TY - THES A1 - Kwok, Chee Keong T1 - Scaling up production of reprogrammed cells for biomedical applications T1 - Skalierung der Produktion von reprogrammierten Zellen für biomedizinische Anwendungen N2 - Induced pluripotent stem cells (iPSCs) have been recognised as a virtually unlimited source of stem cells that can be generated in a patient-specific manner. Due to these cells’ potential to give rise to all differentiated cell types of the human body, they have been widely used to derive differentiated cells for drug screening and disease modelling purposes. iPSCs also garner much interest as they can potentially serve as a source for cell replacement therapy. Towards the realisation of these biomedical applications, this thesis aims to address challenges that are associated with scale-up, safety and biofabrication. Firstly, the manufacture of a high number of human iPSCs (hiPSCs) will require standardised procedures for scale-up and the development of a flexible bioprocessing method, since standard adherent hiPSC culture exhibits limited scalability and is labour-intensive. While the quantity of cells that are required for cell therapy depends largely on the tissue and defect that these replacing cells are meant to correct, an estimate of 1 × 10^9 has been suggested to be sufficient for several indications, including myocardial infarction and islet replacement for diabetes. Here, the development of an integrated, microcarrier-free workflow to transition standard adherent hiPSC culture (6-well plates) to scalable stirred suspension culture in bioreactors (1 L working volume, 2.4 L maximum working volume) is presented. The two-phase bioprocess lasts 14 days and generates hiPSC aggregates measuring 198 ± 58 μm in diameter on the harvesting day, yielding close to 2 × 10^9 cells. hiPSCs can be maintained in stirred suspension for at least 7 weeks with weekly passaging, while exhibiting pluripotency-associated markers TRA-1-60, TRA-1-81, SSEA-4, OCT4, and SOX2. These cells retain their ability to differentiate into cells of all the three germ layers in vitro, exemplified by cells positive for AFP, SMA, or TUBB3. Additionally, they maintain a stable karyotype and continue to respond to specification cues, demonstrated by directed differentiation into beating cardiomyocyte-like cells. Therefore, the aim of manufacturing high hiPSC quantities was met using a state-of-the-art scalable suspension bioreactor platform. Secondly, multipotent stem cells such as induced neural stem cells (iNSCs) may represent a safer source of renewable cells compared to pluripotent stem cells. However, pre-conditioning of stem cells prior to transplantation is a delicate issue to ensure not only proper function in the host but also safety. Here, iNSCs which are normally maintained in the presence of factors such as hLIF, CHIR99021, and SB431542 were cultured in basal medium for distinct periods of time. This wash-out procedure results in lower proliferation while maintaining key neural stem cell marker PAX6, suggesting a transient pre-differentiated state. Such pre-treatment may aid transplantation studies to suppress tumourigenesis through transplanted cells, an approach that is being evaluated using a mouse model of experimental focal demyelination and autoimmune encephalomyelitis. Thirdly, biomedical applications of stem cells can benefit from recent advancements in biofabrication, where cells can be arranged in customisable topographical layouts. Employing a 3DDiscovery bioprinter, a bioink consisting of hiPSCs in gelatin-alginate was extruded into disc-shaped moulds or printed in a cross-hatch infill pattern and cross-linked with calcium ions. In both discs and printed patterns, hiPSCs recovered from these bioprints showed viability of around 70% even after 4 days of culture when loaded into gelatin-alginate solution in aggregate form. They maintained pluripotency-associated markers TRA-1-60 and SSEA-4 and continued to proliferate after re-plating. As further proof-of-principle, printed hiPSC 3D constructs were subjected to targeted neuronal differentiation, developing typical neurite outgrowth and resulting in a widespread network of cells throughout and within the topology of the printed matrix. Staining against TUBB3 confirmed neuronal identity of the differentiated cellular progeny. In conclusion, these data demonstrate that hiPSCs not only survive the 3D-printing process but were able to differentiate along the printed topology in cellular networks. N2 - Induzierte pluripotente Stammzellen (iPSZ) stellen eine praktisch unbegrenzte Stammzellquelle dar, welche patientenspezifisch erzeugt werden kann. Da diese Zellen das Potenzial haben, alle differenzierten Zelltypen des menschlichen Körpers hervorzubringen, werden sie für die Herstellung differenzierter Zellen für Arzneimitteltests und für die Krankheitsmodellierung verwendet. Sie erfahren auch großes Interesse, weil sie als Zellquelle in der Zellersatztherapie Anwendung finden könnten. Die vorliegende Dissertation beschäftigt sich mit drei zentralen Herausforderungen, die im Rahmen der biomedizinischen Anwendung von iPSZ auftreten. Die Herstellung einer großen Zahl von humanen iPSZ (hiPSZ) erfordert die Entwicklung standardisierter Verfahren für die Skalierung, welche durch die Entwicklung einer flexiblen Bioprozessmethode realisiert werden kann. Bisher wird die Skalierbarkeit durch eine standardmäßig adhärente Zellkultur und den damit verbundenen hohen Arbeitsaufwand begrenzt. Die Menge an Zellen, die für die Zelltherapie benötigt wird, hängt stark vom Gewebetyp ab, welcher von den ersetzenden Zellen korrigiert werden soll. Berechnungen legen nahe, dass eine Anzahl 1 × 10^9 Zellen für eine Vielzahl von Indikationen ausreicht – einschließlich Myokardinfarkt und Inselzelltransplantation für Diabetes. Im Rahmen dieser Arbeit wurde ein integrierter Arbeitsablauf zur skalierbaren Zellsuspensionskultur von hiPSZ ohne Verwendung von microcarrier entwickelt, um die standardmäßig adhärente Kultur (6-Well-Platten) in Bioreaktoren (1 L Arbeitsvolumen, 2,4 L maximales Arbeitsvolumen) zu überführen. Der zweiphasige Produktionsprozess dauert 14 Tage und erzeugt hiPSZ-Aggregate mit einem finalen Durchmesser von 198 ± 58 μm, der annähernd 2 × 10^9 Zellen beinhaltet. hiPSZ können mindestens 7 Wochen lang in einer gerührten Zellsuspension bei wöchentlichem Passagieren gehalten werden, wobei sie Pluripotenz-assoziierte Marker wie TRA-1-60, TRA-1-81, SSEA-4, OCT4 und SOX2 beibehalten. Die Zellen behalten weiterhin ihre Fähigkeit, sich in vitro in Zellen mit AFP-, SMA- oder TUBB3-Immunoreaktivität und damit in Zellen aller drei Keimblätter zu differenzieren. Darüber hinaus halten sie einen stabilen Karyotyp aufrecht und reagieren auf gezielt eingesetzte externe Differenzierungsstimuli, wie durch eine gezielte Differenzierung in schlagende Kardiomyozyten-ähnliche Zellen demonstriert werden konnte. Somit wurde das Ziel, eine großen Anzahl hiPSCs herzustellen, mit einer hochmodernen, skalierbaren Suspensionsbioreaktorplattform erreicht. Multipotente Stammzellen wie induzierte neurale Stammzellen (iNSZ) gelten verglichen mit iPSZ als sicherere Zellquelle für Ersatztherapien. Die Vorkonditionierung von Stammzellen vor der Transplantation ist jedoch ein heikles Thema, da sowohl die einwandfreie Funktion im Wirtsgewebe als auch Sicherheit gewährleistet werden müssen. Im Rahmen dieser Arbeit wurden iNSZ, die normalerweise im Kulturmedium mit Faktoren wie hLIF, CHIR99021 und SB431542 gehalten werden, für eine definierte Zeitspanne in basalem Medium kultiviert. Die Vorbehandlung führt zu einer geringeren Proliferation, jedoch unter Erhalt der Expression des wichtigen neuralen Stammzellmarkers PAX6, was auf einen transienten vordifferenzierten Zustand hindeutet. Eine solche Vorbehandlung könnte bei zukünftigen Transplantationsstudien angewandt werden, um die Tumorentstehung durch transplantierte Zellen zu unterdrücken. Dieser Ansatz wird in Zukunft mit einem Mausmodell der experimentellen fokalen Demyelinisierung und der autoimmunen Enzephalomyelitis untersucht. Schließlich kann die Zellersatztherapie von den jüngsten Fortschritten in der Biofabrikation profitieren, bei der die Zellen durch das Drucken in anpassbare topographische Profile angeordnet werden können. Mit einem 3DDiscovery Biodrucker wurde eine Biotinte bestehend aus Gelatine-Alginat und hiPSZ in scheibenförmig extrudiert oder in einem Kreuzschraffurmuster gedruckt und mittels Kalziumionen-Zugabe vernetzt. Gedruckte hiPSZ zeigten auch nach 4 Tagen Kultivierung eine Lebensfähigkeit von etwa 70 % und weiterhin das Auftreten der Pluripotenz-assoziierten Marker TRA-1-60 und SSEA-4. Zudem konnten sie sich anschließend mit standardmäßig adhärenter Zellkultur weiter vermehren. Zudem konnte gezeigt werden, dass die gedruckten Konstrukte einer gezielten neuronalen Differenzierung unterzogen werden können, die zu einem typischen Neuritenauswuchs und zu einer weitreichenden interzellulären Vernetzung durch und innerhalb der Topologie der gedruckten Matrix führte. Die Färbung gegen TUBB3 bestätigte die neuronale Identität der differenzierten Zellen. Zusammenfassend zeigen diese Daten, dass bei Verwendung des in dieser Studie erarbeiteten Protokolls hiPSZ nicht nur den 3D-Druckprozess überleben, sondern auch entlang der gedruckten 3D Topologie in Netzwerke Neurone differenzieren können. KW - scale-up KW - suspension culture KW - biomedical applications KW - bioprocessing KW - human induced pluripotent stem cells KW - Bioprozessmethode KW - humanen induzierte pluripotente Stammzellen Y1 - 2020 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-191865 ER - TY - JOUR A1 - Wörsdörfer, Philipp A1 - Dalda, Nahide A1 - Kern, Anna A1 - Krüger, Sarah A1 - Wagner, Nicole A1 - Kwok, Chee Keong A1 - Henke, Erik A1 - Ergün, Süleyman T1 - Generation of complex human organoid models including vascular networks by incorporation of mesodermal progenitor cells JF - Scientific Reports N2 - Organoids derived from human pluripotent stem cells are interesting models to study mechanisms of morphogenesis and promising platforms for disease modeling and drug screening. However, they mostly remain incomplete as they lack stroma, tissue resident immune cells and in particular vasculature, which create important niches during development and disease. We propose, that the directed incorporation of mesodermal progenitor cells (MPCs) into organoids will overcome the aforementioned limitations. In order to demonstrate the feasibility of the method, we generated complex human tumor as well as neural organoids. We show that the formed blood vessels display a hierarchic organization and mural cells are assembled into the vessel wall. Moreover, we demonstrate a typical blood vessel ultrastructure including endothelial cell-cell junctions, a basement membrane as well as luminal caveolae and microvesicles. We observe a high plasticity in the endothelial network, which expands, while the organoids grow and is responsive to anti-angiogenic compounds and pro-angiogenic conditions such as hypoxia. We show that vessels within tumor organoids connect to host vessels following transplantation. Remarkably, MPCs also deliver Iba1\(^+\) cells that infiltrate the neural tissue in a microglia-like manner. KW - Developmental biology KW - Stem cells Y1 - 2019 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-202681 VL - 9 ER - TY - JOUR A1 - Jansch, Charline A1 - Günther, Katharina A1 - Waider, Jonas A1 - Ziegler, Georg C. A1 - Forero, Andrea A1 - Kollert, Sina A1 - Svirin, Evgeniy A1 - Pühringer, Dirk A1 - Kwok, Chee Keong A1 - Ullmann, Reinhard A1 - Maierhofer, Anna A1 - Flunkert, Julia A1 - Haaf, Thomas A1 - Edenhofer, Frank A1 - Lesch, Klaus-Peter T1 - Generation of a human induced pluripotent stem cell (iPSC) line from a 51-year-old female with attention-deficit/hyperactivity disorder (ADHD) carrying a duplication of SLC2A3 JF - Stem Cell Research N2 - Fibroblasts were isolated from a skin biopsy of a clinically diagnosed 51-year-old female attention-deficit/hyperactivity disorder (ADHD) patient carrying a duplication of SLC2A3, a gene encoding neuronal glucose transporter-3 (GLUT3). Patient fibroblasts were infected with Sendai virus, a single-stranded RNA virus, to generate transgene-free human induced pluripotent stem cells (iPSCs). SLC2A3-D2-iPSCs showed expression of pluripotency-associated markers, were able to differentiate into cells of the three germ layers in vitro and had a normal female karyotype. This in vitro cellular model can be used to study the role of risk genes in the pathogenesis of ADHD, in a patient-specific manner. KW - ADHD KW - SLC2A3 KW - induced pluripotent stem cells Y1 - 2018 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-176654 VL - 28 ER -