TY - THES A1 - Proppert, Sven Martin T1 - Design, implementation and characterization of a microscope capable of three-dimensional two color super-resolution fluorescence imaging T1 - Design, Implementierung und Charakterisierung eines Mikroskops für dreidimensionale zwei Farben superhochauflösende Fluoreszenz-Bildgebung N2 - This thesis reviews the fundamentals of three-dimensional super-resolution localization imaging. In order to infer the axial coordinate of the emission of single fluorophores, the point spread function is engineered following a technique usually referred to as astigmatic imaging by the introduction of a cylindrical lens to the detection path of a microscope. After giving a short introduction to optics and localization microscopy, I outline sources of aberrations as frequently encountered in 3D-localization microscopy and will discuss their respective impact on the precision and accuracy of the localization process. With the knowledge from these considerations, experiments were designed and conducted to verify the validity of the conclusions and to demonstrate the abilities of the proposed microscope to resolve biological structures in the three spatial dimensions. Additionally, it is demonstrated that measurements of huge volumes with virtually no aberrations is in principle feasible. During the course of this thesis, a new method was introduced for inferring axial coordinates. This interpolation method based on cubic B-splines shows superior performance in the calibration of a microscope and the evaluation of subsequent measurement and will therefore be used and explained in this work. Finally, this work is also meant to give future students some guidance for entering the field of 3D localization microscopy and therefore, detailed protocols are provided covering the specific aspects of two color 3D localization imaging. N2 - In dieser Arbeit werden die Grundlagen der dreidimensionalen hochauflösenden Lokalisationsmikroskopie erarbeitet und daraus Spezifikationen für ein geeignetes Mikroskop abgeleitet. Zur Gewinnung der axialen Koordinate der Emission einzelner Farbstoffe wird die Punktspreizfunktion in der Detektion astigmatisch mithilfe einer zylindrischen Linse verändert. Nach einer kurzen Einleitung in die Grundzüge der Optik und der Lokalisationsmikroskopie werden die Ursachen für typische Aberrationen besprochen, wie sie in der 3D-Lokalisationsmikroskopie häufig auftreten. Weiterhin wird der Einfluss dieser Aberrationen auf die erreichbare Präzision und Exaktheit des Lokalisationsprozesses behandelt. Mit dem Wissen aus diesen Überlegungen wurden Experimente entworfen und durchgeführt um die getroffenen Schlussfolgerungen zu validieren und zu demonstrieren, dass das vorgeschlagene Mikroskop dazu in der Lage ist, biologische Strukturen in den drei räumlichen Dimensionen aufzulösen. Weiterhin wird gezeigt, dass beinahe aberrationsfreie Mikroskopie großer Volumina prinzipiell möglich ist. Während der Arbeit an dieser Promotion wurde eine neue Methode zur Gewinnung der axialen Koordinaten eingeführt. Diese auf kubischen B-splines basierende Interpolationsmethode stellte sich als anderen Routinen überlegen in der Kalibration eines Mikroskops und der anschließenden Auswertung von Messungen heraus. Deshalb wird dieses Verfahren in der vorliegenden Arbeit verwendet und erklärt. Da diese Doktorarbeit auch den Anspruch hat, zukünftigen Studenten den Einstieg in die hochauflösende 3D Mikroskopie zu erleichtern, werden abschließend detaillierte Protokolle für spezifische Aspekte der zwei Farben 3D Lokalisationsmikroskopie zur Verfügung gestellt. KW - Dimension 3 KW - aberration KW - Einzelmolekülmikroskopie KW - single molecule microscopy KW - 3D KW - super-resolution KW - Mikroskopie KW - Hochauflösendes Verfahren KW - Aberration Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-107905 ER - TY - THES A1 - Heidbreder, Meike T1 - Association and Activation of TNF-Receptor I Investigated with Single-Molecule Tracking and Super-Resolution Microscopy in Live Cells T1 - Assoziierung und Aktivierung des TNF-Rezeptor I untersucht mit Einzelmolekül-Tracking und hochauflösender Mikroskopie in lebenden Zellen N2 - Cellular responses to outer stimuli are the basis for all biological processes. Signal integration is achieved by protein cascades, recognizing and processing molecules from the environment. Factors released by pathogens or inflammation usually induce an inflammatory response, a signal often transduced by Tumour Necrosis Factor alpha (TNF). TNFα receptors TNF-R1 and TNF-R2 can in turn lead to apoptosis or proliferation via NF-B. These processes are closely regulated by membrane compartimentalization, protein interactions and trafficking. Fluorescence microscopy offers a reliable and non-invasive method to probe these cellular events. However, some processes on a native membrane are not resolvable, as they are well below the diffraction limit of microscopy. The recent development of super-resolution fluorescence microscopy methods enables the observation of these cellular players well below this limit: by localizing, tracking and counting molecules with high spatial and temporal resolution, these new fluorescence microscopy methods offer a previously unknown insight into protein interactions at the near-molecular level. Direct stochastic optical reconstruction microscopy (dSTORM) utilizes the reversible, stochastic blinking events of small commercially available fluorescent dyes, while photoactivated localization microscopy (PALM) utilizes phototransformation of genetically encoded fluorescent proteins. By photoactivating only a small fraction of the present fluorophores in each observation interval, single emitters can be localized with high precision and a super-resolved image can be reconstructed. Quantum Dot Triexciton imaging (QDTI) utilizes the three-photon absorption (triexcitonic) properties of quantum dots (QD) and to achieve a twofold resolution increase using conventional confocal microscopes. In this thesis, experimental approaches were implemented to achieve super-resolution microscopy in fixed and live-cells to study the spatial and temporal dynamics of TNF and other cellular signaling events. We introduce QDTI to study the three-dimensional cellular distribution of biological targets, offering an easy method to achieve resolution enhancement in combination with optical sectioning, allowing the preliminary quantification of labeled proteins. As QDs are electron dense, QDTI can be used for correlative fluorescence and transmission electron microscopy, proving the versatility of QD probes. Utilizing the phototransformation properties of fluorescent proteins, single-receptor tracking on live cells was achieved, applying the concept of single particle tracking PALM (sptPALM) to track the dynamics of a TNF-R1-tdEos chimera on the membrane. Lateral receptor dynamics can be tracked with high precision and the influences of ligand addition or lipid disruption on TNF-R1 mobility was observed. The results reveal complex receptor dynamics, implying internalization processes in response to TNFα stimulation and a role for membrane domains with reduced fluidity, so-called lipid raft domains, in TNF-R1 compartimentalization prior or post ligand induction. Comparisons with previously published FCS data show a good accordance, but stressing the increased data depth available in sptPALM experiments. Additionally, the active transport of NF-κB-tdEos fusions was observed in live neurons under chemical stimulation and/or inhibition. Contrary to phototransformable proteins that need no special buffers to exhibit photoconversion or photoactivation, dSTORM has previously been unsuitable for in vivo applications, as organic dyes relied on introducing the probes via immunostaining in concert with a reductive, oxygen-free medium for proper photoswitching behaviour. ATTO655 had been previously shown to be suitable for live-cell applications, as its switching behavior can be catalyzed by the reductive environment of the cytoplasm. By introducing the cell-permeant organic dye via a chemical tag system, a high specificity and low background was achieved. Here, the labeled histone H2B complex and thus single nucleosome movements in a live cell can be observed over long time periods and with ~20 nm resolution. Implementing these new approaches for imaging biological processes with high temporal and spatial resolution provides new insights into the dynamics and spatial heterogeneities of proteins, further elucidating their function in the organism and revealing properties that are usually only detectable in vitro.   N2 - Zelluläre Antworten auf externe Stimuli sind die Basis aller biologischer Prozesse. Die Integration dieser Signale wird dabei von Proteinkaskaden ausgeführt, welche Moleküle aus der Umgebung wahrnehmen und verarbeiten. Faktoren, welche von Pathogenen oder während einer Entzündung freigesetzt werden, induzieren für gewöhnlich eine Entzündungsantwort, eine Reaktion, die oft vom Tumornekrosefaktor alpha (TNFα) vermittelt wird. Die TNFα Rezeptoren TNF-R1 und TNF-R2 vermitteln nach Ligandenbinding Apoptose oder Zellproliferation durch NF-kB. Diese Prozesse sind engmaschig durch Membrankompartimentierung, Proteininteraktionen und -transport reguliert. Fluoreszenzmikroskopie bietet eine zuverlässige, nicht-invasive Methode um diese zellulären Prozesse zu untersuchen. Allerdings sind einige Prozesse innerhalb einer nativen Membran nicht auflösbar, da sie weit unterhalb der Beugungsgrenze der Lichtmikroskopie stattfinden. Die jüngste Entwicklung der hochauflösenden Fluoreszenzmikroskopiemethoden erlaubt die Beobachtung dieser zellulären Abläufe auf molekularer Ebene: durch das Lokalisieren, Verfolgen und Zählen von Molekülen mit hoher räumlicher und zeitlicher Auflösung bieten diese neuen Fluoreszenzmethoden bisher unbekannte Einblicke in Proteininteraktionen. Direkte stochastische optische Rekonstruktionsmikroskopie (dSTORM) nutzt die reversiblen, stochastischen Ereignisse von kleinen blinkenden, kommerziell erhältlichen Fluoreszenzfarbstoffen, während die photoaktivierte Lokalisationsmikroskopie (PALM) die Phototransformation fluoreszierenden Proteinen nutzt. Durch das Photoaktivieren lediglich eines kleinen Bruchteils der Fluorophore innerhalb eines Zeitintervalls können einzelne Emitter mit hoher Genauigkeit lokalisiert und ein hochaufgelöstes Bild daraus rekonstruiert werden. Quantum Dot Triexciton Imaging (QDTI) nutzt die Drei-Photonen-Absorption von Quantenpunkten um eine zweifache Auflösungserhöhung mittels eines Konfokalmikroskopes zu erreichen. In dieser Arbeit wurden experimentelle Ansätze zur hochauflösenden Mikroskopie an fixierten und lebenden Zellen implementiert, um die räumliche und zeitliche Dynamik von TNF und anderen zellulären Signalwegen zu untersuchen. Zur Analyse der dreidimensionalen, zellulären Verteilung von biologischen Zielen stellen wir QDTI vor, welches eine einfache Methode zur Verbesserung der Auflösung an Konfokalmikroskopen in Kombination mit optischen Schnitten darstellt. Dies ermöglicht die vorläufige Quantifizierung von markierten Proteinen. Da QDs eine hohe Elektronendichte besitzen kann QDTI auch für korrelative Fluoreszenz- und Transmissionselektronenmikroskopie genutzt werden, was die Vielseitigkeit der QD-Sonden verdeutlicht. Mit Hilfe des single-particle tracking PALM (sptPALM) Konzepts konnten einzelne Rezeptormoleküle verfolgt werden, um die Dynamiken einer TNF-R1-tdEos Chimäre auf der Membran zu beobachten. Die laterale Rezeptordynamik kann hier mit hoher Präzision gemessen, und die Einflüsse auf die TNF-R1-Mobilität konnte nach Ligandenzugabe oder die Störung der Membranzusammensetzung analysiert werden. Die Ergebnisse zeigen eine komplexe Rezeptordynamik und lassen sowohl auf Internalisierungsprozesse in Reaktion auf TNFα-Stimulation, als auch auf eine wichtige Rolle von Membrandomänen mit eingeschränkter Fluidität in der TNF-R1 Kompartimentierung während der Ligandenbindung schließen. Zusätzlich wurde der aktive Transport von NF-kB-tdEos Fusionsproteinen in lebenden Neuronen unter chemischer Stimulierung bzw. Inhibierung untersucht. Im Gegensatz zu phototransformierbaren Proteinen, die keine speziellen Puffer zur Photokonversion oder Photoaktivierung benötigen, war dSTORM bisher für in vivo Anwendungen ungeeignet, da organische Farbstoffe auf die Einführung über Immunfärbung in Kombination mit einem reduktiven, Sauerstoff-freiem Medium für korrektes Photoschalten angewiesen waren. ATTO655 wurde zuvor als geeignet für die Anwendung in lebenden Zellen eingestuft, da das Schaltverhalten durch die reduktive Umgebung des Zytoplasmas katalysiert werden kann. Durch die Einführung von membranpermeablen organischen Farbstoffen über ein chemisches Markierungssystem konnte eine hohe Spezifität und ein geringer Hintergrund erreicht werden. Hier konnte durch die Markierung des Histon H2B Komplexes die Bewegung einzelner Nukleosome in lebenden Zellen über lange Zeiträume mit einer Auflösung von ~20 nm beobachtet werden. Die Umsetzung dieser neuen Ansätze für die Darstellung biologischer Prozesse mit hoher zeitlicher und räumlicher Auflösung liefert neue Einblicke in die Dynamiken und die räumliche Heterogenität von Proteinen und enthüllt Funktionen im Organismus und beleuchtet Eigenschaften, die sonst nur in vitro nachweisbar wären. KW - Fluoreszenzmikrosopie KW - Tumor-Nekrose-Faktor KW - Hochauflösendes Verfahren KW - sptPALM KW - dSTORM KW - PALM KW - QDTI KW - TNF-R1 KW - TNF-R2 Y1 - 2012 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-73191 ER -