TY - THES A1 - Narkhede, Yogesh T1 - In silico structure-based optimisation of pyrrolidine carboxamides as Mycobacterium tuberculosis enoyl-ACP reductase inhibitors T1 - In silico Struktur-basierte Optimierung von Pyrrolidin-Carbonsäureamiden als Mycobacterium tuberculosis Enoyl-ACP-Reduktase-Inhibitoren N2 - The high infection rates and recent emergence of extremely drug resistant forms of Mycobacterium tuberculosis pose a significant challenge for global health. The NADH- dependent enoyl-ACP-reductase InhA of the type II mycobacterial fatty acid biosynthesis pathway is a well-validated target for inhibiting mycobacterial growth. InhA has been shown to be inhibited by a variety of compound series. Prominent classes of InhA inhibitors from literature include diaryl ethers, pyrrolidine carboxamides and arylamides which can be subjected to further development. Despite the progress in this area, very few compounds are in clinical development phase. The present work involves a detailed computational investigation of the binding modes and structure-based optimisation of pyrrolidine carboxamides as InhA inhibitors. With substituents of widely varying bulkiness, the pyrrolidine carboxamide dataset presented a challenge for prediction of binding mode as well as affinity. Using advanced docking protocols and in-house developed pose selection procedures, the binding modes of 44 compounds were predicted. The poses from docking were used in short molecular dynamics (MD) simulations to ascertain the dominant binding conformations for the bulkier members of the series. Subsequently, an activity-based classification strategy could be developed to circumvent the affinity prediction problems observed with this dataset. The prominent motions of the bound ligand and the active site residues were then ascertained using Essential Dynamics (ED). The information from ED and literature was subsequently used to design a total of 20 compounds that were subjected to extensive in-silico evaluations. Finally, the molecular determinants of rapid-reversible binding of pyrrolidine carboxamides were investigated using long MD simulations. N2 - Hohe Infektionsraten und das Auftreten von multiresistenten Formen von Mycobacterium tuberculosis stellen eine große Herausforderung f ̈ ur das globale Gesundsheitswesen dar. Die NADH-abh ̈angige Enoyl-ACP-Reduktase des mykobakteriellen Fetts ̈aure-Biosynthesewegs II, InhA, ist ein gut validiertes Target zur Hemmung des mykobakteriellen Wachstums. Es wurde gezeigt, dass InhA durch eine Vielzahl von unterschiedlichen Verbindungs- klassen gehemmt wird. Zu den bekanntesten Klassen von InhA-Inhibitoren aus der Literatur geh ̈ oren Diphenylether, Pyrrolidincarboxamide und Arylamide, die zur weiteren Entwicklung verwendet werden k ̈onnen. Trotz der Fortschritte in diesem Bereich sind sehr wenige Verbindungen in einer klinischen Entwicklungsphase. Die vorliegende Arbeit beinhaltet eine detaillierte computergest ̈ utzte Untersuchung der Bindungsmodi und die strukturbasierte Optimierung von Pyrrolidincarboxamiden als InhA-Inhibitoren. Aufgrund von Substituenten mit stark variierendem Raumanspruch stellt der Pyrrolidin- carboxamid-Datensatz eine Herausforderung f ̈ ur die Vorhersage von Bindungsmodi und Affinitit ̈aten dar. Mit aufw ̈andigen Docking-Protokollen und speziell zu diesem Zweck entwickelten Posen-Auswahlverfahren wurden die Bindungsmodi f ̈ ur 44 Verbindungen vorhergesagt. Die Posen des Dockings wurden in kurzen Molekulardynamik (MD) Sim- ulationen verwendet, um die bevorzugten Bindungskonformationen f ̈ ur die r ̈ aumlich anspruchsvollen Vertreter des Datensatzes zu ermitteln. Anschließend konnte eine akt- ivit ̈atsbasierte Klassifizierungsstrategie entwickelt werden, um die in diesem Datensatz beobachteten Probleme in der Affinit ̈ atsvorhersage zu umgehen. Die wesentlichen Bewe- gungen des gebundenen Liganden und der Aminos ̈auren der Bindetasche wurden daraufhin mit Essential Dynamics (ED) ermittelt. Informationen aus der ED-Analyse und der Literatur wurden anschließend verwendet, um insgesamt 20 Verbindungen zu entwerfen, die umfangreichen in-silico-Bewertungen unterzogen wurden. Schließlich wurden die molekularen Determinanten der schnell-reversiblen Bindung von Pyrrolidincarboxamiden unter Verwendung von langen MD Simulationen untersucht. KW - Tuberkelbakterium KW - Enoyl-acyl-carrier-protein-Reductase KW - Pyrrolidinderivate KW - Arzneimitteldesign KW - Computational drug design KW - Mycobacterium tuberculosis InhA KW - Pyrrolidine carboxamides KW - Mycobacterium tuberculosis KW - Structure-based KW - enoyl ACP reductase KW - pyrrolidine carboxamides Y1 - 2018 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-152468 ER - TY - THES A1 - Luckner, Sylvia T1 - Towards the development of high affinity InhA and KasA inhibitors with activity against drug-resistant strains of Mycobacterium tuberculosis T1 - Entwicklung von hoch-affinen InhA und KasA Inhibitoren gegen resistente Stämme von Mycobacterium tuberculosis N2 - Mycobacterium tuberculosis is the causative agent of tuberculosis and responsible for more than eight million new infections and about two million deaths each year. Novel chemotherapeutics are urgently needed to treat the emerging threat of multi drug resistant and extensively drug resistant strains. Cell wall biosynthesis is a widely used target for chemotherapeutic intervention in bacterial infections. In mycobacteria, the cell wall is comprised of mycolic acids, very long chain fatty acids that provide protection and allow the bacteria to persist in the human macrophage. The type II fatty acid biosynthesis pathway in Mycobacterium tuberculosis synthesizes fatty acids with a length of up to 56 carbon atoms that are the precursors of the critical mycobacterial cell wall components mycolic acids. KasA, the mycobacterial ß-ketoacyl synthase and InhA, the mycobacterial enoyl reductase, are essential enzymes in the fatty acid biosynthesis pathway and validated drug targets. In this work, KasA was expressed in Mycobacterium smegmatis, purified and co-crystallized in complex with the natural thiolactone antibiotic thiolactomycin (TLM). High-resolution crystal structures of KasA and the C171Q KasA variant, which mimics the acyl enzyme intermediate of the enzyme, were solved in absence and presence of bound TLM. The crystal structures reveal how the inhibitor is coordinated by the enzyme and thus specifically pinpoint towards possible modifications to increase the affinity of the compound and develop potent new drugs against tuberculosis. Comparisons between the TLM bound crystal structures explain the preferential binding of TLM to the acylated form of KasA. Furthermore, long polyethylene glycol molecules are bound to KasA that mimic a fatty acid substrate of approximately 40 carbon atoms length. These structures thus provide the first insights into the molecular mechanism of substrate recognition and reveal how a wax-like substance can be accommodated in a cytosolic environment. InhA was purified and co-crystallized in complex with the slow, tight binding inhibitor 2-(o-tolyloxy)-5-hexylphenol (PT70). Two crystal structures of the ternary InhA-NAD+-PT70 were solved and reveal how the inhibitor is bound to the substrate binding pocket. Both structures display an ordered substrate binding loop and corroborate the hypothesis that slow onset inhibition is coupled to loop ordering. Upon loop ordering, the active site entrance is more restricted and the inhibitor is kept inside more tightly. These studies provide additional information on the mechanistic imperatives for slow onset inhibition of enoyl ACP reductases. N2 - Mycobacterium tuberculosis, der Erreger der Tuberkulose ist für mehr als acht Millionen Neu-Infektionen und ungefähr zwei Millionen Todesfälle jedes Jahr verantwortlich. Besonders die Entwicklung von multiresistenten und extrem resistenten Stämmen macht die Entwicklung neuer Medikamente gegen Tuberkulose dringend erforderlich. Die Zellwandbiosynthese ist ein validiertes Ziel für die Chemotherapie bei bakteriellen Infektionen. Bei Mycobakterien besteht die Zellwand zum Großteil aus Mykolsäuren, sehr langkettigen Fettsäuren, die den Bakterien Schutz bieten und ihnen ermöglichen, in Makrophagen zu überleben. Mycobakterien synthetisieren in der Fettsäurebiosynthese II (FAS-II) Fettsäuren bis zu einer Länge von 56 Kohlenstoffatomen, die Bestandteile der Mykolsäuren sind. KasA, die mycobakterielle ß-ketoacyl Synthase und InhA, die mycobakterielle enoyl Reductase, sind essentielle Enzyme der FAS-II und geeignete Ziele für die Entwicklung neuer Antibiotika. In dieser Arbeit wurde KasA in Mycobacterium smegmatis exprimiert und aufgereinigt. Das Protein wurde im Komplex mit dem natürlich vorkommenden Thiolacton-Antibiotikum Thiolactomycin (TLM) co-kristallisiert. Kristallstrukturen von KasA und der C171Q KasA Variante, die das acylierte Enzym-Intermediat darstellt, wurden als apo-Strukturen und im Komplex mit gebundenem TLM aufgeklärt. Die Kristallstrukturen zeigen, wie der Inhibitor an das Enzym gebunden ist und deuten darauf hin, wie das TLM Molekül verändert werden könnte, um seine Affinität für das Protein zu erhöhen und damit ein wirksames Medikament gegen Tuberkulose zu entwickeln. Vergleiche zwischen den TLM gebundenen Kristallstrukturen erklären, warum TLM bevorzugt an die acylierte Form des Enzyms bindet. Des Weiteren sind lange Polyethylenglykol-Moleküle an KasA gebunden, die ein Fettsäuresubstrat einer Länge von etwa 40 Kohlenstoff-Atomen nachahmen. Die Strukturen geben damit zum ersten Mal einen Einblick in den molekularen Mechanismus der Substrat-Erkennung und zeigen, wie eine wachsartige Substanz in einem cytosolischen Umfeld aufgenommen werden kann. InhA wurde aufgereinigt und im Komplex mit dem „slow binding“ Inhibitor 2-(o-tolyloxy)-5-hexylphenol (PT70) co-kristallisiert. Zwei Kristallstrukturen des ternären InhA-NAD+-PT70 Komplexes wurden gelöst und zeigen wie der Inhibitor in der Substratbindetasche gebunden ist. Beide Strukturen, weisen geordnete Substrat-Binde-Loops auf, die den Eingang zur „Active Site“ schließen und damit den gebundenen Inhibitor in der Tasche festhalten. Die Strukturen bestätigen damit die Hypothese, dass „Slow Binding Inhibition“ mit der Ordnung des Loops zusammenhängt. Diese Studien können als Basis für die Entwicklung weiterer „Slow Binding“ Inhibitoren verwendet werden. KW - Tuberkelbakterium KW - Multidrug-Resistenz KW - Arzneimitteldesign KW - Fettsäure-Synthase KW - Zellwand KW - Kristallstruktur KW - tuberculosis KW - multi-drug-resistance KW - drug development KW - fatty acid synthesis KW - cell wall KW - crystal structure KW - structure based drug design Y1 - 2009 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-43621 ER -