis führte, dass Immunglobulin G (IgG) 4-Ablagerungen die Ablösung des Myelins vom Axon an den Paranodien zur Folge haben. Viele Fragen bleiben jedoch ungelöst. So sind Autoantikörper gegen NF155 gut untersucht worden und ihre Pathogenität wurde in einem Tiermodell in vivo nachgewiesen. Bei einigen Patienten sind jedoch Autoantikörper gegen alle Isoformen von NF nachweisbar. Diese anti-pan-NF-Autoantikörper treten seltener auf und führen zu einem sehr schweren klinischen Phänotyp. Da die Pathogenese von Autoantikörpern gegen pan-NF bisher nicht in vivo untersucht wurde, haben wir in einem Tiermodell die Wirkung der akuten Exposition von anti-pan-NF IgG3 durch intraneurale Injektionen in den Ischiasnerv der Ratte untersucht. Zusätzlich verwendeten wir anti-NF155 IgG4 von einem seropositiven Patienten. Verhaltenstests sowie Nervenleitfähigkeitsuntersuchungen zeigten weder nach Injektion von anti-NF155 noch von anti-pan-NF-Autoantikörpern Defizite. Dies lässt den Verdacht aufkommen, dass die Erkrankung eher durch einen chronischen Prozess ausgelöst wird. Ein häufiges Symptom bei Patienten mit anti-CNTN1-assoziierter Neuropathie ist die sensorische Ataxie, weshalb eine Beteiligung der Spinalganglien vermutet wird. Wir zeigen, dass Seren von anti-CNTN1-positiven Patienten in vitro spezifisch an Spinalganglion- Neurone binden und die Oberflächenexpression von CNTN1 reduzieren. Dies ist höchstwahrscheinlich auf eine Internalisierung zurückzuführen, die durch koexistierendes IgG3 vermittelt wird, obwohl IgG4 die vorherrschende Subklasse der Autoantikörper ist. Da bekannt ist, dass CNTN1 mit der β1-Untereinheit von spezifischen Natriumkanälen interagiert, haben wir die Kanalexpression und die Natriumströme von Spinalganglion-Neuronen nach Inkubation mit anti-CNTN1-positiven Patientenseren analysiert. Wir stellten reduzierte Natriumströme nach Langzeitbehandlung mit Patientenmaterial fest, obwohl die Oberflächenkanalexpression stabil blieb. Daraus schlossen wir, dass CNTN1 die Kanaleigenschaften möglicherweise indirekt über die β1-Untereinheiten beeinflusst. Darüber hinaus legen wir eine Beteiligung von Spinalganglion-Neuronen an der Pathogenese der anti-CNTN1-assoziierten CIDP nahe, da mittelgroße bis große Neurone stärker betroffen sind als kleine Neurone. Der genaue Mechanismus, wie anti-CNTN1-Autoantikörper Natriumkanäle beeinflussen, sollte jedoch Gegenstand weiterer Studien sein. Darüber hinaus deuten vorläufige Ergebnisse darauf hin, dass das Epitop für anti-CNTN1- Autoantikörper von seropositiven Patienten mit unterschiedlichen klinischen Merkmalen assoziiert sein könnte. Wir konnten zeigen, dass die Autoantikörper entweder gegen ein konformationelles Epitop gerichtet sein könnten, da die Bindung nach Deletion der ersten Immunglobulin (Ig)-Domäne von CNTN1 verhindert wird, oder gegen die Fibronektin Typ III (FnIII)-Domänen. Auffallend ist, dass beide Patienten mit FnIII-Domänen-Spezifität sehr hohe anti-CNTN1-Autoantikörper Titer und einen chronischen Krankheitsverlauf aufwiesen, während Patienten, die an ein konformationelles Epitop beziehungsweise die Ig- Domänen binden, mit einem schubförmigen oder sogar monophasischen Krankheitsverlauf assoziiert sind. Diese Ergebnisse müssen jedoch noch weiter bestätigt werden, bevor eine klare Aussage getroffen werden kann. Zusammenfassend trägt die vorliegende Studie dazu bei, die Pathogenese von peripheren Neuropathien, die mit anti-paranodalen Autoantikörpern assoziiert sind, aufzuklären. Es sind jedoch weitere Studien erforderlich, die eine größere Anzahl von Patienten einschließen und auch Auswirkungen auf Strukturen wie beispielsweise Spinalganglien neben dem Ranvierschen Schnürring berücksichtigen, um die Krankheitsmechanismen vollständig zu verstehen. KW - Autoantikörper KW - Polyneuropathie KW - Ranvier-Schnürring KW - Pathophysiologie KW - Contactin-1 KW - Neurofascin KW - CIDP KW - Pathogenesis Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-248655 ER - TY - THES A1 - Gerlach, Marius David T1 - Spectroscopy of fulminic acid HCNO with VUV- and soft X-ray radiation T1 - Spektroskopie der Fulminsäure HCNO mit VUV- und weicher Röntgenstrahlung N2 - Die Fulminsäure HCNO wurde zum ersten Mal im Jahre 1800 synthetisiert und wurde seitdem immer wieder verwendet, um neue chemische Konzepte und Theorien zu entwickeln. Durch die erstmalige Entdeckung der Fulminsäure im Weltall im Jahr 2009 ist die Fulminsäure heutzutage vor allem im Bereich der Astrochemie interessant. In dieser Doktorarbeit haben wir die Interaktion von Fulminsäure mit interstellar Strahlung, genauer mit VUV- sowie weicher Röntgenstrahlung untersucht. In Zuge der Messung mit VUV-Strahlung konnten wir das Photoelektronenspektrum von HCNO mit hoher Auflösung aufnehmen und den Renner-Teller verzerrten Grundzustand des Kations mit Hilfe von Wellenpaketdynamiksimulationen beschreiben. Außerdem konnten wir den Mechanismus der dissoziativen Photoionisation bis zu einer Bindungsenergie von 15.3 eV aufklären. Mit weicher Röntgenstrahlung ist es möglich die 1s Elektronen des HCNO zu ionisieren oder anzuregen. Der erzeugte Zustand zerfällt anschließend durch einen Auger-Meitner Prozess, bei dem ein Auger-Elektron erzeugt wird. Im Zuge der Auger-Elektronenspektroskopie haben wir die kinetische Energie dieser Elektronen gemessen und konnten mittels quantenchemischer Rechnung die beobachten Signale analysieren. Wir untersuchten außerdem, wie das durch den Auger-Meitner Prozess erzeugte Ion zerfällt. Hier konnten wir eine Selektivität des Zerfalls beobachten, je nachdem welches der 1s Elektronen im ersten Schritt angeregt oder ionisiert wurde. Diese Beobachtung konnten wir durch ein einfaches thermodynamisches Argument erklären. Diese Arbeit gibt also ein vollständiges Bild über die Interaktion von HCNO mit ionisierender Strahlung. Die erhaltenen Daten könnten für die Beschreibung von HCNO im interstellaren Raum Bedeutung haben. N2 - Fulminic acid, HCNO, was first synthesized in the year 1800 and has since then been used numerous times to develop new chemical theories and concepts. Nowadays, research on HCNO is mainly motivated due to its detection in interstellar space in the year 2009. In this thesis, we investigated the interaction of fulminic acid with VUV- and soft X-ray radiation, i.e., radiation that is also present in the interstellar medium. In our study using VUV radiation, we were able to record the photoelectron spectrum of HCNO with high resolution and we were able to simulate the Renner-Teller distorted ground state of the cation using simulation of wavepacket dynamics. We also elucidated the mechanism of the dissociative photoionisation up to 15.3 eV binding energy. Using soft X-ray radiation enables us to ionise or excite the 1s electrons of HCNO. The created state can decay via an Auger-Meitner process, which produces an Auger electron. We measured the kinetic energy of these auger electron and were able to analyse the observed signals using quantum chemical calculations. We also investigated how the ion fragments after the Auger-Meitner process. We observed a site-selectivity, where the initial ionisation/excitation site influenced the product distribution. We were able to explain this observation with a simple thermodynamic argument. This thesis provides a comprehensive description of the interaction of HCNO with ionising radiation. The obtained data may be valuable for the description of the behaviour of HCNO in interstellar space. KW - Chemie KW - Auger-Spektroskopie KW - Photoelektronenspektroskopie KW - Fulminsäure KW - Astrochemie KW - Kosmochemie Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-329722 ER - TY - THES A1 - Helbig, Tobias Thimo T1 - Theory of eigenstate thermalization T1 - Theorie der Thermalisierung von Quanteneigenzuständen N2 - Next to the emergence of nearly isolated quantum systems such as ultracold atoms with unprecedented experimental tunability, the conceptualization of the eigenstate thermalization hypothesis (ETH) by Deutsch and Srednicki in the late 20th century has sparked exceptional interest in the mechanism of quantum thermalization. The ETH conjectures that the expectation value of a local observable within the quantum state of an isolated, interacting quantum system converges to the thermal equilibrium value at large times caused by a loss of phase coherence, referred to as dephasing. The thermal behavior within the quantum expectation value is traced back to the level of individual eigenstates, who locally act as a thermal bath to subsystems of the full quantum system and are hence locally indistinguishable to thermal states. The ETH has important implications for the understanding of the foundations of statistical mechanics, the quantum-to-classical transition, and the nature of quantum entanglement. Irrespective of its theoretical success, a rigorous proof has remained elusive so far. $$ \ $$ An alternative approach to explain thermalization of quantum states is given by the concept of typicality. Typicality deals with typical states \(\Psi\) chosen from a subspace of Hilbert space with energy \(E\) and small fluctuations \(\delta\) around it. It assumes that the possible microstates of this subspace of Hilbert space are uniformly distributed random vectors. This is inspired by the microcanonical ensemble in classical statistical mechanics, which assumes equal weights for all accessible microstates with energy \(E\) within an energy allowance \(\delta\). It follows from the ergodic hypothesis, which states that the time spent in each part of phase space is proportional to its volume leading to large time averages being equated to ensemble averages. In typicality, the Hilbert space of quantum mechanics is hence treated as an analogue of classical phase space where statistical and thermodynamic properties can be defined. Since typicality merely shifts assumptions of statistical mechanics to the quantum realm, it does not provide a complete understanding of the emergence of thermalization on a fundamental microscopic level. $$ \ $$ To gain insights on quantum thermalization and derive it from a microscopic approach, we exclusively consider the fundamental laws of quantum mechanics. In the joint work with T. Hofmann, R. Thomale and M. Greiter, on which this thesis reports, we explore the ETH in generic local Hamiltonians in a two-dimensional spin-\(1/2\) lattice with random nearest neighbor spin-spin interactions and random on-site magnetic fields. This isolated quantum system is divided into a small subsystem weakly coupled to the remaining part, which is assumed to be large and which we refer to as bath. Eigenstates of the full quantum system as well as the action of local operators on those can then be decomposed in terms of a product basis of eigenstates of the small subsystem and the bath. Central to our analysis is the fact that the coupling between the subsystem and the bath, represented in terms of the uncoupled product eigenbasis, is given by an energy dependent random band matrix, which is obtained from both analytical and numerical considerations. $$ \ $$ Utilizing the methods of Dyson-Brownian random matrix theory for random band matrices, we analytically show that the overlaps of eigenstates of the full quantum system with the uncoupled product eigenbasis are described by Cauchy-Lorentz distributions close to their respective peaks. The result is supported by an extensive numerical study using exact diagonalization, where the numerical parameters for the overlap curve agree with the theoretical calculation. The information on the decomposition of the eigenstates of the full quantum system enables us to derive the reduced density matrix within the small subsystem given the pure density matrix of a single eigenstate. We show that in the large bath limit the reduced density matrix converges to a thermal density matrix with canonical Boltzmann probabilities determined by renormalized energies of the small subsystem which are shifted from their bare values due the influence of the coupling to the bath. The behavior of the reduced density matrix is confirmed through a finite size scaling analysis of the numerical data. Within our calculation, we make use of the pivotal result, that the density of states of a local random Hamiltonian is given by a Gaussian distribution under very general circumstances. As a consequence of our analysis, the quantum expectation value of any local observable in the subsystem agrees with its thermal expectation value, which proves the validity of the ETH in the equilibrium phase for the considered class of random local Hamiltonians and elevates it from hypothesis to theory. $$ \ $$ Our analysis of quantum thermalization solely relies on the application of quantum mechanics to large systems, locality and the absence of integrability. With the self-averaging property of large random matrices, random matrix theory does not entail a statistical assumption, but is rather applied as a mathematical tool to extract information about the behavior of large quantum systems. The canonical distribution of statistical mechanics is derived without resorting to statistical assumptions such as the concepts of ergodicity or maximal entropy, nor assuming any characteristics of quantum states such as in typicality. In future research, with this microscopic approach it may become possible to exactly pinpoint the origin of failure of quantum thermalization, e.g. in systems that exhibit many body localization or many body quantum scars. The theory further enables the systematic investigation of equilibration, i.e. to study the time scales on which thermalization takes place. N2 - Neben der Entwicklung experimentell zugänglicher nahezu isolierter Quantensysteme wie ultrakalter Gase hat die Formulierung der Eigenstate Thermalization Hypothesis (ETH) durch Deutsch und Srednicki im späten 20. Jahrhundert ein gesteigertes Interesse am Mechanismus der Quantenthermalisierung geweckt. Die ETH postuliert, dass der Erwartungswert einer lokalen Observablen innerhalb des Quantenzustands eines isolierten, wechselwirkenden Quantensystems bei großen Zeiten zum thermischen Gleichgewichtswert konvergiert. Dies vollzieht sich durch den Verlust der Phasenkohärenz im Erwartungswert der lokalen Observable, was als Dephasing bekannt ist. Das thermische Verhalten innerhalb des Quantenerwartungswerts wird auf die Ebene einzelner Eigenzustände zurückgeführt, die lokal als thermisches Bad für Untersysteme des gesamten Quantensystems wirken und daher lokal nicht von thermischen Zuständen unterscheidbar sind. Die ETH hat wichtige Auswirkungen auf das Verständnis der Grundlagen der statistischen Mechanik, des Übergangs von der Quanten- zur klassischen Physik und der Natur der Quantenverschränkung. Ungeachtet ihres theoretischen Erfolges ist ein rigoroser Beweis der Hypothese bisher nicht erfolgt. $$ \ $$ Ein alternativer Ansatz zur Erklärung der Thermalisierung von Quantenzuständen ist das Konzept der typicality. Typicality befasst sich mit typischen Zuständen \(\Psi\), die aus einem Unterraum des Hilbertraums mit Energie \(E\) und kleinen Fluktuationen \(\delta\) ausgewählt werden. Dabei wird angenommen, dass die möglichen Mikrozustände dieses Unterraums des Hilbertraums gleichmäßig verteilte Zufallsvektoren sind. Dies ist ein aus dem klassischen mikrokanonischen Ensemble übertragener Ansatz, der von einer Gleichgewichtung aller Mikrozustände mit der Energie \(E\) in einem Energiebereich \(\delta\) ausgeht. Das geht auf die ergodische Hypothese zurück, die besagt, dass die verbrachte Zeit in jedem Teil des klassischen Phasenraums proportional zu dessen Volumen ist. Dies führt schlussendlich zu einer Gleichsetzung der Mittelwerte bei großen Zeiten mit Ensemblemittelwerten. Der Hilbertraum in der Quantenmechanik wird mit typicality daher als Analogon des klassischen Phasenraums behandelt, in dem statistische und thermodynamische Eigenschaften definiert werden können. Da typicality lediglich Annahmen der statistischen Mechanik auf den Quantenbereich überträgt, kann sie kein vollständiges mikroskopisches Bild der Entstehung von Thermalisierung liefern. $$ \ $$ Um Erkenntnisse über die Quantenthermalisierung zu gewinnen und sie aus einem mikroskopischen Ansatz abzuleiten, stützen wir uns ausschließlich auf die grundlegenden Gesetze der Quantenmechanik. In der gemeinsamen Arbeit mit T. Hofmann, R. Thomale und M. Greiter, von der diese Arbeit berichtet, untersuchen wir die ETH in generischen lokalen Hamiltonians in einem zweidimensionalen Spin-\(1/2\)-Gitter mit zufälligen Spin-Spin-Wechselwirkungen zwischen nächsten Nachbarn und zufälligen lokalen Magnetfeldern. Dieses isolierte Quantensystem wird in ein kleines Untersystem aufgeteilt, das schwach an den verbleibenden Teil gekoppelt ist, der als groß angenommen und als Bad bezeichnet wird. Die Eigenzustände des gesamten Quantensystems sowie die Wirkung lokaler Operatoren auf diese können dann in Form einer Produktbasis von Eigenzuständen des kleinen Untersystems und des Bades zerlegt werden. Von zentraler Bedeutung für unsere Analyse ist die Tatsache, dass die Kopplung zwischen dem Untersystem und dem Bad, die in Form der ungekoppelten Produkteigenbasis dargestellt wird, durch eine energieabhängige Zufallsbandmatrix gegeben ist, welche sowohl aus analytischen als auch numerischen Überlegungen gewonnen wird. $$ \ $$ Unter Verwendung der Methoden der mathematischen Theorie für zufällige Bandmatrizen finden wir analytisch heraus, dass der Überlapp von Quanteneigenzuständen mit der ungekoppelten Produkteigenbasis durch Cauchy-Lorentzverteilungen in den Badenergien in der Nähe ihrer jeweiligen Peaks beschrieben werden. Das Ergebnis wird durch eine umfangreiche numerische Studie mit exakter Diagonalisierung bestätigt, bei der die numerischen Parameter für die Überlapps mit der theoretischen Berechnung übereinstimmen. Die Information über die Form der Quanteneigenzustände ermöglicht es uns, die reduzierte Dichtematrix in dem kleinen Untersystem aus der reinen Dichtematrix eines einzelnen Eigenzustandes des isolierten Quantensystems abzuleiten. Wir zeigen, dass sie im Limes großer Bäder zu einer thermischen Dichtematrix mit kanonischen Boltzmann-Gewichten auf der Diagonalen konvergiert. Dies wird mithilfe einer numerischen Skalierungsanalyse für endliche Systeme bestätigt. In unseren Berechnungen verwenden wir das zentrale Ergebnis, dass die Zustandsdichte eines lokalen zufälligen Hamiltonians unter allgemeinen Bedingungen durch eine Gauß-Verteilung gegeben ist. Aus unserer Analyse folgt, dass der Quantenerwartungswert jeder lokalen Observablen in dem Untersystem mit ihrem thermischen Erwartungswert übereinstimmt, was die Gültigkeit der ETH in der Gleichgewichtsphase für die betrachtete Klasse von Hamiltonians beweist. $$ \ $$ Unsere Analyse der Quantenthermalisierung beruht ausschließlich auf der Anwendung der Quantenmechanik auf große Systeme, der Lokalität und der fehlenden Integrabilität. Stützend auf der mathematischen Eigenschaft des Self-averaging von großen Zufallsmatrizen impliziert die Zufallsmatrixtheorie keine statistische Annahme, sondern wird vielmehr als mathematisches Instrument eingesetzt, um Informationen über das Verhalten großer Quantensysteme zu extrahieren. Die kanonische Verteilung der statistischen Mechanik wird abgeleitet, ohne auf die Konzepte der Ergodizität oder der maximalen Entropie zurückzugreifen und ohne irgendwelche Eigenschaften von Quantenzuständen anzunehmen wie es etwa bei typicality der Fall ist. Mit diesem mikroskopischen Ansatz könnte es zudem in zukünftiger Forschung möglich werden, den Ursprung des Nichterfüllens der Quantenthermalisierung, z.B. in Systemen mit Vielteilchenlokalisierung oder Quanten-Scar-Zuständen, exakt zu bestimmen. Die Theorie könnte außerdem eine systematische Untersuchung der Equilibrierung ermöglichen, d.h. die Bestimmung der Zeitskalen, auf denen Thermalisierung stattfindet. KW - Thermalisierung KW - Quantenzustand KW - Quantenthermodynamik KW - Zustandsdichte KW - Stochastische Matrix KW - Eigenstate Thermalization Hypothesis KW - Random Matrix Theory KW - Exact Diagonalization KW - Thermal equilibrium KW - Quantum spin lattices KW - Density of states KW - Quantum information KW - Reduced density matrix Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-329968 ER - TY - THES A1 - Marquardt, André T1 - Machine-Learning-Based Identification of Tumor Entities, Tumor Subgroups, and Therapy Options T1 - Bestimmung von Tumorentitäten, Tumorsubgruppen und Therapieoptionen basierend auf maschinellem Lernen N2 - Molecular genetic analyses, such as mutation analyses, are becoming increasingly important in the tumor field, especially in the context of therapy stratification. The identification of the underlying tumor entity is crucial, but can sometimes be difficult, for example in the case of metastases or the so-called Cancer of Unknown Primary (CUP) syndrome. In recent years, methylome and transcriptome utilizing machine learning (ML) approaches have been developed to enable fast and reliable tumor and tumor subtype identification. However, so far only methylome analysis have become widely used in routine diagnostics. The present work addresses the utility of publicly available RNA-sequencing data to determine the underlying tumor entity, possible subgroups, and potential therapy options. Identification of these by ML - in particular random forest (RF) models - was the first task. The results with test accuracies of up to 99% provided new, previously unknown insights into the trained models and the corresponding entity prediction. Reducing the input data to the top 100 mRNA transcripts resulted in a minimal loss of prediction quality and could potentially enable application in clinical or real-world settings. By introducing the ratios of these top 100 genes to each other as a new database for RF models, a novel method was developed enabling the use of trained RF models on data from other sources. Further analysis of the transcriptomic differences of metastatic samples by visual clustering showed that there were no differences specific for the site of metastasis. Similarly, no distinct clusters were detectable when investigating primary tumors and metastases of cutaneous skin melanoma (SKCM). Subsequently, more than half of the validation datasets had a prediction accuracy of at least 80%, with many datasets even achieving a prediction accuracy of – or close to – 100%. To investigate the applicability of the used methods for subgroup identification, the TCGA-KIPAN dataset, consisting of the three major kidney cancer subgroups, was used. The results revealed a new, previously unknown subgroup consisting of all histopathological groups with clinically relevant characteristics, such as significantly different survival. Based on significant differences in gene expression, potential therapeutic options of the identified subgroup could be proposed. Concludingly, in exploring the potential applicability of RNA-sequencing data as a basis for therapy prediction, it was shown that this type of data is suitable to predict entities as well as subgroups with high accuracy. Clinical relevance was also demonstrated for a novel subgroup in renal cell carcinoma. The reduction of the number of genes required for entity prediction to 100 genes, enables panel sequencing and thus demonstrates potential applicability in a real-life setting. N2 - Molekulargenetische Analysen, wie z. B. Mutationsanalysen, gewinnen im Tumorbereich zunehmend an Bedeutung, insbesondere im Zusammenhang mit der Therapiestratifizierung. Die Identifizierung der zugrundeliegenden Tumorentität ist von entscheidender Bedeutung, kann sich aber manchmal als schwierig erweisen, beispielsweise im Falle von Metastasen oder dem sogenannten Cancer of Unknown Primary (CUP)-Syndrom. In den letzten Jahren wurden Methylom- und Transkriptom-Ansätze mit Hilfe des maschinellen Lernens (ML) entwickelt, die eine schnelle und zuverlässige Identifizierung von Tumoren und Tumorsubtypen ermöglichen. Bislang werden jedoch nur Methylomanalysen in der Routinediagnostik eingesetzt. Die vorliegende Arbeit befasst sich mit dem Nutzen öffentlich zugänglicher RNA-Sequenzierungsdaten zur Bestimmung der zugrunde liegenden Tumorentität, möglicher Untergruppen und potenzieller Therapieoptionen. Die Identifizierung dieser durch ML - insbesondere Random-Forest (RF)-Modelle - war die erste Aufgabe. Die Ergebnisse mit Testgenauigkeiten von bis zu 99 % lieferten neue, bisher unbekannte Erkenntnisse über die trainierten Modelle und die entsprechende Entitätsvorhersage. Die Reduktion der Eingabedaten auf die 100 wichtigsten mRNA-Transkripte führte zu einem minimalen Verlust an Vorhersagequalität und könnte eine Anwendung in klinischen oder realen Umgebungen ermöglichen. Durch die Einführung des Verhältnisses dieser Top 100 Gene zueinander als neue Datenbasis für RF-Modelle wurde eine neuartige Methode entwickelt, die die Verwendung trainierter RF-Modelle auf Daten aus anderen Quellen ermöglicht. Eine weitere Analyse der transkriptomischen Unterschiede von metastatischen Proben durch visuelles Clustering zeigte, dass es keine für den Ort der Metastasierung spezifischen Unterschiede gab. Auch bei der Untersuchung von Primärtumoren und Metastasen des kutanen Hautmelanoms (SKCM) konnten keine unterschiedlichen Cluster festgestellt werden. Mehr als die Hälfte der Validierungsdatensätze wiesen eine Vorhersagegenauigkeit von mindestens 80% auf, wobei viele Datensätze sogar eine Vorhersagegenauigkeit von 100% oder nahezu 100% erreichten. Um die Anwendbarkeit der verwendeten Methoden zur Identifizierung von Untergruppen zu untersuchen, wurde der TCGA-KIPAN-Datensatz verwendet, welcher die drei wichtigsten Nierenkrebs-Untergruppen umfasst. Die Ergebnisse enthüllten eine neue, bisher unbekannte Untergruppe, die aus allen histopathologischen Gruppen mit klinisch relevanten Merkmalen, wie z. B. einer signifikant unterschiedlichen Überlebenszeit, besteht. Auf der Grundlage signifikanter Unterschiede in der Genexpression konnten potenzielle therapeutische Optionen für die identifizierte Untergruppe vorgeschlagen werden. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass bei der Untersuchung der potenziellen Anwendbarkeit von RNA-Sequenzierungsdaten als Grundlage für die Therapievorhersage gezeigt werden konnte, dass diese Art von Daten geeignet ist, sowohl Entitäten als auch Untergruppen mit hoher Genauigkeit vorherzusagen. Die klinische Relevanz wurde auch für eine neue Untergruppe beim Nierenzellkarzinom demonstriert. Die Verringerung der für die Entitätsvorhersage erforderlichen Anzahl von Genen auf 100 Gene ermöglicht die Sequenzierung von Panels und zeigt somit die potenzielle Anwendbarkeit in der Praxis. KW - Maschinelles Lernen KW - Krebs KW - Tumor KW - Sequenzdaten KW - Random Forest KW - Vorhersage KW - RNA-Sequenzierung KW - Prognose Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-329548 ER - TY - THES A1 - Hugo, Julian T1 - ‘Signal-close-to-noise’ calcium activity reflects neuronal excitability T1 - ‘Signal-close-to-noise’ Kalziumaktivität als Ausdruck neuronaler Erregbarkeit N2 - Chronic pain conditions are a major reason for the utilization of the health care system. Inflammatory pain states can persist facilitated by peripheral sensitization of nociceptors. The voltage-gated sodium channel 1.9 (NaV1.9) is an important regulator of neuronal excitability and is involved in inflammation-induced pain hypersensitivity. Recently, oxidized 1-palmitoyl-2-arachidonoyl-sn-glycerol-3-phosphatidylcholine (OxPAPC) was identified as a mediator of acute inflammatory pain and persistent hyperalgesia, suggesting an involvement in proalgesic cascades and peripheral sensitization. Peripheral sensitization implies an increase in neuronal excitability. This thesis aims to characterize spontaneous calcium activity in neuronal compartments as a proxy to investigate neuronal excitability, making use of the computational tool Neural Activity Cubic (NA3). NA3 allows automated calcium activity event detection of signal-close-to-noise calcium activity and evaluation of neuronal activity states. Additionally, the influence of OxPAPC and NaV1.9 on the excitability of murine dorsal root ganglion (DRG) neurons and the effect of OxPAPC on the response of DRG neurons towards other inflammatory mediators (prostaglandin E2, histamine, and bradykinin) is investigated. Using calcium imaging, the presence of spontaneous calcium activity in murine DRG neurons was established. NA3 was used to quantify this spontaneous calcium activity, which revealed decreased activity counts in axons and somata of NaV1.9 knockout (KO) neurons compared to wildtype (WT). Incubation of WT DRG neurons with OxPAPC before calcium imaging did not show altered activity counts compared to controls. OxPAPC incubation also did not modify the response of DRG neurons treated with inflammatory mediators. However, the variance ratio computed by NA3 conclusively allowed to determine neuronal activity states. In conclusion, my findings indicate an important function of NaV1.9 in determining the neuronal excitability of DRG neurons in resting states. OxPAPC exposition does not influence neuronal excitability nor sensitizes neurons for other inflammatory mediators. This evidence reduces the primary mechanism of OxPAPC-induced hyperalgesia to acute effects. Importantly, it was possible to establish an approach for unbiased excitability quantification of DRG neurons by calcium activity event detection and calcium trace variance analysis by NA3. It was possible to show that signal-close-to-noise calcium activity reflects neuronal excitability states. N2 - Entzündliche Schmerzzustände können lange fortbestehen, was durch eine periphere Sensibilisierung von Nozizeptoren begünstigt wird. Der spannungsgesteuerte Natriumkanal 1.9 (NaV1.9) ist ein wichtiger Regulator neuronaler Erregbarkeit und ist nachweislich an entzündungsbedingter Schmerzüberempfindlichkeit beteiligt. Kürzlich wurde oxidiertes 1-Palmitoyl-2-arachidonoyl-sn-glycerol-3-phosphatidylcholin (OxPAPC) als Mediator akuter Entzündungsschmerzen und anhaltender Hyperalgesie identifiziert, was auf eine Beteiligung an Mechanismen der peripheren Sensibilisierung hindeutet. Periphere Sensibilisierung setzt eine Erhöhung der neuronalen Erregbarkeit voraus. In dieser Arbeit soll neuronale spontane Kalziumaktivität charakterisiert werden, um Rückschlüsse auf die neuronale Erregbarkeit zu ziehen. Dazu wurde das Tool Neural Activity Cubic (NA3) eingesetzt, welches die automatisierte Detektion von „signal-close-to-noise“ Kalziumaktivitätsereignissen und die Bewertung neuronaler Aktivitätszustände erlaubt. Mittels NA3 wurde der Einfluss von OxPAPC und NaV1.9 auf die Erregbarkeit von murinen Spinalganglion (DRG)-Neuronen untersucht. Zusätzlich wurde die Reaktion von DRG-Neuronen auf weitere Entzündungsmediatoren (Prostaglandin E2, Histamin und Bradykinin) nach Inkubation mit OxPAPC beurteilt. Mittels Calcium-Imaging konnte spontane Kalziumaktivität in murinen DRG-Neuronen identifiziert werden. NA3 wurde verwendet, um diese spontane Kalziumaktivität zu quantifizieren. NaV1.9 Knockout-Neuronen (KO) zeigten signifikant Verringerte Kalziumaktivität im Vergleich Wildtyp (WT)-Neuronen. Die Inkubation von WT-Neuronen mit OxPAPC vor Calcium-Imaging resultierte in unveränderter Kalziumaktivität. Eine OxPAPC-Inkubation hatte ebenso keinen Einfluss auf die Reaktion von DRG-Neuronen, die mit einem Gemisch aus Entzündungsmediatoren stimuliert wurden. Die von NA3 berechnete „variance ratio“ ermöglichte jedoch eine eindeutige Bestimmung der neuronalen Aktivitätszustände. Zusammenfassend weisen meine Ergebnisse auf eine wichtige Funktion von NaV1.9 bei der Bestimmung der neuronalen Erregbarkeit von DRG-Neuronen im Ruhezustand hin. Eine Exposition mit OxPAPC beeinflusst allerdings weder die neuronale Erregbarkeit noch werden Neuronen für andere Entzündungsmediatoren sensibilisiert. Dies legt akute Effekte als primären Mechanismus der OxPAPC-induzierten Hyperalgesie nahe. Es war möglich, eine Methode für die unverzerrte Quantifizierung neuronaler Erregbarkeit von durch die Erkennung von Kalziumaktivitätsereignissen und die Varianzanalyse von Kalziumsignalen mit NA3 zu etablieren. Es konnte gezeigt werden, dass die „signal-close-to-noise“ Kalziumaktivität den Zustand der neuronalen Erregbarkeit widerspiegelt. KW - Entzündung KW - Schmerz KW - Natriumkanal KW - Erregbarkeit KW - Phospholipide KW - neuronal excitability KW - NaV1.9 KW - inflammatory pain KW - calcium activity Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-292605 ER - TY - THES A1 - Bergmann Borges, Alyssa T1 - The endo-lysosomal system of \(Trypanosoma\) \(brucei\): insights from a protist cell model T1 - Das Endo-lysosomale System von \(Trypanosoma\) \(brucei\): Erkenntnisse aus einem Protisten-Zellmodell N2 - Most of the studies in cell biology primarily focus on models from the opisthokont group of eukaryotes. However, opisthokonts do not encompass the full diversity of eukaryotes. Thus, it is necessary to broaden the research focus to other organisms to gain a comprehensive understanding of basic cellular processes shared across the tree of life. In this sense, Trypanosoma brucei, a unicellular eukaryote, emerges as a viable alternative. The collaborative efforts in genome sequencing and protein tagging over the past two decades have significantly expanded our knowledge on this organism and have provided valuable tools to facilitate a more detailed analysis of this parasite. Nevertheless, numerous questions still remain. The survival of T. brucei within the mammalian host is intricately linked to the endo-lysosomal system, which plays a critical role in surface glycoprotein recycling, antibody clearance, and plasma membrane homeostasis. However, the dynamics of the duplication of the endo-lysosomal system during T. brucei proliferation and its potential relationship with plasma membrane growth remain poorly understood. Thus, as the primary objective, this thesis explores the endo-lysosomal system of T. brucei in the context of the cell cycle, providing insights on cell surface growth, endosome duplication, and clathrin recruitment. In addition, the study revisits ferritin endocytosis to provide quantitative data on the involvement of TbRab proteins (TbRab5A, TbRab7, and TbRab11) and the different endosomal subpopulations (early, late, and recycling endosomes, respectively) in the transport of this fluid-phase marker. Notably, while these subpopulations function as distinct compartments, different TbRabs can be found within the same region or structure, suggesting a potential physical connection between the endosomal subpopulations. The potential physical connection of endosomes is further explored within the context of the cell cycle and, finally, the duplication and morphological plasticity of the lysosome are also investigated. Overall, these findings provide insights into the dynamics of plasma membrane growth and the coordinated duplication of the endo-lysosomal system during T. brucei proliferation. The early duplication of endosomes suggests their potential involvement in plasma membrane growth, while the late duplication of the lysosome indicates a reduced role in this process. The recruitment of clathrin and TbRab GTPases to the site of endosome formation supports the assumption that the newly formed endosomal system is active during cell division and, consequently, indicates its potential role in plasma membrane homeostasis. Furthermore, considering the vast diversity within the Trypanosoma genus, which includes ~500 described species, the macroevolution of the group was investigated using the combined information of the 18S rRNA gene sequence and structure. The sequence-structure analysis of T. brucei and other 42 trypanosome species was conducted in the context of the diversity of Trypanosomatida, the order in which trypanosomes are placed. An additional analysis focused on Trypanosoma highlighted key aspects of the group’s macroevolution. To explore these aspects further, additional trypanosome species were included, and the changes in the Trypanosoma tree topology were analyzed. The sequence-structure phylogeny confirmed the independent evolutionary history of the human pathogens T. brucei and Trypanosoma cruzi, while also providing insights into the evolution of the Aquatic clade, paraphyly of groups, and species classification into subgenera. N2 - Die meisten Studien in der Zellbiologie konzentrieren sich in erster Linie auf Modelle aus der Opisthokont-Gruppe der Eukaryonten. Die Opisthokonten umfassen jedoch nicht die gesamte Vielfalt der Eukaryonten. Daher ist es notwendig, den Forschungsschwerpunkt auf andere Organismen auszuweiten, um ein umfassendes Verständnis grundlegender zellulärer Prozesse zu erlangen, die im gesamten Lebensbaum vorkommen. In diesem Sinne stellt Trypanosoma brucei, ein einzelliger Eukaryote, eine brauchbare Alternative dar. Die gemeinsamen Anstrengungen bei der Genomsequenzierung und der Markierung von Proteinen in den letzten zwei Jahrzehnten haben unser Wissen über diesen Organismus erheblich erweitert und wertvolle Instrumente für eine detailliertere Analyse dieses Parasiten bereitgestellt. Dennoch bleiben noch zahlreiche Fragen offen. Das Überleben von T. brucei im Säugetierwirt ist eng mit dem endo-lysosomalen System verknüpft, das eine entscheidende Rolle beim Recycling von Oberflächenglykoproteinen, der Antikörper-Clearance und der Homöostase der Plasmamembran spielt. Die Dynamik der Verdoppelung des endo-lysosomalen Systems während der Vermehrung von T. brucei und seine mögliche Beziehung zum Wachstum der Plasmamembran sind jedoch noch wenig bekannt. In dieser Arbeit wird daher das endo-lysosomale System von T. brucei im Kontext des Zellzyklus untersucht, um Erkenntnisse über das Wachstum der Zelloberfläche, die Verdopplung der Endosomen und die Clathrin-Rekrutierung zu gewinnen. Darüber hinaus wird in der Studie die Ferritin-Endozytose erneut untersucht, um quantitative Daten über die Beteiligung der TbRab-Proteine (TbRab5A, TbRab7 und TbRab11) und der verschiedenen endosomalen Subpopulationen (frühe, späte bzw. Recycling-Endosomen) am Transport dieses Flüssigphasenmarkers zu erhalten. Bemerkenswert ist, dass diese Subpopulationen zwar als unterschiedliche Kompartimente fungieren, aber verschiedene TbRabs in derselben Region oder Struktur gefunden werden können, was auf eine mögliche physische Verbindung zwischen den endosomalen Subpopulationen hindeutet. Die potenzielle physikalische Verbindung von Endosomen wird im Zusammenhang mit dem Zellzyklus weiter erforscht, und schließlich werden auch die Verdopplung und die morphologische Plastizität des Lysosoms untersucht. Insgesamt bieten diese Ergebnisse Einblicke in die Dynamik des Plasmamembranwachstums und die koordinierte Verdopplung des endo-lysosomalen Systems während der Proliferation von T. brucei. Die frühe Verdoppelung der Endosomen deutet auf ihre mögliche Beteiligung am Plasmamembranwachstum hin, während die späte Verdoppelung der Lysosomen auf eine geringere Rolle in diesem Prozess hindeutet. Die Rekrutierung von Clathrin- und TbRab-GTPasen an der Stelle der Endosomenbildung unterstützt die Annahme, dass das neu gebildete endosomale System während der Zellteilung aktiv ist, und deutet folglich auf seine potenzielle Rolle bei der Homöostase der Plasmamembran hin. In Anbetracht der enormen Vielfalt innerhalb der Gattung Trypanosoma, die etwa 500 beschriebene Arten umfasst, wurde die Makroevolution der Gruppe anhand der kombinierten Informationen der 18S rRNA-Gensequenz und Struktur untersucht. Die Sequenz-Struktur-Analyse von T. brucei und anderen 42 Trypanosomen-Arten wurde im Zusammenhang mit der Vielfalt der Trypanosomatida, der Ordnung, in die Trypanosomen eingeordnet werden, durchgeführt. Eine zusätzliche Analyse, die sich auf Trypanosoma konzentrierte, hob Schlüsselaspekte der Makroevolution dieser Gruppe hervor. Um diese Aspekte weiter zu erforschen, wurden zusätzliche Trypanosomenarten einbezogen und die Veränderungen in der Topologie des Trypanosoma-Baums analysiert. Die Sequenz-Struktur-Phylogenie bestätigte die unabhängige Evolutionsgeschichte der humanen Krankheitserreger T. brucei und Trypanosoma cruzi, während sie gleichzeitig Einblicke in die Evolution der aquatischen Klade, die Paraphylie von Gruppen und die Klassifizierung der Arten in Untergattungen lieferte. KW - 18S rRNA KW - Endocytose KW - Zellzyklus KW - Phylogenie KW - Endocytosis KW - Cell cycle KW - Trypanosoma KW - Phylogeny KW - Sequence-Structure KW - Endosomes KW - Lysosome Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-329248 ER - TY - THES A1 - Bleier, Michael T1 - Underwater Laser Scanning - Refractive Calibration, Self-calibration and Mapping for 3D Reconstruction T1 - Laserscanning unter Wasser - Refraktive Kalibrierung, Selbstkalibrierung und Kartierung zur 3D Rekonstruktion N2 - There is great interest in affordable, precise and reliable metrology underwater: Archaeologists want to document artifacts in situ with high detail. In marine research, biologists require the tools to monitor coral growth and geologists need recordings to model sediment transport. Furthermore, for offshore construction projects, maintenance and inspection millimeter-accurate measurements of defects and offshore structures are essential. While the process of digitizing individual objects and complete sites on land is well understood and standard methods, such as Structure from Motion or terrestrial laser scanning, are regularly applied, precise underwater surveying with high resolution is still a complex and difficult task. Applying optical scanning techniques in water is challenging due to reduced visibility caused by turbidity and light absorption. However, optical underwater scanners provide significant advantages in terms of achievable resolution and accuracy compared to acoustic systems. This thesis proposes an underwater laser scanning system and the algorithms for creating dense and accurate 3D scans in water. It is based on laser triangulation and the main optical components are an underwater camera and a cross-line laser projector. The prototype is configured with a motorized yaw axis for capturing scans from a tripod. Alternatively, it is mounted to a moving platform for mobile mapping. The main focus lies on the refractive calibration of the underwater camera and laser projector, the image processing and 3D reconstruction. For highest accuracy, the refraction at the individual media interfaces must be taken into account. This is addressed by an optimization-based calibration framework using a physical-geometric camera model derived from an analytical formulation of a ray-tracing projection model. In addition to scanning underwater structures, this work presents the 3D acquisition of semi-submerged structures and the correction of refraction effects. As in-situ calibration in water is complex and time-consuming, the challenge of transferring an in-air scanner calibration to water without re-calibration is investigated, as well as self-calibration techniques for structured light. The system was successfully deployed in various configurations for both static scanning and mobile mapping. An evaluation of the calibration and 3D reconstruction using reference objects and a comparison of free-form surfaces in clear water demonstrate the high accuracy potential in the range of one millimeter to less than one centimeter, depending on the measurement distance. Mobile underwater mapping and motion compensation based on visual-inertial odometry is demonstrated using a new optical underwater scanner based on fringe projection. Continuous registration of individual scans allows the acquisition of 3D models from an underwater vehicle. RGB images captured in parallel are used to create 3D point clouds of underwater scenes in full color. 3D maps are useful to the operator during the remote control of underwater vehicles and provide the building blocks to enable offshore inspection and surveying tasks. The advancing automation of the measurement technology will allow non-experts to use it, significantly reduce acquisition time and increase accuracy, making underwater metrology more cost-effective. N2 - Das Interesse an präziser, zuverlässiger und zugleich kostengünstiger Unterwassermesstechnik ist groß. Beispielsweise wollen Archäologen Artefakte in situ mit hoher Detailtreue dokumentieren und in der Meeresforschung benötigen Biologen Messwerkzeuge zur Beobachtung des Korallenwachstums. Auch Geologen sind auf Messdaten angewiesen, um Sedimenttransporte zu modellieren. Darüber hinaus ist für die Errichtung von Offshore-Bauwerken, sowie deren Wartung und Inspektion eine millimetergenaue Vermessung von vorhandenen Strukturen und Defekten unerlässlich. Während die Digitalisierung einzelner Objekte und ganzer Areale an Land gut erforscht ist und verschiedene Standardmethoden, wie zum Beispiel Structure from Motion oder terrestrisches Laserscanning, regelmäßig eingesetzt werden, ist die präzise und hochauflösende Unterwasservermessung nach wie vor eine komplexe und schwierige Aufgabe. Die Anwendung optischer Messtechnik im Wasser ist aufgrund der eingeschränkten Sichttiefe durch Trübung und Lichtabsorption eine Herausforderung. Optische Unterwasserscanner bieten jedoch Vorteile hinsichtlich der erreichbaren Auflösung und Genauigkeit gegenüber akustischen Systemen. In dieser Arbeit werden ein Unterwasser-Laserscanning-System und die Algorithmen zur Erzeugung von 3D-Scans mit hoher Punktdichte im Wasser vorgestellt. Es basiert auf Lasertriangulation und die optischen Hauptkomponenten sind eine Unterwasserkamera und ein Kreuzlinienlaserprojektor. Das System ist mit einer motorisierten Drehachse ausgestattet, um Scans von einem Stativ aus aufzunehmen. Alternativ kann es von einer beweglichen Plattform aus für mobile Kartierung eingesetzt werden. Das Hauptaugenmerk liegt auf der refraktiven Kalibrierung der Unterwasserkamera und des Laserprojektors, der Bildverarbeitung und der 3D-Rekonstruktion. Um höchste Genauigkeit zu erreichen, muss die Brechung an den einzelnen Medienübergängen berücksichtigt werden. Dies wird durch ein physikalisch-geometrisches Kameramodell, das auf einer analytischen Beschreibung der Strahlenverfolgung basiert, und ein optimierungsbasiertes Kalibrierverfahren erreicht. Neben dem Scannen von Unterwasserstrukturen wird in dieser Arbeit auch die 3D-Erfassung von teilweise im Wasser befindlichen Strukturen und die Korrektur der dabei auftretenden Brechungseffekte vorgestellt. Da die Kalibrierung im Wasser komplex und zeitintensiv ist, wird die Übertragung einer Kalibrierung des Scanners in Luft auf die Bedingungen im Wasser ohne Neukalibrierung, sowie die Selbstkalibrierung für Lichtschnittverfahren untersucht. Das System wurde in verschiedenen Konfigurationen sowohl für statisches Scannen als auch für die mobile Kartierung erfolgreich eingesetzt. Die Validierung der Kalibrierung und der 3D-Rekonstruktion anhand von Referenzobjekten und der Vergleich von Freiformflächen in klarem Wasser zeigen das hohe Genauigkeitspotenzial im Bereich von einem Millimeter bis weniger als einem Zentimeter in Abhängigkeit von der Messdistanz. Die mobile Unterwasserkartierung und Bewegungskompensation anhand visuell-inertialer Odometrie wird mit einem neuen optischen Unterwasserscanner auf Basis der Streifenprojektion demonstriert. Dabei ermöglicht die kontinuierliche Registrierung von Einzelscans die Erfassung von 3D-Modellen von einem Unterwasserfahrzeug aus. Mit Hilfe von parallel aufgenommenen RGB-Bildern werden dabei farbige 3D-Punktwolken der Unterwasserszenen erstellt. Diese 3D-Karten dienen beispielsweise dem Bediener bei der Fernsteuerung von Unterwasserfahrzeugen und bilden die Grundlage für Offshore-Inspektions- und Vermessungsaufgaben. Die fortschreitende Automatisierung der Messtechnik wird somit auch eine Verwendung durch Nichtfachleute ermöglichen und gleichzeitig die Erfassungszeit erheblich verkürzen und die Genauigkeit verbessern, was die Vermessung im Wasser kostengünstiger und effizienter macht. T3 - Forschungsberichte in der Robotik = Research Notes in Robotics - 28 KW - Selbstkalibrierung KW - Punktwolke KW - Bildverarbeitung KW - 3D Reconstruction KW - Self-calibration KW - Underwater Scanning KW - Underwater Mapping KW - Dreidimensionale Rekonstruktion KW - 3D-Rekonstruktion Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-322693 SN - 978-3-945459-45-4 ER - TY - THES A1 - Mott, Kristina T1 - Regulation of platelet biogenesis in the native and myeloablated bone marrow niche T1 - Die Regulation der Thrombozytenbiogenese im nativen und myeloablatierten Knochenmark N2 - Megakaryocytes (MKs) are the largest cells of the hematopoietic system and the precursor cells of platelets. During proplatelet formation (PPF) bone marrow (BM) MKs extent large cytoplasmic protrusions into the lumen of sinusoidal blood vessels. Under homeostatic conditions PPF occurs exclusively in the direction of the sinusoid, while platelet generation into the marrow cavity is prevented. So far, the mechanisms regulating this process in vivo are still not completely understood, especially when PPF is deregulated during disease. This thesis investigated the mechanisms of PPF in native BM and after myeloablation by total body irradiation (TBI). First, we have identified a specialized type of BM stromal cells, so called CXCL12-abundant reticular (CAR) cells, as novel possible regulators of PPF. By using complementary high-resolution microscopy techniques, we have studied the morphogenetic events at the MK/vessel wall interface in new detail, demonstrating that PPF formation preferentially occurs at CAR cell-free sites at the endothelium. In the second part of this thesis, we analyzed the processes leading to BM remodeling in response to myeloablation by TBI. We used confocal laser scanning microscopy (CLSM) to study the kinetic of radiation-triggered vasodilation and mapped extracellular matrix (ECM) proteins after TBI. We could demonstrate that collagen type IV and laminin α5 are specifically degraded at BM sinusoids. At the radiation-injured vessel wall we observed ectopic release of platelet-like particles into the marrow cavity concomitantly to aberrant CAR cell morphology, suggesting that the balance of factors regulating PPF is disturbed after TBI. ECM proteolysis is predominantly mediated by the matrix metalloproteinase MMP9, as revealed by gelatin-zymography and by a newly established BM in situ zymography technique. In transgenic mice lacking MMP9 vascular recovery was delayed, hinting towards a role of MMP9 in vessel reconstitution after myeloablation. In a third series of experiments, we studied the irradiated BM in the context of hematopoietic stem cell transplantation (HSCT). By using mice as BM donors that ubiquitously express the fluorescent reporter protein dsRed we tracked engraftment of donor cells and especially MKs in the recipient BM. We found a distinct engraftment pattern and cluster formation for MKs, which is different from other blood cell lineages. Finally, we assessed platelet function after TBI and HSCT and were the first to demonstrate that platelets become massively hyporeactive, particularly upon stimulation of the collagen receptor GPVI. In summary, our findings shed light on the processes of PPF during health and disease which will help to develop treatments for aberrant thrombopoiesis. N2 - Megakaryozyten (MKs) sind die größten Zellen des hämatopoetischen Systems und die Vorläuferzellen der Blutplättchen. Während der Ausbildung von Proplättchen schnüren MKs im Knochenmark (KM) große zytoplasmatische Ausläufer in das Lumen der sinusoidalen Blutgefäße ab. Unter homöostatischen Bedingungen erfolgt die Proplättchenbildung ausschließlich in Richtung der Sinusoide, während die Thrombozytenbildung in die Knochenmarkkavität verhindert wird. Bislang sind die Mechanismen, die diesen Prozess in vivo steuern, noch nicht vollständig aufgeklärt insbesondere, wenn die Thrombozytenbiogenese unter Krankheitsbedingungen dereguliert ist. In dieser Arbeit wurden die Mechanismen der Thrombopoese im nativen Knochenmark und nach Myeloablation durch Ganzkörperbestrahlung (total body irradiation, TBI) untersucht. Zunächst haben wir einen spezialisierten Typ von KM-Stromazellen, die sog. CXCL12-abundant reticular (CAR) Zellen, als neue mögliche Regulatoren der Proplättchenbildung identifiziert. Durch den Einsatz komplementärer hochauflösender Mikroskopietechniken haben wir die morphogenetischen Vorgänge an der Schnittstelle zwischen MKs und Gefäßwand genauer untersucht und gezeigt, dass die Generierung von Proplättchen bevorzugt an CAR-Zell-freien Stellen am Endothel stattfindet. Im zweiten Teil dieser Arbeit analysierten wir die Prozesse, die zum Knochenmarkumbau nach Myeloablation durch TBI führen. Mit Hilfe von konfokaler Laser-Scanning-Mikroskopie untersuchten wir die Kinetik der strahleninduzierten Vasodilatation und kartierten die extrazelluläre Matrix (EZM) Proteine nach TBI. So konnten wir zeigen, dass Kollagen Typ IV und Laminin α5 spezifisch an den Knochenmarksinusoiden abgebaut werden. An der strahlengeschädigten Gefäßwand beobachteten wir die ektope Freisetzung plättchenartiger Partikel in die Knochenmarkkavität, die mit einer abnormalen CAR-Zellmorphologie einherging. Dies weist darauf hin, dass das Gleichgewicht der Faktoren, die die gerichtete Proplättchenbildung regulieren, nach TBI gestört ist. Die EZM-Proteolyse wird vor allem durch die Matrix-Metalloproteinase MMP9 vermittelt, was durch Gelatine-Zymographie und durch eine neu etablierte in situ Zymographie-Technik für das Knochenmark nachgewiesen wurde. Bei transgenen Mäusen, die defizient für MMP9 sind, war die Regeneration der Vaskulatur verzögert, was auf eine Rolle von MMP9 bei der Gefäßrekonstitution nach Myeloablation hindeutet. In einer dritten Versuchsreihe untersuchten wir das bestrahlte KM im Rahmen einer hämatopoetischen Stammzelltransplantation (HSZT). Mit Hilfe von Mäusen als KM-Spender, die ubiquitär das fluoreszierende Reporterprotein dsRed exprimieren, verfolgten wir das Anwachsen von Spenderzellen und insbesondere von MKs im Empfängerknochenmark. Wir beobachteten ein eindeutiges Muster bzw. Clusterbildung für anwachsende MKs, die sich von anderen Blutzelllinien unterschied. Schließlich untersuchten wir die Funktion von Thrombozyten nach TBI und HSZT und konnten als erste zeigen, dass Thrombozyten eine massive Hyporeaktivität ausbilden, insbesondere nach Stimulation des Kollagenrezeptors GPVI. Zusammenfassend geben unsere Ergebnisse Aufschluss über die Prozesse der Thrombopoese im nativen und pathologischen Knochenmark, was zur Entwicklung von Therapien zu Behandlung von defekter Thrombozytenbiogenese beitragen wird. KW - Knochenmark KW - Knochenmarktransplantation KW - Megakaryozyt KW - Thrombozyt KW - Ganzkörperbestrahlung KW - bone marrow KW - myeloablation KW - thrombopoiesis Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-289630 ER - TY - THES A1 - Bauer, Carsten T1 - Learning Curve Effects in Hospitals as Highly Specialized Expert Organizations T1 - Lernkurveneffekte in Krankenhäusern als hochspezialisierte Expertenorganisationen N2 - The collection at hand is concerned with learning curve effects in hospitals as highly specialized expert organizations and comprises four papers, each focusing on a different aspect of the topic. Three papers are concerned with surgeons, and one is concerned with the staff of the emergency room in a conservative treatment. The preface compactly addresses the steadily increasing health care costs and economic pressure, the hospital landscape in Germany as well as its development. Furthermore, the DRG lump-sum compensation and the characteristics of the health sector, which is strongly regulated by the state and in which ethical aspects must be omnipresent, are outlined. Besides, the benefit of knowing about learning curve effects in order to cut costs and to keep quality stable or even improve it, is addressed. The first paper of the collection investigates the learning effects in a hospital which has specialized on endoprosthetics (total hip and knee replacement). Doing so, the specialized as well as the non-specialized interventions are studied. Costs are not investigated directly, but cost indicators. The indicator of costs in the short term are operating room times. The one of medium- to long-term costs is quality. It is operationalized by complications in the post-anesthesia care unit. The study estimates regression models (OLS and logit). The results indicate that the specialization comes along with advantages due to learning effects in terms of shorter operating room times and lower complication rates in endoprosthetic interventions. For the non-specialized interventions, the results are the same. There are no possibly negative effects of specialization on non-specialized surgeries, but advantageous spillover effects. Altogether, the specialization can be regarded as reasonable, as it cuts costs of all surgeries in the short, medium, and long term. The authors are Carsten Bauer, Nele Möbs, Oliver Unger, Andrea Szczesny, and Christian Ernst. In the second paper surgeons’ learning curves effects in a teamwork vs. an individual work setting are in the focus of interest. Thus, the study combines learning curve effects with teamwork in health care, an issue increasingly discussed in recent literature. The investigated interventions are tonsillectomies (surgical excision of the palatine tonsils), a standard intervention. The indicator of costs in the short and medium to long term are again operating room times and complications as a proxy for quality respectively. Complications are secondary bleedings, which usually occur a few days after surgery. The study estimates regression models (OLS and logit). The results show that operating room times decrease with increasing surgeon’s experience. Surgeons who also operate in teams learn faster than the ones always operating on their own. Thus, operating room times are shorter for surgeons who also take part in team interventions. As a special feature, the data set contains the costs per case. This enables assuring that the assumed cost indicators are valid. The findings recommend team surgeries especially for resident physicians. The authors are Carsten Bauer, Oliver Unger, and Martin Holderried. The third paper is dedicated to stapes surgery, a therapy for conductive hearing loss caused by otosclerosis (overflow bone growth). It is conceptually simple, but technically difficult. Therefore, it is regarded as the optimum to study learning curve effects in surgery. The paper seeks a comprehensive investigation. Thus, operating room times are employed as short-term cost indicator and quality as the medium to long term one. To measure quality, the postoperative difference between air and bone conduction threshold as well as a combination of this difference and the absence of complications. This paper also estimates different regression models (OLS and logit). Besides investigating the effects on department level, the study also considers the individual level, this means operating room times and quality are investigated for individual surgeons. This improves the comparison of learning curves, as the surgeons worked under widely identical conditions. It becomes apparent that the operating room times initially decrease with increasing experience. The marginal effect of additional experience gets smaller until the direction of the effect changes and the operating room times increase with increasing experience, probably caused by the allocation of difficult cases to the most experienced surgeons. Regarding quality, no learning curve effects are observed. The authors are Carsten Bauer, Johannes Taeger, and Kristen Rak. The fourth paper is a systematic literature review on learning effects in the treatment of ischemic strokes. In case of stroke, every minute counts. Therefore, there is the inherent need to reduce the time from symptom onset to treatment. The article is concerned with the reduction of the time from arrival at the hospital to thrombolysis treatment, the so-called “door-to-needle time”. In the literature, there are studies on learning in a broader sense caused by a quality improvement program as well as learning in a narrower sense, in which learning curve effects are evaluated. Besides, studies on the time differences between low-volume and high-volume hospitals are considered, as the differences are probably the result of learning and economies of scale. Virtually all the 165 evaluated articles report improvements regarding the time to treatment. Furthermore, the clinical results substantiate the common association of shorter times from arrival to treatment with improved clinical outcomes. The review additionally discusses the economic implications of the results. The author is Carsten Bauer. The preface brings forward that after the measurement of learning curve effects, further efforts are necessary for using them in order to increase efficiency, as the issue does not admit of easy, standardized solutions. Furthermore, the postface emphasizes the importance of multiperspectivity in research for the patient outcome, the health care system, and society. N2 - Die vorliegende Arbeit befasst sich mit Lernkurveneffekten in Kliniken als hochspezialisierte Expertenorganisationen und umfasst vier Aufsätze, die sich jeweils mit einem anderen Aspekt des Themas beschäftigen. Der Fokus liegt dabei in den ersten drei Artikeln auf Lernkurveneffekten von Ärzten bei chirurgischen Eingriffen, im vierten Beitrag steht das Team der Notaufnahme als Ganzes im Fokus. Das Vorwort beleuchtet in kompakter Form die stetig steigenden Gesundheitsausgaben, den damit steigenden Kostendruck, die Krankenhauslandschaft in Deutschland sowie ihre Entwicklung. Ferner wird das Vergütungssystem mittels Fallpauschalen wie auch die Besonderheiten des Gesundheitssektors, der stark staatlich reguliert ist und in dem ethische Aspekte omnipräsent sein müssen, umrissen. Nicht zuletzt wird der Nutzen des Wissens um Lernkurveneffekte skizziert, um Kosten zu senken und zudem die Qualität konstant zu halten oder sogar zu verbessern. Der erste Aufsatz des Sammelbandes untersucht die Lerneffekte in einer Klinik, die sich auf endoprothetische Eingriffe (Hüft- und Kniegelenksersatz) spezialisiert hat. Es werden dabei zwei große Bereiche untersucht, der spezialisierte sowie der nicht-spezialisierte Bereich. Es werden keine Kosten direkt untersucht, sondern Kostenindikatoren verwendet. Der Indikator für die Kosten in der kurzen Frist sind die OP-Zeiten. Der Indikator für die mittlere bis lange Frist ist die Qualität. Sie wird über Komplikationen im Aufwachraum operationalisiert. Die Untersuchung selbst erfolgt mit Regressionsmodellen (KQ und Logit). Die Ergebnisse zeigen, dass die Spezialisierung Vorteile durch Lerneffekte in Form von kürzeren OP-Zeiten und geringeren Komplikationsraten bei den endoprothetischen Eingriffen mit sich bringt. Für die nicht-spezialisierten OPs ergeben sich dieselben Resultate. Auch hier sinken die OP-Zeiten sowie die Komplikationen. Es kommt demnach nicht zu möglicherweise negativen Auswirkungen der Spezialisierung auf den nicht-spezialisierten Bereich, sondern es liegen vorteilhafte Spillover-Effekte vor. Insgesamt ist die Spezialisierung damit als sinnvoll zu betrachten, da sie die kurz-, mittel- und langfristigen Kosten für alle Operationen senkt. Die Autoren sind Carsten Bauer, Nele Möbs, Oliver Unger, Andrea Szczesny und Christian Ernst. Im zweiten Artikel stehen die Unterschiede zwischen den Lernkurveneffekten von Ärzten, die teilweise im Team operieren und denen, die stets alleine operieren, im Vordergrund. Die Untersuchung verbindet somit Lernkurveneffekte mit Teamüberlegungen, welche in den letzten Jahren zunehmend diskutiert werden. Bei den betrachteten Eingriffen handelt es sich um Tonsillektomien (Entfernung der Gaumenmandeln), einen Standardeingriff. Die Indikatoren für die Kosten in der kurzen bzw. mittleren bis langen Frist sind auch hier die OP-Zeiten der Operationen bzw. Komplikationen als Maß für die Qualität. Die Komplikationen sind in diesem Fall Nachblutungen, die meist wenige Tage nach der Operation auftreten. Die Untersuchung selbst erfolgt mit Regressionsmodellen (KQ und Logit). Die Ergebnisse der Untersuchung zeigen, dass die OP-Zeiten mit zunehmender Erfahrung der Ärzte sinken. Ärzte, die auch im Team arbeiten, lernen dabei schneller als Ärzte, die stets alleine operieren. So sind die OP-Zeiten der Ärzte, die auch im Team arbeiten, geringer als die der anderen. Als Besonderheit stehen im verwendeten Datensatz die Fallkosten zur Verfügung, womit die Kostenindikatoren validiert werden können. Aus den Ergebnissen ergibt sich die Empfehlung, dass Assistenzärzte an Team-Operationen teilnehmen sollten. Die Autoren sind Carsten Bauer, Oliver Unger und Martin Holderried. Der dritte Aufsatz widmet sich der Stapesplastik, mithilfe derer Schallleitungsschwerhörigkeit auf-grund von Otosklerose (überschießende Knochenbildung) behandelt werden soll. Die Eingriffe werden als ideale Untersuchungsmöglichkeit von Lernkurveneffekten in der Chirurgie angesehen, da sie konzeptionell einfach, jedoch technisch schwierig sind. Es wird eine möglichst umfassende Betrachtung angestrebt, indem die OP-Zeiten als kurzfristiger und die Qualität als mittel- bis langfristiger Kostenindikator herangezogen werden. Um Qualität zu operationalisieren, wird die postoperative Differenz zwischen Luft- und Knochenleitungsschwelle sowie die Kombination aus dieser Differenz mit der Abwesenheit von Komplikationen verwendet. Auch hier werden verschiedene Regressionsmodelle (KQ und Logit) geschätzt. In diesem Artikel wird neben der Klinikebene auch die Individualebene betrachtet, d.h. OP-Zeiten und Qualität für einzelne Ärzte untersucht, was den Vergleich individueller Lernkurven verbessert, da die Ärzte alle unter weitgehend identischen Bedingungen gearbeitet haben. Es zeigt sich, dass die OP-Zeiten mit zunehmender Erfahrung zunächst sinken. Der marginale Effekt von weiterer Erfahrung wird dabei mit zunehmender Erfahrung geringer bis sich die Richtung des Effektes ändert und die OP-Zeiten mit weiter zunehmender Erfahrung – vermutlich aufgrund der Allokation der schwierigeren Fälle auf die erfahrensten Ärzte – wieder steigen. Bezüglich Qualität sind keine Lernkurveneffekte feststellbar. Die Autoren sind Carsten Bauer, Johannes Taeger und Kristen Rak. Der vierte Beitrag ist ein systematischer Literaturüberblick zu Lerneffekten bei der Behandlung von ischämischen Schlaganfällen. Bei einem Schlaganfall zählt jede Minute, weswegen die inhärente Notwendigkeit besteht, die Dauer vom Auftreten der Symptome bis zur Behandlung zu verkürzen. Der Artikel befasst sich mit der Verkürzung der Dauer vom Eintreffen der Patienten im Krankenhaus bis zur Behandlung mittels Thrombolyse, der sogenannten „Door-to-Needle Time“. In der Literatur gibt es hierzu Untersuchungen von Lernen im weiteren Sinne durch ein Qualitätsverbesserungsprogramm und Lernen im engeren Sinne, bei dem Lernkurveneffekte evaluiert werden. Daneben werden Studien ausgewertet, die sich mit den unterschiedlichen Zeiten zwischen Krankenhäusern mit niedrigen und hohen Fallzahlen befassen, da diese Unterschiede wahrscheinlich das Ergebnis von Lernen und Skaleneffekten sind. Nahezu alle der 165 ausgewerteten Artikel berichten von Verbesserungen bezüglich der Dauer bis zur Behandlung. Zudem unterstreichen die klinischen Ergebnisse die gängige Auffassung, dass eine kürzere Zeit vom Eintreffen im Krankenhaus bis zur Behandlung mit einem besseren Ergebnis einhergeht. Der Literaturüberblick diskutiert zudem die ökonomischen Implikationen der Ergebnisse. Der Autor ist Carsten Bauer. Im Nachwort kommt u.a. zur Sprache, dass für die Nutzung der Lernkurveneffekte zur Effizienzsteigerung nach der Messung der Lerneffekte weitere Anstrengungen unternommen werden müssen, da die Thematik keine einfachen, standardisierten Lösungen zulässt. Zudem wird die Bedeutung der Mehrperspektivität in der Forschung für das Behandlungsergebnis des Patienten, das Gesundheitssystem und die Gesellschaft hervorgehoben. KW - Lernkurve KW - Krankenhaus KW - learning curve KW - learning effect KW - experience KW - hospital KW - Lerneffekt KW - Erfahrung Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-328717 ER - TY - THES A1 - Lan, Yangyang T1 - Bamboo-branch Songs (\({zhuzhici}\)) of Shandong Province: Lyrical Records of Local Life, Traveling and Local History T1 - Bambuszweig-Lieder (\({zhuzhici}\) 竹枝詞) der Provinz Shandong: Lyrische Aufzeichnungen des lokalen Lebens, des Reisens und der lokalen Geschichte N2 - This dissertation presents a comprehensive exploration of the bamboo branch song (zhuzhici 竹枝詞), a classical Chinese poetry genre. One of the defining features of the bamboo branch song genre is its emphasis on all aspects of local culture. As a result, these poems typically have a specific focus on a particular place. This dissertation takes the bamboo branch songs of Shandong Province as its primary subject. The dissertation is divided into two parts. The first section focuses on a cultural study of the bamboo branch song genre. By examining the genre, this dissertation concludes that the bamboo branch song is a genre of vernacular poetry in imperial China. The language has a vernacular style, and the content has a clear focus on local affairs. The subsequent section delves into the Bamboo Branch Songs of Shandong Province, with almost 2,000 poems collected from different sources. From everyday routines to customs, travel culture, and historical episodes, the poems cover a wide range of topics, offering a detailed glimpse into the various facets of the region's society. Women play a significant role in the poems about social life in Bamboo Branch Songs of Shandong Province. They were often the central figures in the ceremonies of festivals, and their behaviour was given special attention. The bamboo branch song genre has an internal character as a form of travel writing. The poems were usually written by authors who had made observations on their journeys. This dissertation delves into the travel culture of the capital Ji'nan, through the lens of bamboo branch songs, providing valuable insights into the region. Another common motif of bamboo branch songs is history. Some nostalgic poems deal with local historical sites, events, legends and personalities. This dissertation finds that these poems contain unique historical information with a microcosmic and individual perspective. N2 - In dieser Dissertation wird eine Untersuchung der klassischen chinesischen Gedichtgattung des Bambuszweig-Lieds (zhuzhici 竹枝詞) vorgelegt. Eines der charakteristischen Merkmale der Gattung ist die Betonung der lokalen Kultur. Folglich haben diese Gedichte in der Regel einen spezifischen Fokus auf einen bestimmten Ort. Diese Dissertation befasst sich mit den Bambuszweig-Liedern der Provinz Shandong und gliedert sich in zwei Teile: Der erste Teil konzentriert sich auf eine kulturelle Untersuchung des Genres, die zu dem Schluss führt, dass das Bambuszweig-Lied ein Genre der volkstümlichen Poesie im kaiserlichen China ist. Seine Sprache hat einen volkstümlichen Stil, und der Inhalt ist eindeutig auf lokale Angelegenheiten ausgerichtet. Der zweite Abschnitt befasst sich mit den Bambuszweig-Liedern der Provinz Shandong, wo fast 2.000 Gedichte aus verschiedenen Quellen gesammelt wurden. Von alltäglichen Abläufen bis zu Bräuchen, Reisekultur und historischen Episoden decken die Gedichte ein breites Themenspektrum ab und bieten einen detaillierten Einblick in die verschiedenen Facetten der Gesellschaft der Region. Frauen spielen in den Gedichten über das gesellschaftliche Leben in den Bambuszweig-Liedern der Provinz Shandong eine wichtige Rolle. Sie waren oft die zentralen Figuren in Feierlichkeiten, und ihrem Verhalten wurde besondere Aufmerksamkeit geschenkt. Die Gedichte wurden in der Regel von Autoren verfasst, die auf ihren Reisen Beobachtungen gemacht hatten. In dieser Dissertation wird die Reisekultur der Hauptstadt Ji'nan durch die Bambuszweig-Lieder beleuchtet, was wertvolle Einblicke in die Region ermöglicht. Ein weiteres gemeinsames Motiv der Bambuszweig-Lieder ist Geschichte. Einige nostalgische Gedichte befassen sich mit lokalen historischen Stätten, Ereignissen, Legenden und Persönlichkeiten. In dieser Dissertation wird festgestellt, dass diese Gedichte einzigartige historische Informationen mit einer mikrokosmischen und individuellen Perspektive enthalten. KW - Bamboo-branch songs KW - Local KW - Daily life KW - Traveling culture KW - History KW - Vernacular poety Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-328687 ER - TY - THES A1 - Hoffmann, Jan Vincent T1 - Small-animal SPECT with Two Stationary Detectors: Performance Evaluation and Image Quality Assessment of Multi-pinhole Collimators T1 - Kleintier-SPECT mit Zwei Stationären Detektoren: Leistungsbewertung und Bildqualitätsanalyse von Multipinhole-Kollimatoren N2 - SPECT as a representative of molecular imaging allows visualization of metabolic processes in vivo. In clinical practice, single photon emission imaging is an established modality for myocardial perfusion imaging or the diagnosis of adrenal or neuroendocrine tumors, to name a few. With technical advances in scanner design and data processing leading to improved spatial resolution and image quality, SPECT has become a serious contender in small animal preclinical imaging. With multi-pinhole collimation, submillimeter spatial resolutions are achieved without limiting sensitivity, which has led to a significant increase of interest in SPECT for preclinical research in recent years. In this dissertation, the potential of a two-detector system through an analysis of three dedicated mouse collimators with multi-pinhole configurations was demonstrated. For this, sensitivity, spatial resolution, and uniformity as key parameters were determined. In the second part of the present work, an evaluation of the image quality at different activity concentrations to allow prediction of the system performance related to in vivo studies was performed. Therefore, a visual evaluation, as well as a calculation of the contrastto-noise ratio, was performed using mini Derenzo phantoms for the respective three mouse collimators. To better classify the results, the study was extended by a comparison with the predecessor system. Due to the absence of the third bottom detector, sensitivity and uniformity are slightly compromised. All three collimators were able to achieve a spatial resolution in the submillimeter range, XUHR-M offers a peak resolution of up to 0.35 mm. In terms of resolution, both evaluated systems performed on an equal level. Visual assessment of image quality indicates a slight advantage of the new two-detector system, and the contrast-to-noise ratio seems to benefit from the improved SROSEM algorithm. However, the differences between the two systems are marginal. The U-SPECT5/CT E-Class is proven to be state-of-the-art for small animal imaging and is a powerful instrument for preclinical molecular imaging research. Improvements in system design compensate well for the reduction in the detection area, allowing excellent imaging even with low activity concentrations. N2 - SPECT als Vertreter der molekularen Bildgebung ermöglicht die Visualisierung von Stoffwechselprozessen in vivo. In der klinischen Praxis ist die Einzelphotonen-Emissions-Bildgebung eine etablierte Modalität für die Myokard-Perfusions-Bildgebung oder die Diagnose von Nebennieren- oder neuroendokrinen Tumoren, um nur einige Beispiele zu nennen. Mit den technischen Fortschritten bei der Konstruktion von Scannern und der Datenverarbeitung, die zu einer verbesserten räumlichen Auflösung und Bildqualität führen, ist SPECT zu einem ernstzunehmenden Mitbewerber in der präklinischen Bildgebung von Kleintieren geworden. Unter der Verwendung von Multipinhole-Kollimatoren lassen sich Ortsauflösungen von unter einem Millimeter erzielen, ohne die Sensitivität deutlich einzuschränken. Dies trug dazu bei, dass das Interesse an SPECT in der präklinischen Forschung in den letzten Jahren zugenommen hat. In dieser Dissertation wurde das Potenzial eines Zweidetektorsystems unter Verwendung von drei Multipinhole-Mauskollimatoren evaluiert. Zur Leistungsbewertung wurde Sensitivität, Ortsauflösung und Homogenität bestimmt. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde eine Analyse der Bildqualität mit verschiedenen Aktivitätskonzentrationen durchgeführt, um eine Vorhersage der Leistung des Systems in In-vivo-Studien zu ermöglichen. Dazu wurde eine visuelle Bewertung sowie eine Berechnung des Kontrast-zu-Rausch-Verhältnisses mit Mini-Derenzo-Phantomen für die entsprechenden drei Mauskollimatoren durchgeführt. Um die Ergebnisse besser einordnen zu können, wurde die Studie um einen Vergleich mit dem Vorgängersystem erweitert. Durch das Fehlen des dritten unteren Detektors sind Sensitivität und Homogenität leicht beeinträchtigt. Alle drei Kollimatoren konnten eine Ortsauflösung unter einem Millimeter erreichen, wobei XUHR-M die höchste Auflösung von bis zu 0.35 mm erreicht. Die beiden untersuchten Systeme sind hinsichtlich der Ortsauflösung gleichwertig. Die visuelle Bewertung der Bildqualität deutet auf einen leichten, jedoch nur marginalen Vorteil des neuen Zweidetektorsystems hin, und das Kontrast-zu-Rausch-Verhältnis scheint von dem verbesserten SROSEM-Algorithmus zu profitieren. Das U-SPECT5/CT E-Class ist nachweislich auf dem neuesten Stand der Technik für die Bildgebung bei Kleintieren und ein leistungsfähiges Instrument für die präklinische Forschung. Das System kompensiert die Reduktion der Detektionsfläche und ermöglicht eine hervorragende Bildgebung auch bei geringen Aktivitätskonzentrationen. KW - SPECT KW - small-animal SPECT KW - performance evaluation KW - multi-pinhole collimation Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-328195 ER - TY - THES A1 - Janßen, Jan Paul T1 - Capabilities of a multi-pinhole SPECT system with two stationary detectors for in vivo imaging in rodents T1 - Leistungsfähigkeit eines Multi-Pinhole SPECT-Systems mit zwei stationären Detektoren zur In-vivo-Bildgebung in Nagetiermodellen N2 - Molecular imaging of rats is of great importance for basic and translational research. As a powerful tool in nuclear medicine, SPECT can be used to visualize specific functional processes in the body, such as myocardial perfusion or bone metabolism. Typical applications in laboratory animals are imaging diagnostics or the development of new tracers for clinical use. Innovations have enabled resolutions of up to a quarter of a millimeter with acceptable sensitivity. These advances have recently led to significantly more interest in SPECT both clinically and preclinically. The objective of this thesis was to evaluate the performance of the new U-SPECT5/CT E-Class by MILabs with a dedicated ultra-high resolution multi-pinhole collimator for rats and its potential for in vivo imaging of rats. The unique features of the U-SPECT are the large stationary detectors and the new iterative reconstruction algorithm. In addition, compared to the conventional system, the "E-Class" uses only two detectors instead of three. First, the sensitivity, maximum resolution, and uniformity were determined as performance parameters. Thereafter, CNRs for different activity levels comparable to those of typical in vivo activities were examined. Finally, two example protocols were carried out for imaging with 99mTc-MIBI and 99mTc-HMDP in healthy rats to evaluate the in vivo capabilities. For this purpose, CNR calculations and an image quality assessment were performed. The focus was on image quality as a function of scan time and post-reconstruction filter across a wide range of realistically achievable in vivo conditions. Performance was reasonable compared to other systems in the literature, with a sensitivity of 567 cps/MBq, a maximum resolution of 1.20 mm, and a uniformity of 55.5%. At the lower activities, resolution in phantom studies decreased to ≥1.80 mm while maintaining good image quality. High-quality bone and myocardial perfusion SPECTs were obtained in rats with a resolution of ≥1.80 mm and ≥2.20 mm, respectively. Although limited sensitivity remains a weakness of SPECT, the U-SPECT5/CT E-Class with the UHR-RM collimator can achieve in vivo results of the highest standard despite the missing third detector. Currently, it is one of the best options for high-resolution radionuclide imaging in rats. N2 - Die molekulare Bildgebung bei Ratten hat einen hohen Stellenwert in der Grundlagenforschung und der translationale Forschung. Dabei ist SPECT ein leistungsfähiges Instrument zur Visualisierung spezifischer funktioneller Prozesse im Körper, wie z. B. der Herzmuskeldurchblutung oder des Knochenstoffwechsels. Typische Anwendungsbereiche an Labortieren sind die bildgebende Diagnostik im Rahmen von Studien oder die Entwicklung neuer Tracer für den klinischen Einsatz. Durch Innovationen wurden Auflösungen von bis zu einem Viertelmillimeter bei akzeptabler Empfindlichkeit erreichbar. Diese Fortschritte haben in letzter Zeit zu einem deutlich gestiegenen Interesse an SPECT sowohl im klinischen als auch im präklinischen Bereich geführt. Ziel dieser Arbeit war es, die Leistung des neuen U-SPECT5/CT E-Class von MILabs mit einem speziellen ultra-hochauflösenden Multi-Pinhole-Kollimator für Ratten und das Potenzial für die In-vivo-Bildgebung bei Ratten zu untersuchen. Dabei sind die Besonderheiten des U-SPECTs die großen stationären Detektoren und der neue iterative Rekonstruktionsalgorithmus. Außerdem verfügt die von uns verwendete „E-Klasse“ im Vergleich zum konventionellen System nur über zwei statt drei Detektoren. Zunächst wurden die Sensitivität, die maximale Ortsauflösung und die Homogenität als Leistungsparameter bestimmt. Anschließend wurde das Kontrast-Rausch-Verhältnis für verschiedene Aktivitätsniveaus, die mit denen typischer In-vivo-Studien vergleichbar sind, untersucht. Schließlich wurden zwei Beispielprotokolle für die Bildgebung mit 99mTc-MIBI und 99mTc-HMDP bei gesunden Ratten durchgeführt, um die In-vivo-Kapazitäten zu erfassen. Zur Bewertung wurden eine Kontrast-Rausch-Analyse und eine Bildqualitätsumfrage genutzt. Der Schwerpunkt lag dabei auf der Bildqualität in Abhängigkeit von der Scanzeit sowie dem Postrekonstruktionsfilters für ein breites Spektrum realistisch erreichbarer In-vivo-Bedingungen. Die Leistung war mit einer Sensitivität von 567 cps/MBq, einer maximalen Ortsauflösung von 1,20 mm und einer Homogenität von 55,5% mit anderen in der Literatur beschriebenen Systemen vergleichbar. Bei niedrigeren Aktivitäten verringerte sich die Auflösung in Phantomstudien auf ≥1,80 mm bei gleichbleibend guter Bildqualität. Es wurden hochqualitative Knochen- und Myokardperfusions-SPECTs mit einer Auflösung von ≥1,80 mm bzw. ≥2,20 mm bei Ratten erzielt. Obwohl die begrenzte Empfindlichkeit nach wie vor eine Schwäche der SPECT ist, kann das U-SPECT5/CT E-Class mit dem UHR-RM-Kollimator, trotz des fehlenden dritten Detektors, In-vivo-Ergebnisse auf höchstem Niveau erzielen. Es ist derzeit eine der besten Optionen für die hochauflösende Radionuklid-Bildgebung bei Ratten. KW - SPECT KW - Molekulare Bildgebung KW - Rodents KW - Image Quality KW - SPECT/CT Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-328608 ER -