TY - THES A1 - Hauptstein, Julia T1 - Hyaluronic Acid-based Multifunctional Bioinks for 3D Bioprinting of Mesenchymal Stromal Cells for Cartilage Regeneration T1 - Hyaluronsäure-basierte multifunktionale Biotinten für den 3D Biodruck von mesenchymalen Stromazellen zur Knorpelregeneration N2 - Articular cartilage is a highly specialized tissue which provides a lubricated gliding surface in joints and thereby enables low-friction movement. If damaged once it has a very low intrinsic healing capacity and there is still no treatment in the clinic which can restore healthy cartilage tissue. 3D biofabrication presents a promising perspective in the field by combining healthy cells and bioactive ink materials. Thereby, the composition of the applied bioink is crucial for defect restoration, as it needs to have the physical properties for the fabrication process and also suitable chemical cues to provide a supportive environment for embedded cells. In the last years, ink compositions with high polymer contents and crosslink densities were frequently used to provide 3D printability and construct stability. But these dense polymeric networks were often associated with restricted bioactivity and impaired cell processes like differentiation and the distribution of newly produced extracellular matrix (ECM), which is especially important in the field of cartilage engineering. Therefore, the aim of this thesis was the development of hyaluronic acid (HA)-based bioinks with a reduced polymer content which are 3D printable and additionally facilitate chondrogenic differentiation of mesenchymal stromal cells (MSCs) and the homogeneous distribution of newly produced ECM. Starting from not-printable hydrogels with high polymer contents and restricted bioactivity, distinct stepwise improvements were achieved regarding stand-alone 3D printability as well as MSC differentiation and homogeneous ECM distribution. All newly developed inks in this thesis made a valuable contribution in the field of cartilage regeneration and represent promising approaches for potential clinical applications. The underlying mechanisms and established ink design criteria can further be applied to other biofabricated tissues, emphasizing their importance also in a more general research setting. N2 - Gelenkknorpel ermöglicht durch seine gleitfähige Oberfläche reibungsarme Bewegungen der Gelenke. Ist der Knorpel jedoch einmal geschädigt, kann er sich kaum selbst regenerieren und es gibt noch keine klinische Lösung, die das native Gewebe wiederherstellen kann. Ein vielversprechender Ansatz im Feld ist die 3D Biofabrikation, da sie gesunde Zellen mit bioaktiven Tintenmaterialen kombiniert. Hierbei ist die Zusammensetzung der Tinte besonders wichtig für die Funktionsweise des Konstruktes, da sie sowohl die physikalischen Voraussetzungen für den 3D Druck als auch die biologische Unterstützung für die Zellkultivierung mitbringen muss. Bisher wurden häufig Tintenzusammensetzungen mit hohen Polymergehalten und Vernetzungsdichten verwendet, um 3D-Druckbarkeit und Konstruktstabilität zu gewährleisten. Das verursachte jedoch häufig eine eingeschränkte Bioaktivität und die Beeinträchtigung von Zellprozessen wie Differenzierung und der Verteilung der neu gebildeten Extrazellulärmatrix (ECM), die insbesondere in der Knorpelregeneration von großer Bedeutung ist. Daher war das Ziel dieser Arbeit 3D-druckbare Tinten auf Hyaluronsäure (HA)-Basis mit reduziertem Polymergehalt zu entwickeln, die die chondrogene Differenzierung von mesenchymalen Stromazellen (MSCs) unterstützen und eine homogene Verteilung der neu produzierten ECM ermöglichen. Ausgehend von nicht-druckbaren Hydrogelen mit hohem Polymergehalt und eingeschränkter Bioaktivität wurde eine schrittweise Verbesserung hinsichtlich 3D-Druckbarkeit, MSC-Differenzierung und homogener ECM-Verteilung erreicht. Alle hier neu entwickelten Tinten leisten einen wertvollen Beitrag auf dem Gebiet der Knorpelregeneration mit Potenzial zur klinischen Anwendung. Die zugrunde liegenden Mechanismen und etablierten Designkriterien können weiterhin auch auf andere biofabrizierte Gewebe übertragen werden, was ihre Bedeutung auch für ein weiter gefasstes Forschungsfeld unterstreicht. KW - Hyaluronsäure KW - 3D-Druck KW - Mesenchymale Stromazelle KW - Gelenkknorpel KW - Extrazelluläre Matrix KW - Chondrogenic Differentiation KW - Biofabrication KW - Bioink KW - Cartilage Tissue Engineering KW - Bioprinting KW - Hyaluronic Acid KW - Mesenchymal Stromal Cell Y1 - 2022 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-260681 ER - TY - THES A1 - Dodt, Katharina Anna T1 - Monitoring enzyme activity by using mass-encoded peptides and multiplexed detection T1 - Überwachung von Enzymaktivität durch die Benutzung von massencodierten Peptiden und multiplexer Detektion N2 - Cell culture models are helpful tools to study inflammatory diseases, like rheumatoid arthritis (RA), osteoarthritis (OA), arteriosclerosis or asthma, which are linked to increased matrix metalloproteinase (MMP) activity. Such cell culture models often focus on the secretion of cytokines and growth factors or the direct effects of disease on tissue destruction. Even though the crucial role of MMPs in inflammatory diseases is known, the results of MMP studies are contradictious and the use of MMPs as biomarkers is inconsistent. MMPs play an important role in disease pathology, as they are involved in elastin degradation in the walls of alveoli in chronic obstructive pulmonary disease (COPD), tumor angiogenesis and metastasis and in cartilage and bone degradation in arthropathies. In RA and OA MMPs are secreted by osteocytes, synoviocytes, and by infiltrating immune cells in response to the increased concentration of inflammatory mediators, like growth factors and cytokines. MMPs are zinc and calcium-dependent proteinases and play an important role in physiological and pathological extracellular matrix (ECM) turn over. Their substrate specificity gives them the ability to degrade all major ECM components, like aggrecan, elastin, gelatin, fibronectin and all types of collagen even the triple helix of collagen monomers. The ECM consists of two large three-dimensional cross-linked macromolecule classes: one are fibrous proteins, like collagen and elastin fibers that are responsible for ECM’s structure, tensile strength, resiliency, reversible extensibility, and deformability and the second class is comprised of proteoglycans composed of glycosaminoglycan (GAG) chains covalently attached to protein cores that are multifunctionally involved in signaling pathways and cell interactions. ECM is present within all tissues and organs and changes in ECM structure contribute to pathogenesis, e.g. wounded and fibrotic tissue, COPD or tumours. This thesis primarily focuses on the development of a diagnostic peptide system, that enables to gain information on MMP activity from ECM by deploying the isobaric mass encoding strategy. The core element of the developed system is an isotopically labelled peptide sequence (mass tag), that is released in response to elevated levels of MMPs and allows multiplexed detection in tandem mass spectrometry (LC-MS/MS). The mass reporters possess a modular structure with different functionalities. C-terminal either a transglutaminase (TG) recognition sequence or a high molecular weight polyethylene glycol (PEG) moiety was attached to immobilize the mass reporters covalently or physically at the injection site. The following matrix metalloproteinase substrate sequence (MSS) is incorporated in two different versions with different sensitivity to MMPs. The MSS were applied in pairs for relative quantification consisting of the cleavable version synthesized with natural L-amino acids and the non-cleavable D-amino acid variant. The mass tag was synthesized with isotopically labelled amino acids and is separated from the MSS by a UV light-sensitive molecule. N-terminal the mass tag is followed by a tobacco etch virus protease (TEV) sensitive sequence, that is responsible to separate the mass tag from the affinity tag, which was either the Strep-tag II sequence or biotin and were added for purification purposes. Chapter 1 presents a step-by-step protocol on how to design a mass tag family allowing for multiplexed analysis by LC-MS/MS. The multiplexing is achieved by developing an isobar mass tag family with four family members, which are chromatographically indistinguishable, but due to the mass encoding principles they fragment in distinct y-type ions with a mass difference of 1 or 2 Da each in MS2. Furthermore, it is explained how to covalently attach the mass reporter peptides onto ECM by the activated calcium-catalyzed blood coagulation transglutaminase factor XIII (FXIIIa). The lysine of mass reporter’s TG sequence (D-domain of insulin-like growth factor-I (IGF-I)) and a glutamine in fibronectin are covalently crosslinked by FXIIIa and build an isopeptide bond. Elevated levels of MMP release the mass reporters from ECM by recognizing the inter-positioned MSS. The designed mass reporters were able to monitor enzyme activity in an in vitro setting with cell-derived ECM, which was shown in Chapter 2. The modular structured mass reporters were investigated in a proof of concept study. First, the different modules were characterized in terms of their MMP responsiveness and their sensitivity to TEV protease and UV light. Then the FXIIIa-mediated coupling reaction was detailed and the successful coupling on ECM was visualized by an immunosorbent assay or confocal laser scanning microscopy. Finally, the immobilized mass reporters on ECM were incubated with MMP-9 to investigate their multiplexing ability of MMP activity. The cleaved mass reporter fragments were purified in three steps and mass tags were analyzed as mix of all four in LC-MS/MS. Chapter 3 describes the change from an immobilizing system as seen in chapter 1 and 2 to a soluble enzyme activity monitoring system that was applied in an osteoarthritic mouse model. Instead of the immobilizing TG sequence the C-terminal MMS was extended with two amino acids where one holds an azide moiety to perform a strain-promoted azide-alkyne cycloaddition to a high molecular weight dibenzocyclooctyne-polyethylene glycol (DBCO-PEG), which was chosen to retain the mass reporters at the injection site. Furthermore, the N-terminal affinity tag was extended with a 2.5 kDa PEG chain to increase the half-life of the mass reporter peptides after MMP release. The systems biocompatibility was proved but its enzyme monitoring ability in an in vivo setting could not be analyzed as samples degraded during shipping resulting from the Chinese customs blocking transport to Germany. In summary the diagnostic peptide system was developed in two variants. The immobilized version one from chapter 1 and 2 was designed to be covalently attached to ECM by the transglutaminase-mediated cross-linking reaction. In an in vitro setting the functionality of the mass reporter system for the detection of MMP activity was successfully verified. The second variant comprises of a soluble mass reporter system that was tested in an OA mouse model and showed biocompatibility. With these two designed systems this thesis provides a flexible platform based on multiplexed analysis with mass-encoded peptides to characterize cell culture models regarding their MMP activity, to deploy cell-derived ECM as endogenous depot scaffold and to develop a mass tag family that enables simultaneous detection of at least four mass tags. N2 - Zellkulturmodelle sind hilfreiche Werkzeuge, um entzündliche Krankheiten, wie rheumatoide Arthritis (RA), Osteoarthritis (OA), Arteriosklerose und Asthma, die mit einer erhöhten Aktivität von Matrixmetalloproteinasen (MMPs) verbunden sind, zu untersuchen. Viele Zellkulturmodelle fokussieren sich hauptsächlich auf die Sekretion von Zytokinen und Wachstumsfaktoren oder die direkten Effekte der Entzündung auf die Gewebezerstörung. Obwohl die zentrale Rolle der MMPs in entzündlichen Erkrankungen bekannt ist, wird die Untersuchung von MMPs in diesen Zellkulturmodellen vernachlässigt. MMPs spielen eine wichtige Rolle in der Krankheitsentstehung, da sie am Abbau von Elastin in den Wänden der Alveolen bei chronisch obstruktiver Lungenerkrankung (COPD), an der Gefäßneubildung und Metastasenbildung von Tumoren und an Knorpelabbau und Knochenzerstörung in Gelenkerkrankungen beteiligt sind. In RA und OA werden MMPs von Osteozyten, Synoviozyten und infiltrierenden Immunzellen als Antwort auf erhöhte Konzentrationen an entzündlichen Mediatoren, wie Wachstumsfaktoren und Zytokinen, sekretiert. MMPs sind Zink- und Calcium-abhängige Proteinasen, die eine wichtige Rolle beim physiologischen und pathologischen Turnover der extrazellulären Matrix (EZM) spielen. Ihre Substratspezifität verleiht ihnen die Fähigkeit alle Hauptkomponenten der EZM, wie Aggrecan, Elastin, Gelatin, Fibronectin und alle Typen des Kollagens, sogar die dreifach-Helix der Kollagenmonomere, abzubauen. Die EZM besteht aus zwei großen, drei-dimensional vernetzten Makromolekülklassen: zu der ersten Klasse zählen die faserigen Proteine, wie Kollagen- und Elastinfasern, die für die Struktur der EZM, ihre Zugfestigkeit, Elastizität, reversible Dehnbar- und Verformbarkeit verantwortlich sind und zur zweiten Klasse gehören die Proteoglykane, die aus Glykosaminoglykanketten (GAG), die kovalent an Kernproteine gebunden sind, bestehen und zusammen multifunktional in Signalwege und Zellinteraktionen involviert sind. Jedes Gewebe und Organ ist mit EZM ausgekleidet und Änderungen in der EZM Struktur können zur Krankheitsentstehung beitragen, z.B. bei verletztem und fibrotischem Gewebe, COPD oder Tumoren. Diese Promotion fokussiert sich primär auf die Entwicklung eines diagnostischen Peptidsystem, das es ermöglicht durch die Anwendung der isobaren massencodierten Strategie Informationen über MMP Aktivität der EZM zu gewinnen. Eine isotopenmarkierte Peptidsequenz stellt dabei das Kernelement des entwickelten Systems dar, welche als Antwort auf erhöhte MMP Level von der EZM freigegeben wird und eine gebündelte Detektion per Tandem-Massenspektrometrie (LC-MS/MS) erlaubt. Die Massenreporter besitzen einen modularen Aufbau mit unterschiedlichen Funktionalitäten. Am C-terminalen Ende wurde entweder eine Transglutaminase (TG) Erkennungssequenz oder eine hochmolekulare Polyethylenglykol (PEG) Einheit angehängt, um die Massenreporter kovalent oder physikalische am Applikationsort zu immobilisieren. Die darauffolgende eingeschobene Matrixmetalloproteinase Substratsequenz (MSS) wurde in zwei verschiedenen Versionen mit unterschiedlicher MMP Sensitivität angewendet. Die MSSs werden für die relative Quantifizierung jeweils in Paaren verwendet, wobei die spaltbare Variante mit natürlichen L-Aminosäuren synthetisiert wird und die nicht-spaltbare Sequenz mit D-Aminosäuren. Der Mass tag wird mit isotopenmarkierten Aminosäuren versehen und ist von dem MSS durch ein lichtsensitives Molekül getrennt. N-terminal des Mass tags folgt die TEV Protease-sensitive Peptidsequenz, die zur Abspaltung des Affinitäts-tags vom Mass tag eingebaut wurde. Zur Aufreinigung dient ein Affinitätstag, der entweder aus der Strep-tag II Sequenz oder Biotin besteht. In Kapitel 1 werden Schritt-für-Schritt Protokolle präsentiert, für die Gestaltung und Entwicklung einer Gruppe von isotopenmarkierten Peptiden, die eine simultane Analyse per LC-MS/MS zulassen. Die gleichzeitige Detektion wird dadurch erreicht, dass jedes Gruppenmitglied in der Summe die gleiche Molekülmasse besitzt, aber aufgrund der angewandten isobaren Isotopenmarkierungen fragmentieren diese in MS2 in spezifische y-Typ Ionen, die einen Massenunterschied von 1 oder 2 Da besitzen. Zudem wurde erklärt, wie die Massenreporter Peptide durch den aktivierten, Calcium-abhängigen Blutkoagulationsfaktor XIII (FXIIIa) kovalent an die EZM gebunden werden. Bei der enzymatischen Reaktion wird durch das Quervernetzen des Lysins der TG Aminosäuresequenz (der D-Domäne von IGF-I) der Massenreporter mit dem Glutamin der Aminosäureerkennungssequenz in Fibronectin eine Isopeptidbindung gebildet. Die Freisetzung der Massenreporter von der EZM erfolgt aufgrund des erhöhten MMP Level und geschieht durch die Spaltung der dazwischenliegenden MSS. Die entwickelten Massenreporter waren in der Lage die Enzymaktivität in einer aus Fibroblasten stammenden in vitro Umgebung aus EZM zu beobachten, was in Kapitel 2 dargestellt wird. Die modulare Struktur der Massenreporter wurde in einer Machbarkeitsstudie untersucht. Zuerst wurden die verschiedenen Module bezüglich ihrer Ansprechempfindlichkeit auf MMP und ihrer Sensitivität gegenüber der TEV Protease und UV-Licht charakterisiert. Dann wurden die vier Peptide FXIIIa-vermittelt an die EZM gekoppelt und die erfolgreiche Kopplung an EZM wurde mit Hilfe eines immunologischen Verfahrens oder konfokaler Laser-Scanning-Mikroskopie visualisiert. Abschließend wurden die auf der EZM immobilisierten Massenreporter mit MMP-9 inkubiert, um deren Fähigkeit der gleichzeitigen Detektion von MMP Aktivität zu untersuchen. Die abgespalteten Massenreporterfragmente wurden in drei Schritten aufgereinigt und die vier isotopenmarkierten Tags wurden als Mix mittels LC-MS/MS analysiert. Kapitel 3 beschreibt die Änderung der aus Kapitel 1 und 2 bekannten immobilisierten System zu einem löslichen System, das die Enzymaktivität in Körperflüssigkeiten bestimmen soll und in einem Mausmodell für Osteoarthritis getestet wurde. Anstelle der immobilisierenden TG Sequenz wurde der C Terminus der MSS um zwei Aminosäuren erweitert. Eine Aminosäure trägt eine Azidgruppe um eine Azid-Alkin Cycloaddition mit einem hochmolekularen PEG durchzuführen, die ausgewählt wurde, um die Massenreporter an der Injektionsstelle zurückzuhalten. Des Weiteren wurde der Affinitäts-tag mit einer 2.5 kDa PEG-Kette erweitert, um die Halbwertszeit des von MMPs freigesetzten Massenreporterpeptides zu erhöhen. Die Biokompatibilität des Systems wurde erwiesen, allerdings war es nicht möglich die MMP Aktivität in einem in vivo Model zu zeigen, da eine Analyse der Proben aufgrund von Versand- und Zollproblemen und damit verbundenen Instabilitäten nicht möglich war. Zusammenfassend wurde ein diagnostische Peptidsystem bestehend aus zwei Varianten entwickelt. Die zu immobilisierende Version aus Kapitel 1 und 2 wurde so konzipiert, dass die Peptide durch die Transglutaminase vermittelte Quervernetzungsreaktion kovalent an EZM gebunden werden. In einem in vitro Model wurde die Funktionalität des Massenreporter Systems hinsichtlich der Detektion von MMP Aktivität erfolgreich bestätigt. Die zweite Variante, bestehend aus einem löslichen Massenreporter System, wurde in einem Osteoarthritis Mausmodel getestet und zeigte Biokompatibilität. Mit diesen zwei entworfenen Systemen stellt diese Dissertation eine flexible Plattform zur Verfügung, die basierend auf der multiplexen Detektion von isotopenmarkierten Peptiden, für die Charakterisierung von Zellkulturmodellen bezüglich deren MMP Aktivität genutzt wird, die zelluläre EZM als endogenes Depot anwendet und die durch die Entwicklung einer Familie aus isotopenmarkierten Tags eine simultane Detektion von mindestens vier Tags erlaubt. KW - Extrazelluläre Matrix KW - Tandem-Massenspektrometrie KW - Proteasen KW - Markierte Verbindungen KW - isotopically labelled peptides KW - tandem mass spectrometry KW - matrix metalloproteinase KW - extracellular matrix KW - transglutaminase Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-229377 ER - TY - THES A1 - Frischholz, Sebastian T1 - Resveratrol Counteracts IL-1β-mediated Impairment of Extracellular Matrix Deposition in 3D Articular Chondrocyte Constructs T1 - Resveratrol wirkt der IL-1β-vermittelten Beeinträchtigung von Extrazellulärmatrix-Deposition in 3D Konstrukten aus artikulären Chondrozyten entgegen N2 - Articular cartilage is an exceptional connective tissue which by a network of fibrillar collagen and glycosaminoglycan (GAG) molecules allows both low- friction articulation and distribution of loads to the subchondral bone (Armiento et al., 2018, Ulrich-Vinther et al., 2003). Because of its very limited ability to self-repair, chondral defects following traumatic injury increase the risk for secondary osteoarthritis (OA) (Muthuri et al., 2011). Still, current OA treatments such as common nonsteroidal anti-inflammatory drugs (NSAIDs) and joint replacement primarily address end-stage symptoms (Tonge et al., 2014). As low-grade inflammation plays a pivotal role in the pathogenesis of OA (Robinson et al., 2016), there is a strong demand for novel therapeutic concepts, such as integrating application of anti-inflammatory agents into cartilage cell- based therapies in order to effectively treat OA affected joints in early disease stages. The polyphenolic phytoalexin resveratrol (RSV), found in the skin of red grapes, berries, and peanuts, has been shown to have effective anti-inflammatory properties (Shen et al., 2012). However, its long-term effects on 3D chondrocyte constructs cultured in an inflammatory environment with regard to tissue quality have remained unexplored so far. Therefore, in this study, pellets made from expanded porcine articular chondrocytes were cultured for 14 days with either the pro-inflammatory cytokine interleukin-1β (IL-1β) (1 - 10 ng/ml) or RSV (50 μM) alone, or a co-treatment with both agents. Constructs treated with chondrocyte medium only served as control. Treatment with IL-1β at 10 ng/ml resulted in a significantly smaller pellet size and reduced DNA content. However, RSV counteracted the IL-1β-induced decrease and significantly enhanced diameter and DNA content. Also, in terms of GAG deposition, treatment with IL-1β at 10 ng/ml resulted in a tremendous depletion of absolute GAG content and GAG/DNA. Again, RSV co-treatment counteracted the inflammatory stimulus and led to a partial recovery of GAG content. Histological analysis utilizing safranin-O staining confirmed these findings. Marked expression of the cartilage-degrading enzyme matrix metalloproteinase 13 (MMP13) was detected in IL-1β-treated pellets, but none upon RSV co- treatment. Moreover, co-treatment of IL-1β-challenged constructs with RSV significantly increased absolute collagen content. However, under non- inflammatory conditions, RSV induced gene expression and protein accumulation of collagen type X, a marker for undesirable hypertrophy. Taken together, in the present thesis, RSV was demonstrated to elicit marked beneficial effects on the extracellular matrix composition of 3D cartilaginous constructs in long-term inflammatory culture in vitro, but also induced hypertrophy under non-inflammatory conditions. Based on these findings, further experiments examining multiple concentrations of RSV under various inflammatory conditions appear desirable concerning potential therapeutic applicability in OA. N2 - Gelenkknorpel ermöglicht als spezielles Bindegewebe aus Kollagenfasern und Glykosaminoglykanen (GAG) sowohl die reibungsarme Beweglichkeit in Gelenken als auch die Lastübertragung auf angrenzende Knochen (Armiento et al., 2018, Ulrich-Vinther et al., 2003). Aufgrund der sehr begrenzten Fähigkeit zur intrinsischen Erneuerung erhöhen chondrale Defekte nach traumatischen Verletzungen das Risiko für sekundäre Arthrose (Osteoarthritis; OA) (Muthuri et al., 2011). Dennoch konzentrieren sich derzeitige Behandlungsansätze, einschließlich nichtsteroidaler Antirheumatika (NSAR) und des operativen Gelenkersatzes, hauptsächlich auf Symptome im Endstadium der Erkrankung (Tonge et al., 2014). Da eine geringgradige Entzündung eine entscheidende Rolle in der Pathogenese der Arthrose spielt (Robinson et al., 2016), besteht ein starker Bedarf an neuartigen Therapiekonzepten, wie der Kombination von anti- inflammatorischen Wirkstoffen mit knorpelzellbasierten Therapien, um von Arthrose betroffene Gelenke in frühen Krankheitsstadien wirksam zu behandeln. Das polyphenolische Phytoalexin Resveratrol (RSV), welches in der Schale roter Weintrauben, in Beeren und Erdnüssen vorkommt, besitzt starke entzündungshemmende Eigenschaften (Shen et al., 2012). Langzeiteffekte auf 3D-Knorpelkonstrukte unter inflammatorischen Bedingungen sind hinsichtlich der Gewebequalität jedoch bislang unerforscht geblieben. Daher wurden in der vorliegenden Studie Pellets aus expandierten porcinen Gelenkknorpelzellen über einen Zeitraum von 14 Tagen entweder mit dem pro-inflammatorischen Zytokin Interleukin-1β (IL-1β) (1 - 10 ng/ml) oder RSV (50 μM) allein, oder mit beiden Agenzien kombiniert behandelt. Konstrukte, welche nur serumfreies Chondrozytenmedium erhielten, dienten als Kontrolle. Die Behandlung mit IL- 1β in einer Konzentration von 10 ng/ml führte zu einem signifikant geringeren Durchmesser der Pellets sowie einem verringerten DNA-Gehalt. RSV wirkte dieser IL-1β-vermittelten Reduktion entgegen und steigerte signifikant sowohl Durchmesser als auch DNA-Gehalt der untersuchten Konstrukte. Auch in Bezug auf die Deposition von GAG-Molekülen führte die Kultur mit IL-1β (10 ng/ml) zu einer massiven Abnahme des absoluten GAG-Gehaltes und der GAG/DNA- Ratio. Abermals wirkte die gleichzeitige Behandlung mit RSV dem Entzündungsreiz deutlich entgegen und resultierte in einer partiellen Wiederherstellung des GAG-Gehaltes. Die histologische Analyse unter Verwendung von Safranin-O-Färbungen bestätigte diese Ergebnisse. Darüber hinaus manifestierte sich eine ausgeprägte Expression des knorpelabbauenden Enzyms Matrix-Metalloproteinase 13 (MMP13) in IL-1β behandelten Pellets, nicht jedoch in denen, die simultan mit RSV behandelt wurden. Außerdem resultierte die gleichzeitige Behandlung von IL-1β-stimulierten Konstrukten mit RSV in einer signifikanten Erhöhung des absoluten Kollagengehaltes. Unter nicht-inflammatorischen Bedingungen induzierte RSV die Genexpression und Proteinakkumulation von Kollagen Typ X, einem Marker für unerwünschte Hypertrophie. Zusammengefasst wurde in der vorliegenden Arbeit gezeigt, dass RSV deutliche positive Effekte auf die Extrazellulärmatrix von 3D- Knorpelkonstrukten in einer Langzeit-Entzündungskultur in vitro hervorruft, allerdings unter nicht-inflammatorischen Bedingungen Hypertrophie induziert. Basierend auf diesen Befunden erscheinen weitere Experimente zur Untersuchung unterschiedlicher RSV-Konzentrationen unter verschiedenen Entzündungsbedingungen hinsichtlich einer möglichen therapeutischen Anwendbarkeit bei OA wünschenswert. KW - Resveratrol KW - Interleukin 1-beta KW - Gelenkknorpel KW - Extrazelluläre Matrix KW - Osteoarthritis KW - IL-1β KW - articular chondrocytes KW - cartilage KW - cell-based therapy KW - extracellular matrix KW - inflammation KW - osteoarthritis KW - resveratrol Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-237453 ER - TY - THES A1 - Semeniak, Daniela T1 - Role of bone marrow extracellular matrix proteins on platelet biogenesis and function T1 - Die Rolle der extrazellulären Matrixproteine des Knochenmarks auf die Thrombozytenbiogenes und -funktion N2 - Platelets, small anucleated blood cells responsible for hemostasis, interact at sights of injury with several exposed extracellular matrix (ECM) proteins through specific receptors. Ligand binding leads to activation, adhesion and aggregation of platelets. Already megakaryocytes (MKs), the immediate precursor cells in bone marrow (BM), are in constant contact to these ECM proteins (ECMP). The interaction of ECMP with MKs is, in contrast to platelets, less well understood. It is therefore important to study how MKs interact with sinusoids via the underlying ECMP. This thesis addresses three major topics to elucidate these interactions and their role in platelet biogenesis. First, we studied the topology of ECMP within BM and their impact on proplatelet formation (PPF) in vitro. By establishing a four-color immunofluorescence microscopy we localized collagens and other ECMP and determined their degree of contact towards vessels and megakaryocytes (MKs). In in vitro assays we could demonstrate that Col I mediates increased MK adhesion, but inhibits PPF by collagen receptor GPVI. By immunoblot analyses we identified that the signaling events underyling this inhibition are different from those in platelet activation at the Src family kinase level. Second, we determined the degree of MK-ECM interaction in situ using confocal laser scanning microscopy of four-color IF-stained femora and spleen sections. In transgenic mouse models lacking either of the two major collagen receptors we could show that these mice have an impaired association of MKs to collagens in the BM, while the MK count in spleen increased threefold. This might contribute to the overall unaltered platelet counts in collagen receptor-deficient mice. In a third approach, we studied how the equilibrium of ECMP within BM is altered after irradiation. Collagen type IV and laminin-α5 subunits were selectively degraded at the sinusoids, while the matrix degrading protease MMP9 was upregulated in MKs. Platelet numbers decreased and platelets became hyporesponsive towards agonists, especially those for GPVI activation. Taken together, the results indicate that MK-ECM interaction differs substantially from the well-known platelet-ECM signaling. Future work should further elucidate how ECMP can be targeted to ameliorate the platelet production and function defects, especially in patients after BM irradiation. N2 - Thrombozyten, kleine kernlose Zellen, die für die Hämostase verantwortlich sind, interagieren an verletzten Gefäßwänden mit exponierten extrazellulären Matrixproteinen (EZMP) durch Oberflächenrezeptoren. Durch die Ligandenbindung werden die Thrombozyten aktiviert, adhärieren und aggregieren schlussendlich. Schon Megakaryozyten (MKs), die unmittelbaren Vorläuferzellen im Knochenmark (KM), stehen ebenfalls mit EZMP im ständigen Kontakt. Im Gegensatz zur Thrombozyteninteraktion ist die Interaktion der MKs mit EZMP jedoch nicht sehr gut untersucht. Aus diesem Grund ist es wichtig zu verstehen wie MKs mit Sinusoiden durch die darunterliegenden EZMP interagieren. Diese Doktorarbeit beleuchtet dazu drei Hauptthemen, die zu einem besseren Verständnis dieser Interaktion und dessen Rolle in der Thrombozytenbildung beitragen. In einem ersten Themenblock klärten wir die Topologie verschiedener EZMP des Knochenmarks und deren Rolle bei der Proplättchenbildung auf. Durch die Etablierung einer Vierfarben-Immunfluoreszenzmikroskopie, lokalisierten wir verschiedene Kollagene und andere EZMP im KM und bestimmten deren Kontakt zu Gefäßen und MKs. In in vitro-Ansätzen konnten wir demonstrieren, dass Kollagen Typ I eine erhöhte Adhäsion von MKs vermittelt, aber die Proplättchenbildung durch den Kollagenrezeptor GPVI inhibiert. Mittels Immunoblotanalysen identifizierten wir eine Signalkaskade, die von der Thrombozytenaktivierung auf der Ebene der Src family Kinasen abweicht. In einem zweiten Themenkomplex bestimmten wir in situ den Grad an Interaktion von MKs mit EZMP mittels konfokaler Laserscanning-Mikroskopie von vierfach immunfluoreszenzgefärbten Femora- und Milzschnitten. In transgenen Mäusen, denen einer der zwei Hauptkollagenrezeptoren fehlen, konnten wir zeigen, dass MKs dieser Mäuse eine veränderte Assoziation zu Kollagenen im Knochenmark aufweisen, während die MK-Anzahl in der Milz um das Dreifache anstieg. Dies könnte insgesamt zur unbeeinflussten Thrombozytenzahl in diesen Mäusen beitragen. In einem dritten Themenkomplex untersuchten wir wie das Gleichgewicht im Knochenmark nach Bestrahlung beeinflusst ist. Spezifisch Kollagen Typ IV und laminin-α5 waren an den Sinusoiden degradiert, während die Expression der matrixabbauenden Protease MMP-9 in MKs hochreguliert war. Die Thrombozytenzahl sank und sie wurden hyporesponsiv auf Agonisten, speziell auf diejenigen für die GPVI-Aktivierung. Zusammengefasst zeigen die Ergebnisse, dass die Interaktion von MKs mit EZMP sich substantiell von der Thrombozyten-EZMP vermittelten Signaltransduktion unterscheidet. Zukünftige Untersuchungen sollen weiter beleuchten wie EZMP gezielt beeinflusst werden können um Defekte in der Thrombozytenproduktion und –funktion abzumildern, besonders in Patienten nach Bestrahlung. KW - Knochenmark KW - Thrombozyt KW - Extracellular matrix proteins KW - platelet biogenesis KW - Extrazelluläre Matrix KW - Megakaryocytes KW - platelets Y1 - 2018 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-155857 ER - TY - THES A1 - Gutmann, Marcus T1 - Functionalization of cells, extracellular matrix components and proteins for therapeutic application T1 - Funktionalisierung von Zellen, extrazellulären Matrixbestandteilen und Proteinen für die therapeutische Anwendung N2 - Glycosylation is a biochemical process leading to the formation of glycoconjugates by linking glycans (carbohydrates) to proteins, lipids and various small molecules. The glycans are formed by one or more monosaccharides that are covalently attached, thus offering a broad variety depending on their composition, site of glycan linkage, length and ramification. This special nature provides an exceptional and fine tunable possibility in fields of information transfer, recognition, stability and pharmacokinetic. Due to their intra- and extracellular omnipresence, glycans fulfill an essential role in the regulation of different endogenous processes (e.g. hormone action, immune surveillance, inflammatory response) and act as a key element for maintenance of homeostasis. The strategy of metabolic glycoengineering enables the integration of structural similar but chemically modified monosaccharide building blocks into the natural given glycosylation pathways, thereby anchoring them in the carbohydrate architecture of de novo synthesized glycoconjugates. The available unnatural sugar molecules which are similar to endogenous sugar molecules show minimal perturbation in cell function and - based on their multitude functional groups - offer the potential of side directed coupling with a target substance/structure as well as the development of new biological properties. The chemical-enzymatic strategy of glycoengineering provides a valuable complement to genetic approaches. This thesis primarily focuses on potential fields of application for glycoengineering and its further use in clinic and research. The last section of this work outlines a genetic approach, using special Escherichia coli systems, to integrate chemically tunable amino acids into the biosynthetic pathway of proteins, enabling specific and site-directed coupling with target substances. With the genetic information of the methanogen archaea, Methanosarcina barkeri, the E. coli. system is able to insert a further amino acid, the pyrrolysine, at the ribosomal site during translation of the protein. The natural stop-codon UAG (amber codon) is used for this newly obtained proteinogenic amino acid. Chapter I describes two systems for the integration of chemically tunable monosaccharides and presents methods for characterizing these systems. Moreover, it gives a general overview of the structure as well as intended use of glycans and illustrates different glycosylation pathways. Furthermore, the strategy of metabolic glycoengineering is demonstrated. In this context, the structure of basic building blocks and the epimerization of monosaccharides during their metabolic fate are discussed. Chapter II translates the concept of metabolic glycoengineering to the extracellular network produced by fibroblasts. The incorporation of chemically modified sugar components in the matrix provides an innovative, elegant and biocompatible method for site-directed coupling of target substances. Resident cells, which are involved in the de novo synthesis of matrices, as well as isolated matrices were characterized and compared to unmodified resident cells and matrices. The natural capacity of the matrix can be extended by metabolic glycoengineering and enables the selective immobilization of a variety of therapeutic substances by combining enzymatic and bioorthogonal reaction strategies. This approach expands the natural ability of extracellular matrix (ECM), like the storage of specific growth factors and the recruitment of surface receptors along with synergistic effects of bound substances. By the selection of the cell type, the production of a wide range of different matrices is possible. Chapter III focuses on the target-oriented modification of cell surface membranes of living fibroblast and human embryonic kidney cells. Chemically modified monosaccharides are inserted by means of metabolic glycoengineering and are then presented on the cell surface. These monosaccharides can later be covalently coupled, by “strain promoted azide-alkyne cycloaddition“ (SPAAC) and/or “copper(I)-catalyzed azide-alkyne cycloaddition“ (CuAAC), to the target substance. Due to the toxicity of the copper catalysator in the CuAAC, cytotoxicity analyses were conducted to determine the in vivo tolerable range for the use of CuAAC on living cell systems. Finally, the efficacy of both bioorthogonal reactions was compared. Chapter IV outlines two versatile carrier – spacer – payload delivery systems based on an enzymatic cleavable linker, triggered by disease associated protease. In the selection of carrier systems (i) polyethylene glycol (PEG), a well-studied, Food and Drug Administration approved substance and very common tool to increase the pharmacokinetic properties of therapeutic agents, was chosen as a carrier for non-targeting systems and (ii) Revacept, a human glycoprotein VI antibody, was chosen as a carrier for targeting systems. The protease sensitive cleavable linker was genetically inserted into the N-terminal region of fibroblast growth factor 2 (FGF-2) without jeopardizing protein activity. By exchanging the protease sensitive sequence or the therapeutic payload, both systems represent a promising and adaptable approach for establishing therapeutic systems with bioresponsive release, tailored to pre-existing conditions. In summary, by site-specific functionalization of various delivery platforms, this thesis establishes an essential cornerstone for promising strategies advancing clinical application. The outlined platforms ensure high flexibility due to exchanging single or multiple elements of the system, individually tailoring them to the respective disease or target site. N2 - Glykosylierung beschreibt einen auf biochemischen Reaktionen basierenden Prozess, welcher durch die Verknüpfung von Glykanen (Kohlenhydraten) mit Proteinen, Lipiden oder einer Vielzahl kleiner organischer Moleküle zur Bildung von Glykokonjugaten führt. Die Entstehung der Kohlenhydratketten erfolgt hierbei durch die kovalente Verknüpfung eines oder mehrerer verschiedener Einfachzucker, welche auf Grund unterschiedlicher Zusammensetzung der Bausteine, Verknüpfungsregion, Länge und Verzweigung eine hohe Diversität aufweisen. Diese Besonderheit ermöglicht eine außergewöhnliche Feinabstimmung im Bereich der Informationsübertragung, Erkennung, Stabilität und Pharmakokinetik. Aufgrund ihrer intra- und extrazellulären Omnipräsenz spielen Glykane zudem eine essentielle Rolle in der Regulierung verschiedenster körpereigener Prozesse (z.B. hormonelle Wirkung, Immunmodulation, Entzündungsreaktionen) und sind folglich ein zentraler Bestandteil bei der Aufrechterhaltung der zellulären Homöostase. Durch die Strategie des „Glycoengineering“ ist man in der Lage, strukturähnliche, aber chemisch modifizierte Zuckerbausteine in die natürlichen Glykosilierungswege einzubinden und diese somit in der Architektur der Kohlenstoffketten von neu-synthetisierten Glykokonjugaten zu verankern. Die hierfür zur Verfügung stehenden, unnatürlichen Zuckermoleküle führen auf Grund ihrer Ähnlichkeit zu körpereigenen Zuckern zu kaum relevanten Störungen der zellulären Funktion, bieten aber durch zahlreiche funktionelle Gruppen die Möglichkeit der gezielten Verknüpfung mit einer Zielsubstanz/-struktur und der Bildung neuer biologischer Eigenschaften. „Glycoengineering“ als chemisch-enzymatische Strategie bietet dabei eine wertvolle Ergänzung zu gentechnischen Ansätzen. Entsprechend beschäftigt sich diese Dissertation primär mit der Beschreibung potentieller Anwendungsgebiete des „Glycoengineering“ und dessen möglichen Einsatz in Klinik und Forschung. Der letzte Abschnitt dieser Arbeit beschreibt einen gentechnischen Ansatz, bei dem mit Hilfe von speziellen Escherichia coli Systemen chemisch modifizierbare Aminosäuren in den Biosyntheseweg von Proteinen eingebunden werden, wodurch anschließend eine spezifische und gerichtete Verknüpfung mit Zielsubstanzen ermöglicht wird. Hierbei benutzt das E. coli-System die genetische Information des methanbildenden Archaeas, Methanosarcina barkeri, mit der es in der Lage ist, eine weitere Aminosäure, das Pyrrolysin, bei der Translation eines Proteins am Ribosom einzufügen. Als Codon für diese neu gewonnene proteinogene Aminosäure fungiert das natürliche Stopp-Codon („amber codon“) UAG. Kapitel I beschreibt zwei Systeme für den Einbau von chemisch modifizierten Zuckern und zeigt Methoden für die Charakterisierung dieser Systeme auf. Es gibt zudem eine allgemeine Übersicht über den Aufbau und die Verwendung von Glykanen und veranschaulicht verschiedene Glykosilierungswege. Des Weiteren wird auch die Strategie des „metabolic glycoengineering“ erläutert. Hierbei wird der Aufbau der dabei verwendeten Grundbausteine dargestellt und auf die Epimerisierung der Zucker während deren Metabolismus eingegangen. Kapitel II überträgt das Konzept des „metabolic glycoengineering“ auf das extrazelluläre Netzwerk von Fibroblasten. Hierbei bietet der Einbau eines chemisch modifizierten Zuckerbausteins in die Matrix eine neue, elegante und biokompatible Möglichkeit der gezielten Verknüpfung von Zielsubstanzen. Die an der Neusynthese der Matrix beteiligten Bindegewebszellen sowie die isolierte Matrix wurden dabei im Vergleich zu nicht modifizierten Bindegewebszellen und Matrices charakterisiert. Durch den Aspekt des “metabolic glycoengineering” wird die natürliche Fähigkeit der Matrix erweitert und ermöglicht durch die Kombination verschiedener enzymatischer und bioorthogonal-chemischer Strategien die selektive Immobilisation einer Vielzahl von therapeutischen Substanzen. Dieser Ansatz erweitert das natürliche Spektrum der Extrazellulärmatrix (ECM), wie Bindung von spezifischen Wachstumsfaktoren, Rekrutierung von Oberflächenrezeptoren und damit einhergehend synergistische Effekte der gebundenen Stoffe. Durch die Auswahl des Zelltyps wird zudem ein breites Spektrum an verschiedenen Matrices ermöglicht. Kapitel III befasst sich mit der Möglichkeit, die Zellmembran von lebenden Fibroblasten sowie menschliche embryonale Nierenzellen gezielt zu verändern. Durch „metabolic glycoengineering“ werden auch hier chemisch modifizierte Zuckerbausteine eingefügt, die dabei auf der Zelloberfläche präsentiert werden. Anschließend können diese Zucker mittels „ringspannungs-geförderter Azid-Alkin Cycloaddition“ (“strain promoted azide-alkyne cycloaddition“, SPAAC) und „Kupfer(I)-katalysierter Azid-Alkin Cycloaddition“ (“copper(I)-catalyzed azide-alkyne cycloaddition“, CuAAC) umgesetzt werden, was eine kovalente Verknüpfung mit einer Zielsubstanz ermöglicht. Aufgrund der Toxizität des Kupferkatalysators in der CuAAC wurde anhand von zytotoxischen Untersuchungen nach einem in vivo vertretbaren Bereich für diese Reaktion gesucht, um die CuAAC auch für lebende Systeme verwendbar zu machen. Zuletzt wurde die Effizienz dieser bioorthogonalen Reaktionen miteinander verglichen. Kapitel IV beschreibt zwei vielseitig einsetzbare „carrier – spacer – payload“ Therapiesysteme (Träger-Verbindungsstück-Therapeutikum-Systeme), basierend auf einem Verbindungsstück (Linker), dessen Spaltung enzymatisch durch krankheitsspezifisch prävalente Proteasen ausgelöst wird. Bei der Auswahl der Trägersysteme wurde für das nicht-zielgerichtete System Polyethylenglycol (PEG) als Träger eingesetzt, eine gut untersuchte, „Food and Drug Administration“ zugelassene Substanz, welche als sehr gängiges Mittel zur Verbesserung der pharmakologischen Eigenschaften verwendet wird. Für das zielgerichtete System diente Revacept als Träger, ein humaner Glykoprotein VI-Antikörper. Der Protease-sensitive Linker wurde genetisch in der N-terminalen Region des Fibroblasten-Wachstumsfaktor 2 verankert, ohne dabei die Bioaktivität zu gefährden. Durch den Austausch der Protease-sensitiven Erkennungssequenz oder des Therapeutikums stellen beide Systeme einen vielversprechenden und anpassungsfähigen Ansatz für therapeutische Systeme dar, welche auf ein bereits bestehendes Erkrankungsbild genau zugeschnitten werden können. Zusammengefasst setzt diese Arbeit durch eine spezifische Funktionalisierung von verschiedenen Therapiesysteme einen wichtigen Meilenstein für vielversprechende Strategien zur Verbesserung der klinischen Anwendbarkeit. Durch den Austausch einer oder mehrerer Komponenten des Systems gewährleisten die hier beschriebenen Therapiesysteme eine hohe Anpassungsfähigkeit, wodurch sie individuell auf die jeweilige Krankheit oder den jeweiligen Zielort angepasst werden können. KW - Glykosylierung KW - Extrazelluläre Matrix KW - Zelloberfläche KW - Antikörper KW - Fibroblastenwachstumsfaktor KW - Glycoengineering KW - Drug delivery platforms KW - Protease-sensitive release Y1 - 2019 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-170602 ER - TY - THES A1 - Jones, Gabriel T1 - Bioinspired FGF-2 delivery for pharmaceutical application T1 - Bioinspiriertes Delivery von FGF-2 für eine pharmazeutische Applikation N2 - In resent years the rate of biologics (proteins, cytokines and growth-factors) as newly registered drugs has steadily risen. The greatest challenge for pharmaceutical biologics poses its arrival at the desired target location due to e.g. proteolytic and pH dependent degradation, plasma protein binding, insolubility etc. Therefore, advanced drug delivery systems, where biologics are site directed immobilized to carriers mimicking endogenous storage sites such as the extra cellular matrix can enormously assist the application and consequently the release of exogenous administered pharmaceutical biologics. We have resorted to the fibroblast growth factor 2/ heparansulfate/ fibroblast growth factor bindingprotein 1 system as a model. Phase I deals with the selection and subcloning of a wild type murine FGF-2 construct into the bacterial pHis-Trx vector system for high yields of expression and fast, feasible purification measurements. This first step enables the provision of mFGF-2, which plays a pivotal part as a growth factor in the wound healing process as well as the vascularization of tumors, for future investigations. Therefore, the correct expression of mFGF-2 was monitored via MALDI-MS and SDS-PAGE, whereas the proper folding of the tertiary beta-trefoil structure was assessed by fluorescence spectroscopy. The MTT assay allowed us to ensure that the bioactivity was comparable to sourced FGF-2. In the last step, the purity; a requirement for future binding- and protein-protein interaction assays was monitored chromatographically (RP-HPLC). In addition, a formulation for freeze-drying was developed to ensure protein stability and integrity over a period of 60 days. Altogether, the bacterial expression and purification proved to be suitable, leading to bioactive and stable production of mFGF-2. In Phase II the expression, purification and characterization of FGFBP1, as the other key partner in the FGF-2/ HS/ FGFBP1 system is detailed. As FGFBP1 exhibits a complex tertiary structure, comprised of five highly conserved disulfide bonds and presumably multiple glycosylation sites, a eukaryotic expression was used. Human embryonic kidney cells (HEK 293F) as suspension cells were transiently transfected with DNA-PEI complexes, leading to expression of Fc-tagged murine FGFBP1. Different PEI to DNA ratios and expression durations were investigated for optimal expression yields, which were confirmed by western blot analysis and SDS-PAGE. LC-MS/MS analysis of trypsin and elastase digested FGFBP1 gave first insights of the three O-glycosylation sites. Furthermore, the binding protein was modified by inserting a His6-tag between the Fc-tag (for purification) and the binding protein itself to enable later complexation with radioactive 99mTc as radio ligand to track bio distribution of administered FGFBP1 in mice. Overall, expression, purification and characterization of mFGFBP1 variants were successful with a minor draw back of instability of the tag free binding protein. Combining the insights and results of expressed FGF-2 as well as FGFBP1 directed us to the investigation of the interaction of each partner in the FGF-2/ HS/ FGFBP1 system as Phase III. Thermodynamic behavior of FGF-2 and low molecular weight heparin (enoxaparin), as a surrogate for HS, under physiological conditions (pH 7.4) and pathophysiological conditions, similar to hypoxic, tumorous conditions (acidic pH) were monitored by means of isothermal titration calorimetry. Buffer types, as well as the pH influences binding parameters such as stoichiometry (n), enthalpy (ΔH) and to some extent the dissociation constant (KD). These findings paved the way for kinetic binding investigations, which were performed by surface plasmon resonance assays. For the first time the KD of full length FGFBP1 and FGF-2 was measured. Furthermore the binding behavior of FGF-2 to FGFBP1 in the presence of various heparin concentrations suggest a kinetic driven release of bound FGF-2 by its chaperone FGFBP1. Having gathered multiple data on the FGF-2 /HS /FGFBP1 system mainly in solution, our next step in Phase IV was the development of a test system for immobilized proteins. With the necessity to better understand and monitor the cellular effects of immobilized growth factors, we decorated glass slides in a site-specific manner with an RGD-peptide for adhesion of cells and via the copper(I)-catalyzed-azide-alkyne cycloaddition (CuAAC) a fluorescent dye (a precursor for modified proteins for click chemistry). Human osteosarcoma cells were able to grow an the slides and the fluorescence dye was immobilized in a biocompatible way allowing future thorough bioactivity assay such as MTT-assays and phospho-ERK-assays of immobilized growth factors. N2 - In den letzten Jahren ist der Anteil an Biologika (Proteine, Zytokine und Wachstumsfaktoren), die neu zugelassen wurden, kontinuierlich angestiegen. Die größte Herausforderung für Biopharmazeutika stellt das Erreichen des gewünschten Wirkortes dar, aufgrund von beispielsweise enzymatischen und pH abhängigem Abbau, Plasmaproteinbindung, und niedriger Löslichkeit. Daher können moderne Wirkstoffträgersysteme, in denen Biologika ortsspezifisch an Träger immobilisiert sind und endogene Aufbewahrungsorte nachahmen, wie zum Beispiel die extrazelluläre Matrix, die Anwendung enorm erleichtern und folglich auch die Freisetzung von Biopharmazeutika, die exogen verabreicht wurden ermöglichen. Wir haben uns auf das Fibroblasten-Wachstumsfaktor 2/ Heparansulfat/ Fibroblasten-Wachstumsfaktor Bindungsprotein 1 (FGF-2/ HS/ FGFBP1) System als Modell gestützt. Abschnitt I handelt von der Auswahl und der Subklonierung von einem wildtypischen, murinen FGF-2 Konstrukt in ein bakterielles pHis-Trx Vektorsystem – für hohe Ausbeuten bei der Expression und für eine schnell durchführbare Aufreinigung. Dieser erste Schritt ermöglicht die Bereitstellung von mFGF-2 für zukünftige Untersuchungen, das eine zentrale Rolle als Wachstumsfaktor im Wundheilungsprozess spielt, genauso wie bei der Gefäßversorgung von Tumoren. Daher wurde die richtige Expression von mFGF-2 durch MALDI-MS und SDS-PAGE überwacht, wobei die korrekte Faltung der tertiären beta-Faltblatt-Struktur durch Fluoreszenzmikroskopie ausgewertet wurde. Mit dem MTT Test konnten wir gewährleisten, dass die Bioaktivität von mFGF-2 und dem käuflich erworbenen FGF-2 übereinstimmen. Im letzten Schritt wurde die Reinheit, die eine wichtige Voraussetzung für künftige Bindungs- und Protein-Protein-Wechselwirkung-Untersuchungen darstellt, chromatographisch (RP-HPLC) überwacht. Des Weiteren wurde eine Formulierung zur Gefriertrocknung entwickelt, um die Stabilität und Unversehrtheit des Proteins über 60 Tage sicherzustellen. Insgesamt erwiesen sich die bakterielle Expression und Aufreinigung als geeignet und führten zur Herstellung von bioaktivem und stabilem mFGF-2. Im Abschnitt II wird die Expression, Aufreinigung und Charakterisierung von FGFBP1 genau beschrieben, ein ebenso wichtiger Partner im FGF-2/HS/FGFBP1-System. Da FGFBP1 eine komplexe tertiäre Struktur aufweist, die aus fünf hochkonservierten Disulfidbrücken und vermutlich einigen Glykosylierungsstellen besteht, wurde ein eukaryotisches Expressionssystem angewendet. Menschliche embryonale Nierenzellen (HEK 293F) wurden als Suspensionszellen transient mit DNA-PEI Komplexen transfiziert und führten zur Expression von Fc markiertem mausartigem FGFBP1. Verschiedene PEI:DNA Verhältnisse wurden untersucht, sowie die Dauer der Expression variiert, um die Ausbeute der Expression zu optimieren. Die Ergebnisse wurden mittels Western Blot und SDS-PAGE bestätigt. Die LC-MS/MS Messung, des mit Trypsin und Elastase verdautem FGFBP1, ergaben erste Erkenntnisse über die drei O-Glykosylierungsstellen. Des Weiteren wurde das Fusionsprotein durch Einschub eines His6-tags zwischen den Fc-tag und FGFBP1 erweitert, um dem Protein die Eigenschaft zu geben, mehrwertige Kationen zu komplexieren. 99mTc, als radioaktiver Ligand, kann in späteren Untersuchungen die Verteilung im Gewebe, anhand von Mäusen darstellen. Die Expression, Aufreinigung, sowie die Charakterisierung von den murinen FGFBP1 Varianten war erfolgreich, jedoch erwies sich das Bindungsprotein ohne Fc-Teil als weniger stabil. Durch Zusammenfassung der Ergebnisse und Erkenntnisse der beiden exprimierten Proteine mFGF-2 und FGFBP1, konnten wir die Wechselwirkungen der Partner im FGF-2 /HS / FGFBP1 Systems untereinander im Abschnitt III untersuchen. Isotherme Titrationskalorimetrie wurde herangezogen, um das thermodynamische Verhalten von FGF-2 mit niedermolekularem Heparin (Enoxaparin), als Stellvertreter für HS, unter physiologischen Bedingungen (pH 7,4) und pathologischer Bedingungen (saurer pH, hervorgerufen durch Sauerstoffmangel im Tumorgewebe) aufzuklären. Sowohl die Art des Puffersystems als auch der pH Wert beeinflussen die Bindungsparameter: Enthalpie (DH), die Stöchiometrie (n) und zu einem gewissen Teil sogar die Dissoziationkonstante (KD). Die thermodynamischen Untersuchungen ermöglichten im folgenden Schritt, mittels Oberflächen Plasmon Resonanz (SPR), kinetische Bindungsverhältnisse zu ermitteln. Zum ersten Mal wurde dank der SPR Dissoziationskonstanten von FGFBP1 und FGF-2 erfasst. Da alle bisherigen Erkenntnisse des FGF-2/ HS/ FGFBP1 Systems hauptsächlich von in Lösung gebrachten Partnern gewonnen wurden, erfolgte im Abschnitt IV die Entwicklung eines Testsystems für immobilisierte Proteine. Durch die zwingende Notwendigkeit zelluläre Effekte von immobilisierten Wachstumsfaktoren zu verstehen und zu beobachten, haben wir Objektträger aus Glas, in einem ortsspezifischem Verfahren mit einem RGD-Peptid, für die Zellanhaftung und mittels 1,3-Dipolare Cycloaddition einen Fluoreszenzfarbstoff (ein Vorläufer für „clickbare“, modifizierte Proteine) dekoriert. Menschliche Knochenkrebszellen waren in der Lage auf diesen Objektträgern zu wachsen und der Farbstoff konnte in einem nicht zytotoxischen Verfahren spezifisch an der Oberfläche immobilisiert werden. Dieses Testsystem erlaubt in Zukunft ausführliche Bioaktivitäts- und Proliferationsstudien von immobilisierten Proteinen durchzuführen. KW - Fibroblastenwachstumsfaktor KW - Extrazelluläre Matrix KW - FGF KW - advanced drug delivery system KW - extra cellular matrix Y1 - 2018 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-153179 ER - TY - THES A1 - Werner, Katharina Julia T1 - Adipose Tissue Engineering - In vitro Development of a subcutaneous fat layer and a vascularized adipose tissue construct utilizing extracellular matrix structures T1 - Fettgewebe Engineering - In vitro Entwicklung einer subkutanen Fettschicht und eines vaskularisierten Fettgewebskonstruktes unter Verwendung extrazellulärer Matrixstrukturen N2 - Each year millions of plastic and reconstructive procedures are performed to regenerate soft tissue defects after, for example, traumata, deep burns or tumor resections. Tissue engineered adipose tissue grafts are a promising alternative to autologous fat transfer or synthetic implants to meet this demand for adipose tissue. Strategies of tissue engineering, especially the use of cell carriers, provide an environment for better cell survival, an easier positioning and supplemented with the appropriate conditions a faster vascularization in vivo. To successfully engineer an adipose tissue substitute for clinical use, it is crucial to know the actual intended application. In some areas, like the upper and lower extremities, only a thin subcutaneous fat layer is needed and in others, large volumes of vascularized fat grafts are more desirable. The use and interplay of stem cells and selected scaffolds were investigated and provide now a basis for the generation of fitted and suitable substitutes in two different application areas. Complex injuries of the upper and lower extremities, in many cases, lead to excessive scarring. Due to severe damage to the subcutaneous fat layer, a common sequela is adhesion formation to mobile structures like tendons, nerves, and blood vessels resulting in restricted motion and disabling pain [Moor 1996, McHugh 1997]. In order to generate a subcutaneous fat layer to cushion scarred tissue after substantial burns or injuries, different collagen matrices were tested for clinical handling and the ability to support adipogenesis. When testing five different collagen matrices, PermacolTM and StratticeTM showed promising characteristics; additionally both possess the clinical approval. Under culture conditions, only PermacolTM, a cross-linked collagen matrix, exhibited an excellent long-term stability. Ranking nearly on the same level was StratticeTM, a non-cross-linked dermal scaffold; it only exhibited a slight shrinkage. All other scaffolds tested were severely compromised in stability under culture conditions. Engineering a subcutaneous fat layer, a construct would be desirable with a thin layer of emerging fat for cushioning on one side, and a non-seeded other side for cell migration and host integration. With PermacolTM and StratticeTM, it was possible to produce constructs with ASC (adipose derived stem cells) seeded on one side, which could be adipogenically differentiated. Additionally, the thickness of the cell layer could be varied. Thereby, it becomes possible to adjust the thickness of the construct to the surrounding tissue. In order to reduce the pre-implantation time ex vivo and the costs, the culture time was varied by testing different induction protocols. An adipogenic induction period of only four days was demonstrated to be sufficient to obtain a substantial adipogenic differentiation of the applied ASC. Thus, seeded with ASC, PermacolTM and StratticeTM are suitable scaffolds to engineer subcutaneous fat layers for reconstruction of the upper and lower extremities, as they support adipogenesis and are appropriately thin, and therefore would not compromise the cosmesis. For the engineering of large-volume adipose tissue, adequate vascularization still represents a major challenge. With the objective to engineer vascularized fat pads, it is important to consider the slow kinetics of revascularization in vivo. Therefore, a decellularized porcine jejunum with pre-existing vascular structures and pedicles to connect to the host vasculature or the circulation of a bioreactor system was used. In a first step, the ability of a small decellularized jejunal section was tested for cell adhesion and for supporting adipogenic differentiation of hASC mono-cultures. Cell adhesion and adipogenic maturation of ASC seeded on the jejunal material was verified through histological and molecular analysis. After the successful mono-culture, the goal was to establish a MVEC (microvascular endothelial cells) and ASC co-culture; suitable culture conditions had to be found, which support the viability of both cell types and do not interfere with the adipogenic differentiation. After the elimination of EGF (epidermal growth factor) from the co-culture medium, substantial adipogenic maturation was observed. In the next step, a large jejunal segment (length 8 cm), with its pre-existing vascular structures and arterial/venous pedicles, was connected to the supply system of a custom-made bioreactor. After successful reseeding the vascular structure with endothelial cells, the lumen was seeded with ASC which were then adipogenically induced. Histological and molecular examinations confirmed adipogenic maturation and the existence of seeded vessels within the engineered construct. Noteworthily, a co-localization of adipogenically differentiating ASC and endothelial cells in vascular networks could be observed. So, for the first time a vascularized fat construct was developed in vitro, based on the use of a decellularized porcine jejunum. As this engineered construct can be connected to a supply system or even to a patient vasculature, it is versatile in use, for example, as transplant in plastic and reconstruction surgery, as model in basic research or as an in vitro drug testing system. To summarize, in this work a promising substitute for subcutaneous fat layer reconstruction, in the upper and lower extremities, was developed, and the first, as far as reported, in vitro generated adipose tissue construct with integrated vascular networks was successfully engineered. N2 - Jedes Jahr werden Millionen von plastischen und wiederherstellenden Eingriffe durchgeführt, um zum Beispiel nach Traumata, hochgradigen Verbrennungen oder Tumorekonstruktionen, die natürliche Erscheinung und Funktion im Bereich von Weichgewebsdefekt wiederherzustellen. Gezüchtete Fettgewebskonstrukte sind eine vielversprechende Alternative zu autologen Fettgewebstransfers oder synthetischen Implantaten, um dem Bedarf an Fettgewebe gerecht zu werden. Die Strategien der Gewebezüchtung, besonders das Verwenden von Zellträgern, schaffen eine Umgebung für besseres Zellüberleben, eine einfachere Positionierung und - versehen mit den entsprechenden Eigenschaften - eine schnellere Vaskularisierung in vivo. Um erfolgreich einen Fettgewebe-Ersatz für die klinische Anwendung herzustellen, ist es notwendig das spätere Anwendungsgebiet zu kennen. In manchen Bereichen, wie in den oberen und unteren Extremitäten, braucht man nur eine dünne Unterhautfettschicht, und in anderen Bereichen wiederum ist ein großes Volumen an vaskularisiertem Fettgewebskonstrukt anzustreben. Die Nutzung und das Zusammenspiel von Stammzellen und ausgewählten Zellträgern wurden untersucht und legen nun eine Basis für die Herstellung von passendem und zweckmäßigem Ersatzgewebe zweier unterschiedlicher Anwendungsgebiete. Komplexe Verletzungen der oberen und unteren Extremitäten führen oftmals zu beträchtlicher Narbenbildung. Eine häufige Folgeerscheinung, hervorgerufen durch eine schwere Beschädigung des Unterhautfettgewebes, ist die Adhäsion zwischen mobilen Strukturen wie Sehnen, Nerven und Blutgefäßen. Dies resultiert dann in eingeschränkter Beweglichkeit und lähmenden Schmerzen [Moor 1996, McHugh 1997]. Um eine subkutane Fettschicht herzustellen, die das vernarbte Gewebe nach schwerer Verbrennung oder Verletzung polstert, wurden verschiedene Kollagenmaterialien auf die klinische Handhabung und die Unterstützung der Adipogenese untersucht. In der Untersuchung von fünf verschiedenen Kollagenmatrices zeigten PermacolTM und StratticeTM vielversprechende Eigenschaften. Beide besitzen außerdem die klinische Zulassung. PermacolTM, eine chemisch quervernetzte Kollagenmatrix, zeigte unter Kulturbedingungen hervorragende Langzeitstabilität. Fast ebenso gute Eigenschaften konnten bei StratticeTM, einem nicht vernetzten dermalen Gerüstmaterial, beobachtet werden; es zeigte lediglich leichte Schrumpfung. Alle sonst getesteten Kollagenmaterialien waren unter Kulturbedingungen stark in ihrer Stabilität beeinträchtigt. Zur Herstellung einer subkutanen Fettschicht wäre ein Konstrukt wünschenswert mit einer dünnen, gerade entstehenden Fettschicht für die Polsterung auf der einen Seite und einer nicht besiedelten anderen Seite für die Zelleinwanderung und die Integration in das umliegende Gewebe. Mit PermacolTM und StratticeTM war es möglich Konstrukte herzustellen, welche auf einer Seite mit ASC (aus dem Fettgewebe isolierte Stammzellen) besiedelt und anschließend adipogen differenziert werden konnten. Zusätzlich konnte die Dicke der Zellschicht hierbei variiert werden. Somit ist es möglich die Dicke des Konstruktes an das umliegende Gewebe anzupassen. Um die Preimplantationszeit ex vivo zu verkürzen und damit auch die Kosten zu senken, wurde die Kulturzeit variiert, indem verschiedene Induktionsprotokolle getestet wurden. Eine adipogene Induktionsperiode von nur vier Tagen erwies sich als ausreichend, um eine substantielle adipogene Differenzierung der eingesetzten ASC zu erreichen. Das heißt, die mit ASC besiedelten PermacolTM und StratticeTM Matrices sind zweckdienliche Zellträgermaterialien, um eine subkutane Fettschicht für die oberen und unteren Extremitäten herzustellen, da sie die Adipogenese unterstützen und durch die nur geringe und anpassbare Dicke die Kosmesis nicht beeinträchtigen. Für die Entwicklung von großvolumigem Fettgewebe stellt die adäquate Vaskularisierung noch immer eine große Herausforderung dar. Mit dem Ziel ein vaskularisiertes Fettkonstrukt herzustellen, ist es wichtig die langsame Kinetik der Revaskularisierung in vivo zu berücksichtigen. Daher wurde hier ein dezellularisiertes Schweinedarmsegment mit schon vorhandenen Gefäßstrukturen und Gefäßanschlüssen für die Verbindung zum Kreislaufsystem des Patienten oder eines Bioreaktor-Systems verwendet. Im ersten Schritt wurden auf einem kleinen dezellularisierten Schweinedarm-Stück die Zelladhäsion und die adipogene Differenzierung der ASC in Monokultur getestet. Die Zelladhäsion und die adipogene Reifung konnte mittels histologischer und molekularer Analysen auf dem jejunalen Material nachgewiesen werden. Nach der erfolgreichen Monokultur musste die Co-Kultur von MVEC (micro vaskuläre Endothelzellen) und ASC etabliert werden. Um dieses Ziel zu erreichen, wurden geeignete Kulturbedingungen gesucht, die die Lebensfähigkeit beider Zelltypen unterstützen und gleichzeitig die adipogene Differenzierung nicht beeinträchtigen. Nach dem Ausschluss von EGF (epidermaler Wachstumsfaktor) aus dem Co-Kulturmedium wurde eine substantielle adipogene Reifung der ASC beobachtet. Im nächsten Schritt wurde ein großes dezellularisiertes jejunales Darmsegment (Länge 8 cm) mit der schon existenten Gefäßstruktur und dem arteriellen und venösen Gefäßstiel an den spezialangefertigten Bioreaktor angeschlossen. Nach der erfolgreichen Wiederbesiedelung der Gefäßstrukturen mit Endothelzellen wurde das Darmlumen mit ASC besiedelt, welche anschließend adipogen induziert wurden. Histologische und molekulare Untersuchungen konnten die adipogenen Reifung und die Existenz von besiedelten Gefäßen im hergestellten Konstrukt bestätigen. Besonders erwähnenswert ist die Beobachtung der Co-Lokalisierung von adipogen differenzierenden ASC und Endothelzellen in vasculären Netzwerken. Somit wurde zum ersten Mal - basierend auf einem dezellularisierten Schweinedarm - ein vaskularisiertes Fettgewebskonstrukt in vitro hergestellt. Da dieses Konstrukt an das Versorgungssystem angeschlossen oder mit dem Blutkreislauf des Patienten verbunden werden kann, ist es vielfältig einsetzbar, zum Beispiel in der plastisch-rekonstruktiven Chirurgie, als Modell in der Grundlagenforschung oder als ein in vitro Medikamenten-Testsystem. Zusammengefasst, wurde in der vorgelegten Arbeit ein vielversprechendes Ersatzmaterial für die Rekonstruktion des Unterhautfettgewebes für die unteren und oberen Extremitäten entwickelt, und zum ersten Mal erfolgreich, so weit in der Literatur bekannt, ein Fettgewebskonstrukt mit integriertem vaskularisiertem Netzwerk in vitro generiert. KW - Tissue Engineering KW - Fettgewebe KW - Extrazelluläre Matrix KW - Vascularisation KW - adipose tissue engineering KW - subcutaneous fat layer KW - scar revision surgery KW - vascularized fat construct KW - Bioreactor System KW - extracellular matrix KW - adipose tissue Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-104676 ER - TY - THES A1 - Heffels, Karl-Heinz T1 - Functional nanofibres for regenerative medicine T1 - Funktionelle Nanofasern für die regenerative Medizin N2 - This thesis concerned the design and examination of a scaffold for tissue engineering applications. The template for the presented scaffold came from nature itself: the intercellular space in tissues that provides structure and support to the cells of the respective tissue, known as extracellular matrix (ECM). Fibres are a predominant characteristic feature of ECM, providing adhesion sites for cell-matrix interactions. In this dissertation a fibrous mesh was generated using the electrospinning technique to mimic the fibrous structure of the ECM. Two base polymers were explored: a biodegradable polyester, poly(D,L-lactide-co-glycolide); and a functional PEG-based star polymer, NCO-sP(EO-stat-PO). This topic was described in three major parts: the first part was materials based, concerning the chemical design and characterisation of the polymer scaffolds; the focus was then shifted to the cellular response to this fibrous scaffold; and finally the in vivo performance of the material was preliminarily assessed. The first steps towards an electrospun mesh started with adjusting the spinning parameters for the generation of homogeneous fibres. As reported in Chapter 3 a suitable setup configuration was on the one hand comprised of a spinning solution that consisted of 28.5 w/v% PLGA RG 504 and 6 w/v% NCO-sP(EO-stat-PO) in 450 µL acetone, 50 µL DMSO and 10 µL of an aqueous trifluoroacetic acid solution. On the other hand an ideal spinning behaviour was achieved at process parameters such as a flow rate of 0.5 mL/h, spinneret to collector distance of 12-16 cm and a voltage of 13 kV. The NCO-sP(EO-stat-PO) containing fibres proved to be highly hydrophilic as the functional additive was present on the fibre surface. Furthermore, the fibres featured a bulk degradation pattern as a consequence of the proportion of PLGA. Besides the morphologic similarity to ECM fibres, the functionality of the electrospun fibres is also decisive for a successful ECM mimicry. In Chapter 4, the passive as well as active functionality of the fibres was investigated. The fibres were required to be protein repellent to prevent an unspecific cell adhesion. This was proven as even 6.5 % sP(EO-stat-PO) in the PLGA fibres reduced any unspecific protein adsorption of bovine serum albumin and foetal calf serum to less than 1 %. However, avidin based proteins attached to the fibres. This adhesion process was avoided by an additional fibre surface treatment with glycidol. The active functionalisation of NCO-sP(EO-stat-PO)/PLGA fibres was investigated with two fluorescent dyes and biocytin. A threefold, chemically orthogonal, fibre modification was achieved with these dyes. The chapters about the chemical and mechanical properties laid the basis for the in vitro chapters where a specific fibre functionalisation with peptides was conducted to analyse the cell adhesion and biochemical expressions. Beginning with fibroblasts in Chapter 5 the focus was on the specific cell adhesion on the electrospun fibres. While NCO-sP(EO-stat-PO)/PLGA fibres without peptides did not allow any adhesion of fibroblasts, a fibre modification with GRGDS (an adhesion mediating peptide sequence) induced the adhesion and spreading of human dermal fibroblasts on the fibrous scaffolds. The control sequence GRGES that has no adhesion mediating qualities did not lead to any cell adhesion as observed on fibres without modifications. While the experiments of Chapter 5 were a proof-of-concept, in Chapter 6 a possible application in cartilage tissue engineering was examined. Therefore, primary human chondrocytes were seeded on fibrous scaffolds with various peptide sequences. Though the chondrocytes exhibited high viability on all scaffolds, an active interaction of cells and fibres was only found for the decorin derived sequence CGKLER. Live-cell-imaging revealed both cell attachment and migration within CGKLER-modified meshes. As chondrocytes undergo a de-differentiation towards a fibroblast-like phenotype, the chondrogenic re-differentiation on these scaffolds was investigated in a long term cell culture experiment of 28 days. Therefore, the glycosaminoglycan production was analysed as well as the mRNA expression of genes coding for collagen I and II, aggrecan and proteoglycan 4. In general only low amounts of the chondrogenic markers were measured, suggesting no chondrogenic differentiation. For conclusive evidence follow-up experiments are required that support or reject the findings. The success of an implant for tissue engineering relies not only on the response of the targeted cell type but also on the immune reaction caused by leukocytes. Hence, Chapter 7 dealt with primary human macrophages and their behaviour and phenotype on two-dimensional (2D) surfaces compared to three-dimensional (3D) fibrous substrates. It was found that the general non-adhesiveness of NCO-sP(EO-stat-PO) surfaces and fibres does not apply to macrophages. The cells aligned along the fibres on surfaces or resided in the pores of the meshes. On flat surfaces without 3D structure the macrophages showed a retarded adhesion kinetic accompanied with a high migratory activity indicating their search for a topographical feature to adhere to. Moreover, a detailed investigation of cell surface markers and chemokine signalling revealed that macrophages on 2D surfaces exhibited surface markers indicating a healing phenotype while the chemokine release suggested a pro-inflammatory phenotype. Interestingly, the opposite situation was found on 3D fibrous substrates with pro-inflammatory surface markers and pro-angiogenic cytokine release. As the immune response largely depends on cellular communication, it was concluded that the NCO-sP(EO-stat-PO)/PLGA fibres induce an adequate immune response with promising prospects to be used in a scaffold for tissue engineering. The final chapter of this thesis reports on a first in vivo study conducted with the presented electrospun fibres. Here, the fibres were combined with a polypropylene mesh for the treatment of diaphragmatic hernias in a rabbit model. Two scaffold series were described that differed in the overall surface morphology: while the fibres of Series A were incorporated into a thick gel of NCO-sP(EO-stat-PO), the scaffolds of Series B featured only a thin hydrogel layer so that the overall fibrous structure could be retained. After four months in vivo the treated defects of the diaphragm were significantly smaller and filled mainly with scar tissue. Thick granulomas occurred on scaffolds of Series A while the implants of Series B did not induce any granuloma formation. As a consequence of the generally positive outcome of this study, the constructs were enhanced with a drug release system in a follow-up project. The incorporated drug was the MMP-inhibitor Ilomastat which is intended to reduce the formation of scar tissue. In conclusion, the simple and straight forward fabrication, the threefold functionalisation possibility and general versatile applicability makes the meshes of NCO-sP(EO-stat-PO)/PLGA fibres a promising candidate to be applied in tissue engineering scaffolds in the future. N2 - Diese Dissertation beschäftigte sich mit der Entwicklung und Untersuchung eines Gerüsts zur Geweberegeneration. Der interzelluläre Raum, der in Geweben für die Gewebestruktur verantwortlich ist, wurde als Vorbild aus der Natur für das entwickelte Gerüst verwendet. Fasern sind in dieser extrazellulären Matrix (EZM) ein charakteristischer Bestandteil, die Adhäsionssequenzen für Zell-Matrix-Interaktionen enthalten und zur strukturellen Organisation der Gewebe beitragen. In der vorliegenden Arbeit wurden Faservliese mit Hilfe des elektrostatischen Verspinnens hergestellt, um die natürlichen Fasern der EZM zu imitieren. Zwei Polymere bildeten die chemische Grundlage für diese Fasern: Ein bioabbaubarer Polyester, Poly(D,L-Laktid-co-Glykolid) (PLGA) und ein funktionales auf Polyethylenglykol basierendes, sternförmiges Polymer, NCO-sP(EO-stat-PO). Der erste Teil des in drei Hauptteile untergliederten Themas beschäftigte sich mit dem chemischen Design und der Fasercharakterisierung im Sinne der Materialeigenschaften. Der zweite Teil betrachtet die Auswirkungen der Fasern auf zellulärer Ebene, während der dritte Teil einen ersten Eindruck über die in vivo Reaktion auf die Materialien vermittelt. Die ersten Schritte in Richtung eines elektrostatisch gesponnenen Vlieses begannen mit der Erforschung geeigneter Einstellungen für eine homogene Faserproduktion. Kapitel 3 thematisiert geeignete Spinnparameter, zu denen auf der einen Seite eine spinnfähige Lösung gehörte, die aus 28.5 w/v% PLGA RG 504 und 6 w/v% NCO-sP(EO-stat-PO) in 450 µL Aceton, 50 µL DMSO und 10 µL trifluoressigsaurer wässriger Lösung besteht. Auf der anderen Seite wurden Prozessparameter gefunden, wie zum Beispiel eine Flussrate von 0.5 mL/h und ein Kollektor-Abstand von 12-16 cm, die bei einer Potentialdifferenz von 13 kV ein stabiles Spinnverhalten garantierten. Fasern mit dem Additiv NCO-sP(EO-stat-PO) zeigten eine äußerst starke Hydrophilie, da das Additiv während des Spinnprozesses an die Faseroberfläche segregierte. Des Weiteren sind die Fasern dank des PLGA-Anteils nach einem Volumenabbaumechanismus unter physiologischen Bedingungen degradierbar. Neben der morphologischen Ähnlichkeit zwischen natürlichen Fasern der EZM und elektrogesponnenen Fasern ist die Funktionalität der synthetischen Fasern entscheidend für eine erfolgreiche Imitation der EZM. Kapitel 4 betrachtet deswegen sowohl die passive als auch aktive Funktionalität der Fasern. Unter passive Funktionalität fällt das proteinabweisende Verhalten, welches eine unspezifische Zelladhäsion verhindert. Es wurde gezeigt, dass ein Anteil von 6.5 % sP(EO-stat-PO) in den PLGA-Fasern ausreicht, um die unspezifische Adhäsion von Albumin aus Rinderserum und fötalem Kälberserum auf weniger als 1 % zu senken. Dennoch adhärierten avidinbasierte Proteine auf den Fasern, was jedoch durch eine Behandlung mit Glycidol unterbunden werden konnte. Die aktive Funktionalisierung wurde exemplarisch mit zwei Fluoreszenzfarbstoffen und Biocytin untersucht. Mit diesen Modellmolekülen wurde eine dreifache, chemisch orthogonale Fasermodifizierung erreicht. Die Kapitel über die chemischen und mechanischen Eigenschaften haben die Grundlage für in vitro Zellversuche gelegt, bei denen eine Faserfunktionalisierung mit Peptidsequenzen durchgeführt wurde, um eine spezifische Zelladhäsion zu erreichen und die biochemische Reaktion der Zellen zu untersuchen. In Kapitel 5 lag der Fokus auf der spezifischen Adhäsion von humanen dermalen Fibroblasten an den elektrogesponnenen Fasern. Während NCO-sP(EO-stat-PO)/PLGA Fasern ohne Peptide keine Zelladhäsion zuließen, induzierte eine Fasermodifikation mit GRGDS, einer adhäsionsvermittelnden Peptidsequenz, sowohl die Adhäsion als auch Ausbreitung der Fibroblasten auf den Fasern. Eine Kontrollsequenz ohne adhäsionsvermittelnde Eigenschaften (GRGES), führte, wie auch Fasern ohne Peptide, zu keiner Zelladhäsion. Die Experimente von Kapitel 6 gingen über das reine Machbarkeitskonzept von Kapitel 5 hinaus, indem eine mögliche Anwendung im Bereich der Knorpelregeneration untersucht wurde. Daher wurden primäre humane Chondrozyten auf Faservliesen ausgesät, die mit unterschiedlichen Peptiden modifiziert wurden. Trotz einer allgemein sehr guten Vitalität der Zellen auf allen Fasertypen, zeigten die Chondrozyten nur auf Vliesen mit der aus Decorin abgeleiteten CGKLER-Sequenz eine aktive Interaktion. Diese konnte mit dem Live-Cell-Imaging-Verfahren anhand der Zelladhäsion und Zellmigration beobachtet werden. Da Chondrozyten in der 2D-Expansionszellkultur einer Dedifferenzierung in Richtung eines Fibroblasten ähnlichen Zelltypen unterliegen, wurde eine 28-tägige Studie durchgeführt, um das Redifferenzierungsverhalten auf den Fasergerüsten zu untersuchen. Dazu wurde sowohl die Glykosaminoglykanproduktion analysiert als auch die mRNA Expression der Gene, die die Kollagen I und II, Aggrecan und Proteoglykan 4 Produktion regulieren. Die chondrogenen Marker wurden in diesen Versuchen nur geringfügig ausgeschüttet, was in Anbetracht der großen Varianzen in den Messwerten auf keine Redifferenzierung schließen lässt. Für eine abschließende Beurteilung werden Folgeexperimente empfohlen, die die gemachten Beobachtungen bestärken oder widerlegen. Der Erfolg eines Implantats zur Geweberegeneration beruht nicht nur auf der gewünschten Reaktion des Zielzelltyps, sondern auch auf der Immunreaktion des Organismus, welche durch Leukozyten gesteuert wird. Folglich beschäftigte sich Kapitel 7 mit dem Verhalten und den Phänotypen primärer humaner Makrophagen auf dreidimensionalen Fasergerüsten und zweidimensionalen Oberflächen im Vergleich zueinander. Bei den Versuchen zeigte sich, dass die generelle Nicht-Adhäsivität von NCO-sP(EO-stat-PO) Oberflächen für Makrophagen nicht zutrifft. Die Zellen richteten sich an den Fasern auf den Oberflächen aus oder saßen in den Poren der Vliese. Auf flachen Oberflächen ohne dreidimensionale Struktur wiesen die Makrophagen ein verzögertes Adhäsionsverhalten auf und migrierten stark über die Oberfläche auf der Suche nach topographischen Unebenheiten, um dort adhärent zu werden. Des Weiteren zeigte eine detaillierte Untersuchung der Oberflächenmarker und der Zytokinausschüttung, dass Makrophagen auf 2D-Oberflächen gemäß der Oberflächenmarker einen entzündungs-hemmenden Phänotypen aufwiesen, während die Zytokinausschüttung einen entzündungs-fördernden Phänotypen suggerierte. Interessanterweise bot sich das entgegengesetzte Bild auf 3D-Faseroberflächen. Hier wurde die Erkenntnis gewonnen, dass die Morphologie einen größeren Einfluss auf die Zellreaktion hat als die Oberflächenchemie. Da die Immunantwort eines Organismus auf ein Implantat stark von der interzellularen Kommunikation abhängt, wurde gefolgert, dass die NCO-sP(EO-stat-PO)/PLGA Fasern eine adäquate Immunantwort hervorrufen mit vielversprechenden Aussichten, die Fasergerüste im Bereich der Geweberegeneration einzusetzen. Das letzte Kapitel der Dissertation berichtet über eine erste in vivo Studie der hier vorgestellten Fasern. Mit den Fasern wurde ein bestehendes Behandlungskonzept für Hernien des Zwerchfells erweitert und die Leistungsfähigkeit in einem Kaninchenmodell überprüft. Zwei Gerüsttypen wurden untersucht, die sich in der Oberflächenmorphologie maßgeblich unterschieden: In Serie A wurden die elektrogesponnenen Fasern in ein Gel aus NCO-sP(EO-stat-PO) gebettet, während die Fasern in Serie B nur mit einer dünnen Gelschicht bedeckt wurden, so dass die topografische Faserstruktur erhalten blieb. Nach 4 Monaten in vivo waren die behandelten Zwerchfelldefekte signifikant kleiner und überwiegend mit Narbengewebe gefüllt. Die ausgeprägte Granulombildung bei Fasergerüsten der Serie A konnte in der darauffolgenden Studie (Serie B) minimiert werden. Das gute Abschneiden dieser Studien wurde zum Anlass genommen, die Vliese weiterzuentwickeln und eine Medikamentenfreisetzung (Ilomastat) zu integrieren, um die Narbenbildung zu minimieren. Zusammenfassend beschreibt diese Dissertation einen einfachen und direkten Weg, Fasern für eine gezielte Geweberegeneration zu erzeugen, die dreifach funktionalisierbar und vielseitig anwendbar sind. Dies macht Fasergerüste auf der Basis von NCO-sP(EO-stat-PO)/PLGA zu einem vielversprechenden Kandidaten um in der Geweberegeneration eingesetzt zu werden. KW - Nanofaser KW - Gewebe KW - Regeneration KW - Extrazelluläre Matrix KW - Polymere KW - Elektrostatisches Verspinnen KW - Geweberegeneration KW - Fibroblasten KW - Makrophagen KW - Chondrozyten KW - Wirkstofffreisetzung KW - Oberflächenfunktionalisierung KW - Electrospinning KW - tissue engineering KW - surface functionalisation KW - drug release Y1 - 2012 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-75684 N1 - Die Arbeit wurde am Lehrstuhl für Funktionswerkstoffe der Medizin und der Zahnheilkunde angefertigt ER - TY - THES A1 - Schlegelmilch, Katrin T1 - Molecular function of WISP1/CCN4 in the musculoskeletal system with special reference to apoptosis and cell survival T1 - Funktionsüberprüfung von WISP1/CCN4 im mukuloskelettalen System mit besonderem Augenmerk auf Apoptose und das Überleben der Zellen N2 - Human adult cartilage is an aneural and avascular type of connective tissue, which consequently reflects reduced growth and repair rates. The main cell type of cartilage are chondrocytes, previously derived from human mesenchymal stem cells (hMSCs). They are responsible for the production and maintainance of the cartilaginous extracellular matrix (ECM), which consists mainly of collagen and proteoglycans. Signal transmission to or from chondrocytes, generally occurs via interaction with signalling factors connected to the cartilaginous ECM. In this context, proteins of the CCN family were identified as important matricellular and multifunctional regulators with high significance during skeletal development and fracture repair. In this thesis, main focus lies on WISP1/CCN4, which is known as a general survival factor in a variety of cell types and seems to be crucial during lineage progression of hMSCs into chondrocytes. We intend to counter the lack of knowledge about the general importance of WISP1-signalling within the musculoskeletal system and especially regarding cell death and survival by a variety of molecular and cell biology methods. First, we established a successful down-regulation of endogenous WISP1 transcripts within different cell types of the human musculoskeletal system through gene-silencing. Interestingly, WISP1 seems to be crucial to the survival of all examined cell lines and primary hMSCs, since a loss of WISP1 resulted in cell death. Bioinformatical analyses of subsequent performed microarrays (WISP1 down-regulated vs. control samples) confirmed this observation in primary hMSCs and the chondrocyte cell line Tc28a2. Distinct clusters of regulated genes, closely related to apoptosis induction, could be identified. In this context, TRAIL induced apoptosis as well as p53 mediated cell death seem to play a crucial role during the absence of WISP1 in hMSCs. By contrast, microarray analysis of WISP1 down-regulated chondrocytes indicated rather apoptosis induction via MAPK-signalling. Despite apoptosis relevant gene regulations, microarray analyses also identified clusters of differentially expressed genes of other important cellular activities, e.g. a huge cluster of interferon-inducible genes in hMSCs or gene regulations affecting cartilage homeostasis in chondrocytes. Results of this thesis emphasize the importance of regulatory mechanisms that influence cell survival of primary hMSCs and chondrocytes in the enforced absence of WISP1. Moreover, findings intensified the assumed importance for WISP1-signalling in cartilage homeostasis. Thus, this thesis generated an essential fundament for further examinations to investigate the role of WISP1-signalling in cartilage homeostasis and cell death. N2 - Humaner adulter Knorpel besitzt weder Blutgefäße noch Nerven, weswegen diese Knorpelart im Vergleich zu anderen Gewebetypen ein verringertes Wachstum und Regenerierung wiederspiegelt. Den Hauptteil der Zellen im adulten Knorpel stellen die Chondrozyten (Knorpelzellen)dar, welche sich zuvor aus humanen mesenchymalen Stammzellen (hMSCs) entwickelt haben. Sie sind verantwortlich für die Bildung und Aufrechterhaltung der extrazellulären Matrix (ECM) des Knorpelgewebes, welche hauptsächlich aus Kollagen und Proteoglykanen besteht. Signale, die durch Chondrozyten erzeugt oder weitergeleitet werden, finden in der Regel durch Interaktion mit Molekülen der im Knorpel liegenden ECM statt. Mitglieder der CCN-Familie gelten hierbei als bedeutende extrazelluläre Matrixproteine, die bei verschiedenen regulatorischen Prozessen während der Skelettentwicklung und der Frakturheilung eine Rolle spielen. In dieser Doktorarbeit liegt das Hauptaugenmerk auf dem CCN Protein WISP1/CCN4. Dieses Protein gilt bereits in verschiedenen Zellen als ein notwendiger Überlebensfaktor und scheint desWeiteren eine regulatorische Funktion während der Differenzierung von hMSCs in Chondrozyten auszuüben. Die generelle Bedeutung von WISP1 für das muskuloskelettale System ist bislang jedoch weitgehend ungeklärt und soll während dieser Doktorarbeit mittels einer Reihe von molekular- und zellbiologischer Methoden genauer untersucht werden. Hierfür wurde zu Beginn eine erfolgreiche Herunterregulierung endogen hergestellter WISP1 Transkripte mittels Genexpressionshemmung (gene-silencing) in verschiedenen muskuloskelettalen Zellen erzielt. Interessanterweise scheint WISP1 eine bedeutende Rolle für das Überleben dieser Zellen zu spielen, da ein Verlust bei allen untersuchten Zelllinien und primären hMSCs zum Zelltod führte. Um zu Grunde liegende Mechanismen genauer zu untersuchen, wurden daraufhin Microarray Analysen von hMSCs und Tc28a2 Chondrocyten durchgeführt (jeweils WISP1 herunterreguliert vs Kontrollzellen). In diesem Zusammenhang identifizierten bioinformatische Analysen differentielle Expressionen verschiedener apoptoseresponsiver Gene. So scheint eine Apoptoseinduktion über TRAIL und/oder p53 in hMSCs stattzufinden, wohingegen eine starke Regulation des MAPK-Signalweges in Chondrozyten detektiert wurde. Neben diesen Genregulationen, deckten die Analysen ebenso Gengruppen auf, die bei anderen wichtigen zellulären Abläufen eine Rolle spielen. Hier sind in WISP1 herunterregulierten hMSCs u.a. viele differenziell exprimierte Gene zu nennen, die durch Interferone induzierbar sind. In Chondrozyten dagegen scheint eine verringerte WISP1 Expression Genexpressionen zu beeinflussen, welche die Knorpelhomeostase regulieren. Die Ergebnisse, die während dieser Doktorarbeit erzielt wurden, verdeutlichen die Wichtigkeit von WISP1 für das Überleben von primären hMSCs und Chondrozyten. Darüberhinaus verstärken die bioinformatischen Analysen die Annahme, das WISP1 regulatorische Funktionen für die Knorpelhomeostase ausübt. Somit bietet diese Doktorarbeit ein essentielles Fundament, um die Rolle von WISP1 bei der Aufrechterhaltung der Knorpelhomeostase und des Zelltodes weiter zu erforschen. KW - Knorpelzelle KW - Extrazelluläre Matrix KW - Zelldifferenzierung KW - Apoptosis KW - WISP1/CCN4 KW - mesenchymale Stammzellen KW - Apoptose KW - WISP1/CCN4 KW - mesenchymal stem cells KW - apoptosis Y1 - 2012 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-73430 ER -