TY - THES A1 - Kerner, Florian Tobias T1 - Reactions of rhodium(I) with diynes and studies of the photophysical behavior of the luminescent products T1 - Reaktionen von Rhodium(I) mit Diinen und Untersuchung der photophysikalischen Eigenschaften der lumineszenten Produkte N2 - Chapter 1 deals with the reaction of [Rh(acac)(PMe3)2] with para-substituted 1,4-diphenylbuta-1,3-diynes at room temperature, in which a complex containing a bidentate organic fulvene moiety, composed of two diynes, σ-bound to the rhodium center is formed in an all-carbon [3+2] type cyclization reaction. In addition, a complex containing an organic indene moiety, composed of three diynes, attached to the rhodium center in a bis-σ-manner is formed in a [3+2+3] cyclization process. Reactions at 100 °C reveal that the third diyne inserts between the rhodium center and the bis-σ-bound organic fulvene moiety. Furthermore, the formation of a 2,5- and a 2,4-bis(arylethynyl)rhodacyclopentadiene is observed. The unique [3+2] cyclization product was used for the synthesis of a highly conjugated organic molecule, which is hard to access or even inaccessible by conventional methods. Thus, at elevated temperatures, reaction of the [3+2] product with para-tolyl isocyanate led to the formation of a purple organic compound containing the organic fulvene structure and one equivalent of para-tolyl isocyanate. The blue and green [3+2+3] complexes show an unusually broad absorption from 500 – 1000 nm with extinction coefficients ε of up to 11000 M-1 cm-1. The purple organic molecule shows an absorption spectrum similar to those of known diketopyrrolopyrroles. Additionally, the reaction of [Rh(acac)(PMe3)2] with para-tolyl isocyanate was investigated. A cis-phosphine complex of the form cis-[Rh(acac)(PMe3)2(isocyanate)2] with an isocyanate dimer bound to the rhodium center by one carbon and one oxygen atom was isolated. Replacing the trimethylphosphine ligands in [Rh(acac)(PMe3)2] with the stronger σ-donating NHC ligand Me2Im (1,3-dimethylimidazolin-2-ylidene), again, drastically alters the reaction. Similar [3+2] and [3+2+3] products to those discussed above could not be unambiguously assigned, but cis- and trans-π-complexes, which are in an equilibrium with the two starting materials, were formed. Chapters 2 is about the influence of the backbone of the α,ω-diynes on the formation and photophysical properties of 2,5-bis(aryl)rhodacyclopentadienes. Therefore, different α,ω-diynes were reacted with [Rh(acac)(PMe3)2] and [Rh(acac)(P(p-tolyl)3)2] in equimolar amounts. In general, a faster consumption of the rhodium(I) starting material is observed while using preorganized α,ω-diynes with electron withdrawing substituents in the backbone. The isolated PMe3-substituted rhodacyclopentadienes exhibit fluorescence, despite the presence of the heavy atom rhodium, with lifetimes τF of < 1 ns and photoluminescence quantum yields Φ of < 0.01 as in previously reported P(p-tolyl)-substituted 2,5-bis(arylethynyl)rhodacyclopentadienes. However, an isolated P(p-tolyl)-substituted 2,5-bis(aryl)rhodacyclopentadiene shows multiple lifetimes and different absorption and excitation spectra leading to the conclusion that different species may be present. Reaction of [Rh(acac)(Me2Im)2] with dimethyl 4,4'-(naphthalene-1,8-diylbis(ethyne-2,1-diyl))dibenzoate, results in the formation of a mixture trans- and cis-NHC-substituted 2,5-bis(aryl)rhodacyclopentadienes. In chapter 3 the reaction of various acac- and diethyldithiocarbamate-substituted rhodium(I) catalysts bearing (chelating)phosphines with α,ω-bis(arylethynyl)alkanes (α,ω-diynes), yielding luminescent dimers and trimers, is described. The photophysical properties of dimers and trimers of the α,ω-diynes were investigated and compared to para-terphenyl, showing a lower quantum yield and a larger apparent Stokes shift. Furthermore, a bimetallic rhodium(I) complex of the form [Rh2(ox)(P(p-tolyl)3)4] (ox: oxalate) was reacted with a CO2Me-substituted α,ω-tetrayne forming a complex in which only one rhodium(I) center reacts with the α,ω-tetrayne. The photophysical properties of this mixed rhodium(I)/(III) species shows only negligible differences compared to the P(p-tolyl)- and CO2Me-substituted 2,5-bis(arylethynyl)rhodacyclopentadiene, previously synthesized by Marder and co-workers. N2 - Kapitel 1 beschäftigt sich mit der Umsetzung von [Rh(acac)(PMe3)2] mit zwei Äquivalenten para-substituierten 1,4-Diphenylbuta-1,3-diins bei Raumtemperatur. Dabei bildete sich ein Komplex, welcher eine organische Fulveneinheit, bestehend aus zwei Diinen und verbunden über zwei σ-Bindungen mit dem Rhodiumzentralatom, besitzt. Diese Verbindung bildet sich in einer „all-carbon“ [3+2] ähnlichen Zyklisierungsreaktion. Ebenso konnte aus derselben Reaktion ein Komplex mit einer Indeneinheit, bestehend aus drei Diinen, welche durch zwei σ-Bindungen mit dem Rhodiumzentralatom verbunden sind, isoliert und charakterisiert werden. Diese Verbindung bildet sich in einer „all-carbon“ [3+2+3] ähnlichen Zyklisierungsreaktion. Experimente bei 100 °C zeigen, dass sich das zusätzliche dritte Diin zwischen dem Rhodiumzentralatom und der organischen Fulveneinheit einfügt. Zusätzlich konnte die Bildung von 2,4- und 2,5-Bis(arylethinyl)rhodazyklopentadienen bei 100°C beobachtet werden. Diese seltene [3+2] Zyklisierungsreaktion kann benutzt werden um konjugierte, organische Moleküle darzustellen, welche sonst nur schwer oder gar nicht mit bisher bekannten Synthesemethoden zugänglich sind. In der Umsetzung des [3+2] Komplexes mit para-Tolylisocyanat bei 80 °C konnte ein violetter, rein organischer Feststoff erhalten werden, bestehend aus der organischen Fulveneinheit und einem Äquivalent para-Tolylisocyanat. Die blauen und grünen [3+2+3] Komplexe zeigen unter anderem eine ungewöhnliche breite Absorption von 500 – 1000 nm mit einem Extinktionskoeffizienten von bis zu 11000 M-1 cm-1. Die violette, rein organische Verbindung zeigt ein Absorptionsspektrum ähnlich zu bereits bekannten Diketopyrrolopyrrolen. Auch wurde die Reaktion von [Rh(acac)(PMe3)2] mit para-Tolylisocyanat untersucht. Es konnte ein cis-phosphan Komplex, bei dem ein para-Tolylisocyanat-Dimer über ein Kohlenstoff- und ein Sauerstoffatom an das Rhodiumzentralatom koordiniert, isoliert und charakterisiert werden. Substitution des Trimethylphosphans im Rh(I)-Präkursors durch einen NHC Liganden, nämlich Me2Im (1,3-dimethylimidazolin-2-yliden) führt zu einem unterschiedlichen Reaktionsverlauf. Ähnliche [3+2] und [3+2+3] Komplexe konnten nicht zweifelsfrei bestätigt werden, dafür konnte aber gezeigt werden, dass sich in der Reaktion bildende cis- und trans-Komplexe im Gleichgewicht mit den verwendeten Startmaterialien befinden. Im zweiten Kapitel dieser Arbeite wurde der Einfluss des Rückgrats von α,ω-bis(arylethynyl)alkanen (α,ω-Diine) auf die Bildung und die photophysikalischen Eigenschaften von 2,5-Bis(aryl)rhodazyklopentadienen untersucht. Dazu wurden mehrere α,ω-Diine mit unterschiedlichem Rückgrat synthetisiert und diese mit [Rh(acac)(PMe3)2] und [Rh(acac)(P(p-tolyl)3)2] in äquimolaren Mengen reagiert. Es konnte ein schnellerer Verbrauch des Rh(I)-Präkursors bei der Verwendung von vororganisierten α,ω-Diinen mit elektronenziehenden Substituenten am Rückgrat festgestellt werden. Die PMe3-substituierten Rhodazyklopentadiene zeigen Fluoreszenz, trotz der Anwesenheit eines Schwermetalls. Lebenszeiten von τF < 1 ns und Quantenausbeuten von Φ < 0.01, ähnlich wie in P(p-tolyl)-substituierten 2,5-Bis(arylethynyl)rhodazyklopentadienen wurden beobachtet. Bei einem isolierten P(p-tolyl)-substituierten 2,5-Bis(aryl)rhodazyklopentadien konnten mehrere Lebenszeiten, wie auch unterschiedliche Absorptions- und Anregungsspektren detektiert werden, was zu der Schlussfolgerung führt, dass in Lösung mehrere Spezies vorhanden sind. Die Reaktion von [Rh(acac)(Me2Im)2] mit Dimethyl 4,4'-(naphthalen-1,8-diylbis(ethyn-2,1-diyl))dibenzoat führt zur Bildung einer Mischung aus trans- und cis-NHC-substituierter 2,5-Bis(aryl)rhodazyklopentadienen. Im dritten Kapitel, wurde die Bildung lumineszenter Dimere und Trimere aus der Umsetzung von verschiedenen α,ω-Diinen mit katalytischen Mengen verschiedener acac- und diethyldithiocarbamat-substituierter Rhodium(I)-Katalysatoren mit (chelatisierenden) phosphanen untersucht. Anschließend wurden die photophysikalischen Eigenschaften der Dimere und Trimere untersucht und mit para-Terphenyl verglichen. Dabei wurden ähnliche Lebenszeiten, eine geringere Quantenausbeute wie auch größere Stokes-Verschiebungen der Dimere und Trimere im Vergleich zu para-Terphenyl gefunden. Auch wurde die Reaktion zwischen einem bimetallischen Rhodium Komplex [Rh2(ox)(P(p-tolyl)3)4] (ox: oxalat) und einem CO2Me-substituiertem α,ω-bis(arylbutadiynyl)alkan (α,ω-Tetrain) untersucht. In dieser Umsetzung reagierte nur eine der beiden möglichen Rhodium(I)-zentren mit dem α,ω-Tetrain unter Bildung eines 2,5-Bis(arylethynyl)rhodazyklopentadiens. Die photophysikalischen Eigenschaften dieser gemischten Rhodium(I)/(III)-Spezies zeigt nur marginale unterschiede, verglichen mit einem mononuklearen P(p-tolyl)- und CO2Me-substituiertem 2,5-Bis(arylethynyl)rhodazyklopentadiens, welches zuvor im Arbeitskreis Marder schon synthetisiert wurde. KW - Übergangsmetallkomplexe KW - Rhodium KW - Übergangsmetallkomplex KW - Zyklisierung KW - Transitionmetal KW - Cyclization Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-209107 ER - TY - THES A1 - Yang, Tao T1 - Functional insights into the role of a bacterial virulence factor and a host factor in Neisseria gonorrhoeae infection T1 - Funktionelle Einblicke in die Rolle eines bakteriellen Virulenzfaktors und eines Wirtsfaktors bei der Infektion mit Neisseria gonorrhoeae N2 - Neisseria gonorrhoeae (GC) is a human specific pathogenic bacterium. Currently, N. gonorrhoeae developed resistance to virtually all the available antibiotics used for treatment. N. gonorrhoeae starts infection by colonizing the cell surface, followed by invasion of the host cell, intracellular persistence, transcytosis and exit into the subepithelial space. Subepithelial bacteria can reach the bloodstream and disseminate to other tissues causing systemic infections, which leads to serious conditions such as arthritis and pneumonia. A number of studies have well established the host-pathogen interactions during the initial adherence and invasion steps. However, the mechanism of intracellular survival and traversal is poorly understood so far. Hence, identification of novel bacterial virulence factors and host factors involved in the host-pathogen interaction is a crucial step in understanding disease development and uncovering novel therapeutic approaches. Besides, most of the previous studies about N. gonorrhoeae were performed in the conventional cell culture. Although they have provided insights into host-pathogen interactions, much information about the native infection microenvironment, such as cell polarization and barrier function, is still missing. This work focused on determining the function of novel bacterial virulence factor NGFG_01605 and host factor (FLCN) in gonococcal infection. NGFG_01605 was identified by Tn5 transposon library screening. It is a putative U32 protease. Unlike other proteins in this family, it is not secreted and has no ex vivo protease activity. NGFG_01605 knockout decreases gonococcal survival in the epithelial cell. 3D models based on T84 cell was developed for the bacterial transmigration assay. NGFG_01605 knockout does not affect gonococcal transmigration. The novel host factor FLCN was identified by shRNA library screening in search for factors that affected gonococcal adherence and/or internalization. We discovered that FLCN did not affect N. gonorrhoeae adherence and invasion but was essential for bacterial survival. Since programmed cell death is a host defence mechanism against intracellular pathogens, we further explored apoptosis and autophagy upon gonococcal infection and determined that FLCN did not affect apoptosis but inhibited autophagy. Moreover, we found that FLCN inhibited the expression of E-cadherin. Knockdown of E- cadherin decreased the autophagy flux and supported N. gonorrhoeae survival. Both non-polarized and polarized cells are present in the cervix, and additionally, E-cadherin represents different polarization properties on these different cells. Therefore, we established 3-D models to better understand the functions of FLCN. We discovered that FLCN was critical for N. gonorrhoeae survival in the 3-D environment as well, but not through inhibiting autophagy. Furthermore, FLCN inhibits the E-cadherin expression and disturbs its polarization in the 3-D models. Since N. gonorrhoeae can cross the epithelial cell barriers through both cell-cell junctions and transcellular migration, we further explored the roles FLCN and E-cadherin played in transmigration. FLCN delayed N. gonorrhoeae transmigration, whereas the knockdown of E-cadherin increased N. gonorrhoeae transmigration. In summary, we revealed roles of the NGFG_01605 and FLCN-E-cadherin axis play in N. gonorrhoeae infection, particularly in relation to intracellular survival and transmigration. This is also the first study that connects FLCN and human-specific pathogen infection. N2 - Neisseria gonorrhoeae (GC) ist ein humanpathogenes Bakterium. Gegen jedes kommerziell erhältliche Antibiotikum konnten bereits Resistenzen entdeckt werden. Die Infektion von Neisserien startet mit der Kolonisierung der Zelloberfläche, gefolgt von der Invasion in die Zelle, intrazellulärer Persistenz, Transzytose und Verlassen des subepithelen Raums. Subepithele Bakterien können den Blutfluss erreichen und sich somit auf andere Gewebe verbreiten und dadurch schwerwiegende Erkrankungen wie Arthritis und Lungenentzündungen verursachen. Zahlreiche Studien haben die Interaktion zwischen Wirtszelle und Pathogen zwischen Adhärenz und Invasion gut charakterisiert. Allerdings ist der Mechanismus des intrazellulären Überlebens und der Transmigration weitestgehend unbekannt. Um neue therapeutische Ansätze zu definieren ist es deshalb wichtig weitere bakterielle und zelluläre Faktoren verantwortlich für Interaktionen zwischen Wirt und Pathogen zu identifizieren. Außerdem wurden Studien über N. gonorrhoeae bisher in konventioneller Zellkultur durchgeführt. Auch wenn diese weitere Einsichten in Wirt-Pathogen Interaktionen geben, ist viel Information in der nativen Infektionsumgebung, wie Zellpolarisierung oder Barrierefunktionen, bisher nicht bekannt. Diese Arbeit fokussiert sich auf die Bestimmung eines neuen bakteriellen Virulenzfaktors, NGFG_01605, und Wirtsfaktoren (FLCN) in der Infektion von Gonokokken. NGFG_01605 wurde über Screening einer Transposonsammlung identifiziert und ist eine vermeintliche U32 Protease. Im Gegensatz zu anderen Proteinen dieser Familie, wird diese Protease nicht sekretiert und hat keine ex vivo Proteaseaktivität. Der Knockout von NGFG_01605 vermindert die Überlebensrate von Gonokokken in Epithelzellen. 3D-Modelle basierend auf T84-Zellen wurden für die Analyse der bakteriellen Transmigration entwickelt. Der Knockout von NGFG_01605 hat keinen Einfluss auf die Transmigration. Bei der Suche neuer Wirtsfaktoren, die für die Adhärenz und/oder Internalisierung wichtig sind, wurde FLCN durch ein Screening einer shRNA Sammlung entdeckt. Wir konnten zeigen, dass dieser Faktor zwar nicht für die Adhärenz oder Invasion von N. gonorrhoeae, aber für das Überleben der Bakterien in der Wirtszelle essenziell ist. Da der programmierte Zelltod ein typischer Abwehrmechanismus gegen intrazelluläre Bakterien ist, haben wir Apoptose und Autophagie weiter untersucht und konnten zeigen, dass FLCN zwar keinen Effekt auf Apoptose hat, aber Autophagie inhibiert. Außerdem konnten wir zeigen, dass FLCN die Expression von E-cadherin inhibiert. Auch der Knockdown von E-cadherin verringerte Autophagie und erhöhte das Überleben von N. gonorrhoeae. Im Gebärmutterhals sind sowohl polarisierte als auch nicht-polarisierte Zellen präsent. E-cadherin hat zudem unterschiedliche Einflüsse auf diese unterschiedlichen Zellen. Aus diesem Grund haben wir ein 3D-Modell entwickelt, um die Funktionen von FLCN besser zu verstehen. Wir entdeckten, dass FLCN zwar auch im 3D Modell wichtig für das Überleben ist, aber nicht durch Inhibition von Autophagie. Außerdem inhibiert FLCN die Expression und Verteilung von E-cadherin in 3D-Modellen. Da N. gonorrhoeae die Epithelzellbarierre durch sowohl Zell-Zell-Kontakte als auch transzelluläre Migration überwinden kann, untersuchten wir daraufhin die Rollen von FLCN und E-cadherin in der transzellulären Migration. Diese wird durch FLCN verspätet und durch Knockdown von E-cadherin erhöht. Zusammengefasst, haben wir die Rolle von NGFG_01605 und den Zusammenhang von FLCN und E-cadherin während der Infektion von N. gonorrhoeae untersucht. Unser Fokus war hierbei das intrazelluläre Überleben sowie zelluläre Transmigration. Diese Arbeit ist die Erste, die FLCN und humanpathogenspezifische Infektion miteinander in Verbindung bringt. KW - Folliculin KW - autophagy KW - polarized epithelium KW - protease KW - Gonococcal invasion KW - autophagocytose Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-208959 ER - TY - THES A1 - Klein, Thomas T1 - Establishing an in vitro disease model for Fabry Disease using patient specific induced pluripotent stem cell-derived sensory neurons T1 - Etablierung eines in vitro Krankheitsmodells für M. Fabry mittels patienteneigener sensibler Neurone, generiert über induzierte pluripotente Stammzellen N2 - Fabry disease (FD) is an X-linked lysosomal storage disorder caused by deficiency of the α-galactosidase A (GLA), leading to intracellular accumulations of globotriaosylceramide (Gb3). Acral burning pain, which can be triggered by heat, fever or physical activity is an early hallmark of FD and greatly reduces patients’ quality of life. The pathophysiology of FD pain is unknown and research is hindered by the limited in vivo availability of suitable human biomaterial. To overcome this obstacle, we generated induced pluripotent stem cells (iPSC) from one female and two male patients with a differing pain phenotype, and developed a refined differentiation protocol for sensory neurons to increase reliability and survival of these neurons, serving as an in vitro disease model. Neurons were characterized for the correct neuronal subtype using immunocytochemistry, gene expression analysis, and for their functionality using electrophysiological measurements. iPSC and sensory neurons from the male patients showed Gb3 accumulations mimicking the disease phenotype, whereas no Gb3 depositions were detected in sensory neurons derived from the female cell line, likely caused by a skewed X-chromosomal inactivation in favor of healthy GLA. Using super-resolution imaging techniques we showed that Gb3 is localized in neuronal lysosomes of male patients and in a first experiment using dSTORM microscopy we were able to visualize the neuronal membrane in great detail. To test our disease model, we treated the neurons with enzyme replacement therapy (ERT) and analyzed its effect on the cellular Gb3 load, which was reduced in the male FD-lines, compared to non-treated cells. We also identified time-dependent differences of Gb3 accumulations, of which some seemed to be resistant to ERT. We also used confocal Ca2+ imaging to investigate spontaneous neuronal network activity, but analysis of the dataset proofed to be difficult, nonetheless showing a high potential for further investigations. We revealed that neurons from a patient with pain pain are more easily excitable, compared to cells from a patient without pain and a healthy control. We provide evidence for the potential of patient-specific iPSC to generate a neuronal in vitro disease model, showing the typical molecular FD phenotype, responding to treatment, and pointing towards underlying electrophysiological mechanisms causing different pain phenotypes. Our sensory neurons are suitable for state-of-the-art microscopy techniques, opening new possibilities for an in-depth analysis of cellular changes, caused by pathological Gb3 accumulations. Taken together, our system can easily be used to investigate the effect of the different mutations of GLA on a functional and a molecular level in affected neurons. N2 - Morbus Fabry (M. Fabry) ist eine X-chromosomal vererbte lysosomale Speichererkrankung, die durch die Defizienz von α-Galaktosidase A (GLA) verursacht wird. Diese führt zu pathologischen Ablagerungen von Globotriaosylceramid (Gb3) in Zellen. Akraler, brennender Schmerz, der durch Hitze, Fieber oder Sport ausgelöst werden kann, ist ein frühes Krankheitsmerkmal und reduziert die Lebensqualität der Patienten deutlich. Die Pathophysiologie von M. Fabry ist unklar und die Forschung ist durch die limitierte Verfügbarkeit von humanem Biomaterial nur eingeschränkt möglich. Um dieses Problem zu bewältigen haben wir induzierte pluripotente Stammzellen (iPSC) von einer weiblichen Patientin und zwei männlichen Patienten mit unterschiedlichen Schmerzphänotypen generiert. Mit diesen Zellen konnten wir ein verbessertes Protokoll zur Herstellung sensibler Neurone etablieren um diese als in vitro Krankheitsmodell zu nutzen. Die Neurone wurden mittels Immunozytochemie, Genexpressionsanalyse und elektrophysiologischer Messungen auf die korrekte Zellidentität und deren Funktionalität getestet. Gb3 Ablagerungen konnten als Krankheitsmerkmal in iPSC und sensiblen Neuronen der männlichen Patienten, nicht aber in Zellen der weiblichen Patientin und der Kontrollperson nachgewiesen werden. Das Fehlen von pathologischen Ablagerungen in Zellen der weiblichen Betroffenen ist vermutlich auf eine verschobene X-Inaktivierung zu Gunsten des gesunden GLA zurückzuführen. Nichtsdestotrotz ist es uns durch die Nutzung hochauflösender Mikroskopietechniken gelungen, bei männlichen Patienten Gb3 in neuronalen Lysosomen nachzuweisen und die Membran in großem Detail abzubilden. Die Behandlung der Neurone mit der Enzymersatztherapie (ERT) als Nachweis für die Funktionalität des Krankheitsmodells führte zu einer Reduktion der Gb3 Ablagerungen bei männlichen Zellen, im Vergleich zu unbehandelten Zellen. Zudem konnten wir unterschiedliche Arten von Gb3 Akkumulationen identifizieren, von denen einige scheinbar behandlungsresistent sind. Erste Versuche mit Ca2+ Imaging zeigten spontane, neuronale Netzwerkaktivität, die noch weitergehend analysiert werden müssen. Mittels Patch-Clamp Analysen konnten wir zeigen, dass Neurone des Patienten mit Schmerzen leichter erregbar sind als Zellen des Patienten ohne Schmerzen, was einen Hinweis auf die mögliche Beteiligung gestörter Ionenkanäle gibt. Wir konnten zeigen, dass patientenspezifische iPSC geeignet sind um ein neuronales in vitro Krankheitsmodell zu erstellen. Dieses Modell zeigt den typischen molekularen Phänotypen des M. Fabry, spricht auf ERT an und liefert erste Hinweise auf pathologische elektrophysiologische Krankheitsursachen, die zu unterschiedlichen Schmerzphänotypen führen können. Zelluläre Veränderungen durch Gb3 Ablagerungen können nun mittels neuester Mikroskopietechniken anhand der von uns generierten Neurone untersucht werden um ein besseres Verständnis der zugrundeliegenden Pathophysiologie zu bekommen. Zusammenfassend bietet unser System eine neue Möglichkeit den neuronalen Einfluss verschiedener GLA Mutationen auf einer funktionellen und molekularen Ebene zu untersuchen und die Diversität von M. Fabry aufzuschlüsseln. KW - Induzierte pluripotente Stammzelle KW - iPSC KW - disease model KW - fabry disease KW - pain Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-199705 ER - TY - THES A1 - Vollmuth, Nadine T1 - Role of the proto-oncogene c-Myc in the development of Chlamydia trachomatis T1 - Die Rolle des proto-onkogenes c-Myc in der Entwicklung von Chlamydia trachomatis N2 - Chlamydia trachomatis, an obligate intracellular human pathogen, is the world’s leading cause of infection related blindness and the most common, bacterial sexually transmitted disease. In order to establish an optimal replicative niche, the pathogen extensively interferes with the physiology of the host cell. Chlamydia switches in its complex developmental cycle between the infectious non-replicative elementary bodies (EBs) and the non-infectious replicative reticulate bodies (RBs). The transformation to RBs, shortly after entering a host cell, is a crucial process in infection to start chlamydial replication. Currently it is unknown how the transition from EBs to RBs is initiated. In this thesis, we could show that, in an axenic media approach, L glutamine uptake by the pathogen is crucial to initiate the EB to RB transition. L-glutamine is converted to amino acids which are used by the bacteria to synthesize peptidoglycan. Peptidoglycan inturn is believed to function in separating dividing Chlamydia. The glutamine metabolism is reprogrammed in infected cells in a c-Myc-dependent manner, in order to accomplish the increased requirement for L-glutamine. Upon a chlamydial infection, the proto-oncogene c-Myc gets upregulated to promote host cell glutaminolysis via glutaminase GLS1 and the L-glutamine transporter SLC1A5/ASCT2. Interference with this metabolic reprogramming leads to limited growth of C. trachomatis. Besides the active infection, Chlamydia can persist over a long period of time within the host cell whereby chronic and recurrent infections establish. C. trachomatis acquire a persistent state during an immune attack in response to elevated interferon-γ (IFN-γ) levels. It has been shown that IFN-γ activates the catabolic depletion of L-tryptophan via indoleamine 2,3-dioxygenase (IDO), resulting in the formation of non-infectious atypical chlamydial forms. In this thesis, we could show that IFN-γ depletes the key metabolic regulator c-Myc, which has been demonstrated to be a prerequisite for chlamydial development and growth, in a STAT1-dependent manner. Moreover, metabolic analyses revealed that the pathogen de routs the host cell TCA cycle to enrich pyrimidine biosynthesis. Supplementing pyrimidines or a-ketoglutarate helps the bacteria to partially overcome the persistent state. Together, the results indicate a central role of c-Myc induced host glutamine metabolism reprogramming and L-glutamine for the development of C. trachomatis, which may provide a basis for anti-infectious strategies. Furthermore, they challenge the longstanding hypothesis of L-tryptophan shortage as the sole reason for IFN-γ induced persistence and suggest a pivotal role of c-Myc in the control of the C. trachomatis dormancy. N2 - Chlamydia trachomatis, ein obligat intrazellul¨ares humanes Pathogen, ist weltweit fu¨hrende Ursache fu¨r infektionsbedingte Erblindung und die h¨aufigste, bakterielle sexuell u¨bertragbare Krankheit. Um eine optimale Replikationsnische zu etablieren, interagiert das Pathogen in tensiv mit der Physiologie der Wirtszelle. Chlamydien wechseln in ihrem komplexen Entwick lungszyklus zwischen den infekti¨osen nicht replizierenden Elementark¨orperchen (EBs) und den nicht infekti¨osen replizierenden Retikulark¨orperchen (RBs), und diese Umwandlung in RBs kurz nach dem Eintritt in die Wirtszelle ist ein entscheidender Prozess in der Infektion, um die Replikation des Bakteriums einzuleiten. Derzeit ist noch nicht bekannt, wodurch diese Transformation von EBs zu RBs eingeleitet wird. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass bei einer zellfreien Kultivierung des Pathogens die Aufnahme von Glutamin durch den Erreger entscheidend ist, um den ¨Ubergang von EB zu RB zu initiieren. Vor kurzem wurde Peptidoglykan in den Septen von sich replizierenden Chlamydien nachgewiesen. Fu¨r die Syn these des Peptidoglykans nutzen die Bakterien das aufgenommene Glutamin. Der Glutamin metabolismus wird in infizierten Zellen c-Myc abh¨angig umprogrammiert, um den erh¨ohten Bedarf an Glutamin zu bew¨altigen. Bei einer Chlamydieninfektion wird das Proto-Onkogen c-Myc zur F¨orderung der Glutaminolyse der Wirtszelle u¨ber die Glutaminase GLS1 und den Glutamin Transporter SLC1A5/ASCT2 hochreguliert. Ein Eingreifen in diese metabolische Neuprogrammierung fu¨hrt zu einem reduzierten Wachstum von C. trachomatis. Neben der aktiven Infektion k¨onnen Chlamydien u¨ber einen sehr langen Zeitraum in der Wirtszelle persistieren, wodurch es zur Etablierung von chronischen und wiederkehrenden Infektionen kommt. C. trachomatis verf¨allt bei einem Immunangriff in Persistenz, wenn sie auf das freigesetzte Interferon-γ treffen. Es ist bekannt, dass Interferon-γ den Katabolismus von Tryptophan mittels indoleamine 2,3-dioxygenase (IDO) aktiviert, was zur Bildung von nicht infekti¨osen atypischen Chlamydienformen fu¨hrt. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass Interferon-γ den zentralen Stoffwechselregulator c-Myc, der sich fu¨r die Entwicklung und das Wachstum von Chlamydien als essentiell erwiesen hat, in Abh¨angigkeit von STAT1 herunter reguliert. Daru¨ber hinaus zeigte die Analyse des Metabolismus, dass das Pathogen den TCA Zyklus der Wirtszelle umleitet, um die Pyrimidinbiosynthese zu unterstu¨tzen. Die Zugabe von Pyrimidinen oder α-Ketoglutarat hilft den Bakterien den Status der Persistenz teilweise zu u¨berwinden. Zusammengenommen deuten die Ergebnisse auf eine zentrale Rolle der c-Myc induzierten Umprogrammierung des Glutaminmetabolismus und des Glutamins selbst fu¨r die Entwicklung von C. trachomatis hin. Diese Befunde k¨onnten eine Basis fu¨r Strategien gegen eine Infektion darstellen. Weiterhin stellen sie die seit langem bestehende Hypothese des Trypotphanmangels als alleiniger Grund fu¨r die von Interferon-γ induzierte Persistenz in Frage und legen eine zentrale Rolle von c-Myc bei der Kontrolle der C. trachomatis Dormanz nahe. KW - Chlamydia trachomatis KW - Persistence KW - trachomatis KW - chlamydia Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-203655 ER - TY - THES A1 - Mayer, Alexander E. T1 - Protein kinase D3 signaling in the regulation of liver metabolism T1 - Proteinkinase D3 Signalwirkung in der Regulation des Leberstoffwechsels N2 - The liver plays a pivotal role in maintaining energy homeostasis. Hepatic carbohydrate and lipid metabolism are tightly regulated in order to adapt quickly to changes in nutrient availability. Postprandially, the liver lowers the blood glucose levels and stores nutrients in form of glycogen and triglycerides (TG). In contrast, upon fasting, the liver provides glucose, TG, and ketone bodies. However, obesity resulting from a discrepancy in food intake and energy expenditure leads to abnormal fat accumulation in the liver, which is associated with the development of hepatic insulin resistance, non-alcoholic fatty liver disease, and diabetes. In this context, hepatic insulin resistance is directly linked to the accumulation of diacylglycerol (DAG) in the liver. Besides being an intermediate product of TG synthesis, DAG serves as second messenger in response to G-protein coupled receptor signaling. Protein kinase D (PKD) family members are DAG effectors that integrate multiple metabolic inputs. However, the impact of PKD signaling on liver physiology has not been studied so far. In this thesis, PKD3 was identified as the predominantly expressed isoform in liver. Stimulation of primary hepatocytes with DAG as well as high-fat diet (HFD) feeding of mice led to an activation of PKD3, indicating its relevance during obesity. HFD-fed mice lacking PKD3 specifically in hepatocytes displayed significantly improved glucose tolerance and insulin sensitivity. However, at the same time, hepatic deletion of PKD3 in mice resulted in elevated liver weight as a consequence of increased hepatic lipid accumulation. Lack of PKD3 in hepatocytes promoted sterol regulatory element-binding protein (SREBP)-mediated de novo lipogenesis in vitro and in vivo, and thus increased hepatic triglyceride and cholesterol content. Furthermore, PKD3 suppressed the activation of SREBP by impairing the activity of the insulin effectors protein kinase B (AKT) and mechanistic target of rapamycin complexes (mTORC) 1 and 2. In contrast, liver-specific overexpression of constitutive active PKD3 promoted glucose intolerance and insulin resistance. Taken together, lack of PKD3 improves hepatic insulin sensitivity but promotes hepatic lipid accumulation. For this reason, manipulating PKD3 signaling might be a valid strategy to improve hepatic lipid content or insulin sensitivity. However, the exact molecular mechanism by which PKD3 regulates hepatocytes metabolism remains unclear. Unbiased proteomic approaches were performed in order to identify PKD3 phosphorylation targets. In this process, numerous potential targets of PKD3 were detected, which are implicated in different aspects of cellular metabolism. Among other hits, phenylalanine hydroxylase (PAH) was identified as a target of PKD3 in hepatocytes. PAH is the enzyme that is responsible for the conversion of phenylalanine to tyrosine. In fact, manipulation of PKD3 activity using genetic tools confirmed that PKD3 promotes PAH-dependent conversion of phenylalanine to tyrosine. Therefore, the data in this thesis suggests that PKD3 coordinates lipid and amino acid metabolism in the liver and contributes to the development of hepatic dysfunction. N2 - Die Leber spielt eine zentrale Rolle bei der Aufrechterhaltung der Energiehomöostase. Der hepatische Kohlenhydrat- und Fettstoffwechsel ist stark reguliert, um sich schnell an Veränderungen in der Nährstoffverfügbarkeit anzupassen. Die Leber senkt postprandial den Blutzuckerspiegel und speichert Nährstoffe in Form von Glykogen und Triglyzeriden (TG). Im Gegensatz dazu stellt die Leber beim Fasten Glukose, TG und Ketonkörper bereit. Fettleibigkeit, welche aus einer Diskrepanz zwischen Nahrungsaufnahme und Energieaufwand resultiert, führt allerdings zu einer abnormalen Fettansammlung in der Leber, die mit der Entwicklung von Leberinsulinresistenz, nicht-alkoholischen Fettlebererkrankungen und Diabetes einhergeht. Hepatische Insulinresistenz steht dabei in direktem Zusammenhang mit der Akkumulation von Diacylglycerol (DAG) in der Leber. DAG ist nicht nur ein Zwischenprodukt der TG-Synthese, sondern dient auch als sekundärer Messenger im G-Protein-gekoppelten Rezeptor-Signalweg. Die Mitglieder der Proteinkinase D (PKD)-Familie sind DAG-Effektoren, die vielfache metabolische Inputs integrieren. Jedoch wurden die Auswirkungen der PKD-Signalwirkung auf die Leberphysiologie bisher nicht untersucht. Im Rahmen dieser Thesis wurde PKD3 als die in der Leber überwiegend exprimierte Isoform identifiziert. Die Stimulation von primären Hepatozyten mit DAG sowie die Fütterung von Mäusen mit fettreicher Nahrung (HFD) führte zu einer Aktivierung von PKD3, was auf eine Relevanz von PKD3 bei Fettleibigkeit hinweist. Mäusen, welchen PKD3 spezifisch in Hepatozyten fehlte und mit HFD gefüttert wurden, zeigten eine deutlich verbesserte Glukosetoleranz und Insulinsensitivität. Gleichzeitig führte jedoch die hepatische Deletion von PKD3 bei Mäusen zu einem erhöhten Lebergewicht in Folge einer erhöhten Lipidakkumulation in der Leber. Das Fehlen von PKD3 in Hepatozyten förderte die Sterol Regulatory Element-Binding Protein (SREBP)-vermittelte de novo Lipogenese in vitro und in vivo und erhöhte damit den Gehalt an Triglyceriden und Cholesterol in der Leber. Darüber hinaus supprimierte PKD3 die Aktivierung von SREBP, indem es die Aktivität der Insulin-Effektoren Proteinkinase B (AKT) und mechanistisches Ziel von Rapamycin- Komplexen (mTORC) 1 und 2 verminderte. Im Gegensatz dazu förderte die leberspezifische Überexpression von konstitutiv aktiver PKD3 die Glukoseintoleranz und Insulinresistenz. Zusammenfassend verbessert der Mangel an PKD3 die hepatische Insulinempfindlichkeit, aber fördert gleichzeitig die Akkumulation von Lipiden in der Leber. Aus diesem Grund könnte das Eingreifen in den PKD3-Signalweg eine gute Strategie zur Verbesserung des hepatischen Lipidgehalts oder der Insulinempfindlichkeit sein. Allerdings bleibt der genaue molekulare Mechanismus, mit dem PKD3 den Stoffwechsel von Hepatozyten reguliert, unklar. Es wurden unvoreingenommene proteomische Ansätze durchgeführt, um PKD3- Phosphorylierungsziele zu identifizieren. In diesem Prozess wurden zahlreiche potenzielle Ziele von PKD3 entdeckt, welche in den verschiedensten Aspekten des Zellstoffwechsels involviert sind. Unter anderem wurde Phenylalaninhydroxylase (PAH) als Ziel von PKD3 in Hepatozyten identifiziert. PAH ist das Enzym, welches für die Umwandlung von Phenylalanin in Tyrosin verantwortlich ist. Tatsächlich bestätigte die Manipulation der PKD3-Aktivität mit Hilfe von genetischen Werkzeugen, dass PKD3 die PAH-abhängige Umwandlung von Phenylalanin in Tyrosin fördert. Deswegen legen die Daten in dieser Arbeit nahe, dass PKD3 den Lipid- und Aminosäurestoffwechsel in der Leber koordiniert und zur Entwicklung von Leber- Dysfunktion beiträgt. KW - Metabolismus KW - Proteinkinase D KW - Leber-Metabolismus Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-207978 ER - TY - THES A1 - Herz, Michaela T1 - Genome wide expression profiling of Echinococcus multilocularis T1 - Genomweite Expressionsanalysen von Echinococcus multilocularis N2 - Alveolar echinococcosis, which is caused by the metacestode stage of the small fox tapeworm Echinococcus multilocularis, is a severe zoonotic disease with limited treatment options. For a better understanding of cestode biology the genome of E. multilocularis, together with other cestode genomes, was sequenced previously. While a few studies were undertaken to explore the E. multilocularis transcriptome, a comprehensive exploration of global transcription profiles throughout life cycle stages is lacking. This work represents the so far most comprehensive analysis of the E. multilocularis transcriptome. Using RNA-Seq information from different life cycle stages and experimental conditions in three biological replicates, transcriptional differences were qualitatively and quantitatively explored. The analyzed datasets are based on samples of metacestodes cultivated under aerobic and anaerobic conditions as well as metacestodes obtained directly from infected jirds. Other samples are stem cell cultures at three different time points of development as well as non-activated and activated protoscoleces, the larval stage that can develop into adult worms. In addition, two datasets of metacestodes under experimental conditions suitable for the detection of genes that are expressed in stem cells, the so-called germinative cells, and one dataset from a siRNA experiment were analyzed. Analysis of these datasets led to expression profiles for all annotated genes, including genes that are expressed in the tegument of metacestodes and play a role in host-parasite interactions and modulation of the host's immune response. Gene expression profiles provide also further information about genes that might be responsible for the infiltrative growth of the parasite in the liver. Furthermore, germinative cell-specific genes were identified. Germinative cells are the only proliferating cells in E. multilocularis and therefore of utmost importance for the development and growth of the parasite. Using a combination of germinative cell depletion and enrichment methods, genes with specific expression in germinative cells were identified. As expected, many of these genes are involved in translation, cell cycle regulation or DNA replication and repair. Also identified were transcription factors, many of which are involved in cell fate commitment. As an example, the gene encoding the telomerase reverse transcriptase (TERT) was studied further. Expression of E. multilocularis tert in germinative cells was confirmed experimentally. Cell culture experiments indicate that TERT is required for proliferation and development of the parasite, which makes TERT a potentially interesting drug target for chemotherapy of alveolar echinococcosis. Germinative cell specific genes in E. multilocularis also include genes of densoviral origin. More than 20 individual densovirus loci with information for non-structural and structural densovirus proteins were identified in the E. multilocularis genome. Densoviral elements were also detected in many other cestode genomes. Genomic integration of these elements suggests that densovirus-based vectors might be suitable tools for genetic manipulation of tapeworms. Interestingly, only three of more than 20 densovirus loci in the E. multilocularis genome are expressed. Since the canonical piRNA pathway is lacking in cestodes, this raises the question about potential silencing mechanisms. Exploration of RNA-Seq information indicated natural antisense transcripts as a potential gene regulation mechanism in E. multilocularis. Preliminary experiments further suggest DNA-methylation, which was previously shown to occur in platyhelminthes, as an interesting avenue to explore in future. The transcriptome datasets also contain information about genes that are expressed in differentiated cells, for example the serotonin transporter gene that is expressed in nerve cells. Cell culture experiments indicate that serotonin and serotonin transport play an important role in E. multilocularis proliferation, development and survival. Overall, this work provides a comprehensive transcription data atlas throughout the E. multilocularis life cycle. Identification of germinative cell-specific genes and genes important for host-parasite interactions will greatly facilitate future research. A global overview of gene expression profiles will also aide in the detection of suitable drug targets and the development of new chemotherapeutics against alveolar echinococcosis. N2 - Alveoläre Echinokokkose wird durch das Metazestodenstadium des kleinen Fuchsbandwurms Echinococcus multilocularis verursacht und medizinisch als eine schwere Zoonose mit begrenzten Behandlungsmöglichkeiten betrachtet. Um ein besseres Verständnis für die Biologie der Zestoden zu erlangen, wurde das Genom von E. multilocularis, zusammen mit denen anderer Zestoden, bereits sequenziert. Bisher wurden nur wenige Studien zum Transkriptom von E. multilocularis durchgeführt und eine umfassende Analyse der Transkriptionsprofile über verschiedene Stadien des Lebenszyklus hinweg fehlt bislang. Diese Arbeit stellt die bisher umfassendste Untersuchung des Transkriptoms von E. multilocularis dar. Unterschiede in der Genexpression in verschiedenen Stadien des Lebenszyklus und unter experimentellen Bedingungen wurden qualitativ und quantitativ untersucht. Dazu wurden Daten aus RNA-Sequenzierungen in drei biologischen Replikaten verwendet. Die untersuchten Datensätze beruhen auf Proben von Metazestoden, die unter aeroben und anaeroben Bedingungen kultiviert, sowie von Metazestoden, die direkt aus Gerbilen isoliert wurden. Weitere Proben umfassen Stammzellkulturen zu drei verschiedenen Entwicklungszeitpunkten sowie nicht-aktivierte und aktivierte Protoskolizes, das Larvenstadium das sich zu Adulten entwickeln kann. Zusätzlich wurden zwei Datensätze von Metazestoden unter experimentellen Bedingungen, die zur Identifizierung stammzellspezifischer (keimzellspezifischer) Gene geeignet sind, sowie ein Datensatz von einem siRNA-Experiment untersucht. Die Analyse dieser Datensätze führte zu Genexpressionsprofilen für alle annotierten Gene, unter anderem für Gene, die im Tegument des Metazestoden exprimiert werden und eine Rolle spielen bei Wirt-Parasit-Interaktionen und der Modulierung der Immunantwort des Wirts. Genexpressionsprofile liefern zudem Informationen über Gene, die für das infiltrative Wachstum des Parasiten in der Leber verantwortlich sein könnten. Des Weiteren wurden keimzellspezifische Gene identifiziert. Keimzellen sind die einzigen proliferierenden Zellen in E. multilocularis und daher von essentieller Bedeutung für die Entwicklung und das Wachstum des Parasiten. Durch eine Kombination von Keimzelldepletierungs- und Keimzellanreicherungsverfahren wurden Gene mit keimzellspezifischer Expression identifiziert. Wie erwartet, sind viele dieser Gene in der Translation, der Zellzyklusregulation oder DNA-Replikation und –Reparatur involviert. Darüber hinaus wurden keimzellspezifisch exprimierte Transkriptionsfaktoren detektiert, von denen viele in der Festlegung des Zellschicksals eine Rolle spielen. Als Beispiel eines keimzellspezifischen Genes wurde das Gen, das für die reverse Transkriptase (TERT) kodiert, genauer untersucht. Die Expression von E. multilocularis tert in Keimzellen wurde experimentell bestätigt. Zellkulturexperimente weisen darauf hin, dass TERT für die Proliferation und die Entwicklung essentiell ist. TERT ist daher ein potentiell interessantes Wirkstofftarget für die chemotherapeutische Behandlung der alveolären Echinokokkose. Zu den keimzellspezifischen Genen in E. multilocularis gehören auch Gene densoviralen Ursprungs. Es wurden mehr als 20 Densovirusloci mit Informationen für nicht-strukturelle und strukturelle Densovirusproteine im E. multilocularis-Genom identifiziert. Densovirale Elemente wurden auch in vielen anderen Zestodengenomen detektiert. Die genomische Integration dieser Elemente deutet darauf hin, dass densovirus-basierte Vektoren zur genetischen Manipulation von Zestoden geeignet sein könnten. Interessanterweise sind nur drei von mehr als 20 Densovirusloci im E. multilocularis-Genom exprimiert. Da es in Zestoden keinen kanonischen piRNA-Signalweg gibt, stellt sich die Frage nach möglichen Genabschaltungsmechanismen. Die Analyse der RNA-Sequenzierdaten ergab Hinweise auf natürliche Antisense-Transkripte als einen möglichen Genregulationsmechanismus in E. multilocularis. Vorläufige Experimente und bisherige Studien deuten weiterhin darauf hin, dass DNA-Methylierung ein Mechanismus der Genregulation und -abschaltung in Zestoden sein könnte. Die Transkriptionsdaten enthalten auch Informationen zu Genen, die in differenzierten Zellen exprimiert werden, wie zum Beispiel das Serotonintransportergen, das in Nervenzellen exprimiert wird. Zellkulturversuche weisen darauf hin, dass Serotonin und Serotonintransport eine wichtige Rolle bei der Proliferation, der Entwicklung und dem überleben von E. multilocularis spielen. Insgesamt bietet diese Arbeit einen umfassenden Transkriptionsdatenatlas über die Stadien des Lebenszyklus von E. multilocularis. Die Identifizierung von keimzellspezifischen Genen und Genen, die für die Interaktion zwischen Wirt und Parasit wichtig sind, wird die zukünftige Forschung erheblich erleichtern. Ein globaler Überblick über die Genexpressionsprofile wird zudem hilfreich sein bei der Entdeckung geeigneter Wirkstofftargets und bei der Entwicklung neuer Chemotherapeutika gegen die alveoläre Echinokokkose. KW - Fuchsbandwurm KW - Serotonin KW - Telomerase KW - Stammzelle KW - Transkriptomanalyse KW - foxtapeworm KW - transcriptome data analysis KW - germinative cell Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-203802 ER - TY - THES A1 - Liess [née Eller], Anna Katharina Luise T1 - Understanding the regulation of the ubiquitin-conjugating enzyme UBE2S T1 - Die Regulation des Ubiquitin-konjugierenden Enzyms UBE2S N2 - The ubiquitination of proteins serves as molecular signal to control an enormous number of physiological processes and its dysregulation is connected to human diseases like cancer. The versatility of this signal stems from the diverse ways by which ubiquitin can be attached to its targets. Thus, specificity and tight regulation of the ubiquitination are pivotal requirements of ubiquitin signaling. Ubiquitin-conjugating enzymes (E2s) act at the heart of the ubiquitination cascade, transferring ubiquitin from a ubiquitin-activating enzyme (E1) to a ubiquitin ligase (E3) or substrate. When cooperating with a RING-type E3, ubiquitin-conjugating enzymes can determine linkage specificity in ubiquitin chain formation. Our understanding of the regulation of E2 activities is still limited at a structural level. The work described here identifies two regulation mechanisms in UBE2S, a cognate E2 of the human RING-type E3 anaphase-promoting complex/cyclosome (APC/C). UBE2S elongates ubiquitin chains on APC/C substrates in a Lys11 linkage-specific manner, thereby targeting these substrates for degradation and driving mitotic progression. In addition, UBE2S was found to have a role in DNA repair by enhancing non-homologous end-joining (NHEJ) and causing transcriptional arrest at DNA damage sites in homologous recombination (HR). Furthermore, UBE2S overexpression is a characteristic feature of many cancer types and is connected to poor prognosis and diminished response to therapy. The first regulatory mechanism uncovered in this thesis involves the intramolecular auto-ubiquitination of a particular lysine residue (Lys+5) close to the active site cysteine, presumably through conformational flexibility of the active site region. The Lys+5-linked ubiquitin molecule adopts a donor-like, ‘closed’ orientation towards UBE2S, thereby conferring auto-inhibition. Notably, Lys+5 is a major physiological ubiquitination site in ~25% of the human E2 enzymes, thus providing regulatory opportunities beyond UBE2S. Besides the active, monomeric state and the auto-inhibited state caused by auto-ubiquitination, I discovered that UBE2S can adopt a dimeric state. The latter also provides an auto-inhibited state, in which ubiquitin transfer is blocked via the obstruction of donor binding. UBE2S dimerization is promoted by its unique C-terminal extension, suppresses auto-ubiquitination and thereby the proteasomal degradation of UBE2S. Taken together, the data provided in this thesis illustrate the intricate ways by which UBE2S activity is fine-tuned and the notion that structurally diverse mechanisms have evolved to restrict the first step in the catalytic cycle of E2 enzymes. N2 - Die Ubiquitinierung von Proteinen fungiert als molekulares Signal zur Kontrolle einer Vielzahl physiologischer Prozesse, wobei eine gestörte Regulation der Ubiquitinierung eng mit zahlreichen Erkrankungen, wie beispielsweise Krebs, verbunden ist. Aufgrund der verschiedenen Verknüpfungsmöglichkeiten von Ubiquitin, die das zelluläre Schicksal des Zielproteins bestimmen, sind Spezifität und stringente Regulation unabkömmliche Voraussetzungen im Ubiquitinierungsprozess. Ubiquitin-konjugierende Enzyme (E2s) fungieren in der Mitte der Ubiquitinierungskaskade. Sie übernehmen ein Ubiquitinmolekül vom Ubiquitin-aktivierenden Enzym (E1) und übertragen es auf eine Ubiquitin-Ligase (E3) oder direkt auf das Zielprotein. Arbeiten Ubiquitin-konjugierende Enzyme mit E3s des RING-Typus zusammen, so bestimmen E2s die Art der Verknüpfung. Die Regulation der Aktivität Ubiquitin-konjugierender Enzyme auf struktureller Ebene ist jedoch bisher nur bedingt verstanden. Die hier dargelegte Arbeit umfasst die Identifizierung zweier Regulationsmechanismen des Ubiquitin-konjugierenden Enzyms UBE2S. UBE2S arbeitet mit einem humanen E3 des RING-Typus‚ dem ‚Anaphase Promoting Complex/Cyclosome‘ (APC/C) zusammen und bildet Lys11-spezifische Ubiquitinketten auf Substraten des APC/Cs. Hierdurch werden die Substrate für den Abbau durch das Proteasom markiert, was das Fortschreiten der Mitose bedingt. Zusätzlich wird UBE2S eine Rolle in der DNS-Reparatur zugeschrieben. Hierbei verstärkt UBE2S die nicht-homologe Rekombination (NHEJ) und verhindert außerdem die Transkription an DNS-Bruchstellen, die durch Homologe Rekombination (HR) repariert werden. Die Überexpression von UBE2S ist ein Charakteristikum verschiedenster Krebsarten, vermindert den Erfolg herkömmlicher Krebstherapien, und führt somit zu schlechten Prognosen für betroffenen Patienten. Der erste hier beschriebene Regulationsmechanismus beinhaltet die intramolekulare Ubiquitinierung eines Lysins (Lys+5) nahe des katalytischen Cysteins, mutmaßlich durch strukturelle Flexibilität der Region des aktiven Zentrums. Das Lys+5-verknüpfte Ubiquitin nimmt eine Donorubiquitin-ähnliche Position auf UBE2S ein, wodurch UBE2S gehemmt wird. Da ein Lysin an der Position +5 in ~25% der humanen E2-Enzyme vorhanden und eine physiologische Ubiquitinierungsstelle ist, birgt dieser Mechanismus Regulationsmöglichkeiten über UBE2S hinaus. Zusätzlich zum aktiven monomeren Zustand und dem durch Autoubiquitinierung ausgelösten inhibierten Zustand, kann UBE2S auch als Dimer vorliegen. In diesem Zustand ist es ebenfalls inaktiv, da die Donorubiquitin-Bindestelle auf UBE2S durch ein zweites Molekül des E2s blockiert wird. Begünstigt wird die Dimerisierung durch die C-terminale Verlängerung von UBE2S und verhindert so deren Autoubiquitinierung, und folglich den proteasomalen Abbau von UBE2S. Es handelt sich hierbei somit um einen zweiten Regulationsmechanismus von UBE2S. Zusammenfassend veranschaulichen die in dieser Arbeit dargelegten Daten die komplexen Möglichkeiten, durch die die Aktivität von UBE2S reguliert werden kann, sowie die Erkenntnis, dass strukturell unterschiedliche Mechanismen existieren, um den ersten Schritt der von Ubiquitin-konjugierenden Enzymen katalysierten Reaktion zu hemmen. KW - E2 KW - Regulation KW - Ubiquitin KW - Mechanismus KW - UBE2S KW - structural mechanism KW - Ubiquitin-conjugating enzyme KW - regulation Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-204190 ER - TY - THES A1 - Dannhäuser, Sven T1 - Function of the Drosophila adhesion-GPCR Latrophilin/CIRL in nociception and neuropathy T1 - Funktionelle Rolle des Drosophila aGPCR Latrophilin/CIRL in Nozizeption und Neuropathie N2 - Touch sensation is the ability to perceive mechanical cues which is required for essential behaviors. These encompass the avoidance of tissue damage, environmental perception, and social interaction but also proprioception and hearing. Therefore research on receptors that convert mechanical stimuli into electrical signals in sensory neurons remains a topical research focus. However, the underlying molecular mechanisms for mechano-metabotropic signal transduction are largely unknown, despite the vital role of mechanosensation in all corners of physiology. Being a large family with over 30 mammalian members, adhesion-type G protein-coupled receptors (aGPCRs) operate in a vast range of physiological processes. Correspondingly, diverse human diseases, such as developmental disorders, defects of the nervous system, allergies and cancer are associated with these receptor family. Several aGPCRs have recently been linked to mechanosensitive functions suggesting, that processing of mechanical stimuli may be a common feature of this receptor family – not only in classical mechanosensory structures. This project employed Drosophila melanogaster as the candidate to analyze the aGPCR Latrophilin/dCIRL function in mechanical nociception in vivo. To this end, we focused on larval sensory neurons and investigated molecular mechanisms of dCIRL activity using noxious mechanical stimuli in combination with optogenetic tools to manipulate second messenger pathways. In addition, we made use of a neuropathy model to test for an involvement of aGPCR signaling in the malfunctioning peripheral nervous system. To do so, this study investigated and characterized nocifensive behavior in dCirl null mutants (dCirlKO) and employed genetically targeted RNA-interference (RNAi) to cell-specifically manipulate nociceptive function. The results revealed that dCirl is transcribed in type II class IV peripheral sensory neurons – a cell type that is structurally similar to mammalian nociceptors and detects different nociceptive sensory modalities. Furthermore, dCirlKO larvae showed increased nocifensive behavior which can be rescued in cell specific reexpression experiments. Expression of bPAC (bacterial photoactivatable adenylate cyclase) in these nociceptive neurons enabled us to investigate an intracellular signaling cascade of dCIRL function provoked by light-induced elevation of cAMP. Here, the findings demonstrated that dCIRL operates as a down-regulator of nocifensive behavior by modulating nociceptive neurons. Given the clinical relevance of this results, dCirl function was tested in a chemically induced neuropathy model where it was shown that cell specific overexpression of dCirl rescued nocifensive behavior but not nociceptor morphology. N2 - Der Tastsinn ist die Fähigkeit, mechanische Reize wahrzunehmen, die für essentielle Verhaltensweisen notwendig sind. Dazu gehören die Vermeidung von Gewebsschädigungen, die Wahrnehmung der Umwelt und soziale Interaktion, aber auch die Propriozeption und das Hören. Daher bleibt die Forschung an Rezeptoren, die mechanische Reize in sensorischen Neuronen in elektrische Signale umwandeln, ein aktueller Forschungsschwerpunk. Die zugrundeliegenden molekularen Mechanismen für die mechanometabotrope Signalübertragung sind trotz der wesentlichen Rolle des Tastsinns in allen Bereichen der Physiologie weitgehend unbekannt. Adhäsions G-Protein gekoppelte Rezeptoren (aGPCRs), eine große Molekülfamilie mit über 30 Vertretern im Menschen, sind an einer Vielzahl von physiologischen Prozessen beteiligt. Demzufolge wird ein Zusammenhang zwischen diesen Rezeptoren und verschiedenen Erkrankungen des Menschen, wie z. B. Entwicklungsstörungen, Defekte des Nervensystems, Allergien und Krebs, angenommen. Mehrere aGPCRs wurden kürzlich mit mechanosensitiven Funktionen in Verbindung gebracht, was darauf hindeutet, dass die Verarbeitung mechanischer Reize ein gemeinsames Merkmal dieser Rezeptorfamilie ist – nicht nur in klassischen mechanosensorischen Strukturen. In diesem Projekt wurde Drosophila melanogaster verwendet, um die Funktion des aGPCR-Latrophilin/dCIRL in der mechanischen Nozizeption in vivo zu analysieren. Zu diesem Zweck konzentriert sich diese Arbeit auf mechano-sensorische Neurone (Typ II Klasse IV) der Fruchtfliegenlarve, um die molekularen Mechanismen der dCIRL-Aktivität zu untersuchen. Hierzu wurden noxische mechanische Reize in Kombination mit optogenetischen Werkzeugen, zur Manipulation der Second-Messenger-Signalübertragung, herangezogen. Zusätzlich wurde ein Neuropathie-Modell etabliert, um eine Beteiligung des aGPCRs dCIRL am beeinträchtigten peripheren Nervensystem zu testen. Zu diesem Zweck untersucht und charakterisiert diese Studie das nozizeptive Verhalten in dCirl-Nullmutanten (dCirlKO) und die RNA-Interferenz (RNAi) Methode, um zellspezifische Manipulationen auszuführen. Die Ergebnisse zeigen, dass dCirl in spezifischen peripheren sensorischen Neuronen (C4da) transkribiert wird - ein Zelltyp, der Nozizeptoren in Säugern strukturell ähnlich ist und verschiedene nozizeptive sensorische Modalitäten vermittelt. Darüber hinaus zeigen dCirlKO-Larven ein erhöhtes nozizeptives Verhalten, welches mittels zellspezifischer Reexpression gerettet werden kann. Die Expression von bPAC (bakterielle photoaktivierbare Adenylatcyclase) in diesen nozizeptiven Neuronen ermöglichte es, intrazelluläre Signalkaskaden von CIRL zu untersuchen, welche durch lichtinduzierte Erhöhung von cAMP angeregt werden. Dieser Versuch zeigt, dass dCIRL durch die Modulation nozizeptiver Neuronen eine Herabregulation des nozizeptiven Verhaltens bewirkt. Angesichts der klinischen Relevanz dieses Ergebnisses wurde die dCirl-Funktion in einem chemisch induzierten Neuropathie-Modell getestet. Dabei stellte sich heraus, dass zellspezifische Überexpression von dCirl eine ausgeprägte Hyperalgesie reduziert, morphologische Schädigungen hingegen nicht gerettet werden konnten. KW - Drosophila KW - Fluoreszenzmikroskopie KW - Nozizeption KW - Neuropathie KW - nociception KW - neuropathy KW - adhesion-GPCR KW - aGPCR KW - dCIRL KW - Latrophilin Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-201580 ER - TY - THES A1 - Gründl, Marco T1 - Biochemical characterization of the MMB-Hippo crosstalk and its physiological relevance for heart development T1 - Biochemische Charakterisierung des MMB-Hippo Signalweges und dessen physiologische Rolle in der Herzentwicklung N2 - The Myb-MuvB (MMB) complex plays an essential role in the time-dependent transcriptional activation of mitotic genes. Recently, our laboratory identified a novel crosstalk between the MMB-complex and YAP, the transcriptional coactivator of the Hippo pathway, to coregulate a subset of mitotic genes (Pattschull et al., 2019). Several genetic studies have shown that the Hippo-YAP pathway is essential to drive cardiomyocyte proliferation during cardiac development (von Gise et al., 2012; Heallen et al., 2011; Xin et al., 2011). However, the exact mechanisms of how YAP activates proliferation of cardiomyocytes is not known. This doctoral thesis addresses the physiological role of the MMB-Hippo crosstalk within the heart and characterizes the YAP-B-MYB interaction with the overall aim to identify a potent inhibitor of YAP. The results reported in this thesis indicate that complete loss of the MMB scaffold protein LIN9 in heart progenitor cells results in thinning of ventricular walls, reduced cardiomyocyte proliferation and early embryonic lethality. Moreover, genetic experiments using mice deficient in SAV1, a core component of the Hippo pathway, and LIN9-deficient mice revealed that the correct function of the MMB complex is critical for proliferation of cardiomyocytes due to Hippo-deficiency. Whole genome transcriptome profiling as well as genome wide binding studies identified a subset of Hippo-regulated cell cycle genes as direct targets of MMB. By proximity ligation assay (PLA), YAP and B-MYB were discovered to interact in embryonal cardiomyocytes. Biochemical approaches, such as co-immunoprecipitation assays, GST-pulldown assays, and µSPOT-based peptide arrays were employed to characterize the YAP-B-MYB interaction. Here, a PY motif within the N-terminus of B-MYB was found to directly interact with the YAP WW-domains. Consequently, the YAP WW-domains were important for the ability of YAP to drive proliferation in cardiomyocytes and to activate MMB target genes in differentiated C2C12 cells. The biochemical information obtained from the interaction studies was utilized to develop a novel competitive inhibitor of YAP called MY-COMP (Myb-YAP competition). In MY-COMP, the protein fragment of B-MYB containing the YAP binding domain is fused to a nuclear localization signal. Co-immunoprecipitation studies as well as PLA revealed that the YAP-B-MYB interaction is robustly blocked by expression of MY-COMP. Adenoviral overexpression of MY-COMP in embryonal cardiomyocytes suppressed entry into mitosis and blocked the pro-proliferative function of YAP. Strikingly, characterization of the cellular phenotype showed that ectopic expression of MY-COMP led to growth defects, nuclear abnormalities and polyploidization in HeLa cells. Taken together, the results of this thesis reveal the mechanism of the crosstalk between the Hippo signaling pathway and the MMB complex in the heart and form the basis for interference with the oncogenic activity of the Hippo coactivator YAP. N2 - Der Myb-MuvB Komplex spielt eine essenzielle Rolle in der transkriptionellen Aktivierung von Zellzyklusgenen. Unser Labor hat kürzlich einen bis dahin unbekannten Mechanismus zwischen dem MMB-Komplex und Hippo-YAP Signalweg, der zur Aktivierung von Mitosegenen beiträgt, identifiziert. Der Hippo-YAP Signalweg ist beteiligt an der Gewebehomöostase und am Wachstum von Organen. So reguliert der Hippo-YAP Signalweg zum Beispiel während der Herzentwicklung die Proliferation von Herzmuskelzellen. Der exakte Mechanismus wie YAP die Zellteilung von Kardiomyozyten aktiviert, ist jedoch bisher nicht bekannt. In der vorliegenden Doktorarbeit wird das Zusammenspiel zwischen dem Hippo-Signalweg und dem MMB-Komplex im Herzen untersucht. Außerdem wird die Interaktion zwischen YAP und B-MYB biochemisch charakterisiert, um einen Inhibitor zu entwickeln, der die Aktivität von YAP vermindert. Die Ergebnisse dieser Doktorarbeit zeigen, dass der Verlust der zentralen Untereinheit des MMB-Komplexes, LIN9, in Vorläuferzellen der Kardiomyozyten zu einer Reduktion der Herzwand sowie zu einer niedrigeren Proliferationsrate von Herzmuskelzellen und einer erhöhten Embryonalsterblichkeit führt. Außerdem wurde in genetischen Experimenten mit Hippo- und LIN9-defizienten Mäusen gezeigt, dass der MMB-Komplex wichtig für die Aktivierung der Proliferation in Hippo-defizienten Kardiomyozyten ist. Eine globale Analyse der Transkription und Chromatinbindung von YAP und LIN9 im Herzen zeigte, dass eine Untergruppe von Zellzyklusgenen, die nach Inaktivierung des Hippo-Signalwegs vermehrt exprimiert werden, gleichzeitig den MMB-Komplex am Promoter gebunden haben. Durch Interaktionsstudien konnte gezeigt werden, dass YAP und B-MYB in embryonalen Kardiomyozyten miteinander interagieren. Die Bindung der beiden Transkriptionsfaktoren wurde durch Co-Immunpräzipitation, GST-Pulldown-Analysen und Peptid-Arrays biochemisch untersucht. Dabei wurde gezeigt, dass ein PY-Motiv im N-terminus von B-MYB direkt an die WW-Domänen von YAP bindet. Im Umkehrschluss wurde festgestellt, dass die WW-Domänen von YAP essenziell sind, um sowohl die Proliferation in Herzmuskelzellen als auch die Expression von Mitosegenen in differenzierten C2C12 Zellen zu aktivieren. Letztendlich wurden die Ergebnisse der Interaktionsstudie genutzt, um einen neuartigen kompetitiven Inhibitor von YAP zu entwickeln. Für MY-COMP (Myb-YAP Competition) wurde der Proteinabschnitt von B-MYB, der die YAP Bindedomäne enthält, mit einer Kernlokalisierungssequenz fusioniert. Bindestudien zeigten, dass MY-COMP die Interaktion zwischen YAP und B-MYB effektiv blockiert. Eine durch Adenoviren vermittelte Überexpression von MY-COMP in embryonalen Herzmuskelzellen resultierte in einer verminderten Anzahl von mitotischen Zellen. Somit wird durch Expression von MY-COMP, die proliferative Fähigkeit von YAP vermindert. Interessanterweise wurden in HeLa Zellen, die mit MY-COMP behandelt wurden, vermehrt Abnormalitäten der Zellkerne, polyploide Zellen sowie ein Wachstumsdefizit beobachtet. Zusammengefasst verdeutlichen die Ergebnisse dieser Doktorarbeit die Bedeutung des Zusammenspiels zwischen dem MMB-Komplex und dem Hippo-YAP-Signalweg für die Herzentwicklung und bilden die Grundlage, für die effektive Inhibierung der onkogenen Eigenschaften des Hippo-Coaktivators YAP. KW - Zellzyklus KW - Heart development KW - Hippo pathway KW - Myb-MuvB complex KW - Cardiomyocyte Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-213328 ER - TY - THES A1 - von Meyer, Katharina T1 - Molecular characterization of defensin-like proteins in the fertilization process of \(Nicotiana\) \(tabacum\) T1 - Molekulare Charakterisierung Defensin-ähnlicher Proteine beim Befruchtungsvorgang in \(Nicotiana\) \(tabacum\) N2 - Flowering plants or angiosperms have developed a fertilization mechanism that involves a female egg and central cell, as well as two male sperm cells. A male gametophyte carries the two non-mobile sperm cells, as they need to be delivered to the female gametophyte, the embryo sac. This transport is initiated by a pollen grain that is transmitted onto the stigma of the angiosperm flower. Here it hydrates, germinates, and forms a pollen tube, which navigates through the female plant tissue towards the ovary. The pollen tube grows into an ovule through the funiculus and into one of the two synergid cells. There, growth arrests and the pollen tube bursts, releasing the two sperm cells. One of the sperm cells fuses with the egg cell, giving rise to the embryo, the other one fuses with the central cell, developing into the endosperm, which nourishes the embryo during its development. After a successful fertilization, each ovule develops into a seed and a fruit is formed. This usually consists of several fertilized ovules. The directional growth of the pollen tube through the maternal tissues towards the ovule, as well as sperm cell release, requires a complex communication between the male and the female gametophyte to achieve reproductive success. Over the last years many studies have been performed, contributing to the understanding of cell-cell communication events between the two gametophytes, nevertheless still many aspects remain to be elucidated. This work focused on two topics: i.) Analysis of biological processes affected by pollination and fertilization in the Nicotiana tabacum flower and identification of cysteine rich proteins (CRPs) expressed via isolating and sequencing RNA from the tissue and analyzing the resulting data. ii.) Identification of the defensin-like protein (DEFL) responsible for pollen tube attraction towards the ovule in tobacco. First, tissue samples of pollen tubes and mature ovules were taken at different stages of the fertilization process (unpollinated ovules, after pollination, and after fertilization of the flower). RNA was then isolated and a transcriptome was created. The resulting reads were assembled and transcriptome data analysis was performed. Results showed that pollen tubes and mature ovules differ severely from each other, only sharing about 23 % of the transcripts, indicating that different biological processes are dominant in the two gametophytes. A MapMan analysis revealed that in the pollen tube the most relevant biological processes are related to the cell wall, signaling, and transport, which supports the fact that the pollen tube grows fast to reach the ovule. On the other hand, in the ovule the values of highest significance were obtained for processes related to protein synthesis and regulation. Upon comparing the transcripts in the ovule before and after pollination, as well as after fertilization, it showed that pollination of the flower causes a bigger alteration in the ovule on the transcriptomic level compared to the step from pollination to fertilization. A total of 953 CRPs were identified in Nicotiana tabacum, including 116 DEFLs. Among those, the peptide responsible for pollen tube attraction towards the ovule should be found. Based on in-silico analysis four candidate peptides were chosen for further analysis, two of which had increased expression levels upon pollination and fertilization and the other two displayed an opposite expression. Quantitative real time PCR experiments were performed for the candidates, confirming the in-silico data in vivo. The candidate transcripts were then expressed in a cell free system and applied to pollen tubes in order to test their effect on the growing cells. Positive controls were used, where pollen tubes grew towards freshly dissected ovules. The four candidates did not provoke a pollen tube attraction towards the peptide, leaving open the chance to work on the 112 remaining DEFLs in the future. N2 - Für den Befruchtungsvorgang von Blütenpflanzen, bzw. Angiospermen werden je eine weibliche Eizelle und Zentralzelle, sowie zwei männliche Spermazellen benötigt. Da diese Spermazellen immobil sind, werden diese zum weiblichen Gametophyten, dem Embryosack, transportiert. Dieser Vorgang wird eingeleitet, indem ein Pollenkorn auf die Narbe des Blütenstempels gelangt. Dort hydriert es, keimt aus und bildet einen Pollenschlauch aus, welcher sich mittels Richtungswachstum durch den Griffel zum Fruchtknoten der Pflanze hin ausdehnt. Der Pollenschlauch wächst daraufhin durch den Funikulus zu den Samenanlagen hin, in eine der beiden Synergiden hinein, wo das Zellwachstum eingestellt wird. Der Pollenschlauch platzt und die zwei Spermazellen werden freigegeben. Eine dieser Spermazellen verschmilzt mit der Eizelle, woraus ein Embryo entsteht, während die andere Spermazelle mit der Zentralzelle verschmilzt, die sich zum Endosperm entwickelt und den Embryo während seiner Entwicklung mit Nährstoffen versorgt. Nach einer erfolgreichen Befruchtung bildet sich aus jeder Eizelle ein Samen aus, in der Regel bilden mehrere befruchtete Eizellen dann einen Fruchtkörper. Eine erfolgreiche Fortpflanzung erfordert eine hochkomplexe Kommunikation zwischen männlichem und weiblichem Gametophyten, die sowohl beim Richtungswachstum des Pollenschlauchs durch das weibliche Pflanzengewebe hin zu den Samenanlagen eine essentielle Rolle spielt, als auch bei der Freisetzung der Spermazellen. Während der letzten Jahre wurden viele Studien durchgeführt, die zum Verstehen dieser Zell-Zell Kommunikation beigetragen haben, dennoch gibt es einige unbekannte Aspekte, die noch zu untersuchen sind. Diese Arbeit konzentriert sich auf zwei Themen: i.) Die Analyse der biologischen Prozesse, die von der Bestäubung und Befruchtung der Blüte in Nicotiana tabacum beeinflusst werden, sowie die Identifizierung von cysteinreichen Proteinen (CRPs), die während dieses Prozesses exprimiert werden. Hierfür wurde RNA aus dem Gewebe isoliert, sequenziert und die resultierenden Daten analysiert. ii.) Die Identifizierung des Defensin-ähnliche Proteins (DEFL), welches für das Anlocken des Pollenschlauchs zu den Samenanlagen hin in Tabak verantwortlich ist. Zunächst wurden Gewebeproben von Pollenschläuchen, sowie von reifen Samenanlagen in verschiedenen Stadien der Befruchtung entnommen (unbestäubte Samenanlagen, nach der Bestäubung und nach Befruchtung der Blüte). Von diesen Geweben wurde im Anschluss die RNA isoliert und ein Transkriptom erstellt. Die erhaltenen Sequenzfragmente wurden zusammengesetzt und die resultierenden Daten analysiert. Die Ergebnisse zeigten, dass sich Pollenschläuche und Samenanlagen stark voneinander unterscheiden; nur 23 % der Transkripte wurden in beiden Geweben gefunden. Eine Untersuchung mit MapMan hat gezeigt, dass die relevantesten biologischen Prozesse im Pollenschlauch mit Zellwand, Signalwegen und Transportvorgängen assoziiert sind. Diese Ergebnisse unterstützen die These, dass der Pollenschlauch schnell wachsen muss, um die Spermazellen zu den Samenanlagen zu transportieren. In den Samenanlagen haben hingegen die Prozesse den höchsten Signifikanzwert, welche mit Proteinsynthese und –regulation zusammenhängen. Wenn man die Transkripte in den Samenanlagen vor der Bestäubung, nach der Bestäubung, sowie nach der Befruchtung betrachtet, stellt man fest, dass die Bestäubung mit einer größeren Veränderung auf Transkriptomlevel einhergeht als der Schritt zwischen Bestäubung und Befruchtung. Es konnten insgesamt 953 CRPs in Nicotiana tabacum identifiziert werden, wovon 116 DEFLs sind. Es sollte herausgefunden werden, welches dieser DEFLs für das Anlocken des Pollenschlauchs zu den Samenanlagen hin verantwortlich ist. Auf Basis von in-silico Analysen wurden vier Kandidatentranskripte ausgewählt, die näher untersucht wurden; bei zweien davon wurde ein ansteigendes Expressionsniveau bei Bestäubung und Befruchtung festgestellt; die anderen beiden Kandidaten zeigten ein gegensätzliches Expressionsmuster. Mittels quantitativer real-time PCR konnten die in-silico Daten in-vivo bestätigt werden. In einem zell-freien System wurden die Kandidatentranskripte exprimiert und auf Pollenschläuche gegeben, um ihren Effekt auf die wachsenden Zellen zu beobachten. Als Positivkontrollen wurden frisch präparierte Samenanlagen verwendet. Keines der vier Kandidatenproteine hat ein Anlocken der Pollenschläuche bewirkt, sodass noch die 112 verbleibenden DEFLs zur weiteren Untersuchung bereitstehen. KW - Samenpflanzen KW - Fortpflanzung KW - Plant fertilization KW - Fortpflanzungsmechanismen KW - Blütenpflanzen Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-192141 ER - TY - THES A1 - Becker, Isabelle Carlotta T1 - The role of megakaryocytes and platelets in vascular and osteogenic development T1 - Die Rolle von Megakaryozyten und Thrombozyten in vaskulärer und osteogener Entwicklung N2 - Platelets, small anucleate cell fragments in the blood stream, derive from large precursor cells, so-called megakaryocytes (MK) residing in the bone marrow (BM). In addition to their role in wound healing, platelets have been shown to play a significant role during inflammatory bleeding. Above all, the immunoreceptor tyrosine-based activation motif (ITAM) receptors GPVI as well as CLEC-2 have been identified as main regulators of vascular integrity. In addition to ITAM-bearing receptors, our group identified GPV as another potent regulator of hemostasis and thrombosis. Surprisingly, concomitant lack of GPV and CLEC-2 deteriorated blood-lymphatic misconnections observed in Clec2-/- mice resulting in severe edema formation and intestinal inflammation. Analysis of lymphatic and vascular development in embryonic mesenteries revealed severely defective blood-lymph-vessel separation, which translated into thrombocytopenia and increased vascular permeability due to reduced tight junction density in mesenteric blood vessels and consequent leakage of blood into the peritoneal cavity. Recently, platelet granule release has been proposed to ameliorate the progression of retinopathy of prematurity (ROP), a fatal disease in newborns leading to retinal degradation. The mechanisms governing platelet activation in this process remained elusive nonetheless, which prompted us to investigate a possible role of ITAM signaling. In the second part of this thesis, granule release during ROP was shown to be GPVI- and partly CLEC-2-triggered since blockade or loss of these receptors markedly deteriorated ROP progression. Proplatelet formation from MKs is highly dependent on a functional microtubule and actin cytoskeleton, the latter of which is regulated by several actin-monomer binding proteins including Cofilin1 and Twinfilin1 that have been associated with actin-severing at pointed ends. In the present study, a redundancy between both proteins especially important for the guided release of proplatelets into the bloodstream was identified, since deficiency in both proteins markedly impaired MK functionality mainly due to altered actin-microtubule crosstalk. Besides ITAM-triggered activation, platelets and MKs are dependent on inhibitory receptors, which prevent overshooting activation. We here identified macrothrombocytopenic mice with a mutation within Mpig6b encoding the ITIM-bearing receptor G6b-B. G6b-B-mutant mice developed a severe myelofibrosis associated with sex-specific bone remodeling defects resulting in osteosclerosis and -porosis in female mice. Moreover, G6b-B was shown to be indispensable for MK maturation as verified by a significant reduction in MK-specific gene expression in G6b-B-mutant MKs due to reduced GATA-1 activity. N2 - Blutplättchen, die kleinsten Zellen des hämatopoetischen Systems, werden von großen Vorläuferzellen, den Megakaryozyten (MKs), im Knochenmark gebildet. Neben ihrer Rolle bei der Blutstillung und Wundheilung sind Thrombozyten außerdem maßgeblich daran beteiligt, Blutungen in Entzündungsprozessen zu verhindern. Insbesondere den immuno- receptor tyrosine-based activation motif (ITAM) Rezeptoren GPVI und CLEC-2 wird eine tragende Rolle in der Aufrechterhaltung der vaskulären Integrität zugeschrieben. Neben den ITAM-Rezeptoren konnten wir auch für den Thrombozytenrezeptor GPV eine Funktion in Hämostase und Thrombose identifizieren. Erstaunlicherweise führte ein gleichzeitiger Verlust von GPV und CLEC-2 zu einer dramatischen Verstärkung der Blut- Lymphgefäß-Fehlbildungen, die bereits in CLEC-2-defizienten Mäusen beschrieben wurde, sodass die Tiere eine starke Ödembildung in den Extremitäten sowie Entzündungen des Dünndarms aufwiesen. Eine vertiefte Analyse der vaskulären Strukturen in Mesenterien während der Embryonalentwicklung offenbarte zusätzliche Defekte in der Blut- und Lymphgefäßtrennung in CLEC-2/GPV-defizienten Mäusen. Diese Deformationen führten zu Thrombozytopenie, Anämie und einer erhöhten vaskulären Permeabilität in adulten Mäusen, was sich auf eine reduzierte tight-junction-Dichte in Mesenterien und Darmgewebe zurückführen ließ, die zu einem Austritt von Blut in die Peritonealhöhle führte. In einer kürzlich veröffentlichten Publikation wurde Plättchengranula eine Rolle in der Auflösung retinopathischer Gefäßmissbildungen zugeschrieben. Retinopathia praema- turorum (ROP) ist eine Krankheit in Frühgeborenen, die aufgrund von Sauerstoffunter- schieden vor und nach Geburt zu Netzhautablösung und Blindheit führen kann. Die exakten Mechanismen, die hierbei zu Thrombozytenaktivierung und nachfolgender Degranulierung beitragen, sind bisher allerdings nicht bekannt. Da eine tragende Rolle von ITAM Rezeptoren in der Aufrechterhaltung vaskulärer Integrität insbesondere in krankhaftem Gewebe zuvor bereits aufgezeigt wurde, untersuchten wir die Entwicklung von Vaso-obliteration und Neovaskularisierung in CLEC-2 und GPVI-depletierten oder defizienten Mäusen und konnten einen Beitrag beider Rezeptoren zur Progression von ROP nachweisen. Die Produktion von Thrombozyten aus MKs ist stark von einem funktionalen Mikrotubuli- und Aktin-Zytoskelett abhängig. Aktinpolymerisation wird substanziell von unterschiedlichen Aktin-bindenden Proteinen reguliert, von denen Cofilin1 und Twinflin1 ein Abtrennen der Filamente induzieren. Wir konnten nun eine funktionale Redundanz beider Proteine in murinen MKs aufzeigen, die insbesondere für ein geregeltes Abschnüren von Thrombozyten in die Blutbahn essentiell ist und von einem Crosstalk zwischen Aktin- und Mikrotubuli- Zytoskeletts abhängig ist, der durch Twinfilin1 und Cofilin1 aufrechterhalten wird. Neben ITAM-induzierter Thrombozytenaktivierung spielt auch die Inhibition derselbigen durch immunoreceptor tyrosine-based inhibition motif (ITIM)-Rezeptoren eine große Rolle in MKs und Plättchen, da diese eine überschießende Aktivierung verhindern. Wir konnten in der vorliegenden Arbeit eine Spontanmutation in Mpig6b, das für den ITIM-Rezeptor G6b-B codiert, in stark makrothrombozytopenen, wildtypischen Mäusen identifizieren. Außer in der stark reduzierten Thrombozytenzahl manifestierte sich die Mutation des Weiteren in einer massiven Myelofibrose, die mit einer geschlechtsspezifischen Osteosklerose und -porose in weiblichen Mäusen einherging. Überraschenderweise konnten wir zudem einen dramatischen Reifungsblock in G6b-B-mutierten MKs feststellen, der insbesondere in einer reduzierten Expression des Transkriptionsfaktors GATA-1 begründet lag. KW - Megakaryozyt KW - Thrombozyt KW - Megakaryocyte KW - platelets KW - bone marrow KW - hematopoiesis Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-210241 ER - TY - THES A1 - Weigand, Isabel T1 - Consequences of Protein Kinase A mutations in adrenocortical cells and tumours T1 - Auswirkungen von Proteinkinase A Mutationen in Zellen und Tumoren der Nebenniere N2 - Adrenal Cushing’s Syndrome (CS) is a rare but life-threatening disease and therefore it is of great importance to understand the pathogenesis leading to adrenal CS. It is well accepted that Protein Kinase A (PKA) signalling mediates steroid secretion in adrenocortical cells. PKA is an inactive heterotetramer, consisting of two catalytic and two regulatory subunits. Upon cAMP binding to the regulatory subunits, the catalytic subunits are released and are able to phosphorylate their target proteins. Recently, activating somatic mutations affecting the catalytic subunit a of PKA have been identified in a sub-population of cortisol-producing adenomas (CPAs) associated with overt CS. Interestingly, the PKA regulatory subunit IIb has long been known to have significantly lower protein levels in a sub-group of CPAs compared to other adrenocortical tumours. Yet, it is unknown, why these CPAs lack the regulatory subunit IIb, neither are any functional consequences nor are the underlying regulation mechanisms leading to reduced RIIb levels known. The results obtained in this thesis show a clear connection between Ca mutations and reduced RIIb protein levels in CPAs but not in other adrenocortical tumours. Furthermore, a specific pattern of PKA subunit expression in the different zones of the normal adrenal gland is demonstrated. In addition, a Ca L206R mutation-mediated degradation of RIIb was observed in adrenocortical cells in vitro. RIIb degradation was found to be mediated by caspases and by performing mutagenesis experiments of the regulatory subunits IIb and Ia, S114 phosphorylation of RIIb was identified to make RIIb susceptible for degradation. LC-MS/MS revealed RIIb interaction partners to differ in the presence of either Ca WT and Ca L206R. These newly identified interaction partners are possibly involved in targeting RIIb to subcellular compartments or bringing it into spatial proximity of degrading enzymes. Furthermore, reducing RIIb protein levels in an in vitro system were shown to correlate with increased cortisol secretion also in the absence of PRKACA mutations. The inhibiting role of RIIb in cortisol secretion demonstrates a new function of this regulatory PKA subunit, improving the understanding of the complex regulation of PKA as key regulator in many cells. N2 - Das adrenale Cushing Syndrom, ausgelöst durch ein Kortisol-sekretierendes Nebennierenadenom (CPA), ist eine potentiell letale Erkrankung mit einer geringen Inzidenz. Schon lange ist bekannt, dass der Proteinkinase A (PKA)-Signalweg maßgeblich die Sekretion von Steroidhormonen in der Nebenniere reguliert. In ihrer inaktiven Form ist die PKA ein Heterotetramer aus zwei katalytischen und zwei regulatorischen Untereinheiten, welches über die Bindung des second messengers cAMP und die daraus resultierende Konformationsänderung aktiviert wird. Kürzlich wurden in etwa 40 % der CPAs, somatische Mutationen in der katalytischen Untereinheit a (Ca) der PKA identifiziert. Diese Mutation verhindert die Bindung der regulatorischen Untereinheiten, was zu einer konstitutiven Aktivierung des PKA-Signalwegs führt. Unabhängig davon war bereits einige Jahre zuvor erkannt worden, dass in einem Teil der CPAs die regulatorische Untereinheit IIb (RIIb) der PKA in geringerem Maße exprimiert wird. Ein Zusammenhang zwischen dieser verringerten Proteinmenge an RIIb und den Mutationen in Ca war bisher nicht bekannt. In dieser Dissertation konnte gezeigt werden, dass zwischen den Mutationen in Ca und der verringerten Proteinmenge von RIIb in CPAs, jedoch nicht in anderen Tumorentitäten der Nebenniere, ein klarer Zusammenhang besteht. Darüber hinaus wurde gezeigt, dass auch die Zonen der normalen Nebenniere ein spezifisches Muster der Proteinkinase A Untereinheiten exprimieren. Zusätzlich konnten in in vitro Versuchen Caspasen identifiziert werden, die maßgeblich am Abbau von RIIb beteiligt sind. Durch Mutagenese-Experimente und den Austausch der Inhibitory-Sequenzen der regulatorischen Untereinheiten RIa und RIIb, konnte die Phosphorylierung von Ser114 an RIIb als essentiell für den Abbau identifiziert werden. Darüber hinaus wurden mittels LC-MS/MS neue RIIb Interaktionspartner in Zellen der Nebennierenrinde identifiziert, die sich in der An-oder Abwesenheit der Ca L206R Mutante unterscheiden. Ferner konnte für RIIb eine inhibierende Rolle, speziell in der Kortisol-Sekretion von Nebennierenrindenzellen, gezeigt werden. Dies stellt eine bislang unbekannte Funktion von RIIb dar, die das Verständnis der komplexen Regulierung von PKA als Schlüsselregulator in vielen Zellen verbessert. KW - Cushing-Syndrom KW - protein kinase a KW - cushing's syndrome KW - tumour KW - signalling KW - adrenal gland Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-160646 ER - TY - THES A1 - Thomas, Sarah Katharina T1 - Design of novel IL-4 antagonists employing site-specific chemical and biosynthetic glycosylation T1 - Herstellung neuer IL-4 basierter Antagonisten durch zielgerichtete chemische und biosynthetische Glykosylierung N2 - The cytokines interleukin 4 (IL-4) and IL-13 are important mediators in the humoral immune response and play a crucial role in the pathogenesis of chronic inflammatory diseases, such as asthma, allergies, and atopic dermatitis. Hence, IL-4 and IL-13 are key targets for treatment of such atopic diseases. For cell signalling IL-4 can use two transmembrane receptor assemblies, the type I receptor consisting of receptors IL-4R and γc, and type II receptor consisting of receptors IL-4R and IL-13R1. The type II receptor is also the functional receptor of IL-13, receptor sharing being the molecular basis for the partially overlapping effects of IL-4 and IL-13. Since both cytokines require the IL-4R receptor for signal transduction, this allows the dual inhibition of both IL-4 and IL-13 by specifically blocking the receptor IL-4R. This study describes the design and synthesis of novel antagonistic variants of human IL-4. Chemical modification was used to target positions localized in IL-4 binding sites for γc and IL-13R1 but outside of the binding epitope for IL-4R. In contrast to existing studies, which used synthetic chemical compounds like polyethylene glycol for modification of IL-4, we employed glycan molecules as a natural alternative. Since glycosylation can improve important pharmacological parameters of protein therapeutics, such as immunogenicity and serum half-life, the introduced glycan molecules thus would not only confer a steric hindrance based inhibitory effect but simultaneously might improve the pharmacokinetic profile of the IL-4 antagonist. For chemical conjugation of glycan molecules, IL-4 variants containing additional cysteine residues were produced employing prokaryotic, as well as eukaryotic expression systems. The thiol-groups of the engineered cysteines thereby allow highly specific modification. Different strategies were developed enabling site-directed coupling of amine- or thiol- functionalized monosaccharides to introduced cysteine residues in IL-4. A linker-based coupling procedure and an approach requiring phenylselenyl bromide activation of IL-4 thiol-groups were hampered by several drawbacks, limiting their feasibility. Surprisingly, a third strategy, which involved refolding of IL-4 cysteine variants in the presence of thiol- glycans, readily allowed synthesis of IL-4 glycoconjugates in form of mixed disulphides in milligram amount. This approach, therefore, has the potential for large-scale synthesis of IL-4 antagonists with highly defined glycosylation. Obtaining a homogenous glycoconjugate with exactly defined glycan pattern would allow using the attached glycan structures for fine-tuning of pharmacokinetic properties of the IL-4 antagonist, such as absorption and metabolic stability. The IL-4 glycoconjugates generated in this work proved to be highly effective antagonists inhibiting IL-4 and/or IL-13 dependent responses in cell-based experiments and in in vitro binding studies. Glycoengineered IL-4 antagonists thus present valuable alternatives to IL-4 inhibitors used for treatment of atopic diseases such as the neutralizing anti-IL-4R antibody Dupilumab. N2 - Die Zytokine Interleukin-4 (IL-4) und IL-13 sind zentrale Mediatoren in der humoralen Immunantwort und sind wesentlich an der Entstehung chronisch inflammatorischer Erkrankungen, wie Asthma, Allergien und atopischer Dermatitis beteiligt. Daher werden IL- 4 und IL-13 als wichtige therapeutische Angriffspunkte für die Behandlung atopischer Erkrankungen betrachtet. Zur Signaltransduktion aktiviert IL-4 zwei heterodimere Rezeptorkomplexe, den Typ I Rezeptor bestehend aus den Untereinheiten IL-4R und γc und den Typ II Rezeptor, der sich aus IL-4R und IL-13R1 zusammensetzt. Der Typ II Rezeptor wird auch von IL-13 zur Signalweiterleitung genutzt, wodurch sich die teilweise überschneidenden Funktionen der beiden Zytokine erklären lassen. Die überlappende Rezeptornutzung erlaubt es durch eine gezielte Blockade des IL-4R-Rezeptors sowohl IL-4, als auch IL-13 gleichzeitig zu inhibieren. Ziel dieser Arbeit war die Herstellung neuartiger IL-4 basierter Antagonisten. Dazu wurden ausgewählte Positionen innerhalb der IL-4 Bindestelle für γc and IL-13R1, jedoch außerhalb des Bindeepitops für IL-4R gezielt chemisch modifiziert. Im Gegensatz zu bereits existierenden Studien, die synthetische Gruppen wie Polyethylenglykol (PEG) zur chemischen Modifizierung von IL-4 nutzten, wurden in dieser Arbeit Glykane als natürliche Alternative zu PEG an IL-4 gekoppelt. Da sich Glykosylierung auf wichtige pharmakologische Eigenschaften proteinbasierter Therapeutika, wie Immunogenität oder Serum Halbwertszeit, positiv auswirken kann, würde der Zucker in dieser Strategie nicht nur den auf sterischer Hinderung basierenden inhibitorischen Effekt vermitteln, sondern könnte gleichzeitig zu einer Optimierung der pharmakologischen Eigenschaften des IL-4 Inhibitors beitragen. Zur chemischen Zucker-Kopplung wurden zusätzliche Cystein-Reste in IL-4 eingebracht, deren freie Thiol-gruppen eine hochspezifische Modifizierung der IL-4 Mutanten erlauben. Die IL-4 Cystein-Mutanten wurden rekombinant in prokaryotischen und eukaryotischen Expressionssystemen hergestellt. Anschließend wurden verschiedene Strategien entwickelt, die eine ortsspezifische Kopplung Amin- und Thiol-haltiger Zucker an die eingebrachten Cystein-Reste in IL-4 ermöglichen. Eine Linker-basierte Reaktion, sowie ein Kopplungsansatz, der eine Aktivierung der Thiol-Gruppe mittels Bromselenobenzol erforderte, wiesen einige Nachteile auf, die eine erhebliche Einschränkung ihrer technischen Durchführbarkeit zur Folge hatte. Eine dritte Strategie hingegen, die eine Rückfaltung derIL-4 Cystein-Mutanten in Anwesenheit von Thiol-Glykanen involvierte, erlaubte eine effiziente Herstellung von IL-4 Glykokonjugaten in Form gemischter Disulfide im Milligrammbereich. Dieser Ansatz könnte somit zur Produktion homogen glykosylierter IL-4 Antagonisten im Großmaßstab eingesetzt werden. Die Herstellung homogener Glykokonjugate mit klar definierten Glykosylierungsmuster würde es erlauben über die gekoppelten Glykanstrukturen die pharmakologischen Eigenschaften von IL-4, wie Absorption und metabolische Stabilität, gezielt zu modulieren. Die hergestellten IL-4 Glykokonjugate erwiesen sich als hochwirksame Antagonisten, die die Aktivität von IL-4 und IL-13 in zellbasierten Experimenten inhibieren konnten. Glykosylierte IL-4 Antagonisten stellen somit eine vergleichbare Alternative zu gängigen IL-4 Inhibitoren dar, die zur Behandlung von atopischen Erkrankungen eingesetzt werden, wie beispielweise der neutralisierende anti-IL-4R Antikörper Dupilumab. KW - Glykosylierung KW - Modifizierung KW - Interleukin KW - Inhibitor KW - Entzündung KW - Glykomodifizierung KW - Interleukin-4 Antagonist KW - TH2 Immunantwort KW - Proteinmodifizierung KW - Rezeptorblocker Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-175172 ER - TY - THES A1 - Rüdenauer, Fabian T1 - Nutrition facts of pollen: nutritional quality and how it affects reception and perception in bees T1 - Nährwertinformationen von Pollen: Nährstoffzusammensetzung und wie diese sich auf Rezeption und Perzeption von Bienen auswirkt N2 - Nutrients belong to the key elements enabling life and influencing an organism’s fitness. The intake of nutrients in the right amounts and ratios can increase fitness; strong deviations from the optimal intake target can decrease fitness. Hence, the ability to assess the nutritional profile of food would benefit animals. To achieve this, they need the according nutrient receptors, the ability to interpret the receptor information via perceptive mechanisms, and the ability to adjust their foraging behavior accordingly. Additionally, eventually existing correlations between the nutrient groups and single nutrient compounds in food could help them to achieve this adjustment. A prominent interaction between food and consumer is the interaction between flowering plants (angiosperms) and animal pollinators. Usually both of the interacting partners benefit from this mutualistic interaction. Plants are pollinated while pollinators get a (most of the times) nutritional reward in form of nectar and/or pollen. As similar interactions between plants and animals seem to have existed even before the emergence of angiosperms, these interactions between insects and angiosperms very likely have co-evolved right from their evolutionary origin. Therefore, insect pollinators with the ability to assess the nutritional profile may have shaped the nutritional profile of plant species depending on them for their reproduction via selection pressure. In Chapter I of this thesis the pollen nutritional profile of many plant species was analyzed in the context of their phylogeny and their dependence on insect pollinators. In addition, correlations between the nutrients were investigated. While the impact of phylogeny on the pollen protein content was little, the mutual outcome of both of the studies included in this chapter is that protein content of pollen is mostly influenced by the plant’s dependence on insect pollinators. Several correlations found between nutrients within and between the nutrient groups could additionally help the pollinators to assess the nutrient profile of pollen. An important prerequisite for this assessment would be that the pollinators are able to differentiate between pollen of different plant species. Therefore, in Chapter II it was investigated whether bees have this ability. Specifically, it was investigated whether honeybees are able to differentiate between pollen of two different, but closely related plant species and whether bumblebees prefer one out of three pollen mixes, when they were fed with only one of them as larvae. Honeybees indeed were able to differentiate between the pollen species and bumblebees preferred one of the pollen mixes to the pollen mix they were fed as larvae, possibly due to its nutritional content. Therefore, the basis for pollen nutrient assessment is given in bees. However, there also was a slight preference for the pollen fed as larvae compared to another non-preferred pollen mix, at least hinting at the retention of larval memory in adult bumblebees. Chapter III looks into nutrient perception of bumblebees more in detail. Here it was shown that they are principally able to perceive amino acids and differentiate between them as well as different concentrations of the same amino acid. However, they do not seem to be able to assess the amino acid content in pollen or do not focus on it, but instead seem to focus on fatty acids, for which they could not only perceive concentration differences, but also were able to differentiate between. These findings were supported by feeding experiments in which the bumblebees did not prefer any of the pollen diets containing less or more amino acids but preferred pollen with less fatty acids. In no choice feeding experiments, bumblebees receiving a diet with high fatty acid content accepted undereating other nutrients instead of overeating fat, leading to increased mortality and the inability to reproduce. Hence, the importance of fat in pollen needs to be looked into further. In conclusion, this thesis shows that the co-evolution of flowering plants and pollinating insects could be even more pronounced than thought before. Insects do not only pressure the plants to produce high quality nectar, but also pressure those plants depending on insect pollination to produce high quality pollen. The reason could be the insects’ ability to receive and perceive certain nutrients, which enables them to forage selectively leading to a higher reproductive success of plants with a pollinator-suitable nutritional pollen profile. N2 - Nährstoffe gehören zu den zentralen Elementen, die das Leben an sich ermöglichen und die Fitness eines Organismus beeinflussen können. Nährstoffaufnahme in den richtigen Mengen und Verhältnissen kann die Fitness verbessern, starke Abweichungen von der optimalen Aufnahme können sie verschlechtern. Deshalb könnten Tiere von der Fähigkeit profitieren das Nährstoffprofil von Nahrung bewerten zu können. Dafür benötigten sie jedoch die passenden Nährstoffrezeptoren, die Fähigkeit die Rezeptorinformationen durch perzeptive Mechanismen zu interpretieren und ihr Sammelverhalten daran anzupassen. Eine zusätzliche Hilfe dabei könnten Korrelationen zwischen sowohl den Nährstoffgruppen als auch einzelnen Nährstoffen bieten. Eine bekannte Interaktion zwischen Nahrung und Konsument ist die zwischen Blühpflanzen (Angiospermen) und tierischen Bestäubern. Normalerweise profitieren beide Interaktionspartner von dieser mutualistischen Interaktion. Pflanzen werden bestäubt, während die Bestäuber eine (zumeist) nahrhafte Belohnung in Form von Nektar und/oder Pollen erhalten. Da ähnliche Interaktionen zwischen Pflanzen und Tieren vermutlich schon vor dem Auftreten der Angiospermen existierten, könnte sich diese Interaktion, im Speziellen mit Insekten, direkt vom evolutiven Startpunkt der Angiospermen aus koevolviert haben. Deshalb ist es möglich, dass Bestäuber mit der Fähigkeit das Nährstoffprofil von Pollen bewerten zu können, dieses bei von ihnen abhängigen Pflanzen durch Selektionsdruck formen konnten. Im Kapitel I dieser Thesis wurde das Nährstoffprofil von Pollen vieler Pflanzenarten im Kontext ihrer Phylogenie und ihrer Abhängigkeit von Insekten als Bestäubern analysiert. Außerdem wurden Korrelationen zwischen den Nährstoffen untersucht. Während die Phylogenie nur einen geringen Einfluss auf den Proteingehalt von Pollen haben könnte, ist der gemeinsame Nenner der beiden Studien in diesem Kapitel, dass der Proteingehalt des Pollens hauptsächlich von der Abhängigkeit der Pflanzen von Bestäubern bestimmt wird. Es wurden zudem einige Korrelationen sowohl in als auch zwischen den Nährstoffgruppen gefunden, die den Bestäubern helfen könnten das Nährstoffprofil von Pollen bewerten zu können. Eine wichtige Grundvoraussetzung für diese Bewertung wäre, dass die Bestäuber überhaupt dazu in der Lage sind zwischen Pollen von unterschiedlichen Pflanzenarten zu unterscheiden. Dies wird in Kapitel II behandelt, in dem untersucht wurde ob Honigbienen in der Lage sind zwischen Pollen zweier nah verwandter Pflanzenarten zu unterscheiden und ob Hummeln eine von drei Pollenmischungen bevorzugen, wenn sie nur mit einer davon als Larve in Kontakt kamen. Honigbienen war es tatsächlich möglich zwischen den Pollenarten zu unterscheiden und Hummeln bevorzugten eine bestimmte Pollenmischung gegenüber der, die sie als Larve erhalten hatten, möglicherweise aufgrund eines vorteilhaften Nährstoffprofils. Die Grundlage zur Nährstoffbewertung scheint bei Bienen also gegeben zu sein. Allerdings hatten die Hummeln auch eine leichte Präferenz für die Pollenmischung, die sie als Larve erhalten hatten gegenüber der dritten, nicht bevorzugten Pollenmischung, was zumindest darauf hindeuten könnte, dass Larvenerinnerungen bei erwachsenen Hummeln erhalten bleiben könnten. Kapitel III beschäftigt sich tiefergehend mit der Nährstoffwahrnehmung von Hummeln. Es wurde gezeigt, dass diese prinzipiell befähigt sind Aminosäuren wahrzunehmen als auch zwischen ihnen und verschiedenen Konzentrationen der gleichen Aminosäure zu unterscheiden. Allerdings scheinen sie entweder nicht in der Lage zu sein oder sich zumindest nicht darauf zu fokussieren den Aminosäuregehalt von Pollen zu bewerten, sondern sich eher auf Fettsäuren zu konzentrieren. Von diesen konnten sie nicht nur Konzentrationsunterschiede feststellen, sondern auch zwischen verschiedenen Fettsäuren im Pollen unterscheiden. Diese Ergebnisse wurden von denen in Fütterungsexperimenten gestützt, in denen die Hummeln gleiche Mengen von Pollen mit mehr oder weniger Aminosäuren aufnahmen, aber Pollen mit weniger Fettsäuren bevorzugten. In Experimenten, in denen die Hummeln keine Wahl hatten, nahmen die Hummeln mit einer Diät, die eine hohe Fettsäurekonzentration hatte, lieber in Kauf, dass sie zu wenig von den anderen Nährstoffen aufnahmen, als zu viel Fett, was zu einer erhöhten Mortalitätsrate und der Unfähigkeit sich zu reproduzieren führte. Deshalb sollten zukünftige Studien sich eingehender mit dem Fettsäuregehalt von Pollen beschäftigen. Zusammenfassend zeigt diese Thesis, dass die Koevolution von Pflanzen und bestäubenden Insekten ausgeprägter sein könnte, als bisher angenommen. Insekten setzen die Pflanzen nicht nur unter Druck qualitativ hochwertigen Nektar zu produzieren, sondern setzen vor allem auch die Pflanzen unter Druck, die von ihrer Bestäubung abhängig sind, qualitativ hochwertigen Pollen zu produzieren. Der Grund dafür könnte die Fähigkeit der Insekten sein, bestimmte Nährstoffe zu rezipieren und perzipieren und dann ihr Sammelverhalten so anzupassen, dass Pflanzen mit einem passenden Nährstoffprofil einen höheren Reproduktionserfolg haben. KW - Pollen KW - bumblebee*s KW - nutrients KW - nutrition KW - pollen KW - reception KW - perception KW - proboscis extension response KW - honeybee*s Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-212548 ER - TY - THES A1 - Krimmer, Elena T1 - Agri-environment schemes and ecosystem services: The influence of different sown flower field characteristics on pollination, natural pest control and crop yield T1 - Agrarumweltmaßnahmen und Ökosystemdienstleistungen: der Einfluss unterschiedlicher Blühflächen Merkmale auf Bestäubung, natürliche Schädlingskontrolle und Erträge N2 - Insects are responsible for the major part of the ecosystem services pollination and natural pest control. If insects decline, these ecosystem services can not longer be reliably delivered. Agricultural intensification and the subsequent loss and fragmentation of habitats has among others been identified to cause insect decline. Ecological intensification aims to promote alternative and sustainable management practices in agricultural farming, for example to decrease the use of external inputs such as pesticides. Agri-environment schemes make amends for farmers if they integrate ecologically beneficial measures into their farming regime and can therefore promote ecological intensification. There is a wide variety of agri-environment schemes, but the implementation of sown flower fields on crop fields is often included. Flower fields offer foraging resources as well as nesting sites for many different insect species and should be able to support insect populations as well as to increase ecosystem services to adjacent fields. However, the potential of flower fields to exhibit these effects is depending on many factors. Among others, the age and size of the flower field can influence if and how different insects profit from the measure. Additionally, the complexity of the surrounding landscape and therefore the existing biodiversity is influencing the potential of flower fields to increase ecosystem services locally. The goal of this study is to disentangle to which degree these factors influence the ecosystem services pollination and natural pest control and if these factors interact with each other. Furthermore, it will be examined if and how flower fields and ecosystem services influence crop yield. Additional factors examined in this study are distance decay and pesticide use. The abundance of beneficial insects can decrease strongly with increasing distance to suitable habitats. Pesticide use in turn could abrogate positive effects of flower fields on beneficial insects. To examine these different aspects and to be able to make recommendations for flower field implementation, field experiments were conducted on differently composed sown flower fields and adjacent oilseed rape fields. Flower fields differed in their age and continuity as well as in their size. Additionally, flower and oilseed rape fields were chosen in landscapes with different amounts of semi-natural habitat. Oilseed rape fields adjacent to calcareous grasslands and conventional crop fields served as controls. Pollinator observations and pollen beetle and parasitism surveys were conducted in the oilseed rape fields. Additionally, different yield parameters of the oilseed rape plants were recorded. Observations were conducted and samples taken in increasing distance to the flower fields to examine distance decay functions. Spray windows were established to inspect the influence of pesticides on ecosystem services and crop yields. Linear mixed models were used for statistical analysis. The results show, that newly established flower fields with high amounts of flower cover are very attractive for pollinators. If the flower fields reached a certain size (> 1.5ha), the pollinators tended to stay in these fields and did not distribute into the surroundings. High amounts of semi-natural habitat in the surrounding landscape increased the value of small flower fields as starting points for pollinators and their subsequent spillover into crop fields. Additionally, high amounts of semi-natural habitat decreased the decay of pollinators with increasing distance to the flower fields. Based on these results, it can be recommended to establish many small flower fields in landscapes with high amounts of semi-natural habitat and large flower fields in landscapes with low amounts of semi-natural habitat. However, it is mentionable that flower fields are no substitute for perennial semi-natural habitats. These still must be actively conserved to increase pollination to crop fields. Furthermore, the lowest amount of pollen beetle infestation was found on oilseed rape fields adjacent to continuous flower fields aged older than 6 years. Flower fields and calcareous grasslands in general increased pollen beetle parasitism in adjacent oilseed rape fields compared to conventional crop fields. The threshold for effective natural pest control could only be reached in the pesticide free areas in the oilseed rape fields adjacent to continuous flower fields and calcareous grasslands. Parasitism and superparasitism declined with increasing distance to the adjacent fields in pesticide treated areas of the oilseed rape fields. However, they remained on a similar level in spray windows without pesticides. Large flower fields increased parasitism and superparasitism more than small flower fields. Flower fields generally have the potential to increase pollen beetle parasitism rates, but pesticides can abrogate these positive effects of flower fields on natural pest control. Last but not least, effects of flower fields and ecosystem services on oilseed rape yield were examined. No positive effects of pollination on oilseed rape yield could be found. Old and continuous flower fields increased natural pest control in oilseed rape fields, which in turn increased seed set and total seed weight of oilseed rape plants. The pesticide treatment had negative effects on natural pest control, but positive effects on crop yield. Pollination and natural pest control decreased with increasing distance to the field edge, but fruit set slightly increased. The quality of the field in terms of soil and climatic conditions did not influence the yield parameters examined in this study. Yield formation in oilseed rape plants is a complex process with many factors involved, and it is difficult to disentangle indirect effects of flower fields on yield. However, perennial flower fields can promote ecological intensification by increasing crop yield via natural pest control. This study contributes to a better understanding of the effects of differently composed flower fields on pollination, natural pest control and oilseed rape yield. N2 - Insekten sind für einen Großteil der Ökosystemdienstleistungen Bestäubung und natürliche Schädlingskontrolle zuständig. Schwinden die Insekten, so können diese Dienstleistungen nicht mehr zuverlässig gewährleistet werden. Als Ursachen für den Rückgang an Insekten wurde unter anderem die Intensivierung der Landwirtschaft und damit einhergehend der Verlust und die Fragmentierung von Lebensraum identifiziert. Ökologische Intensivierung hat das Ziel, alternative und nachhaltige Bewirtschaftungsmethoden in der Landwirtschaft zu fördern und beispielsweise den Einsatz von Spritzmitteln zu verringern. Agrarumweltmaßnahmen entschädigen Landwirte, wenn sie ökologisch wertvolle Maßnahmen in ihren Betrieb integrieren und können dadurch ökologische Intensivierung unterstützen. Die Bandbreite an Agrarumweltmaßnahmen ist groß, beinhaltet aber häufig das Anlegen von Blühflächen auf Ackerflächen. Blühflächen liefern Nahrungsressourcen und Lebensraum für eine Vielzahl von Insekten und sollten daher in der Lage sein Insektenpopulationen zu unterstützen und Ökosystemdienstleistungen auf angrenzenden Feldern zu verstärken. Jedoch ist das ökologische Potential von Blühflächen von einer Vielzahl von Faktoren abhängig. Unter anderem können das Alter und die Größe der Blühfläche entscheidend beeinflussen, inwiefern unterschiedliche Insektengruppen profitieren. Zusätzlich hat die Landschaftskomplexität der direkten Umgebung, und damit die potentiell vorhandene Biodiversität, großen Einfluss auf die Fähigkeit von Blühflächen Ökosystemdienstleistungen lokal zu erhöhen. In dieser Studie geht es darum zu entschlüsseln, wie sich diese verschiedenen Faktoren sich auf die beiden Ökosystemdienstleistungen Bestäubung und natürliche Schädlingskontrolle auswirken und ob sie sich gegenseitig beeinflussen. Zusätzlich soll untersucht werden, inwiefern Blühflächen und Ökosystemdienstleistungen Erträge beeinflussen können. Weitere in dieser Studie untersuchte Einflussfaktoren sind die Distanz zur Blühfläche und der Einsatz von Pestiziden. Die Abundanz von Nützlingen kann mit der Distanz zu geeigneten Habitaten stark abnehmen. Der Einsatz von Spritzmitteln wiederum könnte die positiven Einflüsse der Blühflächen auf Nützlinge aufheben. Um diese verschiedenen Aspekte zu untersuchen und letztendlich Empfehlung für die Etablierung von Blühflächen geben zu können, wurden Feldversuche auf Blühflächen mit unterschiedlicher Beschaffenheit und auf angrenzenden Rapsflächen durchgeführt. Die Blühflächen unterschieden sich hierbei in ihrem Alter und ihrer Kontinuität. Zusätzlich wurden Blühflächen mit unterschiedlicher Größe getestet. Außerdem wurden die Blühflächen und ihre benachbarten Rapsfelder so ausgewählt, dass sie sich in Landschaften mit unterschiedlichem Anteil an halbnatürlichen Habitaten befinden. Rapsflächen neben Kalkmagerrasen und Äckern mit konventionellen Feldfrüchten dienten als Kontrollflächen. Auf den Rapsflächen wurden Bestäuberbeobachtungen sowie Aufnahmen von Rapsglanzkäferbefall und deren Parasitierung durchgeführt. Zusätzlich wurden verschiedene Ertragsparameter von Raps aufgenommen. Die Untersuchungen fanden jeweils in unterschiedlichen Distanzen zur Blühfläche innerhalb des Rapsfeldes statt, um Distanz-Abnahme Funktionen zu untersuchen. Spritzfenster wurden etabliert, um den Einfluss von Pestiziden auf Ökosystemdienstleistungen und Erträge zu untersuchen. Für die statistische Auswertung wurden lineare gemischte Modelle verwendet. Die Ergebnisse haben zum einen gezeigt, dass frisch angelegte Blühflächen mit hoher Blütendeckung sehr attraktiv für Bestäuber sind. Jedoch blieben die Bestäuber in den Blühflächen, wenn diese eine gewisse Größe hatten (> 1.5ha) und verteilten sich nicht auf die umgebenden Flächen. Ein hoher Anteil an halbnatürlichen Habitaten in der umgebenden Landschaft erhöhte den Wert von kleinen Blühflächen als Ausgangspunkt für Bestäuber und ihren anschließenden Übergang auf Ackerflächen. Hohe Mengen an halbnatürlichen Habitaten verringerten außerdem den Rückgang der Bestäuber mit steigender Entfernung zur Blühfläche. Auf Grundlage dieser Ergenisse wäre es zu empfehlen, kleine Blühflächen in Landschaften mit viel halbnatürlichem Habitat und große Blühflächen in Landschaften mit wenig halbnatürlichem Habitat anzulegen. Außerdem ist anzumerken, dass Blühflächen keinen adequaten Ersatz für dauerhafte halbantürliche Habitate darstellen. Diese müssen weiterhin aktiv geschützt und erhalten werden, um Bestäubung auf Ackerflächen zu fördern. Des Weiteren wurde auf Rapsflächen neben kontinuierlichen Blühflächen mit einem Alter über 6 Jahre der niedrigste Befall mit Rapsglanzkäferlarven festgestellt. Blühflächen und Kalkmagerrasen erhöhten die Parasitierung von Rapsglanzkäfern in benachbarten Rapsflächen im Vergleich zu Rapsflächen die neben Ackerflächen liegen. Der Schwellenwert für eine effektive natürliche Schädlingskontrolle wurde nur in den pestizidfreien Bereichen in Rapsflächen neben kontinuierlichen Blühflächen und Kalkmagerasen erreicht. In mit Pestiziden behandelten Bereichen nahmen Parasitismus und Superparasitismus mit zunehmender Entfernung zum benachbarten Feld ab. In den Spritzfenstern ohne Pestizide blieben sie jedoch auf dem gleichen Niveau. Große Blühflächen erhöhten Parasitismus und Superparasitismus mehr als kleine. Insgesamt können Blühflächen die Parasitierungsraten von Rapsglanzkäfern auf Rapsflächen erhöhen, jedoch können Pestizide diese positiven Effekte aufheben. Zuletzt wurden die Effekte von Blühflächen und Ökosystemdienstleistungen auf den Rapsertrag untersucht. Hier stellte sich heraus, dass Bestäubung keine positiven Effekte auf den Rapsertrag hatte. Alte und kontinuierliche Blühflächen erhöhten die natürliche Schädlingskontrolle in den Rapsfeldern, welche wiederrum den Samenansatz und das absolute Samengewicht erhöhten. Die Behandlung mit Pestiziden hatte negative Asuwirkungen auf natürliche Schädlingskontrolle, aber positive Auswirkungen auf den Ertrag. Bestäubung und natürliche Schädlingskontrolle nahmen mit der zunehmenden Entfernung zum Feldrand ab, aber der Fruchtansatz nahm leicht zu. Die Feldqualität hatte keine Auswirkungen auf die im Modell untersuchten Rapsertrag Messwerte. Ertragsbildung bei Rapspflanzen ist ein komplexer Vorgang an dem viele Faktoren beteiligt sind. Mehrjährige Blühflächen können ökologische Intensivierung fördern indem sie den Ertrag durch natürliche Schädlingskontrolle erhöhen. Diese Studie leistet einen wertvollen Beitrag zum besseren Verständnis der Auswirkungen von unterschiedlich beschaffenen Blühflächen auf Bestäubung, natürliche Schädlingskontrolle und Rapsertrag. KW - Ökologie KW - Agrarumweltmaßnahmen KW - Ökosystemdienstleistung Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-206577 ER - TY - THES A1 - Rüdt von Collenberg, Cora Freifrau T1 - The role of Ciliary Neurotrophic Factor in hippocampal synaptic plasticity and learning T1 - Die Rolle von Ciliary Neurotrophic Factor bei hippocampaler synaptischer Plastizität und Lernen N2 - Ciliary neurotrophic factor (Cntf) acts as a differentiation and survival factor for different types of neurons and glial cells. It is expressed by peripheral Schwann cells and astrocytes in the central nervous system and mediates its effects via a receptor complex involving CntfRα, LifRß and gp130, leading to downstream activation of Stat3. Recent studies by our group have shown that Cntf modulates neuronal microtubule dynamics via Stat3/stathmin interaction. In a mouse model for motor neuron disease, i.e. pmn, Cntf is able to rescue axonal degeneration through Stat3/stathmin signaling. While these findings suggest a role of Cntf in controlling axonal functions in the neuromuscular system, additional data indicate that Cntf might also play a role in synaptic plasticity in the hippocampus. Electrophysiological recordings in hippocampal organotypic cultures and acute slices revealed a deficit in long-term potentiation (LTP) in Cntf -/- mice. This deficit was rescued by 24 h stimulation with Cntf, combined with an acute application of Cntf during LTP-measurements indicating that Cntf is both necessary and sufficient for hippocampal LTP, and possibly synaptic plasticity. Therefore, Cntf knockout mice were investigated to elucidate this possible role of Cntf in hippocampal LTP and synaptic plasticity. First, we validated the presence of Cntf in the target tissue: in the hippocampus, Cntf was localized in Gfap-positive astrocytes surrounding small blood vessels in the fissure and in meningeal areas close to the dentate gyrus. Laser micro-dissection and qPCR analysis showed a similar distribution of Cntf-coding mRNA validating the obtained immunofluorescent results. Despite the strong LTP deficit in organotypic cultures, in vivo behavior of Cntf -/- mice regarding hippocampus-dependent learning and anxiety-related paradigms was largely inconspicuous. However, western blot analysis of hippocampal organotypic cultures revealed a significant reduction of pStat3 levels in Cntf -/- cultures under baseline conditions, which in turn were elevated upon Cntf stimulation. In order to resolve and examine synaptic structures we turned to in vitro analysis of cultured hippocampal neurons which indicated that pStat3 is predominantly located in the presynapse. In line with these findings, presynapses of Cntf -/- cultures were reduced in size and when in contact to astrocytes, contained less pStat3 immunoreactivity compared to presynapses in wildtype cultures. In conclusion, our findings hypothesize that despite of a largely inconspicuous behavioral phenotype of Cntf -/- mice, Cntf appears to have an influence on pStat3 levels at hippocampal synapses. In a next step these two key questions need to be addressed experimentally: 1) is there a compensatory mechanism by members of the Cntf family, possibly downstream of pStat3, which explains the in vivo behavioral results of Cntf -/- mice and can likewise account for the largely inconspicuous phenotype in CNTF-deficient humans? 2) How exactly does Cntf influence LTP through Stat3 signaling? To unravel the underlying mechanism further experiments should therefore investigate whether microtubule dynamics downstream of Stat3 and stathmin signaling are involved in the Cntf-induced modulation of hippocampal synaptic plasticity, similar to as it was shown in motoneurons. N2 - Ciliary neurotrophic factor (Cntf) wirkt als Differenzierungs- und Überlebensfaktor für verschiedene Arten von Neuronen und Gliazellen. Es wird von peripheren Schwann´schen Zellen und Astrozyten des zentralen Nervensystems exprimiert und vermittelt seine Effekte über einen Rezeptorenkomplex, der aus CntfRα, LifRß und gp130 besteht, und zu einer nachfolgenden Aktivierung von Stat3 führt. Jüngste Studien unserer Arbeitsgruppe haben gezeigt, dass Cntf neuronale Mikrotubulidynamik über Stat3/stathmin Interaktion modulieren kann. In pmn Mäusen, einem Mausmodell für Motoneuronenerkrankungen, ist Cntf in der Lage, durch Stat3/Stathmin Signaltransduktion die zugrundeliegende axonale Degeneration wieder aufzuheben. Während diese Ergebnisse eine Rolle von Cntf bei der Kontrolle axonaler Funktionen im neuromuskulären System postulieren, deuten zusätzliche Daten darauf hin, dass Cntf ebenfalls eine Funktion bei synaptischer Plastizität im Hippocampus ausübt. Elektrophysiologische Messungen in hippocampalen organotypischen Kulturen und akuten Schnitten zeigen ein Defizit in der Langzeitpotenzierung (LTP) bei Cntf -/- Mäusen. Dieses Defizit konnte durch eine 24 stündige Stimulation mit Cntf, in Kombination mit akuter Zugabe von Cntf während der LTP Messungen, kompensiert werden. Dies weist darauf hin, dass Cntf sowohl notwendig als auch ausreichend für hippocampale LTP und möglicherweise synaptische Plasizität ist. Deshalb wurden Cntf knockout Mäuse untersucht, um diese putative Rolle von Cntf bei hippocampaler LTP und synaptischer Plastizität zu untersuchen. Zunächst haben wir die Lokalisation von Cntf in unserem Zielgewebe bestätigt: im Hippocampus war Cntf sowohl in Gfap-positiven Astrocyten lokalisiert, die kleine Blutgefäße in der Fissur umschließen, als auch in Gfap-positiven Astrocyten nahe des Gyrus dentatus. Lasermikrodissektion und qPCR-Analysen zeigten eine ähnliche Verteilung von Cntf kodierender mRNA, und bestätigten somit die durch Immunoflureszenz-Färbung erworbenen Ergebnisse. Trotz des starken LTP Defizits in organotypischen Kulturen zeigten jedoch Cntf -/- Mäuse in Hippocampus-abhängigen lern- und angstbedingten Verhaltensparadigmen keinen offensichtlichen Phänotyp. Allerdings zeigten Western Blot Analysen hippocampaler Kulturen eine signifikante Reduktion der pStat3 Level in Cntf -/- Kulturen unter Kontrollbedingungen, die nach Cntf Zugabe wieder erhöht werden konnten. Um synaptische Strukturen besser darstellen und evaluieren zu können, wurden hippocampale Neurone in vitro kultiviert, in denen Stat3 überwiegend in Präsynapsen lokalisiert war. In Übereinstimmung mit diesen Beobachtungen zeigten Cntf -/- Präsynapsen eine geringere Größe und enthielten, verglichen zu Präsynapsen in Wildtypkulturen, weniger pStat3 Immunreaktivität, gerade dann, wenn sie sich in Kontakt mit Astrozyten befanden. Zusammenfassend weisen unsere Befunde darauf hin, dass Cntf – trotz eines weitgehend unaufälligen Verhaltensphänotyps bei Cntf -/- Mäusen – einen Einfluss auf den Level von pStat3 an hippokampalen Synapsen zu haben scheint. In einem nächsten Schritt sollten die folgenden zwei Schlüsselfragen experimentell geklärt werden: 1) gibt es einen kompensierenden Mechanismus, über welchen Mitglieder der Cntf Familie wirken könnten – möglicherweise nachfolgend von pStat3 – und welcher das Verhalten der Cntf -/- Mäuse, sowie den größtenteils unauffälligen Phänotyp bei CNTF defizienten Menschen erklären könnte? 2) Wie genau wirkt sich Cntf induziertes pStat3 auf LTP aus? Um diesen zugrundeliegenden Mechanismus aufzuklären, sollten weitere Experimente untersuchen, ob pStat3 und Stathmin abhängige Mikrotubulidynamik in der durch Cntf induzierten Modulation hippocampaler Plastizität eine Rolle spielt – ähnlich, wie es in Motoneuronen bereits gezeigt wurde. KW - Hippocampus KW - Ciliary neurotrophic factor KW - hippocampus KW - synaptic plasticity KW - learning KW - Hippocampus KW - synaptische Plastizität KW - Lernen Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-206646 ER - TY - THES A1 - Schuster, Sarah T1 - Analysis of \(Trypanosoma\) \(brucei\) motility and the infection process in the tsetse fly vector T1 - Analyse der Motilität von \(Trypanosoma\) \(brucei\) und dem Infektionsprozess in der Tsetsefliege N2 - African trypanosomes are protist pathogens that are infective for a wide spectrum of mammalian hosts. Motility has been shown to be essential for their survival and represents an important virulence factor. Trypanosoma brucei is transmitted by the bite of the bloodsucking tsetse fly, the only vector for these parasites. The voyage through the fly is complex and requires several migration, proliferation and differentiation steps, which take place in a defined order and in specific fly tissues. The first part of this doctoral thesis deals with the establishment of the trypanosome tsetse system as a new model for microswimmer analysis. There is an increasing interdisciplinary interest in microbial motility, but a lack of accessible model systems. Therefore, this work introduces the first enclosed in vivo host parasite system that is suitable for analysis of diverse microswimmer types in specific microenvironments. Several methods were used and adapted to gain unprecedented insights into trypanosome motion, the fly´s interior architecture and the physical interaction between host and parasite. This work provides a detailed overview on trypanosome motile behavior as a function of development in diverse host surroundings. In additional, the potential use of artificial environments is shown. This can be used to partly abstract the complex fly architecture and analyze trypanosome motion in defined nature inspired geometries. In the second part of the thesis, the infection of the tsetse fly is under investigation. Two different trypanosome forms exist in the blood: proliferative slender cells and cell cycle arrested stumpy cells. Previous literature states that stumpy cells are pre adapted to survive inside the fly, whereas slender cells die shortly after ingestion. However, infection experiments in our laboratory showed that slender cells were also potentially infective. During this work, infections were set up so as to minimize the possibility of stumpy cells being ingested, corroborating the observation that slender cells are able to infect flies. Using live cell microscopy and fluorescent reporter cell lines, a comparative analysis of the early development following infection with either slender or stumpy cells was performed. The experiments showed, for the first time, the survival of slender trypanosomes and their direct differentiation to the procyclic midgut stage, contradicting the current view in the field of research. Therefore, we can shift perspectives in trypanosome biology by proposing a revised life cycle model of T. brucei, where both bloodstream stages are infective for the vector. N2 - Afrikanische Trypanosomen sind pathogene Protisten, die ein breites Spektrum von Säugetierwirten infizieren. Es wurde gezeigt, dass die Zellmotilität für das Überleben der Parasiten essenziell ist und einen wichtigen Virulenzfaktor darstellt. Trypanosoma brucei wird durch den Biss der blutsaugenden Tsetsefliege übertragen, dem einzigen Vektor für diese Parasiten. Der Entwicklungszyklus in der Fliege ist komplex und beinhaltet mehrere Migrations-, Proliferations- und Differenzierungsschritte, die in einer definierten Reihenfolge und in spezifischen Fliegenorganen stattfinden. Der erste Teil dieser Doktorarbeit beschäftigt sich mit der Etablierung des Trypanosomen Tsetse Systems als ein neues Modell für Motilitätsanalysen. Es besteht ein wachsendes interdisziplinäres Interesse an mikrobieller Motilität, aber es fehlen zugängliche Mikroschwimmersysteme. Deswegen stellt diese Arbeit das erste abgeschlossene in vivo Wirt Parasit System vor, das für Analysen von verschiedenen Mikroschwimmertypen in spezifischen Umgebungen geeignet ist. Verschiedene Methoden wurden benutzt und adaptiert, um sowohl Einblicke in die Trypanosomenbewegung, die innere Fliegenarchitektur als auch die physikalischen Wechselwirkungen zwischen Wirt und Parasit zu erhalten. Diese Arbeit bietet einen detaillierten Überblick über das motile Verhalten von Trypanosomen als Funktion der Entwicklung in diversen Wirtsumgebungen. Zusätzlich ist die potenzielle Nutzung von artifiziellen Umgebungen gezeigt. Diese können benutzt werden, um die komplexe Architektur der Fliege teilweise zu abstrahieren und die Trypanosomenbewegung in definierten und von der Nature inspirierten Geometrien zu analysieren. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde die Infektion der Fliege genauer betrachtet. Im Blut existieren zwei verschiedene Trypanosomenformen: proliferierende ‘slender’ und Zellzyklus arretierte ‘stumpy’ Zellen. Bisherige Literatur besagt, dass stumpy Zellen präadaptiert sind, um in der Fliege zu überleben, wohingegen slender Zellen kurz nach der Aufnahme sterben. Dennoch konnten Infektionsexperimente in unserem Labor zeigen, dass auch slender Zellen potenziell infektiös sind. Während dieser Arbeit wurden weitere Infektionen so durchgeführt, dass die Möglichkeit für die Aufnahme von stumpy Zellen minimiert wurde und die Infektionskapazität der slender Zellen bestätigt werden konnte. Durch Lebendzell Mikroskopie mit fluoreszenten Reporterzelllinien wurde eine vergleichende Analyse für die frühe Entwicklung von slender und stumpy Parasiten nach der Infektion durchgeführt. Die Experimente zeigten zum ersten Mal das Überleben von slender Trypanosomen in der Tsetsefliege und ihre direkte Differenzierung in das prozyklische Mitteldarmstadium. Sie widersprechen demnach der aktuellen Auffassung im Forschungsbereich. Demzufolge können wir von einem Perspektivwechsel in der Trypanosomenbiologie sprechen und schlagen einen revidierten Lebenszyklus für T. brucei vor, in dem beide Blutstromformen für den Vektor infektiös sind. KW - Motilität KW - Trypanosomen KW - Tsetsefliege KW - Parasit KW - tsetse fly KW - motility KW - trypanosome KW - vector-parasite interaction KW - microswimming Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-192691 ER - TY - THES A1 - Heiby, Julia T1 - Insight into molecular mechanisms of folding and self-association of spider silk protein domains T1 - Einblicke in molekulare Mechanismen der Faltung und Selbstassoziation von Spinnenseidenproteindomänen N2 - Spider silk is a biomaterial of extraordinary toughness paired with elasticity. The assembly of silk proteins, so-called spidroins (from “spider” and “fibroin”), generates the silk threads we typically see in our garden or the corners of our houses. Although spider webs from different species vary considerably in geometry and size, many sections of spidroin sequences are conserved. Highly conserved regions, found in all spidroins, relate to the terminal domains of the protein, i.e., the N-terminal (NTD) and C-terminal domains (CTD). Both have an essential function in the silk fibre association and polymerisation. The NTD is a 14 kDa five-helix bundle, which self-associates via a pH-driven mechanism. This process is critical for starting the polymerisation of the fibre. However, detailed insights into how conserved this mechanism is in different species and the quantitative thermodynamic comparison between homologous NTDs was missing. For this reason, four homologous NTDs of the major ampullate gland (MaSp) from spider species Euprosthenops australis, Nephila clavipes, Latrodectus hesperus, and Latrodectus geometricus were investigated. I analysed and quantified equilibrium thermodynamics, kinetics of folding, and self-association. Methods involved dynamic light scattering (MALS), stopped-flow fluorescence and circular dichroism spectroscopy in combination with thermal and chemical denaturation experiments. The results showed conserved, cooperative two-state folding on a sub-millisecond time scale. All homologous NTDs showed a similarly fast association in the order of 10^9 M^−1 s^−1, while the resulting equilibrium dissociation constants were in the low nanomolar range. Electrostatic forces were found to be of great importance for protein association. Monomeric protein stability increased with salt concentration while enhancing its folding speed. However, due to Debye-Hückel effects, we found intermolecular electrostatics to be shielded, which reduced the NTDs association capacity significantly at high ionic strength. Altogether, the energetics and kinetics of the NTD dimerisation was conserved for all analysed homologs. Comparable to the NTD, the spider silks CTD is also a α-helix bundle, which covalently links two spidroins. The orientation of the domains predetermines the future fibre geometry. Here again, the detailed quantitative characterisation of the folding and dimerisation was missing. Therefore, the CTD from the E. australis was analysed in-depth. The protein folded via a three-state mechanism and was placed in the family of knotted proteins. By analysing the amino acid composition of the NTD of the MaSp1 of the Euprosthenops australis, we found an unusually high content of methionine residues (Met). To elucidate why this protein exhibits so many Met residues, I mutated all core Mets simultaneously to leucine (Leu). Results revealed a dramatically stabilised NTD, which now folded 50 times faster. After solving the tertiary structure of the mutant by NMR (nuclear magnetic resonance) spectroscopy, the structure of the monomeric mutant was found to be identical with the wild-type protein. However, when probing the dimerisation of the NTD, I could show that the association capacity was substantially impaired for the mutant. Our findings lead to the conclusion that Met provides the NTD with enhanced conformational dynamics and thus mobilises the protein, which results in tightly associated dimers. In additional experiments, I first re-introduced new Met residues into the Met-depleted protein at sequence positions containing native Leu. Hence, the mutated NTD protein was provided with the same number of Leu, which were previously removed by mutation. However, the protein did not regain wild-type characteristics. The functionality was not restored, but its stability was decreased as expected. To probe our hypothesis gained from the MaSp NTD, I transferred the experiment to another protein, namely the Hsp90 chaperone. Therefore, I incorporated methionine residues in the protein, which resulted in a slight improvement of its function. Finally, trial experiments were performed aiming at the synthesis of shortened spidroin constructs containing less repetitive middle-segments than the wild-type protein. The objective was to study the findings of the terminal domains in the context of an intact spidroin. The synthesis of these engineered spidroins was challenging. Nevertheless, preliminary results encourage the assumption that the characteristics observed in the isolated domains hold true in the context of a full-length spidroin. N2 - Spinnenseide ist ein Biomaterial mit außergewöhnlicher Widerstandsfähigkeit welche gepaart ist mit Elastizität. Das Zusammenfügen von Seidenproteinen aus so ge-nannten Spidroinen (ein Kunstwort aus „Spinne“ und „Fibroin“) erzeugt die Seiden-fäden, die wir typischerweise in unseren Gärten oder in den Ecken unserer Häuser finden. Obwohl Spinnennetze von verschiedenen Spinnenarten in Geometrie und Größe stark variieren, sind große Teile der Spidroin-Sequenzen konserviert. Stark konservierte Bereiche, die in allen Spidroinen vorkommen, sind die endständigen Bereiche des Proteins, die N-terminale (NTD) und C-terminale Domäne (CTD) ge-nannt werden. Beide haben wichtige Funktionen in der Assoziation der Proteine im Spinnkanal und deren Polymerisation zur Ausbildung des Seidenfadens. Die NTD ist ein kleines 14 kDa Protein, bestehend aus einem Bündel aus fünf Helices, dessen Selbstorganisation pH-abhängig ist. Dieser Prozess leitet die Poly-merisation der Faser ein. Allerdings fehlten bis heute Informationen darüber, ob dieser Mechanismus bei homologen Domänen aus verschiedenen Spinnenarten konser¬viert ist, da kaum quantitative biophysikalische Daten vorhanden sind. Aus diesem Grund wurden vier homologe NTDs der Spinnenarten Euprosthenops australis, Nephila clavipes, Latrodectus hesperus und Latrodectus geometricus vergleichend untersucht und deren Gleichgewichts-Thermodynamik, die Kinetik der Faltung und die Selbstassoziation quantitativ analysiert. Dazu wurden Methoden wie dynamische Mehrwinkel-Lichtstreuung (MALS), Stopped-Flow Fluoreszenz-spektroskopie und Zirkulardichroismus in Kombination mit thermischen und chemischen Denaturierungs¬experimenten angewandt. Die Ergebnisse lieferten die Erkenntnis einer kooperativen Zwei-Zustands-Faltung, die auf einer Zeitskala von weniger als einer Millisekunde stattfand. Alle homologen NTDs zeigten eine schnelle Assoziationsratenkonstante in der Größenordnung von 10^9 M^-1 s^-1, während die Gleichgewichts-Dissoziationskonstante für alle Homologe im nied¬rigen nano-molaren Bereich lag. Die Proteinassoziation wurde durch elektrostatische Kräfte gesteuert, wobei hohe Salzkonzentrationen die Stabilität des monomeren Proteins und dessen Faltungsgeschwindigkeit erhöhten. Die Assoziation zweier Domänen wurde jedoch durch Abschirmung intermolekularer elektrostatischer Kräfte, dem Debye-Hückel-Gesetz zufolge, reduziert. Die Energetik und Kinetik der NTD-Dimerisierung aller untersuchten Homologen erwies sich konserviert. Ebenso wie die NTD, ist auch die CTD der Spinnenseide ein α-helikales Bündel, welche jedoch zwei Spidroine kovalent miteinander verbindet. Die Orientierung der verknüpften Domäne bestimmt bereits die zukünftige Faserstruktur. Ähnlich wie bei der NTD, waren Faltung und Dimerisierung der CTD bisher nicht im Detail be-schrieben. Durch eine detaillierte Analyse der CTD der E. australis konnte gezeigt werden, dass das Protein sich in einem dreistufigen Mechanismus faltet und außerdem der Familie der geknoteten Proteine angehört. Bei genauerer Betrachtung der Aminosäurezusammensetzung der E. australis NTD konnte ein ungewöhnlich hoher Anteil der Aminosäure Methionin (Met) festge¬stellt werden. Um diesen überraschenden Sachverhalt zu verstehen, habe ich alle im Kern liegenden Met zu Leucin (Leu) mutiert. Die Ergebnisse zeigten eine extrem stabilisierte NTD, welche sich nun 50-fach schneller faltete. Die Protein¬struktur der Mutante wurde in Lösung mittels NMR Spektroskopie ermittelt. Das Ergebnis lieferte deckungsgleiche Strukturen von Mutante und Wildtyp im monomeren Zustand. Allerdings zeigten NTD Dimerisierungs-Versuche, dass die Assoziations-fähigkeit der Mutante erheblich beeinträchtigt war. Untersuchungen der nativen Dynamik mittels NMR und Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie zeigten, dass Met diese entscheidend verstärkt, was zu einem eng assoziierten Dimer führte. Im Versuch die Dynamik wieder künstlich herzustellen, habe ich neue Met in die Mutante eingeführt, auf Sequenzpositionen welche natürlicherweise Leu aufweisen. Somit wurde die ursprüngliche Anzahl an Met in der NTD wiederher¬gestellt, jedoch an anderen Positionen. Obwohl das Protein wie erwartet an Stabilität verlor, konnte dessen Funktionalität nicht wiederhergestellt werden. Um unsere Erkenntnisse auf andere Proteine zu übertragen, wurden Met Reste künstlich in ein Hsp90 Protein eingeführt. Es konnte eine leicht verbesserte Funktionalität des Proteins beobachtet werden. Schließlich wurde versucht, die für die CTD und NTD gewonnen Erkenntnisse auf intakte, jedoch verkürzte Spidroine zu übertragen. Dazu wurden Spidroine mit weniger repetitiven Mittelsegmenten mittels rekombinanten Methoden hergestellt. Die Synthese dieser Spidroine erwies sich als Herausforderung. Allerdings zeigten die vorläufigen Ergebnisse, dass eine Verallgemeinerung der Erkenntnisse der isolierten Domänen auf das Volllängen-Spidroin möglich ist. KW - Spinnenseide KW - Fluoreszenzspektroskopie KW - Terminale Domaine KW - Spider Silk KW - Fluorescence spectroscopy KW - Terminal domains Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-193455 ER - TY - THES A1 - Markert, Sebastian Matthias T1 - Enriching the understanding of synaptic architecture from single synapses to networks with advanced imaging techniques T1 - Vertiefung des Verständnisses synaptischer Architektur von der einzelnen Synapse bis zum Netzwerk mit modernsten bildgebenden Verfahren N2 - Because of its complexity and intricacy, studying the nervous system is often challenging. Fortunately, the small nematode roundworm Caenorhabditis elegans is well established as a model system for basic neurobiological research. The C. elegans model is also the only organism with a supposedly complete connectome, an organism-wide map of synaptic connectivity resolved by electron microscopy, which provides some understanding of how the nervous system works as a whole. However, the number of available data-sets is small and the connectome contains errors and gaps. One example of this concerns electrical synapses. Electrical synapses are formed by gap junctions and difficult to map due to their often ambiguous morphology in electron micrographs, leading to misclassification or omission. On the other hand, chemical synapses are more easily mapped, but many aspects of their mode of operation remain elusive and their role in the C. elegans connectome is oversimplified. A comprehensive understanding of signal transduction of neurons between each other and other cells will be indispensable for a comprehensive understanding of the nervous system. In this thesis, I approach these challenges with a combination of advanced light and electron microscopy techniques. First, this thesis describes a strategy to increase synaptic specificity in connectomics. Specifically, I classify gap junctions with a high degree of confidence. To achieve this, I utilized array tomography (AT). In this thesis, AT is adapted for high-pressure freezing to optimize for structure preservation and for super-resolution light microscopy; in this manner, I aim to bridge the gap between light and electron microscopy resolutions. I call this adaptation super-resolution array tomography (srAT). The srAT approach made it possible to clearly identify and map gap junctions with high precision and accuracy. The results from this study showcased the feasibility of incorporating electrical synapses into connectomes in a systematic manner, and subsequent studies have used srAT for other models and questions. As mentioned above, the C. elegans connectomic model suffers from a shortage of datasets. For most larval stages, including the special dauer larval stage, connectome data is completely missing up to now. To obtain the first partial connectome data-set of the C. elegans dauer larva, we used focused ion-beam scanning electron microscopy (FIB-SEM). This technique offers an excellent axial resolution and is useful for acquiring large volumes for connectomics. Together with our collaborators, I acquired several data-sets which enable the analysis of dauer stage-specific “re-wiring” of the nervous system and thus offer valuable insights into connectome plasticity/variability. While chemical synapses are easy to map relative to electrical synapses, signal transduction via chemical transmitters requires a large number of different proteins and molecular processes acting in conjunction in a highly constricted space. Because of the small spatial scale of the synapse, investigating protein function requires very high resolution, which electron tomography provides. I analyzed electron tomograms of a worm-line with a mutant synaptic protein, the serine/threonine kinase SAD-1, and found remarkable alterations in several architectural features. My results confirm and re-contextualize previous findings and provide new insight into the functions of this protein at the chemical synapse. Finally, I investigated the effectiveness of our methods on “malfunctioning,” synapses, using an amyotrophic lateral sclerosis (ALS) model. In the putative synaptopathy ALS, the mechanisms of motor neuron death are mostly unknown. However, mutations in the gene FUS (Fused in Sarcoma) are one known cause of the disease. The expression of the mutated human FUS in C. elegans was recently shown to produce an ALS-like phenotype in the worms, rendering C. elegans an attractive disease model for ALS. Together with our collaboration partners, I applied both srAT and electron tomography methods to “ALS worms” and found effects on vesicle docking. These findings help to explain electrophysiological recordings that revealed a decrease in frequency of mini excitatory synaptic currents, but not amplitudes, in ALS worms compared to controls. In addition, synaptic endosomes appeared larger and contained electron-dense filaments in our tomograms. These results substantiate the idea that mutated FUS impairs vesicle docking and also offer new insights into further molecular mechanisms of disease development in FUS-dependent ALS. Furthermore, we demonstrated the broader applicability of our methods by successfully using them on cultured mouse motor neurons. Overall, using the C. elegans model and a combination of light and electron microscopy methods, this thesis helps to elucidate the structure and function of neuronal synapses, towards the aim of obtaining a comprehensive model of the nervous system. N2 - Das Nervensystem ist ein definierendes Merkmal aller Tiere, unter anderem verantwortlich für Sinneswahrnehmung, Bewegung und „höhere“ Hirnfunktionen. Wegen dessen Komplexität und Feingliedrigkeit stellt das Erforschen des Nervensystems oft eine Herausforderung dar. Jedoch ist der kleine Fadenwurm Caenorhabditis elegans als Modellsystem für neurobiologische Grundlagenforschung gut etabliert. Erbesitzt eines der kleinsten und unveränderlichsten bekannten Nervensysteme. C.elegans ist auch das einzige Modell, für das ein annähernd vollständiges Konnektom vorliegt, eine durch Elektronenmikroskopie erstellte Karte der synaptischen Verbindungen eines gesamten Organismus, die Einblicke in die Funktionsweise des Nervensystems als Ganzes erlaubt. Allerdings ist die Anzahl der verfügbaren Datensätze gering und das Konnektom enthält Fehler und Lücken. Davon sind beispielsweise elektrische Synapsen betroffen. Elektrische Synapsen werden von Gap Junctions gebildet und sind auf Grund ihrer oft uneindeutigen Morphologie in elektronenmikroskopischen Aufnahmen schwierig zu kartieren, was dazu führt, dass einige falsch klassifiziert oder übersehen werden. Chemische Synapsen sind dagegen einfacher zu kartieren, aber viele Aspekte ihrer Funktionsweise sind schwer zu erfassen und ihre Rolle im Konnektom von C.elegans ist daher zu vereinfacht dargestellt. Ein umfassendes Verständnis der Signaltransduktion von Neuronen untereinander und zu anderen Zellen wird Voraussetzung für ein vollständiges Erfassen des Nervensystems sein. In der vorliegenden Arbeit gehe ich diese Herausforderungen mithilfe einer Kombination aus modernsten licht- und elektronenmikroskopischen Verfahren an. Zunächst beschreibt diese Arbeit eine Strategie, um die synaptische Spezifität in der Konnektomik zu erhöhen, indem ich Gap Junctions mit einem hohen Maß an Genauigkeit klassifiziere. Um dies zu erreichen, nutzte ich array tomography (AT), eine Technik, die Licht- und Elektronenmikrokopie miteinander korreliert. In dieser Arbeit wird AT adaptiert für Hochdruckgefrierung, um die Strukturerhaltung zu optimieren, sowie für ultrahochauflösende Lichtmikroskopie; so wird die Kluft zwischen den Auflösungsbereichen von Licht- und Elektronenmikroskopie überbrückt. Diese Adaption nenne ich super-resolution array tomography (srAT). Der srATAnsatz machte es möglich, Gap Junctions mit hoher Präzision und Genauigkeit klar zu identifizieren. Für diese Arbeit konzentrierte ich mich dabei auf Gap Junctions des retrovesikulären Ganglions von C.elegans. Die Ergebnisse dieser Studie veranschaulichen, wie es möglich wäre, elektrische Synapsen systematisch in Konnektome aufzunehmen. Nachfolgende Studien haben srAT auch auf andere Modelle und Fragestellungen angewandt ... KW - Caenorhabditis elegans KW - Synapse KW - Elektronenmikroskopie KW - Myatrophische Lateralsklerose KW - connectomics KW - focused ion-beam scanning electron microscopy KW - super-resolution array tomography Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-189935 ER - TY - THES A1 - Bergmann Bueno, Amauri T1 - Ecophysiological adaptations of cuticular water permeability of plants to hot arid biomes T1 - Ökophysiologische Anpassungen der kutikulären Wasserpermeabilität von Pflanzen an heiße aride Biome N2 - Arid environments cover almost one-third of the land over the world. Plant life in hot arid regions is prone to the water shortage and associated high temperatures. Drought-stressed plants close the stomata to reduce water loss. Under such conditions, the remaining water loss exclusively happens across the plant cuticle. The cuticular water permeability equals the minimum and inevitable water loss from the epidermal cells to the atmosphere under maximally stomatal closure. Thus, low cuticular water permeability is primordial for plant survival and viability under limited water source. The assumption that non-succulent xerophytes retard water loss due to the secretion of a heavier cuticle is often found in the literature. Intuitively, this seems to be plausible, but few studies have been conducted to evaluate the cuticular permeability of xerophilous plants. In chapter one, we investigated whether the cuticular permeability of Quercus coccifera L. grown in the aridest Mediterranean-subtype climate is indeed lower than that of individuals grown under temperate climate conditions. Also, the cuticular wax chemical compositions of plants grown in both habitats were qualitatively and quantitatively analysed by gas-chromatography. In few words, our findings showed that although the cuticular wax deposition increased in plants under Mediterranean climate, the cuticular permeability remained unaltered, regardless of habitat. The associated high temperatures in arid regions can drastically increase the cuticular water permeability. Thereby, the thermal stability of the cuticular transpirational barrier is decisive for safeguarding non-succulent xerophytes against desiccation. The successful adaptation of plants to hot deserts might be based on finding different solutions to cope with water and heat stresses. Water-saver plants close the stomata before the leaf water potential drastically changes in order to prevent damage, whereas water-spender plants reduce the leaf water potential by opening the stomata, which allow them to extract water from the deep soil to compensate the high water loss by stomatal transpiration. In chapter two, we compare the thermal stability of the cuticular transpiration barrier of the desert water-saver Phoenix dactylifera L. and the water-spender Citrullus colocynthis (L.) Schrad. In short, the temperature-dependent increase of the cuticular permeability of P. dactylifera was linear over the whole temperature range (25-50°C), while that of C. colocynthis was biphasic with a steep increase at temperatures ≥ 40°C. This drastic increase of cuticular permeability indicates a thermally induced breakdown of the C. colocynthis cuticular transpiration barrier, which does not occur in P. dactylifera. We further discussed how the specific chemical composition of the cutin and cuticular waxes might contribute to the pronounced thermal resistance of the P. dactylifera cuticular transpiration barrier. A multitude of morpho and physiological modifications, including photosynthetic thermal tolerance and traits related to water balance, led to the successful plant colonisation of hot arid regions over the globe. High evaporative demand and elevated temperatures very often go along together, thereby constraining the plant life in arid environments. In chapter 3, we surveyed cuticular permeability, leaf thermal tolerance, and cuticular wax chemical composition of 14 non-succulent plant species native from some of the hottest and driest biomes in South-America, Europe, and Asia. Our findings showed that xerophilous flowering plants present high variability for cuticular permeability and leaf thermal tolerance, but both physiological features could not be associated with the species original habitat. We also provide substantial evidence that non-succulent xerophytes with more efficient cuticular transpirational barrier have higher leaf thermal tolerance, which might indicate a potential coevolution of these features in hot arid biomes. We further discussed the efficiency of the cuticular transpiration barrier in function to the cuticular wax chemical composition in the general discussion section. N2 - Trockene Trockene Lebensräume bedecken fast ein Drittel der Landoberfläche der Erde. Das Pflanzenleben in Trockengebieten ist durch Wasserknappheit und hohe Temperaturen gekennzeichnet. Durch Trockenheit beanspruchte Pflanzen schließen die Stomata, um den Wasserverlust zu reduzieren. Unter diesen Bedingungen erfolgt der verbleibende Wasserverlust ausschließlich über die pflanzliche Kutikula. Die kutikuläre Wasserpermeabilität entspricht dem minimalen und unvermeidbaren Wasserverlust aus den Epidermiszellen an die Atmosphäre. Daher ist eine niedrige kutikuläre Wasserpermeabilität für die Lebensfähigkeit der Pflanzen unter begrenzter Wasserverfügbarkeit entscheidend. Die Annahme, dass xerophile Pflanzen den Wasserverlust aufgrund der Ausbildung einer speziellen Kutikula verringern, findet sich häufig in der Literatur. Intuitiv erscheint dies plausibel, jedoch wurden nur wenige Studien durchgeführt, um die kutikuläre Wasserpermeabilität von xerophilen Pflanzen zu untersuchen. Im ersten Kapitel wurde getestet, ob die kutikuläre Wasserpermeabilität von Quercus coccifera L., angezogen im ariden Klima des mediterranen Subtyps, tatsächlich geringer ist als die von Pflanzen derselben Art, die unter gemäßigten Klimabedingungen kultiviert wurden. Außerdem wurde die chemische Zusammensetzung der kutikulären Wachse von Pflanzen, die in beiden Habitaten angezogen wurden, quantitativ und qualitativ durch Gaschromatographie mit Flammenionisationsdetektion- beziehungsweise Massenspektrometrie-Kopplung analysiert. Die Ergebnisse zeigen, dass die kutikuläre Wasserpermeabilität unter beiden Anzuchtbedingungen vergleichbar war, obwohl die Pflanzen, die unter dem mediterranen Klima wuchsen, eine höhere Menge an kutikulären Wachsen aufwiesen. Die hohen Temperaturen in trockenen Regionen können die Wasserdurchlässigkeit der pflanzlichen Kutikula drastisch erhöhen. Dabei ist die thermische Stabilität der kutikulären Transpirationsbarriere entscheidend für den Austrocknungsschutz xerophiler Pflanzen. Die erfolgreiche Anpassung von Wüstenpflanzen kann auf verschiedenen Strategien zur Bewältigung von Wassermangel und Hitze beruhen. Wassersparende Pflanzen (water-save plants) schließen die Stomata, bevor sich das Wasserpotenzial drastisch ändert, um Schädigungen zu verhindern. Wasserverschwendende Pflanzen (water-spender plants) reduzieren das Wasserpotenzial durch das Öffnen der Stomata. Dadurch können diese Pflanzen Wasser aus tiefen Bodenschichte nachziehen, um den hohen stomatären Wasserverlust zu kompensieren. Im zweiten Kapitel wurde die thermische Stabilität der kutikulären Transpirationsbarriere der beiden Wüstenpflanzen Phoenix dactylifera L. (saver) und Citrullus colocynthis (L.) Schrad. (spender) verglichen. Der temperaturabhängige Anstieg der kutikulären Wasserpermeabilität von P. dactylifera verlief linear über einen Temperaturbereich von 25°C bis 50°C. Dagegen war der temperaturabhängige Anstieg der kutikulären Wasserpermeabilität von C. colocynthis zweiphasig. Der steile Anstieg der kutikulären Permeabilität bei Temperaturen ≥ 35°C weist auf eine thermisch induzierte Schädigung der kutikulären Transpirationsbarriere hin. Die spezielle chemische Zusammensetzung der Kutinmatrix und der kutikulären Wachse trägt zur ausgeprägten thermischen Resistenz der kutikulären Transpirationsbarriere von P. dactylifera bei. Die erfolgreiche Besiedlung von heißen und trockenen Regionen der Erde beruht auf einer Vielzahl von morphologischen und physiologischen Anpassungen wie der fotosynthetischen Hitzetoleranz. Eine hohe Verdunstungskapazität und hohe Temperaturen treten oft zusammen auf, wodurch das Pflanzenleben in ariden Klimazonen eingeschränkt wird. In Kapitel 3 wurde die kutikuläre Wasserpermeabilität, die kutikuläre Wachszusammensetzung sowie die fotosynthetische Hitzetoleranz von 14 nicht-sukkulenten Pflanzenarten aus einigen der heißesten und trockensten Biome Südamerikas, Europas und Asiens untersucht. Die Ergebnisse zeigen, dass die ausgewählten xerophilen Pflanzen eine hohe Variabilität in der kutikulären Wasserpermeabilität und der fotosynthetischen Hitzetoleranz aufwiesen. Beide physiologischen Merkmale konnten jedoch nicht mit dem ursprünglichen Standort der Arten assoziiert werden. Dennoch weisen xerophile Pflanzen mit einer effizienteren kutikulären Transpirationsbarriere eine höhere Hitzetoleranz auf, was auf eine mögliche Koevolution dieser Merkmale in trockenen Biomen hinweisen könnte. Darüber hinaus wurde die Effizienz der kutikulären Transpirationsbarriere in Zusammenhang mit der chemischen Zusammensetzung der kutikulären Wachse diskutiert KW - Plant cuticle KW - Arid biomes KW - Cuticular transpiration KW - Cuticular waxes KW - Water stress KW - Heat stress Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-167832 ER - TY - THES A1 - Schönwetter, Elisabeth Sofie T1 - Towards an understanding of the intricate interaction network of TFIIH T1 - Auf dem Weg zum Verständnis des komplexen TFIIH Interaktionsnetzwerkes N2 - The integrity of its DNA is fundamental for every living cell. However, DNA is constantly threatened by exogenous and endogenous damaging agents that can cause a variety of different DNA lesions. The severe consequences of an accumulation of DNA lesions are reflected in cancerogenesis and aging. Several DNA repair mechanisms ensure the repair of DNA lesions and thus maintain DNA integrity. One of these DNA repair mechanisms is nucleotide excision repair (NER), which is famous for its ability to address a large variety of structurally unrelated DNA lesions. A key component of eukaryotic NER is the transcription factor II H (TFIIH) complex, which is not only essential for DNA repair but also for transcription. The TFIIH complex is composed of ten subunits. How these subunits work together during NER to unwind the DNA around the lesion is, however, not yet fully understood. High-resolution structural data and biochemical insights into the function of every subunit are thus indispensable to understand the functional networks within TFIIH. The importance of an intact TFIIH complex is reflected in the severe consequences of patient mutations in the TFIIH subunits XPB, XPD or p8 leading to the hallmark diseases xeroderma pigmentosum, Cockayne syndrome and trichothiodystrophy. Defects in the NER pathway are further associated with several types of cancer including skin cancer. The herein described work focused on five TFIIH subunits derived from the thermophilic fungus Chaetomium thermophilum, the p34/p44 pair and the ternary XPB/p52/p8 complex. The interaction between p34 and p44 was characterized based on a high-resolution structure of the p34_vWA/p44_RING minimal complex. Biochemical studies of the p34/p44 interaction led to the disclosure of an additional interaction between the p34 and p44 subunits, which had not been characterized so far. The p34/p44 interaction was shown to be central to TFIIH, which justifies the presence of several redundant interfaces to safeguard the interaction between the two proteins and might explain why so far, no patient mutations in these subunits have been identified. The p52 subunit of TFIIH was known to be crucial to stimulate the ATPase activity of XPB, which is required during NER. This work presents the first entire atomic resolution structural characterization of p52, which was derived of several crystal structures of p52 variants and a p52/p8 variant thereby demonstrating the interaction between p52 and p8. The precise structural model of p52 offered the possibility to investigate interactions with other TFIIH subunits in more detail. The middle domain 2 of p52 and the N-terminal domain of XPB were shown to mediate the main interaction between the two subunits. An analysis of the p52 crystal structures within recently published cryo-electron microscopy structures of TFIIH provides a model of how p52 and p8 stimulate the ATPase activity of XPB, which is essential for NER and transcription. The structural and biochemical findings of this work provide an additional building block towards the uncovering of the architecture and function of this essential transcription factor. N2 - Die Unversehrtheit ihrer DNA ist für jede lebende Zelle elementar. Die DNA ist jedoch fortwährend exogenen und endogenen Toxinen ausgeliefert, die eine Vielfalt unterschiedlicher DNA-Schäden verursachen. Die sehr ernsthaften Konsequenzen einer Anhäufung von DNA-Schäden spiegeln sich in der Entstehung von Tumorerkrankungen und Alterung wider. Verschiedene DNA-Reparaturmechanismen sorgen für die Reparatur von DNA-Schäden und erhalten so die Unversehrtheit der DNA. Einer dieser DNA-Reparaturmechanismen ist die Nukleotid-Exzisions-Reparatur (NER), die bekannt dafür ist, eine Vielfalt an strukturell unterschiedlichen DNA-Schäden zu adressieren. Eine Schlüsselkomponente der eukaryotischen NER ist der Transkriptionsfaktor II H (TFIIH), welcher nicht nur für die DNA-Reparatur, sondern auch für die Transkription essentiell ist. Der TFIIH Komplex besteht aus zehn Untereinheiten. Wie diese Untereinheiten zusammenarbeiten, um die DNA um den Schaden herum zu entwinden, ist jedoch noch nicht hinreichend bekannt. Hochaufgelöste Strukturdaten und biochemische Einblicke in die Funktion jeder Untereinheit sind daher unabkömmlich, um das funktionelle Netzwerk innerhalb dieses Transkriptionsfaktors zu verstehen. Die Bedeutung eines intakten TFIIH Komplexes spiegelt sich in den verheerenden Folgen von Patientenmutationen in den TFIIH Untereinheiten XPB, XPD oder p8 wider, die zu den kennzeichnenden Krankheitsbildern von Xeroderma Pigmentosum, Cockayne Syndrom und Trichothiodystrophie führen. Ein fehlerhafter NER Reparaturweg ist ferner mit einigen Krebsarten wie Hautkrebs assoziiert. Die hier beschriebene Arbeit hat sich auf fünf TFIIH Untereinheiten konzentriert, die aus dem thermophilen Pilz Chaetomium thermophilum stammen, das p34/p44 Heterodimer und der ternäre XPB/p52/p8 Komplex. Die Interaktion zwischen p34 und p44 wurde basierend auf einer hochaufgelösten Kristallstruktur des p34_vWA/p44_RING Minimalkomplexes charakterisiert. Biochemische Studien der p34/p44 Interaktion haben zur Aufdeckung einer weiteren Interaktion zwischen p34 und p44 geführt, die bisher noch nicht charakterisiert wurde. Die p34/p44 Interaktion ist von zentraler Bedeutung für TFIIH, was die Gegenwart mehrerer redundanter Schnittstellen zwischen p34 und p44, um die p34/p44 Interaktion abzusichern, rechtfertigt und erklären könnte, warum bislang keine Patientenmutationen in diesen Untereinheiten identifiziert wurden. Die p52 Untereinheit von TFIIH ist bekannt dafür, die ATPase-Aktivität von XPB zu stimulieren, die während der NER benötigt wird. Diese Arbeit zeigt die erste vollständige atomare strukturelle Charakterisierung von p52, die aus verschiedenen Kristallstrukturen von p52 Varianten und einer p52/p8 Variante, welche die Interaktion zwischen p52 und p8 darstellt, stammt. Das Strukturmodel von p52 bietet die Möglichkeit Interaktionen mit anderen TFIIH Untereinheiten zu analysieren. Es wurde gezeigt, dass die mittlere Domäne 2 von p52 und die N-terminale Domäne von XPB die hauptsächliche Interaktion zwischen den beiden Untereinheiten vermitteln. Eine Analyse der p52 Kristallstrukturen in neuesten publizierten cryo-Elektronenmikroskopie TFIIH-Strukturen ermöglichte die Erstellung eines Models, das zeigt, wie p52 und p8 die ATPase-Aktivität von XPB stimulieren, welche essentiell für die NER und die Transkription ist. Die strukturellen und biochemischen Erkenntnisse dieser Arbeit bieten einen wichtigen Beitrag zur Enthüllung der Architektur und Funktion von TFIIH, einem essentiellen zellulären Komplex. KW - DNS-Reparatur KW - Röntgenkristallographie KW - Strukturbiologie KW - DNA repair KW - TFIIH KW - Nucleotide excision repair KW - Nukleotid-Exzisions-Reparatur Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-168926 ER - TY - THES A1 - Brosi, Cornelia T1 - Functional characterization of the TTF complex and its role in neurodevelopmental disorders T1 - Funktionelle Charakterisierung des TTF-Komplexes und seine Rolle in neurologischen Entwicklungsstörungen N2 - The eukaryotic gene expression requires extensive regulations to enable the homeostasis of the cell and to allow dynamic responses due to external stimuli. Although many regulatory mechanisms involve the transcription as the first step of the gene expression, intensive regulation occurs also in the post-transcriptional mRNA metabolism. Thereby, the particular composition of the mRNPs plays a central role as the components associated with the mRNA form a specific “mRNP code” which determines the fate of the mRNA. Many proteins which are involved in this regulation and the mRNA metabolism are affected in diseases and especially neurological disorders often result from an aberrant mRNP code which leads to changes in the regulation and expression of mRNPs. The focus of this work was on a trimeric protein complex which is termed TTF complex based on its subunits TDRD3, TOP3β and FMRP. Biochemical investigations revealed that the three components of the TTF complex are nucleo-cytosolic shuttle proteins which localize in the cytoplasm at the steady-state, associate with mRNPs and are presumably connected to the translation. Upon cellular stress conditions, the TTF components concentrate in stress granules. Thus, the TTF complex is part of the mRNP code, however its target RNAs and function are still completely unknown. Since the loss of functional FMRP results in the fragile X syndrome and TOP3β is associated with schizophrenia and intellectual disability, the TTF complex connects these phenotypically related neuro-psychiatric disorders with each other on a molecular level. Therefore, the aim of this work was to biochemically characterize the TTF complex and to define its function in the mRNA metabolism. In this work, evidence was provided that TDRD3 acts as the central unit of the TTF complex and directly binds to FMRP as well as to TOP3β. Thereby, the interaction of TDRD3 and TOP3β is very stable, whereas FMRP is a dynamic component. Interestingly, the TTF complex is not bound directly to mRNA, but is recruited via the exon junction complex (EJC) to mRNPs. This interaction is mediated by a specific binding motif of TDRD3, the EBM. Upon biochemical and biological investigations, it was possible to identify the interactome of the TTF complex and to define the role in the mRNA metabolism. The data revealed that the TTF complex is mainly associated with “early” mRNPs and is probably involved in the pioneer round of translation. Furthermore, TOP3β was found to bind directly to the ribosome and thus, establishes a connection between the EJC and the translation machinery. A reduction of the TTF components resulted in selective changes in the proteome in cultured cells, whereby individual protein subsets seem to be regulated rather than the global protein expression. Moreover, the enzymatic analysis of TOP3β indicated that TOP3β is a type IA topoisomerase which can catalytically attack not only DNA but also RNA. This aspect is particularly interesting with regard to the connection between early mRNPs and the translation which has been revealed in this work. The data obtained in this work suggest that the TTF complex plays a role in regulating the metabolism of an early mRNP subset possibly in the course of the pioneer round of translation. Until now, the link between an RNA topoisomerase and the mRNA metabolism is thereby unique and thus provides a completely new perspective on the steps in the post-transcriptional gene expression and its regulation. N2 - Die eukaryotische Genexpression bedarf einer umfassenden Regulation um die Homöostase der Zelle zu gewährleisten und um dynamische Reaktionen auf externe Einflüsse zu ermöglichen. Obwohl viele der regulatorischen Mechanismen die Transkription als ersten Schritt der Genexpression betreffen, findet auch eine intensive Regulierung auf der Ebene des post-transkriptionellen mRNA-Metabolismus statt. Dabei spielt die jeweilige Zusammensetzung der mRNPs eine zentrale Rolle, da je nachdem, mit welchen Faktoren eine mRNA assoziiert ist, ein sog. „mRNP-Code“ entsteht, der das Schicksal der mRNA bestimmt. Viele der an der Regulierung und dem mRNA-Metabolismus beteiligten Proteine sind in Krankheiten betroffen und gerade neurologische Erkrankungen resultieren häufig von einem fehlerhaften mRNP-Code, der zu Veränderungen in der Regulation und Expression von mRNPs führt. Im Zentrum dieser Arbeit stand ein trimerer Proteinkomplex, der aufgrund seiner Untereinheiten TDRD3, TOP3β und FMRP als TTF-Komplex bezeichnet wird. Biochemische Daten haben gezeigt, dass die drei Komponenten des TTF-Komplexes nucleo-cytoplasmatische „Shuttle“-Proteine sind, die sich im „steady-state“ hauptsächlich im Cytoplasma befinden, mit mRNPs assoziieren und vermutlich mit der Translation in Verbindung stehen. Unter zellulären Stressbedingungen konzentrieren sich die TTF-Komponenten in Stress Granula. Der TTF-Komplex ist damit Teil des mRNP-Codes, dessen zelluläre Ziel-RNAs und Funktion bislang aber völlig unbekannt sind. Da der Verlust von funktionellem FMRP zu der Ausprägung des fragilen X Syndroms (FXS) führt und TOP3β mit Schizophrenie und geistiger Retardation in Verbindung steht, verbindet der TTF-Komplex phänotypisch verwandte neuro-psychiatrische Krankheiten auf molekularer Ebene miteinander. Das Ziel dieser Arbeit war es daher, den TTF-Komplex biochemisch zu charakterisieren und seine Funktion im mRNA-Metabolismus zu definieren. Im Zuge dieser Arbeit gelang der Nachweis, dass TDRD3 als zentrale Einheit des TTF-Komplexes agiert und sowohl FMRP als auch TOP3β direkt bindet. Die Interaktion von TDRD3 und TOP3β ist hierbei sehr stabil, FMRP ist hingegen eine dynamische Komponente. Interessanterweise wird der TTF-Komplex nicht direkt an mRNA gebunden, sondern über den Exon-Junction-Komplex (EJC) an mRNPs rekrutiert. Diese Interaktion wird durch ein spezifisches Bindungsmodul in TDRD3, dem sog. EBM vermittelt. In einer Reihe von biochemischen und systembiologischen Studien konnte das Interaktom des TTF-Komplexes bestimmt und seine Rolle im mRNA-Metabolismus definiert werden. Die Daten offenbarten, dass der TTF-Komplex primär mit „frühen“ mRNPs assoziiert ist und sehr wahrscheinlich an der „pioneer round of translation“ beteiligt ist. Weiterhin zeigte sich, dass TOP3β das Ribosom direkt bindet und somit eine Verbindung des EJC und der Translationsmaschinerie etabliert. Die Reduktion von Komponenten des TTF-Komplexes in kultivierten Zellen führte zu selektiven Änderungen im Proteom, wobei einzelne Proteinteilgruppen, jedoch nicht die globale Expression durch den TTF-Komplex reguliert zu sein scheinen. Die enzymatische Analyse von TOP3β hat darüber hinaus gezeigt, dass es sich um eine Topoisomerase vom Typ IA handelt, die nicht nur DNA sondern auch RNA angreifen kann. Dieser Aspekt ist besonders interessant im Zusammenhang der in dieser Arbeit aufgedeckten Verbindung von frühen mRNPs mit der Translation. Die im Rahmen dieser Arbeit erhaltenen Daten legen nahe, dass der TTF-Komplex eine Rolle bei der Regulation des Metabolismus „früher“ mRNP-Teilgruppen möglicherweise im Zuge der „Pionierrunde“ der Translation spielt. Dabei ist die Verbindung einer RNA-Topoisomerase mit dem mRNA-Metabolismus bisher einzigartig und eröffnet so eine ganz neue Sichtweise auf die post-transkriptionellen Schritte der Genexpression und ihre Regulation. KW - Messenger-RNP KW - Fragiles-X-Syndrom KW - Schizophrenie KW - Translation KW - Gene Expression KW - TTF complex KW - TDRD3 KW - TOP3b KW - FMRP Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-157783 ER - TY - THES A1 - Auer, Daniela T1 - Impact of the chlamydial deubiquitinase ChlaDUB1 on host cell defense T1 - Einfluss der chlamydiellen Deubiquitinase ChlaDUB1 auf die Wirtszellabwehr N2 - The human pathogen Chlamydia trachomatis is the main cause of sexually transmitted infections worldwide. The obligate intracellular bacteria are the causative agent of several diseases that reach from conjunctivitis causing trachoma and blindness as well as salpingitis and urethritis which can lead to infertility if left untreated. In order to gain genetically engineered Chlamydia that inducible knock down specific gene expression, the CRISPRi system was established in C. trachomatis. In a proof of principle experiment it was shown that C. trachomatis pCRISPRi:gCdu1III target ChlaDUB1 expression and reduce the protein amount up to 50 %. Knock-down of the DUB did not influence protein levels of anti-apoptotic Mcl-1 and did not make cells susceptible for apoptosis. However, reduced dCas9 protein size, bacterial growth impairment and off target effects interfering with the GFP signal, form obstacles in CRISPRi system in Chlamydia. For routinely use of the CRISPRi method in C. trachomatis further investigation is needed. Since the bacterial life cycle includes two morphological and functional distinct forms, it is essential for chlamydial spread to complete the development cycle and form infectious progeny. Therefore, Chlamydia has evolved strategies to evade the host immune system in order to stay undetected throughout the developmental cycle. The bacteria prevent host cell apoptosis via stabilization of anti-apoptotic proteins like Mcl-1, Survivin and HIF-1α and activate pro-survival pathways, inhibiting invasion of immune cells to the site of infection. The host cell itself can destroy intruders via cell specific defense systems that involve autophagy and recruitment of professional immune cells. In this thesis the role of the chlamydial deubiuqitinase ChlaDUB1 upon immune evasion was elucidated. With the mutant strain Ctr Tn-cdu1 that encodes for a truncated DUB due to transposon insertion, it was possible to identify ChlaDUB1 as a potent opponent of the autophagic system. Mutant inclusions were targeted by K48 and K63 chain ubiquitination. Subsequently the inclusion was recognized by autophagic receptors like p62, NBR1 and NDP52 that was reversed again by complementation with the active DUB. Xenophagy was promoted so far as LC3 positive phagosomes formed around the inclusion of Ctr Tn-cdu1, which did not fuse with the lysosome. The detected growth defect in human primary cells of Chlamydia missing the active DUB was not traced back to autophagy, but was due to impaired development and replication. It was possible to identify Ankib1, the E3 ligase, that ubiquitinates the chlamydial inclusion in a siRNA based screen. The activating enzyme Ube1 and the conjugating enzyme Ube2L3 are also essential in this process. Chlamydia have a reduced genome and depend on lipids and nutrients that are translocated from the host cell to the inclusion to proliferate. Recruitment of fragmented Golgi stacks to the inclusion surface was prevented when ChlaDUB1 was inactive, probably causing diminished bacterial growth. Additionally, the modification of the inclusion by Ankib1 and subsequent decoration by autophagic markers was not only present in human but also murine cells. Comparison of other Chlamydia strains and species revealed Ankib1 to be located at the proximity of the inclusion in C. trachomatis strains only but not in C. muridarum or C. pneumoniae, indicating that Ankib1 is specifically the E3 ligase of C. trachomatis. Moreover, the role of ChlaDUB1 in infected tissue was of interest, since ChlaDUB1 protein was also found in early EB stage and so might get in contact with invading immune cells after cell lysis. While bacteria spread and infect new host cells, Chlamydia can also infect immune cells. Infection of human neutrophils with Ctr Tn-cdu1 shows less bacterial survival and affirms the importance of the DUB for bacterial fitness in these cells. N2 - Chlamydia trachomatis ist weltweit der häufigste Auslöser von sexuell übertragenen Krankheiten. Das obligat intrazelluläre Bakterium manifestiert sich in diversen Krankheitsbildern, darunter Konjunktivitis, die zu einem Trachom oder sogar Erblindung führen kann und Salpingitis oder Urethritis, die unbehandelt unfruchtbar macht. Das CRISPRi System wurde in C. trachomatis etabliert, um genetisch veränderte Bakterien zu bekommen, in denen induzierbar die spezifische Genexpression herunter gefahren werden kann. Es wurde gezeigt, dass in C. trachomatis pCRISPRi:gCdu1III, einem Stamm, der mit der Genexpression von ChlaDUB1 interferiert, die Menge an ChlaDUB1 um bis zu 50 % reduziert ist. Die Sensitivität für Apoptose durch sinkende Mcl-1 Proteinmengen wurde dadurch jedoch nicht wieder hergestellt. Das verkürzte dCas9 Protein, vermindertes bakterielles Wachstum, sowie Effekte auf andere Genexpressionen, wie z.B. das GFP Signal zeigen die Problematik des CRISPRi Systems in C. trachomatis. Um CRISPRi als Routinemethode für genetische Transformation in Chlamydien zu etablieren, stehen noch weitere Untersuchungen an. Der Lebenszyklus von Chlamydien zeichnet sich durch zwei morphologisch und funktionell unterschiedliche Stadien aus, weshalb die Vollendung des Lebenszyklus und die Produktion infektiöser Partikel essenziell sind. Daher haben die Pathogene Strategien entwickelt, um dem Immunsystem des Wirts zu entgehen und sich unerkannt in der Zelle zu entwickeln. Die Bakterien verhindern Apoptose infizierter Zellen durch die Stabilisierung von anti-apoptotischen Proteinen wie Mcl-1, Survivin und HIF-1α und aktivieren Überlebens-Signalwege, die die Invasion von Immunzellen in das infizierte Gewebe unterdrücken. Die Wirtszelle selbst ist in der Lage bakterielle Eindringlinge durch die eigenen Abwehrmechanismen wie Autophagie und die Rekrutierung von professionellen Immunzellen zu zerstören. In dieser Arbeit wurde die Rolle der chlamydiellen Deubiquitinase ChlaDUB1 auf die Vermeidungsstrategien vor dem Immunsystem untersucht. Mit Hilfe der Mutante Ctr Tn-cdu1, die durch Insertion eines Transposons für eine verkürzte und inaktive Deubiquitinase codiert, konnte gezeigt werden, dass ChlaDUB1 ein Gegenspieler des Autophagiesystems ist. Die Inklusionen der Mutante wurden mit K48 und K63 Ubiquitinketten modifiziert, was die Rekrutierung von Autophagiemarkern wie p62, NBR1 und NDP52 zur Folge hatte. Die Rekomplementierung mit aktivem ChlaDUB1 Protein hob die Modifikation der Inklusion wieder auf. Jedoch wurde die Xenophagie so weit vorangetrieben, bis sich LC3 positive Phagosomen um die Inklusionen von Ctr Tn-cdu1 bildeten, die allerdings nicht mit dem Lysosom verschmolzen. Das beobachtete Wachstumsdefizit in Chlamydien, die keine funktionelle Deubiquitinase exprimieren, konnte nicht auf die Autophagie zurückgeführt werden, sondern war voraussichtlich aufgrund verlangsamter Entwicklung und Replikation entstanden. In einem siRNA basierten Experiment konnte die E3 Ligase Ankib1 für die Ubiquitinierung der Ctr Tn-cdu1 Inklusion identifiziert werden. Des Weiteren sind das Ubiquitin aktivierende Enzym Ube1 und das Ubiquitin konjugierende Enzym Ube2L3 essentiell für die Modifikation der Inklusion. Da Chlamydien ein reduziertes Genom haben und nicht für alle Enzyme selbst kodieren, sind sie auf Lipide und Metabolite der Wirtszelle für ihr Wachstum angewiesen. Die Rekrutierung der fragmentierten Glogi-Membranen zur Inklusionsoberfläche wurde durch inaktives ChlaDUB1 Protein verhindert, das wahrscheinlich die bakterielle Entwicklung negativ beeinflusst. Des Weiteren ubiquitinierte Ankib1 nicht nur Inklusionen in humanen, sondern auch in murinen Zellen, was auch hier die Bindung von Autophagiemarkern zur Folge hatte. Der Vergleich unter verschiedenen chlamydiellen Serotypen und Arten zeigte, dass Ankib1 nur an Inklusionen von C. trachomatis zu finden war, nicht aber für C. muridarum oder C. pneumoniae. Des Weitern wurde die Rolle von ChlaDUB1 in infiziertem Gewebe genauer betrachtet, da die Protease auch während frühen EB Phasen nachgewiesen wurde, in denen sie Kontakt zu immigrierenden Immunzellen haben könnte. Während der Zelllyse werden Bakterien frei gesetzt, die neue Wirtszellen, aber auch Immunzellen, infizieren können. Die Infektion von humanen Neutrophilen mit Ctr Tn-cdu1 zeigte vermindertes bakterielles Wachstum und verdeutlicht die Bedeutung von ChlaDUB1 für das Überleben in diesen Immunzellen. KW - Chlamydia KW - Golgi KW - ChlaDUB1 KW - Cdu1 Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-178462 ER - TY - THES A1 - Kimbadi Lombe, Blaise T1 - Novel-Type Dimeric Naphthylisoquinoline Alkaloids from Congolese Ancistrocladus Lianas: Isolation, Structural Elucidation, and Antiprotozoal and Anti-Tumoral Activities T1 - Dimere Naphthylisoquinolin-Alkaloide des neuen Typs aus kongolesischen Ancistrocladus-Lianen: Isolierung, Strukturaufklärung und antiprotozoale und antitumorale Aktivitäten N2 - Herein described is the discovery of three novel types of dimeric naphthylisoquinoline alkaloids, named mbandakamines, cyclombandakamines, and spirombandakamines. They were found in the leaves of a botanically as yet unidentified, potentially new Ancistrocladus species, collected in the rainforest of the Democratic Republic of the Congo (DRC). Mbandakamines showed an exceptional 6′,1′′-coupling, in the peri-position neighboring one of the outer axes, leading to an extremely high steric hindrance at the central axis, and to U-turn-like molecular shape, which – different from all other dimeric NIQs, whose basic structures are all quite linear – brings three of the four bicyclic ring systems in close proximity to each other. This created an unprecedented follow-up chemistry, involving ring closure reactions, leading to two further, structurally even more intriguing subclasses, the cyclo- and the spirombandakamines, displaying eight stereogenic elements (the highest total number ever found in naphthylisoquinoline alkaloids). The metabolites exhibited pronounced antiplasmodial and antitrypanosomal activities. Likewise reported in this doctoral thesis are the isolation and structural elucidation of naphthylisoquinoline alkaloids from two further potentially new Ancistrocladus species from DRC. Some of these metabolites have shown pronounced antiausterity activities against human pancreatic cancer PANC-1 cells. N2 - In dieser Arbeit wird die Entdeckung von drei neuen Typen von dimeren Naphthylisochinolin-Alkaloiden (NIQs) beschrieben, die als Mbandakamine, Cyclombandakamine und Spirombandakamine bezeichnet werden. Sie wurden in den Blättern einer botanisch noch nicht identifizierten, möglicherweise neuen Ancistrocladus-Art gefunden, die im Regenwald der Demokratischen Republik Kongo (DR Kongo) gesammelt wurde. Mbandakamine zeigen eine außergewöhnliche 6',1''-Kupplung in der peri-Position neben einer der äußeren Achsen, was zu einer extrem hohen sterischen Hinderung an der zentralen Achse und zu einer U-förmigen Molekülform führt. Diese unterschiedet sich von allen anderen dimeren NIQs, deren Grundstrukturen alle ziemlich linear sind. Im Fall der Mbandakamine werden drei der vier bicyclischen Ringsysteme in enger Nachbarschaft zueinander gebracht. Dies führte zu einer beispiellosen Folgechemie mit Ringschlussreaktionen, die zu zwei weiteren, strukturell noch faszinierenderen Unterklassen führte, den Cyclo- und Spirombandakaminen, die acht stereogene Elemente aufweisen (die höchste Gesamtzahl, die jemals in Naphthylisochinolin-Alkaloiden gefunden wurde). Die Metaboliten zeigten ausgeprägte antiplasmodiale und antitrypanosomale Aktivitäten. Ebenfalls in dieser Dissertation wird über die Isolierung und Strukturaufklärung von Naphthylisochinolin-Alkaloiden aus zwei weiteren potentiell neuen Ancistrocladus-Arten aus der DR Kongo berichtet. Einige dieser Metaboliten zeigten ausgeprägte Antiaustizitäts-Aktivitäten gegen humane Pankreaskrebs-PANC-1-Zellen. KW - Isolation KW - Isolierung KW - Structural elucidation KW - Naphthylisoquinoline KW - Alkaloid KW - Dimer KW - Natural Products KW - Ancistrocladus KW - Congo KW - Pancreatic cancer KW - Antiausterity activity KW - Anti-infectious activity KW - Strukturaufklärung KW - Naphthylisoquinolin KW - Alkaloide KW - Dimere KW - Ancistrocladus KW - Kongo KW - Naphthylisochinolinalkaloide KW - Ancistrocladaceae KW - Dimere KW - Isolierung KW - Strukturaufklärung Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-191789 ER - TY - THES A1 - Spieler, Valerie T1 - Bioinspired drug delivery of interleukin-4 T1 - Bioinspirierte Wirkstofffreisetzung von Interleukin-4 N2 - Chronic inflammatory diseases such as rheumatoid arthritis, type 2 diabetes and cardiovascular diseases, are associated with the homeostatic imbalance of one of several physiological systems combined with the lack of spontaneous remission, which causes the disease to persevere throughout patients’ lives. The inflammatory response relies mainly on tissue-resident, pro-inflammatory M1 type macrophages and, consequently, a chance for therapeutic intervention lies in driving macrophage polarization towards the anti-inflammatory M2 phenotype. Therefore, anti-inflammatory cytokines that promote M2 polarization, including interleukin-4 (IL4), have promising therapeutic potential. Unfortunately, their systemic use is hampered by a short serum half-life and dose-limiting toxicity. On the way towards cytokine therapies with superior safety and efficacy, this thesis is focused on designing bioresponsive delivery systems for the anti-inflammatory cytokine IL4. Chapter 1 describes how anti-inflammatory cytokines are tightly regulated in chronic, systemic inflammation as in rheumatoid arthritis but also in acute, local inflammation as in myocardial infarction. Both diseases show a characteristic progression during which anti-inflammatory cytokine delivery is of variable benefit. A conventional, passive drug delivery system is unlikely to release the cytokines such that the delivery matches the dynamic course of the (patho-)physiological progress. This chapter presents a blueprint for active drug delivery systems equipped with a 24/7 inflammation detector that continuously senses for matrix metalloproteinases (MMP) as surrogate markers of the disease progress and responds by releasing cytokines into the affected tissues at the right time and place. Because they are silent during phases of low disease activity, bioresponsive depots could be used to treat patients in asymptomatic states, as a preventive measure. The drug delivery system only gets activated during flares of inflammation, which are then immediately suppressed by the released cytokine drug and could prevent the steady damage of subclinical chronic inflammation, and therefore reduce hospitalization rates. In a first proof of concept study on controlled cytokine delivery (chapter 2), we developed IL4-decorated particles aiming at sustained and localized cytokine activity. Genetic code expansion was deployed to generate muteins with the IL4’s lysine 42 replaced by two different unnatural amino acids bearing a side chain suitable for click chemistry modification. The new IL4 muteins were thoroughly characterized to ensure proper folding and full bioactivity. Both muteins showed cell-stimulating ability and binding affinity to IL4 receptor alpha similar to those of wild type IL4. Copper-catalyzed (CuAAC) and strain-promoted (SPAAC) azide–alkyne cycloadditions were used to site-selectively anchor IL4 to agarose particles. These particles had sustained IL4 activity, as demonstrated by the induction of TF-1 cell proliferation and anti-inflammatory M2 polarization of M-CSF-generated human macrophages. This approach of site-directed IL4 anchoring on particles demonstrates that cytokine-functionalized particles can provide sustained and spatially controlled immune-modulating stimuli. The idea of a 24/7 sensing, MMP driven cytokine delivery system, as described in the introductory chapter, was applied in chapter 3. There, we simulated the natural process of cytokine storage in the extracellular matrix (ECM) by using an injectable solution of IL4 for depot formation by enzyme-catalyzed covalent attachment to ECM components such as fibronectin. The immobilized construct is meant to be cleaved from the ECM by matrix-metalloproteinases (MMPs) which are upregulated during flares of inflammation. These two functionalities are facilitated by a peptide containing two sequences: a protease-sensitive peptide linker (PSL) for MMP cleavage and a sequence for covalent attachment by activated human transglutaminase FXIIIa (TGase) included in the injection mix for co-administration. This peptide was site-selectively conjugated to the unnatural amino acid at IL4 position 42 allowing to preserve wild type bioactivity of IL4. In vitro experiments confirmed the anticipated MMP response towards the PSL and TGase-mediated construct attachment to fibronectin of the ECM. Furthermore, the IL4-peptide conjugates were able to reduce inflammation and protect non-load bearing cartilage along with the anterior cruciate ligament from degradation in an osteoarthritis model in rabbits. This represents the first step towards a minimally invasive treatment option using bioresponsive cytokine depots with potential clinical value for inflammatory conditions. One of the challenges with this approach was the production of the cytokine conjugate, with incorporation of the unnatural amino acid into IL4 being the main bottleneck. Therefore, in chapter 4, we designed a simplified version of this depot system by genetically fusing the bifunctional peptide via a flexible peptide spacer to murine IL4. While human IL4 loses its activity upon C-terminal elongation, murine IL4 is not affected by this modification. The produced murine IL4 fusion protein could be effectively bound to in vitro grown extracellular matrix in presence of TGase. Moreover, the protease-sensitive linker was selectively recognized and cleaved by MMPs, liberating intact and active IL4, although at a slower rate than expected. Murine IL4 offers the advantage to evaluate the bioresponsive cytokine depot in many available mouse models, which was so far not possible with human IL4 due to species selectivity. For murine IL4, the approach was further extended to systemic delivery in chapter 5. To increase the half-life and specifically target disease sites, we engineered a murine IL4 variant conjugated with a folate-bearing PEG chain for targeting of activated macrophages. The bioactive IL4 conjugate had a high serum stability and the PEGylation increased the half-life to 4 h in vivo. Surprisingly, the folate moiety did not improve targeting in an antigen-induced arthritis (AIA) mouse model. IL4-PEG performed better in targeting the inflamed joint, while IL4-PEG-folate showed stronger accumulation in the liver. Fortunately, the modular nature of the IL4 conjugate facilitates convenient adaption of PEG chain length and the targeting moiety to further improve the half-life and localization of the cytokine. In summary, this thesis describes a platform technology for the controlled release of cytokines in response to inflammation. By restricting the release of the therapeutic to the site of inflammation, the benefit-risk ratio of this potent class of biologics can be positively influenced. Future research will help to deepen our understanding of how to perfectly combine cytokine, protease-sensitive linker and immobilization tag or targeting moiety to tackle different diseases. N2 - Chronische Entzündungskrankheiten wie rheumatoide Arthritis, Typ-2-Diabetes oder Herz-Kreislauf-Erkrankungen werden durch das Ungleichgewicht eines von mehreren physiologischen Systemen in Verbindung mit fehlender spontaner Remission verursacht, wodurch die Krankheiten lebenslang bestehen bleiben. Die zugrunde liegenden Entzündungsreaktionen beruhen hauptsächlich auf im Gewebe vorhandenen Makrophagen und deren Polarisation in Richtung des entzündlichen M1-Phänotyps, was gleichzeitig die Möglichkeit einer therapeutischen Intervention bietet. Entzündungshemmende Zytokine, einschließlich Interleukin-4 (IL4), haben ein großes therapeutisches Potenzial, da sie Makrophagen in Richtung des entzündungshemmenden M2-Phänotyps zu polarisieren vermögen. Leider ist ihre systemische Anwendung durch eine kurze Serumhalbwertszeit und dosislimitierende Toxizität eingeschränkt. Auf dem Weg zu Zytokintherapeutika mit verbesserter Sicherheit und Wirksamkeit konzentriert sich diese Arbeit auf die Entwicklung von bioresponsiven Freisetzungssystemen für das entzündungshemmende Zytokin IL4. Kapitel 1 beschreibt, wie entzündungshemmende Zytokine bei chronischen systemischen Entzündungen wie rheumatoider Arthritis im Vergleich zu akuten lokalen Entzündungen wie dem Myokardinfarkt reguliert werden. Beide Erkrankungen zeigen einen charakteristischen Verlauf, währenddessen die Freisetzung von entzündungshemmenden Zytokinen von unterschiedlich großem Nutzen ist. Gewöhnliche, passive Arzneimittelfreisetzungssysteme sind nicht in der Lage, Zytokine in idealer Menge zur optimalen Unterdrückung des dynamischen, (patho-)physiologischen Verlaufs der Krankheit freizusetzen. In diesem Kapitel werden deshalb aktive Arzneimittelfreisetzungssysteme vorgestellt, die mit einer Sensorik für die Entzündung ausgestattet sind, mit der sie kontinuierlich die Konzentration von Matrix-Metalloproteinasen (MMP) als Indikatoren für den Krankheitsverlauf erfassen können. Somit kann das aktive Arzneimittelfreisetzungssystem krankes Gewebe zum richtigen Zeitpunkt und am richtigen Ort mit Zytokinen behandeln. Solche bioresponsiven Depots können zur vorbeugenden Behandlung von asymptomatischen Patienten eingesetzt werden, da sie während Phasen geringer Krankheitsaktivität inaktiv sind. Das Freisetzungssystem wird erst durch Entzündungsschübe aktiviert, die dann sofort durch die freigesetzten Zytokine unterdrückt werden. Dadurch könnte die dauerhafte Schädigung durch subklinische, chronische Entzündung verhindert und als Konsequenz die Hospitalisierungsrate gesenkt werden. In einer ersten Machbarkeitsstudie wurden in Kapitel 2 IL4-dekorierte Partikel mit dem Ziel entwickelt, eine langanhaltende und lokalisierte Zytokinaktivität zu gewährleisten. Dazu wurden IL4-Muteine erzeugt, bei denen das Lysin 42 mittels Erweiterung des genetischen Codes durch zwei verschiedene unnatürliche Aminosäuren ersetzt wurde, die jeweils eine für Klick-Chemie geeignete Seitenkette tragen. Die IL4-Muteine wurden ausführlich charakterisiert, um eine korrekte Faltung und volle Bioaktivität sicherzustellen. Beide Muteine zeigten zellstimulierende Fähigkeit und Bindungsaffinität an IL4-Rezeptor-alpha, die mit der von Wildtyp-IL4 vergleichbar ist. Anschließend wurde kupferkatalysierte (CuAAC) und kupferfreie (SPAAC) Azid-Alkin-Cycloaddition verwendet, um IL4 ortsspezifisch auf Agarosepartikeln zu verankern. Die Partikel waren in der Lage, die IL4-Aktivität über längere Zeit aufrecht zu erhalten, was durch TF-1-Zellproliferation und M2-Polarisation von M-CSF-generierten, humanen Makrophagen gezeigt werden konnte. Dieser Ansatz der ortsspezifischen Verankerung von IL4 auf Agarosepartikeln zeigt, dass zytokinfunktionalisierte Partikel anhaltende und räumlich kontrollierte, immunmodulierende Stimuli liefern können. Die Idee eines MMP-gesteuerten Zytokinfreisetzungssystems mit 24/7-Sensorik, das im Einleitungskapitel vorgestellt wurde, wurde in Kapitel 3 umgesetzt. Der natürliche Prozess der Zytokinspeicherung in der extrazellulären Matrix (EZM) wurde mithilfe einer injizierbaren IL4-Lösung zur enzymatischen Depotbildung durch kovalente Bindung an EZM-Komponenten, z. B. Fibronektin, simuliert. Nach der Bindung soll das Konstrukt durch Matrix-Metalloproteinasen (MMPs), die während Entzündungsschüben hochreguliert werden, aus der EZM freigesetzt werden können. Eine Peptidsequenz, die ein Protease-sensitives Verbindungsstück und eine Sequenz, mit der das Zytokin bei gleichzeitiger Injektion von aktivierter menschlicher Transglutaminase FXIIIa (TGase) kovalent auf der EZM immobilisiert wird enthält, wurde ortsspezifisch über eine unnatürliche Aminosäure an Position 42 von IL4 gekoppelt. Dadurch wurde die Bioaktivität von IL4 vollständig erhalten, während das Protease-sensitive Verbindungsstück auf MMPs reagierte und das Konstrukt durch TGase an das Fibronektin der EZM gebunden werden konnte. Die IL4-Peptid-Konjugate waren in einem Osteoarthritis-Modell bei Kaninchen in der Lage, die Entzündung des Kniegelenks zu verringern und den nicht-tragenden Knorpel sowie das vordere Kreuzband vor Degradation zu schützen. Dies ist der erste Schritt in Richtung einer minimalinvasiven Behandlung durch Verwendung von bioresponsiven Zytokindepots mit potenziellem klinischem Nutzen bei Entzündungserkrankungen. Eine der Herausforderungen bei diesem Vorgehen war die Herstellung der Zytokinkonjugate, wobei der Einbau der unnatürlichen Aminosäure in IL4 den größten Engpass darstellte. Deshalb wurde in Kapitel 4 eine vereinfachte Version dieses Depotsystems entworfen, indem das bifunktionelle Peptid über eine flexible Verbindungssequenz mit murinem IL4 genetisch fusioniert wurde. Während humanes IL4 bei C-terminaler Verlängerung an Aktivität verliert, ist murines IL4 durch die Modifikation nicht beeinflusst. Die murinen IL4-Fusionsproteine konnten in Gegenwart von TGase wirksam an in vitro generierte extrazelluläre Matrix gebunden werden. Darüber hinaus wurde das Protease-sensitive Verbindungsstück selektiv von MMPs erkannt und gespalten, wobei intaktes und aktives IL4 freigesetzt wurde, wenn auch mit einer langsameren Rate als erwartet. Murines IL4 bietet die Möglichkeit das bioresponsive Zytokindepot in den vielen verfügbaren Mausmodellen zu testen, was mit humanem IL4 aufgrund der Speziesselektivität nicht möglich ist. Für murines IL4 wurde die Entwicklung in Kapitel 5 auf die systemische Applikation ausgeweitet. Um die Serumhalbwertszeit zu erhöhen und eine Wirkstofflokalisation im entzündeten Gewebe zu erreichen, wurde eine murine IL4-Variante entwickelt, die mit einer Folat-tragenden PEG-Kette konjugiert wurde, um aktivierte M1 Makrophagen zu adressieren. Das bioaktive IL4-Konjugat wies eine hohe Serumstabilität auf und die PEGylierung erhöhte die Halbwertszeit in vivo auf 4 h. Allerdings konnte durch die Konjugation der Folatgruppe an IL4 die Wirkstofflokalisation in einem Mausmodell mit Antigen-induzierter Arthritis (AIA) nicht verbessert werden. IL4-PEG akkumulierte sich stärker im entzündeten Gelenk, während IL4-PEG-Folat eine stärkere Anreicherung in der Leber zeigte. Erfreulicherweise erleichtert der modulare Aufbau des IL4-Konjugats die bequeme Anpassung der PEG-Kettenlänge und der zielorientierten Einheit, um die Halbwertszeit und Lokalisierung des Zytokins weiter zu verbessern. Zusammenfassend beschreibt diese Arbeit eine Plattformtechnologie zur kontrollierten Freisetzung von Zytokinen als Reaktion auf Entzündungen. Durch die Beschränkung der Freisetzung des Therapeutikums auf den Ort der Entzündung kann das Nutzen-Risiko-Verhältnis dieser potenten Klasse von Biologika positiv beeinflusst werden. Zukünftige Forschungen werden dazu beitragen zu verstehen, wie Zytokin, Protease-sensitives Verbindungsstück und Immobilisierungsanhängsel oder etwaige zielorientierte Einheiten zur Bekämpfung verschiedener Krankheiten perfekt kombiniert werden können. KW - Targeted drug delivery KW - Kontrollierte Wirkstofffreisetzung KW - Interleukin 4 KW - Cytokine KW - Drug delivery platform KW - Protease-sensitive release KW - Site-specific protein conjugation Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-193590 ER - TY - THES A1 - da Cruz Güerisoli, Irene Maria T1 - Investigating the murine meiotic telomere complex TERB1-TERB2-MAJIN: spatial organization and evolutionary history T1 - Untersuchung des murinen meiotischen Telomer-Komplex TERB1-TERB2-MAJIN: spatiale Organisation und Evolutionsgeschichte N2 - Einess der faszinierenden Merkmale der meiotischen Prophase I sind die hochkonservierten kräftigen Bewegungen homologer Chromosomen. Diese Bewegungen sind entscheidend für den Erfolg von Schlüsselereignissen wie die Ausrichtung, Paarung und Rekombination der homologen Chromosomen. Mehrere bisher untersuchte Organismen, darunter Säugetiere, Würmer, Hefen und Pflanzen, erreichen diese Bewegungen, indem sie die Chromosomenenden an spezialisierten Stellen in der Kernhülle verankern. Diese Verankerung erfordert Telomer-Adapterproteine, die bisher in der Spalthefe und der Maus identifiziert wurden. Die meiosespezifischen Telomer-Adapterproteine der Maus, TERB1, TERB2 und MAJIN, sind an der Verankerung des ubiquitären Telomer-Shelterin-protein an den LINC-Komplex beteiligt, mit einem analogen Mechanismus, wie er die Spalthefe beschrieben wird. Obgleich die meiose-spezifischen TelomerAdapterproteine eine wesentliche Rolle spielen, ist der genaue Mechanismus der Verankerung der Telomere an die Kernhülle sowie ihre evolutionäre Geschichte bisher noch wenig verstanden. Das Hauptziel dieser Arbeit ist daher die Untersuchung der Organisation des meiosespezifischen TelomerAdapterkomplexes TERB1-TERB2-MAJIN der Maus und dessen Evolutionsgeschichte. Im ersten Teil dieser Arbeit wurde die Organisation des TERB1-TERB2-MAJIN Komplexes mittels hochauflösender Mikroskopie (SIM), an Mausspermatozyten untersucht, sowie die Lokalisation in Bezug auf TRF1 des Telomer-ShelterinKomplexes und die telomerische DNA analysiert. In den Stadien Zygotän und Pachytän zeigten die Fluoreszenzsignale eine starke Überlappung der Verteilung der meiotischen Telomer-Komplex-Proteine, wobei die Organisation von TERB2 an den Chromosomenenden heterogener war als die von TERB1 und MAJIN. Außerdem konnte die TRF1-Lokalisation an den Enden der Lateralelemente (LEs) mit einer griffartigen Anordnung um die TERB1- und MAJIN-Signale im Zygotän- und Pachytän-Stadium gezeigt werden. Interessanterweise erwies sich die telomerische DNA als lateral verteilt und teilweise überlappend mit der zentralen Verteilung der meiotischen Telomer-Komplex-Proteine an den Enden der LEs. Die Kombination dieser Ergebnisse erlaubte die Beschreibung eines alternativen Modells der Verankerung der Telomer an die Kernhülle während der meiotischen Prophase I. Der zweite Teil dieser Arbeit analysiert die Evolutionsgeschichte der Mausproteine von TERB1, TERB2 und MAJIN. Die fehlende Übereinstimmung zwischen den Meiose-spezifische Telomer-Adapteproteinen der Maus und der Spalthefe hat die Frage nach dem evolutionsbedingten Ursprung dieses spezifischen Komplexes aufgeworfen. Um vermeintliche Orthologen der Mausproteinevon TERB1, TERB2 und MAJIN über Metazoen hinweg zu identifizieren, wurden computergestützte Verfahren und phylogenetische Analysen durchgeführt. Darüber hinaus wurden Expressionsstudien implementiert, um ihre potenzielle Funktion während der Meiose zu testen. Die Analysen haben ergeben, dass der Meiose-spezifische Telomer-Komplex der Maus sehr alt ist, da er bereits in den Eumetazoen entstand, was auf einen einzigen Ursprung hindeutet. Das Fehlen jeglicher Homologen des meiosespezifischen Telomerkomplexes in Nematoden und die einigen wenigen in Arthropoden nachgewiesenen Kandidaten, deuten darauf hin, dass die Telomer-Adapterproteine in diesen Abstammungslinien verloren/ersetzt oder stark diversifiziert worden sind. Bemerkenswerterweise zeigten Proteindomänen von TERB1, TERB2 und MAJIN, die an der Bildung des Komplexes sowie an der Interaktion mit dem Telomer-Shelterin-Protein und den LINC-Komplexen beteiligt sind, eine hohe Sequenzähnlichkeit über alle Kladen hinweg. Abschließend lieferte die Genexpression im Nesseltier Hydra vulgaris den Beweis, dass der TERB1-TERB2-MAJIN-Komplex selektiv in der Keimbahn exprimiert wird, was auf die Konservierung meiotischer Funktionen über die gesamte Metazoen-Evolution hinweg hindeutet. Zusammenfassend bietet diese Arbeit bedeutende neue Erkenntnisse hinsichtlich des Meiose-spezifischen Telomer-Adapterkomplex, seines Mechanismus zur Verankerung der Telomer an die Kernhülle und die Entschlüsselung seines Ursprungs in den Metazoen. N2 - One of the fascinating features of meiotic prophase I, is the highly conserved vigorous movements of homologous chromosomes. These movements are critical for the success of essential events as homologs alignment, synapsis and recombination. Several organisms studied so far, including mammals, worms, yeast and plants achieve these movements by anchoring the chromosome ends to specialized sites in the nuclear envelope (NE). This attachment requires telomere adaptor proteins which have to date been identified in fission yeast and mice. The mouse meiosis-specific telomere adaptor proteins TERB1, TERB2, and MAJIN are involved in the attachment of ubiquitous shelterin telomere to the LINC complex, in an analogous mechanism as those described in fission yeast. Despite the essential role of meiosis-specific telomere adaptor proteins, the precise mechanism of anchorage of telomeres to the nuclear envelope, as well as their evolutionary history, are still not well understood. Therefore, the main aim of this thesis is to investigate the organization of the mouse meiosis-specific telomere adaptor complex TERB1-TERB2-MAJIN and its evolutionary history. In the first part of this thesis high-resolution Structured Illumination Microscopy (SIM), indirect immunofluorescence and Telo-FISH on mouse spermatocytes were used to determine precisely how the telomere complex proteins are localized with relation to the shelterin telomeric TRF1 protein and telomeric DNA. During zygotene and pachytene stages staining patterns revealed extensively overlapping of meiotic telomere complex proteins distributions in which TERB2 organization is more heterogeneous than TERB1 and MAJIN at the chromosome ends. Further, TRF1 localization was shown at the side of lateral elements (LEs) ends with grasp-like distribution surrounding the TERB1 and MAJIN signals in zygotene and pachytene stages. Interestingly, telomeric DNA was shown to be laterally distributed and partially overlapping with the more central distribution displayed by meiotic telomere complex proteins of LEs ends. The combination of these results allowed to describe an alternative model of the telomere attachment to the NE during meiotic prophase I. The second part of this thesis, analyses mouse TERB1, TERB2, and MAJIN evolutionary history. The lack of similarity between mouse and fission yeast meiotic-specific telomere adaptor proteins has raised the question about the origin of this specific complex through evolution. To identify mouse TERB1, TERB2, and MAJIN putative orthologues, computational approaches and phylogenetic analyses were performed. Besides, to test their potential function during meiosis, expression studies were conducted. From these analyses, it was revealed that mouse meiosis-specific telomere complex is ancient, as it originated as early as eumetazoans pointing to a single origin. The absence of any homologs in Nematoda and only a few candidates detected in Arthropoda for meiosis-specific telomere complex, seemed, that these proteins have been lost/replaced or highly diversified in these lineages. Remarkably, TERB1, TERB2, and MAJIN protein domains involved in the formation of the complex as well as those required for the interaction with the telomere shelterin protein and the LINC complexes revealed high sequence similarity across all clades. Finally, gene expression in the cnidarian Hydra Vulgaris provided evidence that the TERB1-TERB2-MAJIN complex is selectively expressed in the germline suggesting conservation of meiotic functions across metazoan evolution. In summary, this thesis provides significant insights into the meiosis-specific telomere complex mechanism to engage telomeres to the nuclear envelope and the elucidation of its origin in metazoans. KW - meiosis KW - chromosomes telomere-led movement KW - TERB1-TERB2-MAJIN KW - SIM KW - Evolution Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-210562 ER - TY - THES A1 - Meza Chincha, Ana Lucia T1 - Catalytic Water Oxidation with Functionalized Ruthenium Macrocycles T1 - Katalytische Wasseroxidation mit funktionalisierten Ruthenium Makrozyklen N2 - In light of the rapidly increasing global demand of energy and the negative effects of climate change, innovative solutions that allow an efficient transition to a carbon-neutral economy are urgently needed. In this context, artificial photosynthesis is emerging as a promising technology to enable the storage of the fluctuating energy of sunlight in chemical bonds of transportable “solar fuels”. Thus, in recent years much efforts have been devoted to the development of robust water oxidation catalysts (WOCs) leading to the discovery of the highly reactive Ru(bda) (bda: 2,2’-bipyridine-6,6’-dicarboxylic acid) catalyst family. The aim of this thesis was the study of chemical and photocatalytic water oxidation with functionalized Ruthenium macrocycles to explore the impact of substituents on molecular properties and catalytic activities of trinuclear macrocyclic Ru(bda) catalysts. A further objective of this thesis comprises the elucidation of factors that influence the light-driven water oxidation process with this novel class of supramolecular WOCs. N2 - Innovative Ansätze zur Ermöglichung eines effizienten Übergangs zur CO2-Neutralität werden angesichts der schnell steigenden Nachfrage nach Energie und der negativen Effekte des Klimawandels dringend gesucht. In diesem Zusammenhang hat das Konzept der künstlichen Photosynthese in den letzten Jahren für besondere Aufmerksamkeit gesorgt. In dieser Hinsicht erscheinen in 2009 erstmals beschriebenen Ru(bda) (bda: 2,2’-bipyridin-6,6’-dicarbonsäure) Wasseroxidationskatalysatoren besonders vielversprechend. Das Ziel dieser Forschungsarbeit war die Untersuchung von funktionalisierten Ruthenium Makrozyklen in der chemischen und photokatalytischen Wasseroxidation, um den Einfluss der Substituenten in den Liganden auf molekulare Eigenschaften und katalytische Aktivitäten der Makrozyklen zu analysieren. Des Weiteren sollten Faktoren identifiziert werden, welche Einfluss auf die Effizienz der Photokatalyse mit dieser neuartigen Klasse von supramolekularen Katalysatoren ausüben. KW - Rutheniumkomplexe KW - Ruthenium complexes KW - Supramolekulare Chemie KW - Katalyse KW - Wasser KW - metallosupramolecular chemistry KW - catalysis KW - water oxidation KW - Oxidation KW - Wasseroxidation KW - Metallosupramolekulare Chemie Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-209620 ER - TY - THES A1 - Hock, Andreas T1 - NHC-stabilized Alanes and Gallanes T1 - NHC-stabilisierte Alane und Gallane N2 - This thesis describes the synthesis and reactivity of NHC-stabilized Lewis-acid/Lewis-base adducts of alanes and gallanes (NHC = Me2ImMe, iPr2Im, iPr2ImMe, Dipp2Im, Dipp2ImH). As this field of research has developed tremendously, especially in the last five years, the first chapter provides an overview of the current state of knowledge. The influence of electronegative π-donor-substituents on the stability of the NHC alane adducts is examined in chapter 2. For this purpose, the carbene stabilized alanes (NHC)∙AlH3 (NHC = iPr2Im, Dipp2Im) were reacted with secondary amines of different steric demand and with phenols. The π-donor substituents saturate the Lewis acidic aluminium center and coordination of a second NHC-ligand was not observed. The strongly electronegative N and O substituents increase the Lewis acidity of the aluminium atom, which leads to stronger Al-CNHC as well as Al-H bonds, which inhibits the insertion of the carbene into the Al-H bond. In Chapter 3 the development of the synthesis and reactivity of carbene-stabilized gallanes is presented. The synthesis of NHC gallane adducts (NHC)∙GaH3, (NHC)∙GaH2Cl and (NHC)∙GaHCl2 and their reactivity towards NHCs and cAACMe were investigated in detail. The reaction of the mono- and dichlorogallanes (NHC)∙GaH2Cl and (NHC)∙GaHCl2 (NHC = iPr2ImMe, Dipp2Im) with cAACMe led to insertion of the cAACMe with formation of chiral and achiral compounds depending on the sterically demand of the used NHC. Furthermore, the formation of bis-alkylgallanes was observed for the insertion of two equivalents of cAACMe with release of the NHC ligand. Chapter 4 describes investigations concerning the synthesis and reactivity of NHC-stabilized iodoalanes and iodogallanes, which are suitable for the formation of cationic aluminium and gallium dihydrides. The reaction of (NHC)∙EH2I (E = Al, Ga) stabilized by the sterically less demanding NHCs (NHC = Me2ImMe, iPr2Im, iPr2ImMe) with an additional equivalent of the NHC led to the formation of the cationic bis-NHC aluminium and gallium dihydrides [(NHC)2∙AlH2]+I- and [(NHC)2∙GaH2]+I-. Furthermore, the influence of the steric demand of the used NHC was investigated. The adduct (Dipp2Im)∙GaH2I was reacted with an additional equivalent of Dipp2Im. Due to the bulk of the NHC used, rearrangement of one of the NHC ligands from normal to abnormal coordination occurred and the cationic gallium dihydride [(Dipp2Im)∙GaH2(aDipp2Im)] was isolated. Chapter 5 of this thesis reports investigations concerning the reduction of cyclopentadienyl-substituted alanes and gallanes with singlet carbenes. NHC stabilized pentamethylcyclopentadienyl aluminium and gallium dihydrides (NHC)∙Cp*MH2 (E = Al, Ga) were prepared by the reaction of (AlH2Cp*)3 with the corresponding NHCs or by the salt elimination of (NHC)∙GaH2I with KCp*. The gallane adducts decompose at higher temperatures with reductive elimination of Cp*H and formation of Cp*GaI. . The reductive elimination is preferred for sterically demanding NHCs (Dipp2Im > iPr2ImMe > Me2ImMe). In addition, NHC ring expansion of the backbone saturated carbene Dipp2ImH was observed for the reaction of the NHC with (AlH2Cp*)3, which led to (RER-Dipp2ImHH2)AlCp*. Furthermore, the reactivity of the adducts (NHC)∙Cp*EH2 (E = Al, Ga) towards cAACMe was investigated. The reaction of the alane adducts stabilized by the sterically more demanding NHCs iPr2ImMe and Dipp2Im afforded the exceptionally stable insertion product (cAACMeH)Cp*AlH V-10 with liberation of the NHC. The reaction of the gallium hydrides (NHC)∙Cp*GaH2 with cAACMe led to the reductive elimination of cAACMeH2 and formation of Cp*GaI. A variety of neutral and cationic carbene-stabilized alanes and gallanes are presented in this work. The introduction of electronegative π-donor substituents (Cl-, I-, OR-, NR2-) and the investigations on the thermal stability of these compounds led to the conclusion that the stability of alanes and gallanes increased significantly by such a substitution. Investigations on the reactivity of the NHC adducts towards cAACMe resulted in various insertion products of the carbene into the Al-H or Ga-H bonds and the first cAACMe stabilized dichlorogallane was isolated. Furthermore, a first proof was provided that carbenes can be used specifically for the (formal) reduction of group 13 hydrides of the higher homologues. Thus, the synthesis of Cp*GaI from the reaction of (NHC)∙Cp*GaH2 with cAACMe was developed. In the future, this reaction pathway could be of interest for the preparation of other low-valent compounds of aluminium and gallium. N2 - Die vorliegende Arbeit befasst sich mit der Synthese und Reaktivität NHC stabilisierter Lewis-Säuren/Lewis-Basen Addukte von Alanen und Galanen. Da sich dieses Forschungsgebiet insbesondere in den letzten fünf Jahren rasant entwickelt hat, wird im ersten Kapitel dieser Arbeit eine Übersicht über den gegenwärtigen Kenntnisstand gegeben. Nachdem in vorangegangenen Arbeiten in der Gruppe gezeigt werden konnte, dass NHC-substituierte Alane (NHC)∙AlH3 eine begrenzte Stabilität bezüglich einer möglichen Eliminierung von Dihydroaminal NHC-H2 bzw. der Ringerweiterung oder Ringöffnung des NHC-Liganden aufweisen, wird in Kapitel 2 der Arbeit der Einfluss elektronegativer π-Donor-Substituenten am Aluminium auf die Stabilität der dargestellten NHC-Alan-Addukte untersucht. Dazu wurden die Carben stabilisierten Alane (NHC)∙AlH3 (NHC = iPr2Im, Dipp2Im) mit sekundären Aminen unterschiedlichen sterischen Anspruchs und Phenolen umgesetzt. Die π-Donor Substituenten sättigen das Lewis-saure Aluminiumzentrum ab, sodass eine Koordination eines zweiten NHC-Liganden nicht möglich ist. Ferner erhöhen die stark elektronegativen N- und O-Substituenten die Lewis-Acidität des Aluminiumatoms, das zu stärkeren Al-CNHC, aber auch Al-H-Bindungen führt und vermutlich deshalb die Insertion des Carbens in diese Bindung erschwert ist. Kapitel 3 beschreibt die Entwicklung der Synthese von Carben-stabilisierten Gallanen und Untersuchungen zu deren Reaktivität. Es wurde die Darstellung der NHC-Gallan-Addukte und ihre Reaktivität gegenüber NHCs und cAACMe im Detail untersucht. Durch die Substitution der Hydrid-Substituenten durch Chloride konnte mit zunehmendem Chlorierungsgrad eine erhöhte Stabilität der Addukte festgestellt werden. Die Reaktion von cAACMe mit den NHC-stabilisierten Gallanen führt zur Insertion des cAACMe in die Ga-H-Bindung unter Ausbildung chiraler und achiraler Insertionsprodukten, sowie der zweifachen Insertion von cAACMe unter Abspaltung des NHC-Liganden und Bildung von Bisalkylgallanen. Kapitel 4 beschreibt Untersuchungen zur Synthese und Reaktivität Carben-stabilisierter Iodtriele, welche zur Darstellung kationischer Aluminium- und Galliumdihydride geeignet sind. Die Reaktion der NHC-Iodotriele (NHC)∙EH2I (E = Al, Ga), welche durch weniger sterisch anspruchsvollen NHCs stabilisiert werden, mit einem zusätzlichen Äquivalent des entsprechenden NHCs führt zur Bildung der kationischen bis-NHC-Aluminium- und Galliumdihydride [(NHC)∙MH2]+I. Um den Einfluss des sterischen Anspruchs des NHCs zu untersuchen, wurde das Addukt (Dipp2Im)∙GaH2I mit einem zusätzlichen Äquivalent Dipp2Im umgesetzt. Aufgrund der Sterik der verwendeten Carbene führte dies zur Umlagerung eines NHCs von normaler zu abnormaler Koordination unter Bildung von [(Dipp2Im)∙GaH2(aDipp2Im)]I. Im fünften Kapitel der Arbeit werden Untersuchungen zur Reduktion Cp*-substituierter Triele mit Carbenen beschrieben. Die Darstellung NHC-stabilisierter Cp* -Alane- und Gallane (NHC)∙Cp*MH2 (M = Al, Ga) erfolgte durch die direkte Umsetzung von (AlH2Cp*)3 mit den entsprechenden NHCs, bzw. durch Salzeliminierung ausgehend von (NHC)∙GaH2I mit KCp*. Die Gallan-Addukte zersetzen sich bei höheren Temperaturen unter reduktiver Eliminierung von Cp*H und Bildung von Cp*GaI. Die reduktive Eliminierung findet bevorzugt für sterisch anspruchsvolle NHCs statt. Darüber hinaus wurde eine NHC Ringerweiterungsreaktion des im Rückgrat gesättigten Carbens Dipp2ImH bei der Reaktion mit (AlH2Cp*)3 unter Ausbildung von (RER-Dipp2ImHH2)AlCp*. Darüber hinaus wurde die Reaktivität der Addukte (NHC)∙Cp*EH2 (E = Al. Ga) gegenüber cAACMe untersucht. Die Reaktion der durch die sterisch anspruchsvolleren NHCs iPr2ImMe und Dipp2Im stabilisierten Addukte mit cAACMe führte zur Bildung des außergewöhnlich stabilen Insertionsproduktes (cAACMeH)Cp*AlH unter Abspaltung des NHC-Liganden. Die Reaktion der Galliumhydride (NHC)∙Cp*GaH2 mit cAACMe führte stattdessen direkt zur reduktiven Eliminierung von cAACMeH2 unter Ausbildung von Cp*GaI.Im Rahmen dieser Arbeit wurden neutrale und kationische Carben-stabilisierte Alane und Gallane eingehend untersucht. Durch das Einführen elektronegativer π-Donor-Substituenten und Untersuchungen zur thermischen Belastbarkeit dieser Verbindungen wurde nachgewiesen, dass sich die Stabilität der Alane bzw. Gallane durch eine derartige Substitution deutlich erhöht. Untersuchungen zur Reaktivität der NHC-Addukte gegenüber cAACMe brachte diverse Insertionsprodukte des Carbens in Al-H bzw. Ga-H-Bindungen hervor. Ferner konnte das erste cAACMe-stabilisierte Dichlorogalliumhydrid dargestellt werden. Darüber hinaus wurde ein erster Nachweis erbracht, dass Carbene gezielt zur (formalen) Reduktion von Hydriden der höheren Homologen der Gruppe 13 verwendet werden können. So wurde die Synthese von Cp*GaI aus der Reaktion von (NHC)∙Cp*GaH2 mit cAACMe entwickelt. In Zukunft könnte dieser Reaktionspfad zur Darstellung niedervalenter Verbindungen der Triele Aluminium und Gallium von Interesse sein. KW - Aluminiumhydridderivate KW - Gallium KW - Heterocyclische Carbene <-N> KW - Aluminium KW - Carbene Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-212525 ER - TY - THES A1 - Peethambaran Nair Syamala, Pradeep T1 - Bolaamphiphilic Rylene Bisimides: Thermodynamics of Self-assembly and Stimuli-responsive Properties in Water T1 - Bolaamphiphile Rylenebisimide: Thermodynamik der Selbstorganisation und Stimuli-responsiven Merkmale in Wasser N2 - The present thesis demonstrates how different thermodynamic aspects of self-assembly and stimuli-responsive properties in water can be encoded on the structure of π-amphiphiles, consisting of perylene or naphthalene bisimide cores. Initially, quantitative thermodynamic insights into the entropically-driven self-assembly was studied for a series of naphthalene bisimides with UV/Vis and ITC measurements, which demonstrated that their thermodynamic profile of aggregation is heavily influenced by the OEG side chains. Subsequently, a control over the bifurcated thermal response of entropically driven and commonly observed enthalpically driven self-assembly was achieved by the modulation of glycol chain orientation. Finally, Lower Critical Solution Temperature (LCST) phenomenon observed for these dyes was investigated as a precise control of this behavior is quintessential for self-assembly studies as well as to generate ‘smart’ materials. It could be shown that the onset of phase separation for these molecules can be encoded in their imide substituents, and they are primarily determined by the supramolecular packing, rather than the hydrophobicity of individual monomers. N2 - Die vorliegende Arbeit zeigt, wie verschiedene thermodynamische Aspekte der Selbstorganisation sowie die Stimuli-responsiven Merkmale in Wasser mittels der Struktur von π-Amphiphilen mit Perylen- oder Naphthalinbisimidkernen programmiert werden können. Zunächst wurden quantitative thermodynamische Einblicke in die entropisch getriebene Selbstorganisation für eine Reihe von Naphthalinbisimiden mit UV / Vis- und ITC-Messungen untersucht. Diese zeigten, dass ihr thermodynamisches Aggregationsprofil stark von den Oligoethylenglykol-Seitenketten beeinflusst wird. Anschließend wurde durch gezielte Modulation der Glykolketten und der daraus resultierenden Neuorientierung der Ketten, eine Kontrolle über die Thermodynamik der Selbstassemblierung zwischen der häufiger beobachtbaren enthalpisch getriebenen und der entropisch getriebenen Selbstorganisation erreicht. Schließlich wurde das für diese Farbstoffe beobachtete Phänomen der niedrigeren kritischen Lösungstemperatur (LCST) untersucht, da eine genaue Kontrolle dieses Verhaltens für Selbstorganisationsstudien sowie für die Erzeugung „intelligenter“ Materialien von entscheidender Bedeutung ist. Es konnte gezeigt werden, dass der Beginn der Phasentrennung für diese Moleküle von ihren Imidsubstituenten und hauptsächlich durch die supramolekulare Packung bestimmt werden und nicht durch die Hydrophobie einzelner Monomere. KW - Supramolekulare Chemie KW - Aggregation KW - Selbstorganisation KW - Wasser KW - Supramolecular Chemistry KW - Thermodynamics KW - Self-assembly KW - Lower Critical Solution Temperature (LCST) KW - Water KW - Organische Chemie Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-213424 ER - TY - THES A1 - Wehner, Marius T1 - Supramolecular Polymorphism in Homo- and Heterochiral Supramolecular Polymerizations T1 - Supramolekularer Polymorphismus in homo- und heterochiralen supramolekularen Polymerisationen N2 - The aim of the first part of this thesis was to investigate (R,R)-PBI as a model system for polymorphism at its origin by a supramolecular approach. The pathway complexity of (R,R)-PBI was fine-tuned by experimental parameters such as solvent, temperature and concentration to make several supramolecular polymorphs accessible. Mechanistic and quantum chemical studies on the kinetics and thermodynamics of the supramolecular polymerization of (R,R)-PBI were conducted to shed light on the initial stages of polymorphism. The second part of this work deals with mechanistic investigations on the supramolecular polymerization of the racemic mixture of (R,R)- and (S,S)-PBI with regard to homochiral and heterochiral aggregation leading to conglomerates and a racemic supramolecular polymer, respectively. N2 - Das Ziel des ersten Teils der Dissertation war es, anhand des Modellsystems (R,R)-PBI Polymorphismus mit Hilfe eines supramolekularen Ansatzes an dessen Ursprung zu untersuchen. Durch die Wahl geeigneter experimenteller Parameter wie Lösungsmittel, Temperatur und Konzentration wurden die komplexen Polymerisationspfade von (R,R)-PBI gezielt beeinflusst und verschiedene supramolekulare Polymorphe zugänglich gemacht. Mechanistische und quantenchemische Untersuchungen der Kinetik und Thermodynamik der supramolekularen Polymerisation von (R,R)-PBI wurden durchgeführt, um die Anfangsphase des Polymorphismus zu beleuchten. Der zweite Teil der vorliegenden Arbeit befasst sich mit mechanistischen Untersuchungen der supramolekularen Polymerisation der racemischen Mischung aus (R,R)- und (S,S)-PBI im Hinblick auf homo- und heterochirale Aggregation, welche zu Konglomeraten beziehungsweise einem racemischen supramolekularen Polymer führte. KW - Supramolekulare Chemie KW - Polymorphismus KW - Konglomerat KW - Aggregat KW - Organische Chemie KW - Aggregation Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-211519 ER - TY - THES A1 - Tylek, Tina T1 - Establishment of a Co-culture System of human Macrophages and hMSCs to Evaluate the Immunomodulatory Properties of Biomaterials T1 - Etablierung eines Co-Kultur-Systems von humanen Makrophagen und hMSCs zur Bewertung der Immunmodulatorischen Eigenschaften von Biomaterialien N2 - The outcome of the innate immune response to biomaterials mainly determines whether the material will be incorporated in the body to fulfill its desired function or, when it gets encapsulated, will be rejected in the worst case. Macrophages are key players in this process, and their polarization state with either pro- (M1), anti-inflammatory (M2), or intermediate characteristics is crucial for deciding on the biomaterial’s fate. While a transient initial pro-inflammatory state is helpful, a prolonged inflammation deteriorates the proper healing and subsequent regeneration. Therefore, biomaterial-based polarization may aid in driving macrophages in the desired direction. However, the in vivo process is highly complex, and a mono-culture of macrophages in vitro displays only one part of the cellular system, but, to this date, there is a lack of established co-cultures to assess the immune response to biomaterials. Thus, this thesis aimed to establish a functional co-culture system of human macrophages and human mesenchymal stromal cells (hMSCs) to improve the assessment of the immune response to biomaterials in vitro. Together with macrophages, hMSCs are involved in tissue regeneration and inflammatory reactions and can modulate the immune response. In particular, endogenously derived hMSCs considerably contribute to the successful engrafting of biomaterials. This thesis focused on poly(ε-caprolactone) (PCL) fiber-based scaffolds produced by the technique of melt electrowriting (MEW) as biomaterial constructs. Via this fabrication technique, uniform, precisely ordered scaffolds varying in geometry and pore size have been created in-house. To determine the impact of scaffold geometries and pore sizes on macrophages, mono-cultures incubated on scaffolds were conducted. As a pre-requisite to achieve a functional co-culture system on scaffolds, setups for direct and indirect systems in 2D have initially been established. These setups were analyzed for the capability of cell-cell communication. In parallel, a co-culture medium suitable for both cell types was defined, prior to the establishment of a step-by-step procedure for the co-cultivation of human macrophages and hMSCs on fiber-based scaffolds. Regarding the scaffold morphologies tested within this thesis to improve M2-like polarization, box-shaped scaffolds outperformed triangular-, round- or disordered-shaped ones. Upon further investigation of scaffolds with box-shaped pores and precise inter-fiber spacing from 100 µm down to only 40 µm, decreasing pore sizes facilitated primary human macrophage elongation accompanied by their differentiation towards the M2 type, which was most pronounced for the smallest pore size of 40 µm. To the best of my knowledge, this was the first time that the elongation of human macrophages in a 3D environment has been correlated to their M2-like polarization. Thus, these results may set the stage for the design, the assessment, and the selection of new biomaterials, which can positively affect the tissue regeneration. The cell communication of both cell types, detected via mitochondria exchange in direct and indirect co-cultures systems, took place in both directions, i.e., from hMSCs to macrophages and vice versa. Thereby, in direct co-culture, tunneling nanotubes enabled the transfer from one cell type to the respective other, while in indirect co-culture, a non-directional transfer through extracellular vesicles (EVs) released into the medium seemed likely. Moreover, the phagocytic activity of macrophages after 2D co-cultivation and hence immunomodulation by hMSCs increased with the highest phagocytic rate after 48 h being most pronounced in direct co-cultivation. As the commonly used serum supplements for macrophages and hMSCs, i.e., human serum (hS) and fetal calf serum (FCS), respectively, failed to support the respective other cell type during prolonged cultivation, these sera were replaced by human platelet lysate (hPL), which has been proven to be the optimal supplement for the co-cultivation of human macrophages with hMSCs within this thesis. Thereby, the phenotype of both cell types, the distribution of both cell populations, the phagocytic activity of macrophages, and the gene expression profiles were maintained and comparable to the respective standard mono-culture conditions. This was even true when hPL was applied without the anticoagulant heparin in all cultures with macrophages, and therefore, heparin was omitted for further experiments comprising hPL and macrophages. Accordingly, a step-by-step operating procedure for the co-cultivation on fiber-based scaffolds has been established comprising the setup for 3D cultivation as well as the description of methods for the analysis of phenotypical and molecular changes upon contact with the biomaterial. The evaluation of the macrophage response depending on the cultivation with or without hMSCs and either on scaffolds or on plastic surfaces has been successfully achieved and confirmed the functionality of the suggested procedures. In conclusion, the functional co-culture system of human macrophages and hMSCs established here can now be employed to assess biomaterials in terms of the immune response in a more in vivo-related way. Moreover, specifically designed scaffolds used within the present thesis showed auspicious design criteria positively influencing the macrophage polarization towards the anti-inflammatory, pro-healing type and might be adaptable to other biomaterials in future approaches. Hence, follow-up experiments should focus on the evaluation of the co-culture outcome on promising scaffolds, and the suggested operating procedures should be adjusted to further kinds of biomaterials, such as cements or hydrogels. N2 - Der Verlauf der angeborene Immunantwort auf Biomaterialien bestimmt maßgebend, ob das Material vom Körper angenommen wird, um so seine gewünschte Funktion zu erfüllen, oder ob es zur Einkapselung und im schlimmsten Fall zur Abstoßung kommt. Makrophagen spielen in diesem Prozess eine Schlüsselrolle, und ihr Polarisationszustand, entweder pro (M1), antiinflammatorisch (M2) oder ein dazwischenliegender Subtyp, ist dabei von entscheidender Bedeutung. Während ein vorübergehender proinflammatorischer Anfangszustand hilfreich ist, verschlechtert eine anhaltende Entzündung eine zeitnahe Heilung und die anschließende Regeneration. Daher könnte eine durch Biomaterialien beeinflusste Polarisation hilfreich sein, um die Makrophagen in die gewünschte Richtung zu lenken. Die in vivo Reaktion ist jedoch äußerst komplex und die Kultivierung von Makrophagen in vitro stellt nur einen Teil des Prozesses dar. An etablierten Co-Kultursystem zur Untersuchung der immunmodulierenden Eigenschaften von Biomaterialien mangelt es jedoch. Daher war es Ziel dieser Arbeit ein funktionelles Co-Kultursystem von humanen Makrophagen und humanen mesenchymalen Stromazellen (hMSCs) zu etablieren um die in vitro Bewertung der Immunantwort nach Kontakt mit Biomaterialien zu verbessern. Von Interesse sind hMSCs hierbei, da sie zusammen mit Makrophagen an der Geweberegeneration und an Entzündungsreaktionen beteiligt sind. Zudem weisen MSCs immunmodulierende Eigenschaften in Hinblick auf Makrophagen auf und sind aktiv am Verlauf der Fremdkörperreaktion nach der Transplantation von Biomaterial beteiligt. Im Rahmen dieser Arbeit wurden Poly(ε-caprolactone) (PCL)-Scaffolds auf Faserbasis als Biomaterialkonstrukte verwendet, welche mit der Technik des Melt Electrowriting (MEW) hergestellt wurden. Mit dieser Technik kann sowohl die Form der Scaffolds als auch die Porengröße variiert werden. Um Unterschiede der Scaffoldgeometrien und Porengrößen in Hinblick auf die Makrophagenreaktion zu untersuchen, wurden zunächst Versuche mit Makrophagen-Monokulturen durchgeführt. Zur Etablierung eines funktionellen Co-Kultursystem, wurde zu Beginn ein Aufbau für ein direktes und indirektes System in 2D erstellt. Dieser Aufbau wurde anschließend auf die Möglichkeit der Zell-Zell-Kommunikation darin analysiert. Weiterhin wurde ein, für beide Zelltypen, geeignetes Kulturmedium definiert, gefolgt von der Etablierung eines Protokoll für die Co-Kultivierung beider Zelltypen auf faserbasierten Scaffolds. Im Bezug zu dieser Arbeit wurden Scaffolds mit unterschiedlicher Geometrie mittels der Technik des Melt Electrowriting hergestellt um die Veränderung der Makrophagenpolarisation zu untersuchen. Dabei zeigte sich eine verstärkte M2-Polarisation auf Scaffolds mit einer kastenförmigen Morphologie, verglichen mit dreieckigen, runden oder ungeordnet-strukturierten Scaffolds. Die weitere Untersuchung von Scaffolds mit kastenförmigen Poren und präzisen Faserabständen von 100 µm bis zu 40 µm zeigte das kleinere Porengrößen die Elongation primärer menschlicher Makrophagen förderten. Begleitet wurde die verstärkte Elongation mit einer gesteigerten Polarisation in Richtung des M2 Typs. Dieser Effekt war nach Kultivierung von Makrophagen auf Scaffolds mit 40 µm Poren am stärksten ausgeprägt. Im Rahmen dieser Arbeit konnte damit erstmals eine länglichen Morphologie humaner Makrophagen mit einer Polarisierung in den M2 Typ korreliert werden. Diese Ergebnisse könnten daher für das Design neuer Biomaterialien, welche sich positiv auf die Geweberegeneration auswirken sollen, von Bedeutung sein. Die Zellkommunikation beider Zelltypen, welche über Mitochondrienaustausch im direkten und indirekten Co-Kultur-System nachgewiesen wurde, fand sowohl ausgehend von Makrophagen als auch von hMSCs statt. Dabei ermöglichten „Tunneling Nanotubes“ in der direkten Co-Kultur den Transfer von Mitochondrien von einem Zelltyp zum jeweils anderen, während in der indirekter Co-Kultur ein ungerichteter Transfer durch in das Medium freigesetzte extrazelluläre Vesikel (EVs) stattfand. Darüber hinaus wurde die phagozytotische Aktivität von Makrophagen nach Co-Kultivierung untersucht, um die immunmodulatorischen Eigenschaften von hMSCs nachzuweisen, wobei die höchste phagozytotische Aktivität nach 48 stündiger Co-Kultivierung festgestellt wurde. Da die üblicherweise verwendeten Serumzusätze für Makrophagen (humanes Serum (hS)) und hMSCs (fötales Kälberserum (FCS)) bei längerer Kultivierung den jeweils anderen Zelltyp nicht unterstützen konnten, wurden diese Seren durch humanes Thrombozytenlysat (hPL) ersetzt. Dieses erwies sich im Rahmen dieser Arbeit als optimale Ergänzung für die gemeinsame Kultivierung beider Zelltypen in der Co-Kultur. Dabei wurden der Phänotyp und die Populationsverteilung beider Zelltypen, sowie die phagozytotische Aktivität und die Veränderung des Genexpressionsprofils von Makrophagen untersucht und mit den jeweiligen Standard-Monokulturbedingungen verglichen. Des Weiteren konnte gezeigt werde, dass eine Zugabe von Heparin in Zellkulturen mit Makrophagen und hPL nicht nötig ist. Daher wurde auf den Zusatz von Heparin für alle weitere Experimente, die hPL und Makrophagen umfassten, verzichtet. Im letzten Teil der Arbeit wurde ein Protokoll für die Co-Kultivierung auf MEW Scaffolds erstellt. Neben der Etablierung eines Setups für die 3D-Kultivierung wurden sowohl Protokolle zur Bewertung phänotypischer als auch molekularer Veränderungen entwickelt. Durch Feststellung von Unterschieden in der Makrophagenreaktion in Abhängigkeit zu der Kultivierung mit / ohne hMSCs und entweder auf Scaffolds oder Plastik-Kulturschalen konnte die Funktionalität der Protokolle nachgewiesen werden. Mit dem in dieser Arbeit etabliertem funktionellen Co-Kultursystem von humanen Makrophagen und hMSCs können zukünftig Biomaterialien mit einem stärkeren in vivo -Bezug in Hinblick auf die Immunantwort bewertet werden. Darüber hinaus deuten Ergebnisse auf speziell konstruierte MEW-Scaffolds ein vielversprechendes Designkriterium für neu entwickelte Biomaterialien an, wobei die Polarisation der Makrophagen in Richtung des entzündungshemmenden, heilungsfördernden Typens durch eine gesteuerte Morphologieänderung beeinflusst werden kann. An diese Arbeit anschließende Experimente sollten sich auf die Untersuchung vielversprechender Scaffolds mittels Co-Kultivierung sowie auf die Anpassung der etablierten Protokolle an andere Biomaterialgruppen, wie beispielsweiße für Zemente oder Hydrogele, konzentrieren. KW - Makrophage KW - Biomaterial KW - Co-culture system KW - Mesenchymal stromal cells KW - Macrophages Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-203570 ER - TY - THES A1 - Joshi, Hemant Kumar T1 - Function of IRAK2 in macrophages and HECTD1 in B cells T1 - Funktion von IRAK2 in makrophagen und HECTD1 in B zellen N2 - The Immune system exerts its response against invading pathogens via a cumulative, sequential cooperation of immune cells coordinated by their secreted products. Immune cells, such as macrophages and dendritic cells (DCs), express toll-like receptors (TLRs) to sense the presence of pathogens through pathogen-associated molecular patterns (PAMPs). The interaction of PAMPs with TLRs elicits a cytosolic signaling cascade that enhances the expression of genes to stimulate inflammation. Interleukin 1 receptor-associated kinase 2 (IRAK2) is a component of the TLR signaling pathway. IRAK2 transduces the TLR signal via a direct interaction with TNF receptor-associated factor 6 (TRAF6) and subsequent enhancement of its ubiquitination. During my PhD thesis, I determined that a 55-amino acid long stretch at the C-terminal end of IRAK2 is important for TLR signaling. Overexpression of C-terminal truncated IRAK2 (IRAK2Δ55) in the murine macrophage cell line RAW 264.7 led to impaired CD40 expression after TLR4 stimulation by Lipopolysaccharide (LPS). I observed attenuated competency of IRAK2Δ55 in restoring a full TLR signaling response i.e. IL-6 secretion, NO production and CD40 expression in IRAK2-deficient RAW cells generated via CRISPR-Cas9 approach. Additionally, diminished TLR4 induced activation of nuclear factor κB (NF-κB) and extracellular signal related kinase (ERK) was observed with IRAK2Δ55 reconstituted RAW cells as compared to cell reconstituted with wildtype IRAK2. IRAK2Δ55 reconstituted RAW cells also exhibited reduced TLR4-induced cell death and phosphorylation of receptor interacting protein kinase 3 (RIP3). Co-immunoprecipitation experiments in HEK 293T cells showed that IRAK2Δ55 was still able to bind to TRAF6 alike IRAK2 but failed to induce ubiquitination of TRAF6. In conclusion, the results suggest that the IRAK2 TRAF6 interaction is not sufficient to sustain full TLR signaling. An C-terminus-dependent unknown molecular mechanism is also involved. Through my PhD work, I also analyzed a B cell lineage-specific HECTD1 knock-out mice. HECTD1 is an E3 ubiquitin ligase for various substrate proteins, such as heat shock protein 90 (HSP90), adenomatous polyposis coli and phosphatidylinositol phosphate kinase type 1 γ. Hsp90 regulates a variety of signaling molecules in NF-κB activation pathways which are essential for an optimal B cell response. HECTD1-deficient pro-B cells developed normally into mature B cells. However, TLR4 stimulated HECTD1-deficient B cells displayed reduced immunoglobulin (Ig) production in in vitro cultures. In addition, mice with HECTD1-deficient B cells showed a diminished Ig response after nitrophenylacetyl-keyhole limpet hemocyanin immunization. Thus, HECTD1 is necessary for efficient Ig secretion. N2 - Auf das Eindringen von Pathogenen in den Körper antwortet das Immunsystem mit einer kumulativen, sequenziellen und wechselseitigen Zusammenarbeit zwischen Immunzellen, ihren Oberflächenrezeptoren sowie den von ihnen sezernierten Mediatoren. Immunzellen, wie Makrophagen und dendritische Zellen (DZ), sind dabei in der Lage mittels Toll-like Rezeptoren (TLRs) das Vorhandensein von Pathogenen über Pathogen-assoziierte molekulare Muster (pathogen-associated molecular patterns, PAMPs) zu detektieren. Die Bindung von PAMPs an TLRs führt über intrazelluläre Signalkaskaden zu einer verstärkten Expression pro-inflammatorischer Gene und damit zur Initiierung einer Immunreaktion. Die Interleukin 1 Rezeptor-assoziierte Kinase 2 (IRAK2) ist einer Komponente der TLR Signalkaskade. IRAK2 bindet direkt an den TNF-Rezeptor-assozierten Faktor 6 (TRAF6), welcher daraufhin verstärkt ubiquitiniert wird. In meiner Promotionsarbeit habe ich einen 55 Aminosäure langen Abschnitt im C-Terminus von IRAK2 identifiziert, der für die Signalleitung von TLRs essentiell ist. Die Überexpression von mutierten IRAK2, dem dieser C-terminale Bereich fehlt (IRAK2∆55), in der murinen Macrophagen Zelllinie RAW 264.7 führte zu einer verminderten Expression von CD40 nach Stimulation des TLR4 durch Lipopolysaccharid (LPS). Wurden IRAK2-defiziente RAW Zellen mit dem mutierten IRAK2∆55 Gen rekonstituiert, zeigten diese Zellen verglichen mit Zellen, die mit dem wildtypischen Gen rekonstituiert wurden, eine verminderte Aktivierung des nuclear factor κB (NF-κB) und der extracellular signal related kinase (ERK) nach Stimulation des TLR4. Ebenso waren die Expression von CD40, die Sekretion von IL-6 und NO gestört. In IRAK2-defizienten und IRAK2∆55 RAW Zellen war eine Reduktion des durch TLR4 induzierten Zelltodes sowie der TLR4-induzierten Phosphorylierung der Rezeptor-interagierenden Proteinkinase 3 (RIP3) zu beobachten. Ko-Immunpräzipitationsexperimente mit HEK 293T Zellen zeigten, dass IRAK2∆55 genauso wie intaktes IRAK2 zwar in der Lage ist, TRAF6 zu binden, aber nicht dessen Ubiquitinylierung zu induzieren. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen, dass die Interaktion von IRAK2 mit TRAF6 für ein optimales TLR-Signal nicht ausreichend ist und deshalb ein bisher unbekannter Mechanismus an der Signalweiterleitung beteiligt sein muss. Dieser Mechanismus ist vom C-terminalen Ende von IRAK2 abhängig. In einem zweiten Teil meiner Doktorarbeit analysierte ich B-Zellen von Mäusen, in denen HECTD1-spezifisch in der B-Zellentwicklungslinie deletiert wurde. HECTD1 ist eine E3 Ubiquitin-Ligase für zahlreiche Substratproteine, wie bspw. dem Hitzeschock-Protein (heat-shock-protein, HSP90), dem adenomatösen Polyposis coli Protein oder der Phosphatidylinositol Phosphatkinase Typ 1 γ. HSP90 reguliert eine Vielzahl an Signalmolekülen im NF-κB Signalweg, die für eine optimale B-Zell-Antwort wesentlich sind. HECTD1-defiziente pro-B-Zellen entwickelten sich normal zu reifen B-Zellen. Die Stimulation des TLR4 auf HECTD1-defizienten B-Zellen führte in vitro zu einer im Vergleich zu wildtypischen B-Zellen reduzierten Immunglobulin-Sekretion. Eine reduzierte Immunglobulin-Antwort konnte auch in B-Zell-spezifischen hectd1-/- Mäusen beobachtet werden, wenn diese zuvor mit Schlitzschnecken-Hämocyanin (Keyhole Limpet Hemocyanin, NP-KLH) immunisiert wurden. Die reduzierte Produktion von Antikörpern durch HECTD1-defiziente B-Zellen zeigt, dass dieses Protein für diese zentrale Aufgabe von B-Zellen notwendig ist. KW - Toll-like-Rezeptoren KW - IRAK2 KW - HECTD1 KW - Signaltransduktion KW - TLR signaling Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-150846 ER - TY - THES A1 - Blum, Carina T1 - A first step to an integral biointerface design for the early phase of regeneration T1 - Ein erster Schritt zur Etablierung eines integralen biologischen Grenzflächendesigns für die frühe Phase der Regeneration N2 - The implantation of any foreign material into the body automatically starts an immune reaction that serves as the first, mandatory step to regenerate tissue. The course of this initial immune reaction decides on the fate of the implant: either the biomaterial will be integrated into the host tissue to subsequently fulfill its intended function (e.g., tissue regeneration), or it will be repelled by fibrous encapsulation that determines the implant failure. Especially neutrophils and macrophages play major roles during this inflammatory response and hence mainly decide on the biomaterial's fate. For clinically relevant tissue engineering approaches, biomaterials may be designed in shape and morphology as well as in their surface functionality to improve the healing outcome, but also to trigger stem cell responses during the subsequent tissue regeneration phase. The main focus of this thesis was to unravel the influence of scaffold characteristics, including scaffold morphology and surface functionality, on primary human innate immune cells (neutrophils and macrophages) and human mesenchymal stromal cells (hMSCs) to assess their in vitro immune response and tissue regeneration capacity, respectively. The fiber-based constructs were produced either via melt electrowriting (MEW), when the precise control over scaffold morphology was required, or via solution electrospinning (ES), when the scaffold design could be neglected. All the fiber-based scaffolds used throughout this thesis were composed of the polymer poly(ε caprolactone) (PCL). A novel strategy to model and alleviate the first direct cell contact of the immune system with a peptide-bioactived fibrous material was presented in chapter 3 by treating the material with human neutrophil elastase (HNE) to imitate the neutrophil attack. The main focus of this study was put on the effect of HNE towards an RGDS-based peptide that was immobilized on the surface of a fibrous material to improve subsequent L929 cell adhesion. The elastase efficiently degraded the peptide-functionality, as evidenced by a decreased L929 cell adhesion, since the peptide integrated a specific HNE-cleavage site (AAPV-motif). A sacrificial hydrogel coating based on primary oxidized hyaluronic acid (proxHA), which dissolved within a few days after the neutrophil attack, provided an optimal protection of the peptide-bioactivated fibrous mesh, i.e, the hydrogel alleviated the neutrophil attack and largely ensured the biomaterial's integrity. Thus, according to these results, a means to protect the biomaterial is required to overcome the neutrophil attack. Chapter 4 was based on the advancement of melt electrowriting (MEW) to improve the printing resolution of MEW scaffolds in terms of minimal inter-fiber distances and a concomitant high stacking precision. Initially, to gain a better MEW understanding, the influence of several parameters, including spinneret diameter, applied pressure, and collector velocity on mechanical properties, crystallinity, fiber diameter and fiber surface morphology was analyzed. Afterward, innovative MEW designs (e.g., box-, triangle-, round , and wall-shaped scaffolds) have been established by pushing the printing parameters to their physical limits. Further, the inter-fiber distance within a standardized box-structured scaffold was successfully reduced to 40 µm, while simultaneously a high stacking precision was maintained. In collaboration with a co-worker of my department (Tina Tylek, who performed all cell-based experiments in this study), these novel MEW scaffolds have been proven to facilitate human monocyte-derived macrophage polarization towards the regenerative M2 type in an elongation-driven manner with a more pronounced effect with decreasing pore sizes. Finally, a pro-adipogenic platform for hMSCs was developed in chapter 5 using MEW scaffolds with immobilized, complex ECM proteins (e.g., human decellularized adipose tissue (DAT), laminin (LN), and fibronectin (FN)) to test for the adipogenic differentiation potential in vitro. Within this thesis, a special short-term adipogenic induction regime enabled to more thoroughly assess the intrinsic pro-adipogenic capacity of the composite biomaterials and prevented any possible masking by the commonly used long-term application of adipogenic differentiation reagents. The scaffolds with incorporated DAT consistently showed the highest adipogenic outcome and hence provided an adipo-inductive microenvironment for hMSCs, which holds great promise for applications in soft tissue regeneration. Future studies should combine all three addressed projects in a more in vivo-related manner, comprising a co-cultivation setup of neutrophils, macrophages, and MSCs. The MEW-scaffold, particularly due to its ability to combine surface functionality and adjustable morphology, has been proven to be a successful approach for wound healing and paves the way for subsequent tissue regeneration. N2 - Die Implantation eines Biomaterials löst stets eine Immunreaktion im Körper aus, die den ersten zwingenden Schritt zur Geweberegeneration darstellt. Der Verlauf dieser anfänglichen Immunreaktion entscheidet über das Schicksal des Implantats: Entweder wird das Biomaterial in das Wirtsgewebe integriert, um anschließend seine vorgesehene Funktion (z.B. Geweberegeneration) zu erfüllen, oder aber es findet eine Abstoßungsreaktion durch Einkapselung des Implantats statt. Insbesondere Neutrophile und Makrophagen spielen für die Immunantwort eine wichtige Rolle und entscheiden daher hauptsächlich über das Schicksal des Biomaterials. Für klinisch relevante Ansätze der Gewebezüchtung können Biomaterialien sowohl in ihrer Morphologie als auch in ihrer Oberflächenfunktionalität so gestaltet werden, dass sie zum einen die Wundheilung verbessern, zum anderen auch Stammzellreaktionen während der anschließenden Geweberegenerationsphase auslösen. Der Fokus dieser Doktorarbeit lag auf der Beurteilung des Einflusses von Morphologie und Oberflächenfunktionalität fasriger Scaffolds auf die frühe Phase der Geweberegeneration. Insbesondere wurde die in vitro-Immunantwort von primären humanen Immunzellen (Neutrophile und Makrophagen) sowie die Geweberegenerationskapazität von humanen mesenchymalen Stromazellen (hMSCs) untersucht. Die hierfür verwendeten faserbasierten Poly(ε-Caprolacton) (PCL) Scaffolds wurden entweder mittels Solution Electrospinning (ES) oder Melt Electrowriting (MEW) hergestellt. Während ES eine zufällig orientierte Faserablage zur Folge hat, erlaubt MEW eine präzise Kontrolle der Scaffold-Morphologie. Zunächst wurde eine neue Strategie zur Nachahmung und Abmilderung des ersten direkten Zellkontakts während der Immunreaktion vorgestellt. Dabei wurde die Interaktion zwischen Neutrophilen mit einem Peptid-bioaktivierten Fasermaterial untersucht (Kapitel 3), wobei der sog. Neutrophilen-Angriff mittels des Enzyms Neutrophilen Elastase (HNE) nachgeahmt wurde. Das an der Faseroberfläche immobilisierte CGGGAAPVGGRGDS-Peptid verfügte über eine spezifische HNE-Schnittstelle (AAPV-Motiv), an welcher die Elastase das Peptid effizient degradieren konnte. Das Degradationsverhalten des Enzyms wurde anschließend über L929 Zelladhärenz analysiert, welche über das RGDS-Motiv im Peptid vermittelt wurde. Im Rahmen der Arbeit konnte nachgewiesen werden, dass der Neutrophilen-Angriff und die damit einhergehende Verringerung des RGDS-Motivs zu einer reduzierten Zelladhärenz führte. Die Einbettung des Scaffolds in ein Hydrogel auf der Basis von Aldehyd-haltiger Hyaluronsäure (proxHA) bot während des Neutrophilen-Angriffs einen optimalen Schutz der Peptidfunktionalität. Um diese wiederum anschließend für Adhäsionsversuche verfügbar zu machen, konnte das Hydrogelsystem derartig eingestellt werden, dass sich dieses innerhalb weniger Tage auflöste. Auf diese Weise konnte das Hydrogel den Neutrophilen-Angriff abmildern und so die Integrität des Biomaterials weitestgehend gewährleisten. Kapitel 4 behandelt die Präzisierung der Faserablage, insbesondere die Verringerung des Faserabstands, während des MEW-Prozesses. Zunächst wurde der Einfluss verschiedener Parameter (Spinndüsendurchmesser, angelegter Luftdruck und Kollektorgeschwindigkeit) auf die mechanischen Eigenschaften, die Kristallinität, den Faserdurchmesser und die Faseroberflächenmorphologie analysiert. Durch Optimierung der Druckparameter konnten innovative MEW-Designs (u.a. mit runder Porengeometrie) gedruckt werden. Der Abstand zwischen den Fasern in einem Scaffold mit standardisierter kastenförmiger Porengeometrie wurde erfolgreich auf 40 µm reduziert, während gleichzeitig eine hohe Stapelpräzision gewährleistet wurde. In Zusammenarbeit mit einer Kollegin am Lehrstuhl (Tina Tylek, die alle zellbasierten Experimente in dieser Studie durchführte) wurde nachgewiesen, dass diese innovativen MEW-Scaffolds die Polarisierung menschlicher Makrophagen in Richtung des regenerativen M2-Typs förderten. Die Makrophagen-Polarisierung ging einher mit einer Zellelongation, wobei dieser Effekt verstärkt für kleinere Porengrößen auftrat. Abschließend stand die Untersuchung der pro-adipogenen Wirkung von faserfunktionalisierten MEW-Scaffolds im Fokus (Kapitel 5), welche mit ECM-Proteinen, wie beispielsweise dezellularisiertes Fettgewebe (DAT), beschichtet wurden. Das pro-adipogene Potential dieser Materialien wurde mit Hilfe einer adipogenen Kurzzeitinduktion näher analysiert, da eine Langzeitapplikation der Differenzierungsreagenzien diesen Effekt überdeckte. Die Scaffolds mit der DAT-Beschichtung zeigten durchweg die höchste adipogene Differenzierung und boten somit für Stammzellen eine adipo-induzierende Mikroumgebung, weshalb sie für die Anwendung in der Weichgeweberegeneration sehr vielversprechend sind. An diese Arbeit anschließende Experimente sollten alle drei Projekte in einem Co-Kulturansatz von Neutrophilen, Makrophagen und MSCs kombinieren, um so einen stärkeren in vivo-Bezug herzustellen. Hierfür erweist sich das MEW-Scaffold insbesondere durch seine Kombinationsfähigkeit der Oberflächenfunktionalität und Morphologie als Ansatz für einen erfolgreichen Wundheilungsprozess und ebnet damit den Weg für eine bestmögliche Geweberegeneration. KW - Scaffold KW - Biomaterial KW - tissue regeneration KW - melt electrowriting KW - Scaffold Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-212117 ER - TY - THES A1 - Scheide-Nöth, Jan-Philipp T1 - Activation of the Interleukin-5 receptor and its inhibition by cyclic peptides T1 - Aktivierung des IL-5 Rezeptors und dessen Inhibierung durch zyklische Peptide N2 - The cytokine interleukin-5 (IL-5) is part of the TH2-mediated immune response. As a key regulator of eosinophilic granulocytes (eosinophils), IL-5 controls multiple aspects of eosinophil life. Eosinophils play a pathogenic role in the onset and progression of atopic diseases as well as hypereosinophilic syndrome (HES). Here, cytotoxic proteins and pro-inflammatory mediators stored in intracellular vesicles termed granula are released upon activation thereby causing local inflammation to fight the pathogen. However, if such inflammation persists, tissue damage and organ failure can occur. Due to the close relationship between eosinophils and IL-5 this cytokine has become a major pharmaceutical target for the treatment of atopic diseases or HES. As observed with other cytokines, IL-5 signals by assembling a heterodimeric receptor complex at the cell surface in a stepwise mechanism. In the first step IL-5 binds to its receptor IL-5Rα (CD125). This membrane-located complex then recruits the so-called common beta chain βc (CD131) into a ternary ligand receptor complex, which leads to activation of intracellular signaling cascades. Based on this mechanism various strategies targeting either IL-5 or IL-5Rα have been developed allowing to specifically abrogate IL-5 signaling. In addition to the classical approach of employing neutralizing antibodies against IL 5/IL-5Rα or antagonistic IL-5 variants, two groups comprising small 18 to 30mer peptides have been discovered, that bind to and block IL-5Rα from binding its activating ligand IL-5. Structure-function studies have provided detailed insights into the architecture and interaction of IL-5IL-5Rα and βc. However, structural information for the ternary IL-5 complex as well as IL-5 inhibiting peptides is still lacking. In this thesis three areas were investigated. Firstly, to obtain insights into the second receptor activation step, i.e. formation of the ternary ligand-receptor complex IL-5•IL-5Rα•βc, a high-yield production for the extracellular domain of βc was established to facilitate structure determination of the ternary ligand receptor assembly by either X-ray crystallography or cryo-electron microscopy. In a second project structure analysis of the ectodomain of IL-5Rα in its unbound conformation was attempted. Data on IL-5Rα in its ligand-free state would provide important information as to whether the wrench-like shaped ectodomain of IL-5Rα adopts a fixed preformed conformation or whether it is flexible to adapt to its ligand binding partner upon interaction. While crystallization of free IL-5Rα failed, as the crystals obtained did not diffract X rays to high resolution, functional analysis strongly points towards a selection fit binding mechanism for IL-5Rα instead of a rigid and fixed IL-5Rα structure. Hence IL-5 possibly binds to a partially open architecture, which then closes to the known wrench-like architecture. The latter is then stabilized by interactions within the D1-D2 interface resulting in the tight binding of IL-5. In a third project X-ray structure analysis of a complex of the IL-5 inhibitory peptide AF17121 bound to the ectodomain of IL-5Rα was performed. This novel structure shows how the small cyclic 18mer peptide tightly binds into the wrench-like cleft formed by domains D1 and D2 of IL-5Rα. Due to the partial overlap of its binding site at IL-5Rα with the epitope for IL-5 binding, the peptide blocks IL-5 from access to key residues for binding explaining how the small peptide can effectively compete with the rather large ligand IL-5. While AF17121 and IL-5 seemingly bind to the same site at IL-5Rα, functional studies however showed that recognition and binding of both ligands differ. With the structure for the peptide-receptor complex at hand, peptide design and engineering could be performed to generate AF17121 analogies with enhanced receptor affinity. Several promising positions in the peptide AF17121 could be identified, which could improve inhibition capacity and might serve as a starting point for AF17121-based peptidomimetics that can yield either superior peptide based IL-5 antagonists or small-molecule-based pharmacophores for future therapies of atopic diseases or the hypereosinophilic syndrome. N2 - Das Zytokin Interleukin-5 (IL-5) nimmt eine zentrale Rolle im Zellzyklus von eosinophlien Granulozyten (Eosinophile) ein, indem es beispielsweise die Differenzierung, Aktivierung und Apoptose dieser Zellen steuert. Als Immunantwort auf Pathogene kommt es zur Aktivierung von Eosinophilen. Dieses führt zur Freisetzung von in intrazellulären Vesikeln (Granula) gespeicherten zytotoxischen Proteinen und proinflammatorischen Mediatoren, wodurch lokale Entzündungen verursacht werden, um den Erreger zu bekämpfen. Fehlregulationen (übermäßige Produktion) von eosinophilen Granulozyten können zu Gewebeschäden und Organversagen führen, wenn diese über einen längeren Zeitraum bestehen, und sind insbesondere mit dem Ausbruch und Fortschreiten von atopischen Erkrankungen sowie dem Hypereosinophilen Syndrom (HES) assoziiert. IL-5 muss, um die Eosinophilen aktivieren zu können, an einen heterodimeren Transmembranrezeptor binden. Im ersten Schritt bindet IL-5 an seinen zytokin-spezifischen Rezeptor IL-5Rα (CD125). Dieser membrangebundene Komplex rekrutiert dann die sogenannte gemeinsame („common“) beta-Kette βc (CD131) in einen ternären Liganden Rezeptorkomplex, was zur Aktivierung von intrazellulären Signalkaskaden führt. Aufgrund dieser engen Beziehung zwischen Eosinophilen und IL-5 ist dieses Zytokin in den Fokus der pharmazeutischen Industrie für die Behandlung atopischer Erkrankungen oder HES gerückt. Bisherige Therapien basieren auf der Unterdrückung der Immunreaktion durch Corticosteroide, neutralisierende gegen IL 5/IL-5Rα gerichtete Antikörper oder antagonistische IL-5 Varianten. Eine alternative Therapiemöglichkeit stellen IL-5 inhibierende Peptide dar, welche an IL 5Rα binden und hierbei die Bindung des aktivierenden Liganden (IL-5) hemmen. Derzeit stehen Strukturen vom binären IL-5IL-5Rα Komplex und von βc im ungebundenen Zustand zur Verfügung. Zudem konnten wichtige Wechselwirkungen im binären Komplex identifiziert werden. Allerdings sind vom ternären IL-5 Komplex und den IL-5 inhibierenden Peptiden keinerlei Strukturdaten bekannt. Um im Rahmen dieser Arbeit Einblicke in den zweiten Rezeptoraktivierungsschritt, d.h. die Bildung des ternären Ligand-Rezeptor Komplexes IL-5•IL-5Rα•βc, zu erhalten, wurde ein Herstellungsverfahren für die extrazelluläre Domäne von βc etabliert. Zusammen mit den optimierten Reinigungsverfahren für IL-5 und IL 5Rα konnte hiermit eine gute Grundlage für zukünftige Strukturanalysen des ternären IL-5 Komplexes geschaffen werden. In einem zweiten Projekt wurde versucht, die Struktur der Ektodomäne von IL 5Rα in ihrem freien Zustand aufzuklären. Diese Strukturdaten würden wichtige Informationen darüber liefern, ob die bisher bekannte „Schraubenschlüssel“-Architektur der IL-5Rα Ektodomäne in einer rigiden, vorgebildeten Konformation vorliegt, oder ob die Architektur der Ektodomäne bei Bindung flexibel an ihren Liganden angepasst wird. Während die Kristallisation von IL-5Rα ohne einen Bindepartner fehlschlug, deuten neue Funktionsanalysen auf einen „selection fit binding mechanism“ für IL-5Rα hin. Der relativ große Ligand IL-5 bindet daher sehr wahrscheinlich an eine teilweise „offene“ Rezeptorkonformation, die erst nach Bindung die bekannte „Schraubenschlüssel“-Architektur annimmt. In einem dritten Projekt wurde eine Strukturanalyse des Komplexes des IL-5 inhibierenden AF17121 Peptids gebunden an die Ektodomäne von IL-5Rα durchgeführt. Anhand dieser neuen Struktur lässt sich erklären, wie das kleine zyklische 18mer Peptid effektiv mit dem wesentlich größeren Liganden IL-5 um die Bindung am Rezeptor konkurrieren kann. Aufgrund der Überlappung der Bindestellen von AF17121 und IL-5 am Rezeptor IL 5Rα blockiert das Peptid den Zugang von IL-5 an seinen Rezeptor. Obwohl AF17121 und IL-5 in einem ähnlich Strukturbereich in IL-5Rα binden, zeigen funktionelle Studien, dass sich Erkennung und Bindung beider Liganden unterscheiden. Mit der vorliegenden Struktur vom Peptid Rezeptor Komplex konnte ein strukturbasiertes Peptid-Design durchgeführt und so AF17121 Varianten mit verbesserter Rezeptorbindung erzeugt werden. Dabei wurden mehrere Positionen im Peptid AF17121 identifiziert, die dessen Inhibierungseigenschaften möglicherweise verbessern. Somit konnte ein weiterer Grundstein für die Entwicklung von effektiveren Peptid-basierten IL 5 Antagonisten oder sogar nicht-peptidischen Inhibitoren für zukünftige Therapieansätze gegen atopische Erkrankungen oder HES gelegt werden. KW - Interleukin 5 KW - Eosinophiler Granulozyt KW - atopic diseases KW - eosinophil KW - interleukin-5 signaling KW - peptide-based interleukin-5 inhibitor KW - peptide engineering KW - receptor KW - functional studies KW - structure analysis Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-182504 ER - TY - THES A1 - Tian, Yaming T1 - Selective C-X and C-H Borylation by N-Heterocyclic Carbene Nickel(0) Complex T1 - Selektive C-X und C-H Borylierung mittels N-Heterozyklischer Carben Nickel(0) Komplexe N2 - Organoboron compounds are important building blocks in organic synthesis, materials science, and drug discovery. The development of practical and convenient ways to synthesize boronate esters attracted significant interest. Photoinduced borylations originated with stoichiometric reactions of arenes and alkanes with well-defined metal-boryl complexes. Now photoredox-initiated borylations, catalyzed either by transition-metal or organic photocatalysts, and photochemical borylations with high efficiency have become a burgeoning area of research. In this chapter, we summarize research in the field of photocatalytic C-X borylation, especially emphasizing recent developments and trends, based on transition-metal catalysis, metal-free organocatalysis and direct photochemical activation. We focus on reaction mechanisms involving single electron transfer (SET), triplet energy transfer (TET), and other radical processes. We developed a highly selective photocatalytic C-F borylation method that employs a rhodium biphenyl complex as a triplet sensitizer and the nickel catalyst [Ni(IMes)2] (IMes = 1,3-dimesitylimidazolin-2-ylidene) for the C-F bond activation and defluoroborylation process. This tandem catalyst system operates with visible (400 nm) light and achieves borylation of a wide range of fluoroarenes with B2pin2 at room temperature in excellent yields and with high selectivity. Direct irradiation of the intermediary C-F bond oxidative addition product trans-[NiF(ArF)(IMes)2] leads to fast decomposition when B2pin2 is present. This destructive pathway can be bypassed by indirect excitation of the triplet states of the nickel(II) complex via the photoexcited rhodium biphenyl complex. Mechanistic studies suggest that the exceptionally long-lived triplet excited state of the Rh biphenyl complex used as the photosensitizer allows for efficient triplet energy transfer to trans-[NiF(ArF)(IMes)2], which leads to dissociation of one of the NHC ligands. This contrasts with the majority of current photocatalytic transformations, which employ transition metals as excited state single electron transfer agents. We have previously reported that C(arene)-F bond activation with [Ni(IMes)2] is facile at room temperature, but that the transmetalation step with B2pin2 is associated with a high energy barrier. Thus, this triplet energy transfer ultimately leads to a greatly enhanced rate constant for the transmetalation step and thus for the whole borylation process. While addition of a fluoride source such as CsF enhances the yield, it is not absolutely required. We attribute this yield-enhancing effect to (i) formation of an anionic adduct of B2pin2, i.e. FB2pin2-, as an efficient, much more nucleophilic {Bpin-} transfer reagent for the borylation/transmetalation process, and/or (ii) trapping of the Lewis acidic side product FBpin by formation of [F2Bpin]- to avoid the formation of a significant amount of NHC-FBpin and consequently of decomposition of {Ni(NHC)2} species in the reaction mixture. We reported a highly selective and general photo-induced C-Cl borylation protocol that employs [Ni(IMes)2] (IMes = 1,3-dimesitylimidazoline-2-ylidene) for the radical borylation of chloroarenes. This photo-induced system operates with visible light (400 nm) and achieves borylation of a wide range of chloroarenes with B2pin2 at room temperature in excellent yields and with high selectivity, thereby demonstrating its broad utility and functional group tolerance. Mechanistic investigations suggest that the borylation reactions proceed via a radical process. EPR studies demonstrate that [Ni(IMes)2] undergoes very fast chlorine atom abstraction from aryl chlorides to give [NiI(IMes)2Cl] and aryl radicals. Control experiments indicate that light promotes the reaction of [NiI(IMes)2Cl] with aryl chlorides generating additional aryl radicals and [NiII(IMes)2Cl2]. The aryl radicals react with an anionic sp2-sp3 diborane [B2pin2(OMe)]- formed from B2pin2 and KOMe to yield the corresponding borylation product and the [Bpin(OMe)]•- radical anion, which reduces [NiII(IMes)2Cl2] under irradiation to regenerate [NiI(IMes)2Cl] and [Ni(IMes)2] for the next catalytic cycle. A highly efficient and general protocol for traceless, directed C3-selective C-H borylation of indoles with [Ni(IMes)2] as the catalyst was achieved. Activation and borylation of N-H bonds by [Ni(IMes)2] is essential to install a Bpin moiety at the N-position as a traceless directing group, which enables the C3-selective borylation of C-H bonds. The N-Bpin group which is formed is easily converted in situ back to an N-H group by the oxidiative addition product of [Ni(IMes)2] and in situ-generated HBpin. The catalytic reactions are operationally simple, allowing borylation of of a variety of substituted indoles with B2pin2 in excellent yields and with high selectivity. The C-H borylation can be followed by Suzuki-Miyaura cross-coupling of the C-borylated indoles in an overall two-step, one-pot process providing an efficient method for synthesizing C3-functionalized heteroarenes. N2 - Es wurden effiziente und allgemeine Methoden für die selektive C-B-Verknüpfung mittels [Ni(IMes)2]-katalysierter Borylierungen von Arylfluoriden, Arylchloriden und substituierten Indolen entwickelt, welches alles leicht verfügbare Substrate sind. ... KW - Organoboron Compounds KW - N-Heterocyclic Carbene KW - Borylation KW - Photocatalysis KW - C-F KW - C-Cl KW - C-H KW - Nickel KW - Rhodium KW - Borylierung KW - Heterocyclische Carbene <-N> KW - Nickelkomplexe Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-213004 ER - TY - THES A1 - Miesler, Tobias Hans-Herbert T1 - Development of diagnostic systems targeting the human tongue as a 24/7 available detector T1 - Entwicklung von diagnostischen Systemen, welche die menschliche Zunge als 24/7 verfügbaren Detektor nutzen N2 - To diagnose diseases correctly requires not only trained and skilled personnel, but also cost-intensive and complex equipment. Rapid tests can help with the initial evaluation, but result generation can also take up to several hours, depending on the test system. At this point, novel bioresponsive diagnostic systems are used, responding to the disease related shift of biological processes. They monitor changes in the biological environment and can react to them e.g. with the release of substances. This can be used in drug delivery formulations but can also help to diagnose diseases occurring in the oral cavity and inform patients of their state of health. The tongue is herein used as a 24/7 available detector. In section I of this work, the foundation for the development of these diagnostic systems was laid. A suitable flavoring agent was found, which is stable, can be coupled to the N-terminus of peptides and has a strongly conceivable taste. For the optimization of the protease-sensitive linker (PSL), an analytical system was established (PICS assay), which determines protease-specific cleavable amino acid sequences. In order to replace the PMMA particles previously required, an acetyl protecting group was introduced N-terminally as it protects peptides and proteins in the human body from degradation by human aminopeptidase. The new synthesized flavor was examined with a NIH cell line for cytotoxicity and with an electronic tongue setup for its bitterness. Section II deals with the structure of a system which detects severe inflammations in the oral cavity, e.g. PA. The established PICS assay was used to confirm the previously used PSL sequence in its application. Using solid phase peptide synthesis, 3 linkers were synthesized which respond to the elevated MMP concentrations present in inflammation. The resulting peptides were acetylated and coupled with HATU/DIPEA to the modified denatonium. Cutting experiments with MMPs over different concentration and time ranges confirmed the response of the diagnostic sensor to these enzymes. The obtained construct was examined for cell toxicity by WST assay. The masked bitterness of the sensors was confirmed by an electronic tongue setup. To address non-human proteases (and thereby infections), section III focuses on the establishment of detection system of a cysteine protease SpeB expressed by Streptococcus pyogenes. The in-house expression of SpeB using E. coli cells was established for this purpose. An analysis of the SpeB cleavage sites was performed using a PICS assay setup. Four constructs with different PSL were synthesized analogous to section II. Cleavage experiments with the expressed and purified SpeB showed a response of two constructs to the protease. In addition, a system was established to quantify the concentration of SpeB in human saliva using western blot technique with subsequent quantification. In section IV a compound was synthesized which can now be coupled to a flavor. The final coupled construct is able to detect present NA activity specifically from influenza A and B. The market for existing influenza diagnostics was explored to determine the need for such a system. A neuraminic acid was modified in positions 4 and 7 and protected in such a way that subsequent coupling via the hydroxy-group in position 2 was selectively possible. In summary, this results in a diagnostic platform that can be used anywhere, by anyone and at any time. This represents a new dimension in the rapid diagnosis of inflammations and bacterial or viral infections. N2 - Krankheiten korrekt zu diagnostizieren erfordert nicht nur geschultes und ausgebildetes Personal, sondern zudem auch kostenintensive und komplexe Geräte. Schnelltests helfen bei der ersten Auswertung, können aber je nach Testsystem dennoch bis zu einigen Stunden in Anspruch nehmen, bevor ein Ergebnis vorliegt. An dieser Stelle werden neuartige, , sogenannte bioresponsive diagnostische Systeme eingesetzt. Sie überwachen Ihre biologische Umgebung und können auf Veränderung dieser z.B. mit der Freisetzung von Substanzen reagieren. Durch das in dieser Arbeit entwickelte diagnostische System können Veränderungen im Mundraum erkannt und Patienten über ihren Gesundheitszustand in Kenntnis gesetzt werden. Hierbei wird die Zunge als 24/7 verfügbarer Detektor genutzt. Im Abschnitt I wurde das Fundament zur Entwicklung dieser diagnostischen Systeme gelegt. Ein geeigneter Geschmacksstoff wurde gefunden, welcher stabil, koppelbar an Peptide und geschmacklich gut wahrnehmbar ist um ein positives Testresultat anzuzeigen. Für die Optimierung des Protease-sensitiven Linkers (PSL) wurde ein System etabliert (PICS-Assay), welches in der Lage ist eine Protease-spezifische Aminosäure-Schneidsequenz zu bestimmen. Um den im vorherigen System benötigten PMMA-Partikel zu ersetzen, wurde eine Acetylschutzgruppe am N-terminus eingeführt, welche die gleiche schützende Funktion wie ein solcher Partikel gegen den Abbau von Peptiden und Proteinen durch die körpereigene Aminopeptidase besitzt. Das gesamte Konstrukt wurde mit einer NIH-Zelllinie auf toxikologische Aspekte hin untersucht und die Maskierung des Geschmacks im ungeschnittenen Zustand mittels elektronischer Zunge überprüft. Abschnitt II handelt vom Aufbau eines Systems, welches schwerwiegende Entzündungen im Mundraum, wie sie z.B. bei einer Parodontitis vorliegen detektiert. Der etablierte PICS-Assay wurde genutzt, die vorher verwendete PSL-Sequenz in ihrer Anwendung zu bestätigen. Mittels Festphasen-Peptidsynthese wurden drei Linker synthetisiert, welche auf die erhöhten MMP-Konzentrationen, welche bei Entzündungen vorliegen ansprechen. Die erhaltenen Peptide wurden acetyliert und mit HATU/DIPEA an das modifizierte Denatonium gekoppelt. Schneidversuche dieser Modelsysteme mit MMP‘s über verschiedene Konzentrations- und Zeitbereiche bestätigten das Ansprechen des diagnostischen Sensors auf diese Enzyme. Das erhaltene Konstrukt wurde mittels WST-Assay auf Zelltoxizität hin untersucht. Um auch non-humane Proteasen, welche auf Infektionen hinweisen, adressieren zu können konzentriert sich Abschnitt III auf die Etablierung eines Nachweis-Systems der Cystein-Protease SpeB, welches von Streptococcus pyogenes exprimiert wird. Hierzu wurde die hauseigene Exprimierung von SpeB mittels E. Coli Zellen etabliert. Vom gewonnenen SpeB wurde eine Analyse der Schnittstelle mittels PICS-Assay durchgeführt. Vier Konstrukte mit verschiedenen PSL wurden analog zu Abschnitt II synthetisiert. Schneidversuche mit dem exprimierten SpeB zeigten ein Ansprechen von zwei Konstrukten auf die Protease. Zudem wurde ein System etabliert um mittels Western Blot die Konzentration von SpeB im menschlichen Speichel zu quantifizieren. Im Abschnitt IV wurde eine Verbindung synthetisiert, welche an einen Geschmacksstoff gekoppelt werden kann. Das gesamte diagnostische System ist im Stande Influenza-Viren nachzuweisen. Der Markt zur bestehenden Influenza Diagnostik wurde exploriert um die Notwendigkeit eines solchen Systems zu ermitteln. Eine Neuraminsäure wurde in Position 4 und 7 modifiziert und so geschützt, das nachfolgendes Koppeln über die Hydroxygruppe in Position 2 selektiv möglich wurde. Zusammengefasst ergibt sich eine diagnostische Plattform, welche überall, von jedem und jederzeit angewandt werden. Dies stellt eine neue Dimension der Schnelldiagnostik von Entzündungen und bakteriellen oder viralen Infektionen dar. KW - Diagnostik KW - Schnelltest KW - Sensoren KW - Zunge KW - Kaugummi KW - Point-of-Care-testing KW - Tongue KW - Chewing Gum KW - Sensors KW - Zunge KW - Kaugummi Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-214490 ER - TY - THES A1 - Pernitzsch, Sandy Ramona T1 - Functional Characterization of the abundant and conserved small regulatory RNA RepG in Helicobacter pylori T1 - Funktionelle Charakterisierung der abundanten und konservierten kleinen regulatorischen RNA RepG in Helicobacter pylori N2 - Bacterial small non-coding RNAs (sRNAs) play fundamental roles in controlling and finetuning gene expression in a wide variety of cellular processes, including stress responses, environmental signaling and virulence in pathogens. Despite the identification of hundreds of sRNA candidates in diverse bacteria by genomics approaches, the mechanisms and regulatory capabilities of these posttranscriptional regulators have most intensively been studied in Gram-negative Gammaproteobacteria such as Escherichia coli and Salmonella. So far, almost nothing is known about sRNA-mediated regulation (riboregulation) in Epsilonproteobacteria, including the major human pathogen Helicobacter pylori. H. pylori was even thought to be deficient for riboregulation as none of the sRNAs known from enterobacteria are conserved in Helicobacter and since it lacks the major RNA chaperone Hfq, which is crucial for sRNA function as well as stability in many bacteria. Nonetheless, more than 60 cis- and trans-acting sRNA candidates were recently identified in H. pylori by a global RNA sequencing approach, indicating that this pathogen, in principle, has the capability to use riboregulation for its gene expression control. However, the functions and underlying mechanisms of H. pylori sRNAs remained unclear. This thesis focused on the first functional characterization and target gene identification of a trans-acting sRNA, RepG (Regulator of polymeric G-repeats), in H. pylori. Using in-vitro and in-vivo approaches, RepG was shown to directly base-pair with its C/Urich terminator loop to a variable homopolymeric G-repeat in the 5’ untranslated region (UTR) of the tlpB mRNA, thereby regulating expression of the chemotaxis receptor TlpB. While the RepG sRNA is highly conserved, the length of the G-repeat in the tlpB mRNA leader varies among different H. pylori isolates, resulting in a strain-specific tlpB regulation. The modification of the number of guanines within the G-stretch in H. pylori strain 26695 demonstrated that the length of the homopolymeric G-repeat determines the outcome of posttranscriptional control (repression or activation) of tlpB by RepG. This lengthdependent targeting of a simple sequence repeat by a trans-acting sRNA represents a new twist in sRNA-mediated regulation and a novel mechanism of gene expression control, since it uniquely links phase variation by simple sequence repeats to posttranscriptional regulation. In almost all sequenced H. pylori strains, tlpB is encoded in a two gene operon upstream of HP0102, a gene of previously unknown function. This study provided evidence that HP0102 encodes a glycosyltransferase involved in LPS O-chain and Lewis x antigen production. Accordingly, this glycosyltransferase was shown to be essential for mice colonization by H. pylori. The coordinated posttranscriptional regulation of the tlpB-HP0102 operon by antisense base-pairing of RepG to the phase-variable G-repeat in the 5’ UTR of the tlpB mRNA allows for a gradual, rather than ON/OFF, control of HP0102 expression, thereby affecting LPS biosynthesis in H. pylori. This fine-tuning of O-chain and Lewis x antigen expression modulates H. pylori antibiotics sensitivity and thus, might be advantageous for Helicobacter colonization and persistence. Whole transcriptome analysis based on microarray and RNA sequencing was used to identify additional RepG target mRNAs and uncover the physiological role of this riboregulator in H. pylori. Altogether, repG deletion affected expression of more than 40 target gene candidates involved various cellular processes, including membrane transport and adhesion, LPS modification, amino acid metabolism, oxidative and nitrosative stress, and nucleic acid modification. The presence of homopolymeric G-repeats/G-rich sequences in almost all target mRNA candidates indicated that RepG hijacks a conserved motif to recognize and regulate multiple target mRNAs in H. pylori. Overall, this study demonstrates that H. pylori employs riboregulation in stress response and virulence control. In addition, this thesis has successfully established Helicobacter as a new model organism for investigating general concepts of gene expression control by Hfq-independent sRNAs and sRNAs in bacterial pathogens. N2 - Bakterielle kleine, nicht-kodierende RNAs (sRNAs, engl. für small RNAs) spielen eine fundamentale Rolle in der Kontrolle und Feinabstimmung der Genexpression in Bakterien. Sie sind an einer Vielzahl von zellulären Prozessen, einschließlich der Adaption an unterschiedliche Stress- sowie Umweltbedingungen und der Virulenz von bakteriellen Pathogenen, beteiligt. Trotz der Identifizierung von Hunderten von sRNA-Kandidaten in diversen Bakterien durch genomweite Untersuchungsmethoden, wurden die regulatorischen Eigenschaften und Mechanismen dieser posttranskriptionellen Regulatoren bisher hauptsächlich in Gram-negativen Gammaproteobakterien wie Escherichia coli und Salmonella untersucht. Bislang ist nur wenig über sRNA-basierte Regulation (Riboregulation) in Epsilonproteobakterien, einschließlich dem weitverbreiteten Humanpathogen Helicobacter pylori, bekannt. Es wurde sogar angenommen, dass H. pylori über keine Art der Riboregulation verfügt, da keine der enterobakteriellen sRNAs in Helicobacter konserviert sind. Zudem konnte in diesem Erreger kein Homolog für das RNAChaperon Hfq, welches in vielen Bakterien essentiell für die Funktion und Stabilität von sRNAs ist, identifiziert werden. Nichtsdestotrotz wurden mit Hilfe einer globalen RNASequenzierungsstudie,die auf der Sequenzierung primärer Transkripte in einem Hochdurchsatzverfahren basiert, kürzlich mehr als 60 in cis- und in trans-agierende sRNAKandidaten in H. pylori identifiziert. Diese Transkriptomanalyse deutet darauf hin, dass H. pylori prinzipiell die Fähigkeit hat Riboregulation zur Kontrolle seiner Genexression zu nutzen. Die Funktionen und Mechanismen von sRNAs in H. pylori sind jedoch immer noch unklar. In der vorgelegten Arbeit wurde erstmals eine in trans-agierende sRNA, RepG (Regulator of polymeric G-repeats), in Helicobacter charakterisiert sowie dessen zelluläre Zielgene identifiziert. Mit Hilfe diverser in-vitro und in-vivo Analysen konnte gezeigt werden, dass der C/U-reiche Transkriptionsterminatorloop von RepG direkt an eine variable, repetitive G-Sequenz in der 5‘ untranslatierten Region (UTR) der tlpB mRNA bindet. Durch diese direkte sRNA-mRNA Interaktion wird die Expression des Chemotaxis Rezeptors TlpB reguliert. Im Gegensatz zu einer hohen Konservierung der Sequenz der RepG sRNA, variiert die Länge des G-Stretches im 5‘ UTR der tlpB mRNA zwischen unterschiedlichen H. pylori Isolaten. Diese Längenvariation resultiert in einer Stamm-spezifischen Regulation der TlpB Expression. Die Modifikation der Anzahl der Guanin-Basen im G-Stretch des H. pylori Stammes 26695 demonstrierte, dass die Länge der repetitiven G-Sequenz das Ergebnis der posttranskriptionellen Regulation (Repression oder Aktivierung) von tlpB durch RepG beeinflusst. Die hier beschriebene Längen-abhängige Interaktion zwischen einer in transagierenden sRNA und einer einfachen, repetitiven Sequenz repräsentiert nicht nur ein neues Konzept für die Genregulation durch sRNAs, sondern stellt auch einen neuen Mechanismus der Genexpressionskontrolle dar. Darüber hinaus, veranschaulicht die hier beschriebene sRNA-mRNA Interaktion eine bislang einzigartige Verknüpfung von Phasenvariation durch hochvariabel, repetitive Sequenzen mit Genregulation durch sRNAs. In nahezu allen sequenzierten H. pylori Stämmen ist das tlpB Gen in einem Operon zusammen mit einem Gen mit bisher unbekannter Funktion, HP0102, kodiert. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass HP0102 für eine Glykosyltransferase kodiert, die an der Synthese der O-Seitenketten des LPS und des Lewis x Antigens in H. pylori beteiligt ist. Darüber hinaus konnte demonstriert werden, dass diese Glykosyltransferase für die Kolonisierung des murinen Magens durch H. pylori essentiell ist. Die koordinierte, posttranskriptionelle Regulation des tlpB-HP0102 Operons, welche durch antisense Basenpaarung zwischen RepG und der phasen-variablen, repetitiven G-Sequenz im 5‘ UTR der tlpB mRNA vermittelt wird, ermöglicht eine graduelle Kontrolle der Genexpression von HP0102, und somit Einflussnahme auf die LPS Biosynthese in H. pylori. Diese Feinabstimmung der LPS O-Seitenketten und Lewis x Antigen Expression beeinflusst die Resistenz von H. pylori gegen diverse Antibiotika und könnte somit sowohl für die Kolonisierung als auch für die persistente Infektion des Wirts durch H. pylori vorteilhaft sein. Um Einblicke in die physiologische Funktion von RepG zu gewinnen, wurden in einer genom-weiten Transkriptomanalyse mittels Microarray und RNA-Sequenzierung weitere Zielgene von RepG bestimmt. Insgesamt beeinflusste die Deletion von repG die Expression von mehr als 40 potentiellen Zielgenen, welche an diversen zellulären Prozessen beteiligt sind, wie z.B. Membrantransport und Adhäsion, Aminosäure- und Nukleinsäure-Metabolismus, oxidative und nitrosative Stressantwort sowie LPS Modifizierung. Die Identifizierung von homopolymeren G-Stretchen bzw. G-reichen Sequenzen in allen ZielmRNAs deutet darauf hin, dass RepG ein konserviertes Motiv bindet, um mehrere Zielgene in H. pylori zu erkennen und zu regulieren. Zusammenfassend zeigt diese Arbeit, dass H. pylori Riboregulation basierend auf sRNAs nutzt, um seine Genexpression in unterschiedlichen Stress- und Virulenzbedingungen zu regulieren. Darüber hinaus hat diese Studie Helicobacter als neuen Modelorganismus für die Untersuchung genereller Wirkungsweisen Hfq-unabhängiger sRNAs und sRNAs in bakteriellen Pathogenen etabliert. KW - Small RNA KW - Helicobacter pylori KW - Genregulation KW - Riboregulation KW - Chemotaxis KW - LPS Biosynthese KW - Sequenzwiederholung KW - Phasenvariation Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-122686 ER - TY - THES A1 - Adenugba, Akinbami Raphael T1 - Functional analysis of the gene organization of the pneumoviral attachment protein G T1 - Funktionelle Analyse der Genorganisation des pneumoviralen Attachment-Protein G N2 - The putative attachment protein G of pneumonia virus of mice (PVM), a member of the Pneumoviruses, is an important virulence factor with so far ambiguous function in a virus-cell as well as in virus-host context. The sequence of the corresponding G gene is characterized by significant heterogeneity between and even within strains, affecting the gene and possibly the protein structure. This accounts in particular for the PVM strain J3666 for which two differing G gene organizations have been described: a polymorphism in nucleotide 65 of the G gene results in the presence of an upstream open reading frame (uORF) that precedes the main ORF in frame (GJ366665A) or extension of the major G ORF for 18 codons (GJ366665U). Therefore, this study was designed to analyse the impact of the sequence variations in the respective G genes of PVM strains J3666 and the reference strain 15 on protein expression, replication and virulence. First, the controversy regarding the consensus sequence of PVM J3666 was resolved. The analysis of 45 distinct cloned fragments showed that the strain separated into two distinct virus populations defined by the sequence and structure of the G gene. This division was further supported by nucleotide polymorphisms in the neighbouring M and SH genes. Sequential passage of this mixed strain in the cell line standardly used for propagation of virus stocks resulted in selection for the GJ366665A-containing population in one of two experiments pointing towards a moderate replicative advantage. The replacement of the G gene of the recombinant PVM 15 with GJ366665A or GJ366665U, respectively, using a reverse genetic approach indicated that the presence of uORF within the GJ366665A significantly reduced the expression of the main G ORF on translational level while the potential extension of the ORF in GJ366665U increased G protein expression. In comparison, the effect of the G gene-structure on virus replication was inconsistent and dependent on cell line and type. While the presence of uORF correlated with a replication advantage in the standardly used BHK-21 cells and primary murine embryonic fibroblasts, replication in the murine macrophage cell line RAW 264.7 did not. In comparison, the GJ366665U variant was not associated with any effect on replication in cultured cells at all. Nonetheless, in-vivo analysis of the recombinant viruses associated the GJ366665U gene variant, and hence an increased G expression, with higher virulence whereas the GJ366665A gene, and therefore an impaired G expression, conferred an attenuated phenotype to the virus. To extend the study to other G gene organizations, a recombinant PVM expressing a G protein without the cytoplasmic domain and for comparison a G-deletion mutant, both known to be attenuated in vivo, were studied. Not noticed before, this structure of the G gene was associated with a 75% reduction in G protein expression and a significant attenuation of replication in macrophage-like cells. This attenuation was even more prominent for the virus lacking G. Taking into consideration the higher reduction in G protein levels compared to the GJ366665A variant indicates that a threshold amount of G is required for efficient replication in these cells. In conclusion, the results gathered indicated that the expression levels of the G protein were modulated by the sequence of the 5’ untranslated region of the gene. At the same time the G protein levels modulated the virulence of PVM. N2 - Das mutmaßliche „attachment“ Protein G des Pneumonievirus der Maus (PVM), einem Mitglied des Genus Pneumovirus, ist ein bedeutender Virulenzfaktor, mit allerdings noch nicht vollständig verstandener Funktion. Dabei zeichnet sich die Sequenz des G-Gens durch Nukleotid-Polymorphismen und damit verbundenen Variationen in der Genorganisation und möglicherweise der Proteinstruktur sowohl zwischen als auch innerhalb von PVM-Stämmen aus. Insbesondere für den PVM-Stamm J3666 wurden zwei verschiedene Organisationen des G-Gens beschrieben: ein Polymorphismus des Nukleotids 65 des G-Genes erzeugt einen neuen „upstream Open reading frame“ (uORF), der dem eigentlichen G-ORF vorausgeht (GJ366665A), oder führt zu einer Verlängerung des eigentlichen G-ORF von G um 18 Kodons (GJ366665U). Ziel dieser Studie war es deshalb, die Auswirkung dieser Sequenzvariabilitäten der für PVM J3666 beschriebenen G-Gene im Vergleich zu dem des Referenzstamms PVM 15 bezüglich Proteinexpression, der Virusreplikation und der Virulenz zu untersuchen. Als erstes wurden die beschriebenen Sequenzunterschiede bezüglich des PVM-Stamms J3666 untersucht. Die Analyse von 45 verschiedenen klonierten Fragmenten von PVM J3666 zeigte, dass es sich bei diesem Stamm eigentlich um zwei separate Viruspopulationen handelt, die sich durch die Sequenz und Struktur des G-Genes definieren lassen. Diese Unterscheidung wird durch weitere Nukleotid-Polymorphismen in den benachbarten Genen, M und SH, gestärkt. Sequenzielle Passagierung dieses gemischten Stammes in der standardmäßig zur Virusanzucht verwendeten BHK-21-Zelllinie resultierte in einem von zwei Experimenten in der Selektion der GJ366665A-Population, das ein Hinweis auf einen moderaten Replikationsvorteil darstellt. Der Austausch des G-Gens des Referenzstamms PVM 15 durch GJ366665A oder GJ366665U mithilfe der Reversen Genetik, zeigte, dass der uORF innerhalb von GJ366665A zu einer deutlich reduzierten Expression des eigentlichen G-ORF führt. Andererseits führte die potenzielle Verlängerung des ORF in GJ366665U zu einer im gleichen Maße erhöhten Expression des G-Proteins. Dagegen war der Einfluss der G-Genorganisation auf die Virusvermehrung in Zellkultur in Abhängigkeit von Zelllinie und Zelltyp inkonsistent. Während ein uORF mit einem Replikationsvorteil in BHK-21-Zellen und primären murinen embryonen Fibroblasten korrelierte, war dies in der murinen Makrophagen-Zelllinie RAW 264.7 nicht zu beobachten. Im Vergleich dazu konnte die GJ366665U-Variante nicht mit einem Einfluss auf die Virusvermehrung in Verbindung gebracht werden. Nichtsdestotrotz, konnte die GJ366665U-Variante, und damit eine erhöhte Expression von G, mit einer gesteigerten Virulenz assoziiert werden, während die GJ366665A-Variante, d. h. eine verringerte G-Expression zur Attenuierung des Virus führte. Die Untersuchungen wurden auf weitere G-Genstrukturen, d.h. ein rekombinantes PVM, rPVM-Gt, das ein N-terminal verkürztes G-Protein exprimiert, ausgeweitet. Zum Vergleich wurde eine Deletionsmutante des kompletten G-Gens, rPVM-ΔG, mit einbezogen. Von beiden Viren war bereits bekannt, dass sie in vivo attenuiert sind. Die Organisation des Gt-Gens war mit einer um 75 % verringerten Expression des entsprechenden Proteins assoziiert, was zuvor nicht beobachtet worden war. Zugleich zeigte rPVM-Gt eine deutliche Attenuierung der Replikation in RAW 264.7-Zellen und primären Mausmakrophagen, die von der G-Deletionsmutante noch übertroffen wurde. Die im Vergleich zu der GJ366665A-Variante deutlich höhere Reduktion der G-Expression dieser beiden G-Mutanten in Betracht ziehend, scheint dies darauf hinzuweisen, dass eine bestimmte Mindestexpression von G für eine effiziente Virusvermehrung in diesen Zellen benötigt wird. Zusammenfassend deuten die erhaltenen Ergebnisse darauf hin, dass die Expression des G-Proteins durch die jeweiligen 5’ nicht-translatierte Region des Gens moduliert wird, was einen neuen Mechanismus für Negativstrang-RNA-Viren darstellt. Zugleich moduliert die Expressionsrate von G die Virulenz von PVM. KW - G glycoprotein KW - protein regulation and expression KW - Pneumoviruses KW - regulation KW - expression KW - replication KW - virulence KW - 5`-UTR KW - PVM KW - RSV Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-128146 ER - TY - THES A1 - Hecht, Markus T1 - Liquid-Crystalline Perylene Bisimide and Diketopyrrolopyrrole Assemblies T1 - Flüssigkristalline Perylenbisimid- und Diketopyrrolopyrrolstrukturen N2 - The research presented in this thesis illustrates that self-assembly of organic molecules guided by intermolecular forces is a versatile bottom-up approach towards functional materials. Through the specific design of the monomers, supramolecular architectures with distinct spatial arrangement of the individual building blocks can be realized. Particularly intriguing materials can be achieved when applying the supramolecular approach to molecules forming liquid-crystalline phases as these arrange in ordered, yet mobile structures. Therefore, they exhibit anisotropic properties on a macroscopic level. It is pivotal to precisely control the interchromophoric arrangement as functions originate in the complex structures that are formed upon self-assembly. Consequently, the aim of this thesis was the synthesis and characterization of liquid-crystalline phases with defined supramolecular arrangements as well as the investigation of the structure-property relationship. For this purpose, perylene bisimide and diketopyrrolopyrrole chromophores were used as they constitute ideal building blocks towards functional supramolecular materials due to their thermal stability, lightfastness, as well as excellent optical and electronic features desirable for the application in, e.g., organic electronics. N2 - Mithilfe von Gestaltungsprinzipien der supramolekularen Chemie können komplexe Strukturen realisiert werden, die mit Ansätzen der kovalenten Chemie nicht erreichbar sind. Ein zentraler Aspekt ist hierbei der systematische Aufbau der Monomereinheiten, welche unter geeigneten Bedingungen über intermolekulare Wechselwirkungen selbstassemblieren und Architekturen mit spezifischer räumlicher Anordnung der einzelnen Bauelemente formen. Flüssigkristalline Materialien zeigen zusätzlich zu positioneller und Orientierungsfernordnung der Moleküle, welche anisotrope Eigenschaften auf makroskopischer Ebene erzeugen, eine gewisse Mobilität. Daher können durch Kombination des supramolekularen Ansatzes mit Flüssigkristallen besonders interessante Materialien erzeugt werden. Da die spezische Anordnung der Moleküle die Funktion des selbstassemblierten Materials stark beeinflusst, ist es von großer Bedeutung, diese exakt kontrollieren zu können. Daher war es Ziel dieser Arbeit, flüssigkristalline Phasen mit einer definierten supramolekularen Struktur zu synthetisieren und zu charakterisieren. Weiterhin war es ein Ziel, diese auf ihre funktionellen Eigenschaften zu untersuchen, die aus der spezifischen Anordnung der Monomereinheiten hervorgehen. Für diesen Zweck wurden Perylenbisimid- und Diketopyrrolopyrrolfarbstoffe als Baueinheiten verwendet, da diese aufgrund ihrer Licht- und Hitzestabilität sowie exzellenten optischen und elektronischen Eigenschaften ideale Materialien für die Anwendung in der organischen Elektronik darstellen. KW - Selbstorganisation KW - Flüssigkristall KW - Perylenderivate KW - Perylene Bisimide KW - Liquid Crystal KW - J-Aggregates KW - Photoconductivity KW - Self-Assembly KW - Perylenbisimid Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-216987 ER - TY - THES A1 - Simon, Camilla T1 - Financial Market Effects of Macroeconomic Policies T1 - Finanzmarkteffekte makroökonomischer Politikmaßnahmen N2 - Within three self-contained studies, this dissertation studies the impact and interactions between different macroeconomic policy measures in the context of financial markets empirically and quantitatively. The first study of this dissertation sheds light on the financial market effects of unconventional central bank asset purchase programs in the Eurozone, in particular sovereign bond asset purchase programs. The second study quantifies the direct implications of unconventional monetary policy on decisions by German public debt management regarding the maturity structure of gross issuance. The third study provides novel evidence on the role of private credit markets in the propagation of public spending toward private consumption in the U.S. economy. Across these three studies a set of different time-series econometric methods is applied including error correction models and event study frameworks to analyze contemporaneous interactions in financial and macroeconomic data in the context of unconventional monetary policy, as well as vector auto regressions (VARs) and local projections to trace the dynamic consequences of macroeconomic policies over time. N2 - Die vorliegende Dissertation untersucht in drei in sich geschlossenen Studien die Effekte und Wechselwirkungen verschiedener makroökonomischer Politikmaßnahmen an den Finanzmärkten empirisch und quantitativ. Die erste Studie dieser Dissertation beleuchtet dabei die Finanzmarkteffekte unkonventioneller geldpolitischer Programme - insbesondere Staatsanleihekäufe - der Europäischen Zentralbank. Die zweite Studie untersucht und quantifiziert die direkten Auswirkungen unkonventioneller Geldpolitik auf Entscheidungen des deutschen öffentlichen Schuldenmanagements hinsichtlich der Laufzeitenstruktur neuemittierter Wertpapiere. Die dritte Studie liefert neue Erkenntnisse über die Rolle der privaten Kreditmärkte bei der Transmission öffentlicher Ausgaben für den privaten Konsum in der US-Wirtschaft. Im Rahmen der enthaltenen Studien wird eine Reihe verschiedener zeitreihenökonometrischer Methoden angewandt, darunter Fehlerkorrekturmodelle und Ereignisstudien zur Analyse simultaner Wechselwirkungen von Finanz- und makroökonomischen Daten im Kontext unkonventioneller Geldpolitik sowie Vektor-Autoregressionen (VARs) und lokale Projektionen, um die dynamischen Folgen makroökonomischer Politiken im Zeitablauf zu verfolgen. KW - Geldpolitik KW - Notenbank KW - Kreditmarkt KW - Unkonventionelle Geldpolitik KW - Öffentliches Schuldenmanagement KW - Öffentliche Ausgaben KW - Unconventional Monetary Policy KW - Public Debt Meanagement KW - Public Spending KW - Europäische Zentralbank KW - Bundesrepublik Deutschland - Finanzagentur KW - Zeitreihenanalyse Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-217654 ER - TY - THES A1 - Hafer [geb. Zailer], Elina T1 - Tagging - Development of new qNMR methods T1 - Tagging - Die Entwicklung neuer Quantifizierungmethoden in der NMR Spektroskopie N2 - High-resolution nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy is used in structure elucidation and qualitative as well as quantitative examination of product components. Despite the worldwide development of numerous innovative NMR spectroscopic methods, several official methods that analyze specific substances and do not represent a holistic analysis, are still in use for the quality control of drugs, food and chemicals. Thus, counterfeit or contaminated products of inferior quality can be brought onto the market and distributed despite previous quality controls. To prevent this, three NMR spectroscopic methods have been developed within the scope of this work (1) to study the peroxide value in vegetable and animal oils, (2) for the qualitative and quantitative analysis of metal cations and (3) to determine the enantiomeric excess in chiral alcohols. In oil analysis, titration methods are used to determine the bulk quality parameters such as peroxide value, which represents the concentration of peroxides. Titrations show several drawbacks, such as the need of a large amount of sample and solvents, cross reactions and the low robustness. Thus, an alternative NMR spectroscopic method was developed to improve the peroxide analysis by using triphenylphosphine as a derivatization reagent, which reacts with peroxides in a stoichiometric ratio of 1:1 forming triphenylphosphine oxide. In the 1H-31P decoupled NMR spectrum, the signals of the unreacted triphenylphosphine and the reacted triphenylphosphine oxide are detected at 7.4 ppm and 7.8 ppm, respectively. The ratio of the two signals is used for the calculation of the peroxide concentration. 108 oil samples with a peroxide value between 1 meq/kg and 150 meq/kg were examined using the developed method. Oils with a very low peroxide value of less than 3 meq/kg showed a relative standard deviation of 4.9%, highly oxidized oils with a peroxide value of 150 meq/kg of 0.2%. The NMR method was demonstrated as a powerful technique for the analysis of vegetable and krill oils. Another 1H NMR spectroscopic method was developed for the qualitative determination of Be2+, Sr2+ and Cd2+, and for the qualitative and quantitative determination of Ca2+, Mg2+, Hg2+, Sn2+, Pb2+ and Zn2+ by using ethylenediamine tetraacetate (EDTA) as complexing agent. EDTA is a hexadentate ligand that forms stable chelate complexes with divalent cations. The known amount of added EDTA and the signal ratio of free and complexed EDTA are used to calculate the concentrations of the divalent cations, which makes the use of an internal standard obsolete. The use of EDTA with Be2+, Sr2+, Cd2+, Ca2+, Mg2+, Hg2+, Sn2+, Pb2+ and Zn2+ result in complexes whose signals are pH-independent, showing cation-specific chemical shifts and couplings in the 1H NMR spectrum that are used for identification and quantification. In the presented NMR method, the limit of quantification of the cations Ca2+, Mg2+, Hg2+, Sn2+, Pb2+, and Zn2+ was determined with 5-22 μg/mL. This method is applicable in the food and drug sectors. The third NMR spectroscopic method introduced an alternative determination of the enantiomer excess (ee) of the chiral alcohols menthol, borneol, 1-phenylethanol and linalool using phosgene as a derivatizing reagent. Phosgene reacts with a chiral alcohol to form carboxylic acid diesters, made of two identical (RR, SS) or two different enantiomers (RS, SR). These two different types of diastereomers can be examined by the difference of their chemical shifts. In the presented method, the integration values of the carbonyl signals in the 13C NMR spectrum are used for the determination of the enantiomer excess. The limit of quantification depends, among others, on the sample and on the non-labelled or 13C-labelled phosgene used for the analysis. In the case of menthol, a quantification limit of ee=99.1% was determined using non-labelled phosgene and ee=99.9% using 13C-labelled phosgene. The 13C NMR method was also applied for the quality control of the enantiomeric purity of borneol, 1-phenylethanol and linalool. The developed 13C NMR method represents a powerful alternative to Mosher’s reagent for investigating the enantiomeric excess in chiral alcohols. This work demonstrates the variety of possibilities of applications for the quantitative nuclear magnetic resonance spectroscopy in the chemical analysis of drugs, food and chemicals using tagging reactions such as derivatizations and complexations. The nuclear resonance spectroscopic methods developed in this research work represent powerful alternatives to the previously used quality control techniques. N2 - Die hochauflösende Kernresonanzspektroskopie findet heute primär Anwendung in derStrukturaufklärung und der qualitativen sowie quantitativen Untersuchung von Produkt-inhaltsstoffen. Trotz der weltweiten Entwicklung von innovativen kernresonanzspektrosko-pischen Methoden sind noch zahlreiche, offiziell anerkannte Methoden zur Qualitätskon-trolle von Arzneimitteln, Lebensmitteln und Chemikalien in Verwendung, die spezifischeSubstanzen kontrollieren und keine ganzheitliche Untersuchung darstellen. Somit könnenverunreinigte, qualitativ minderwertige oder gefälschte Produkte trotz vorheriger Quali-tätskontrollen auf den Markt gebracht und vertrieben werden. Um dies zu verhindern,wurden im Rahmen dieser Arbeit drei kernresonanzspektroskopische Methoden entwickelt,die zur (1) Bestimmung der primären Oxidation in pflanzlichen und tierischen Ölen anhandder Peroxidzahl, (2) zur qualitativen und quantitativen Analyse von Metallkationen und(3) zur Ermittlung des Enantiomerüberschusses in chiralen Alkoholen dienen.In der Ölanalytik werden Titrationsverfahren zur Bestimmung der Bulkqualitätsparameterwie auch der Peroxidzahl, welche die Konzentration an Peroxiden aufzeigt, eingesetzt. Dadie Titration neben dem Einsatz von größeren Mengen an Probenmaterial und Lösungsmit-teln, auch Kreuzreaktionen und eine geringe Robustheit aufweist, wurde eine kernreso-nanzspektroskopische Methode entwickelt, in der Triphenylphosphin als Derivatisierungs-reagenz eingesetzt wird, welches mit Peroxiden im stöchiometrischen Verhältnis von 1:1zu Triphenylphosphinoxid reagiert. Im1H-31P entkoppelten Kernresonanzspektrum wer-den die Signale des nicht reagierten Triphenylphosphins bei 7,4 ppm und des reagiertenTriphenylphosphinoxid bei 7,8 ppm detektiert. Das Verhältnis beider Signale wird in dieKonzentration der Peroxide umgerechnet. 108 Ölproben mit einer Peroxidzahl zwischen 1meq/kg und 170 meq/kg wurden mit der entwickelten Methode untersucht. Hierbei zeigtenÖle mit einer sehr geringen Peroxidzahl von weniger als 3 meq/kg eine relative Standard-abweichung von 4,9%, hochoxidierte Öle mit einer Peroxidzahl von 150 meq/kg 0,2%. Diekernresonanzspektroskopische Methode findet Anwendung in der Untersuchung von Krill-und pflanzlichen Ölen.Eine weitere1H kernresonanzspektroskopische Methode wurde zur qualitativen Analyse. Zusammenfassungvon Be2+, Sr2+und Cd2+und zur qualitatitativen sowie quantitativen Bestimmung vonCa2+, Mg2+, Hg2+, Sn2+, Pb2+und Zn2+entwickelt. Hierbei wurde Ethylendiamintetra-acetat (EDTA) als Komplexbildner verwendet. EDTA ist ein sechszähniger-Ligand, derstabile Chelatkomplexe mit zweiwertigen Kationen bildet. Die definierte Menge an EDTAund das Verhältnis von freier und komplexierter EDTA nach Zugabe der Probe werdenfür die Rückrechnung der Konzentration der Kationen verwendet. Somit ist der Einsatzeines internen Standards obsolet. EDTA komplexiert Be2+, Sr2+, Cd2+, Ca2+, Mg2+, Hg2+,Sn2+, Pb2+und Zn2+zu stabilen Komplexen, deren Signale im Protonen-Kernresonanz-spektrum pH-unabhängige und kationenspezifische chemische Verschiebungen und Kop-plungen aufweisen, die zur Identifizierung und Quantifizierung verwendet werden. DieKoaleszenz der∆undΛKonfigurationen des EDTA-Komplexes mit Be2+, Sr2+und Cd2+führt bei 298K zu einer Signalverbreiterung, die eine Quantifizierung bei den vorliegendenParametern unmöglich macht. Die Kationen Ca2+, Mg2+, Hg2+, Sn2+, Pb2+und Zn2+sindab einer Konzentration von 5-22μg/mL quantitativ in wässriger Lösung quantifizierbar.Diese Methode kann im Lebensmittel- und Arzneimittelbereich eingesetzt werden.Die dritte kernresonanzspektroskopische Methode stellt eine neue Bestimmung des Enan-tiomerüberschusses (ee) in den chiralen Alkoholen Menthol, Borneol, 1-Phenylethanol undLinalool unter Einsatz von Phosgen als Derivatisierungsreagenz vor. Phosgen reagiert miteinem chiralen Alkohol zu Carbonsäurediestern, die aus zwei gleichen (RR, SS) oder zweiunterschiedlichen Enantiomeren (RS, SR) entstehen. Diese zwei Diastereomertypen kön-nen anhand der unterschiedlichen, chemischen Verschiebungen ihrer Signale identifiziertwerden. In der vorgestellten Methode wird das Carbonylsignal integriert und zur Bes-timmung des Enantiomerenüberschusses eingesetzt. Die Bestimmungsgrenze ist hierbeiu. a. von dem eingesetzten Phosgen und der Probe abhängig. Bei Menthol wurdeeine Bestimmungsgrenze mittels nicht markiertem Phosgen von ee = 99,1% und mit-tels13C-markiertem Phosgen von ee = 99,9% ermittelt. Die13C Methode wurde zudemzur Qualitätskontrolle der Enantiomerreinheit von Borneol, 1-Phenylethanol sowie vonLinalool eingesetzt. Hierbei enthielten die käuflich erworbenen Chemikalien (-)-Borneolund (S)-1-Phenylethanol jeweils 1,7% des anderen Enantiomers (+)-Borneol bzw. (R)-1-Phenylethanol. Bei (-)-Linalool konnte ein Enantiomerüberschuss von ee = 66,4% undsomit eine größere Verunreinigung durch (+)-Linalool identifiziert werden. Bei Proben,die einen Enantiomerüberschuss von ee < 95,0% aufweisen, sollte eine potentielle, asym-metrische Induktion mittels Kalibrationskurven anhand von künstlichen Enantiomeren-mischungen vorab untersucht werden. Die entwickelte13C kernresonanzspektroskopischeMethode präsentiert eine leistungsstarke Alternative zur Analyse mittels Mosher’s Reagenzfür die Untersuchung des Enantiomerüberschusses in chiralen Alkoholen.Diese Arbeit weist eine Vielfalt an Möglichkeiten der Anwendungen der quantitativen Kern-resonanzspektroskopie in der chemischen Untersuchung von Arzneimitteln, Lebensmittelnund Chemikalien unter Einsatz von Tagging, wie Derivatisierungen und Komplexierun-gen auf. Die hierbei entwickelten kernresonanzspektroskopischen Methoden repräsentierenleistungsstarke Alternativen zu bisher eingesetzten Techniken der Qualitätskontrolle KW - NMR Spektroskopie KW - EDTA KW - Lipid-Peroxide KW - Chiralität KW - Derivsatisierung KW - Peroxidzahl KW - Enantiomerüberschuss KW - qNMR Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-219583 ER - TY - THES A1 - Oberdörfer, Sebastian T1 - Better Learning with Gaming: Knowledge Encoding and Knowledge Learning Using Gamification T1 - Besser Lernen durch Spielen: Wissensencodierung und Lernen von Wissen mit Gamification N2 - Computer games are highly immersive, engaging, and motivating learning environments. By providing a tutorial at the start of a new game, players learn the basics of the game's underlying principles as well as practice how to successfully play the game. During the actual gameplay, players repetitively apply this knowledge, thus improving it due to repetition. Computer games also challenge players with a constant stream of new challenges which increase in difficulty over time. As a result, computer games even require players to transfer their knowledge to master these new challenges. A computer game consists of several game mechanics. Game mechanics are the rules of a computer game and encode the game's underlying principles. They create the virtual environments, generate a game's challenges and allow players to interact with the game. Game mechanics also can encode real world knowledge. This knowledge may be acquired by players via gameplay. However, the actual process of knowledge encoding and knowledge learning using game mechanics has not been thoroughly defined, yet. This thesis therefore proposes a theoretical model to define the knowledge learning using game mechanics: the Gamified Knowledge Encoding. The model is applied to design a serious game for affine transformations, i.e., GEtiT, and to predict the learning outcome of playing a computer game that encodes orbital mechanics in its game mechanics, i.e., Kerbal Space Program. To assess the effects of different visualization technologies on the overall learning outcome, GEtiT visualizes the gameplay in desktop-3D and immersive virtual reality. The model's applicability for effective game design as well as GEtiT's overall design are evaluated in a usability study. The learning outcome of playing GEtiT and Kerbal Space Program is assessed in four additional user studies. The studies' results validate the use of the Gamified Knowledge Encoding for the purpose of developing effective serious games and to predict the learning outcome of existing serious games. GEtiT and Kerbal Space Program yield a similar training effect but a higher motivation to tackle the assignments in comparison to a traditional learning method. In conclusion, this thesis expands the understanding of using game mechanics for an effective learning of knowledge. The presented results are of high importance for researches, educators, and developers as they also provide guidelines for the development of effective serious games. N2 - Computerspiele stellen attraktive, spannende und motivierende Lernumgebungen dar. Spieler erlernen zu Spielbeginn die grundlegenden Spielregeln und wenden dieses Wissen während des Spielablaufs an. Dadurch wird das dem Spiel zu Grunde liegende Wissen durch Wiederholung geübt und verinnerlicht. Durch einen konstanten Fluss an neuen Herausforderungen, die in ihrer Schwierigkeit ansteigen, müssen Spieler das Wissen auf neue Szenarien übertragen. Innerhalb eines Computerspiels sind Spielmechaniken für eine Anwendung als auch Demonstration des Spielwissens verantwortlich. Die Spielmechaniken regeln den Spielablauf, in dem sie die Spieleraktionen definieren, die virtuelle Umgebung generieren und die Herausforderungen des Spiels festlegen. Das in den Spielmechaniken kodierte Wissen kann jedoch auch der realen Welt entstammen. In diesem Fall entwickeln Spieler Kompetenzen, die später auch in der Realität Anwendung finden können. Das Kodieren von Wissen in Spielmechaniken und der damit einhergehende Lernprozess wurde allerdings noch nicht genau theoretisch erfasst. Diese Dissertation versucht diese Forschungslücke zu schließen, indem ein theoretisches Model der Wissenskodierung in Spielmechaniken entworfen wird: das Gamified Knowledge Encoding. Dieses Model wird sowohl für das Design einer Lernanwendung für das Wissen der Affinen Transformationen, GEtiT, als auch zur Vorhersage von Lerneffekten eines Computerspiels, Kerbal Space Program, herangezogen. In einer Usability-Studie wird sowohl die Anwendbarkeit des Modells für ein effektives Spieldesign als auch das Gesamtdesign von GEtiT bewertet. Das Lernergebnis, das beim Spielen von GEtiT und Kerbal Space Program erzielt wird, wird in vier weiteren Nutzerstudien überprüft. Die Studien validieren den Einsatz des Gamified Knowledge Encoding Models zur Entwicklung von computerspielbasierten Lernumgebungen und die Vorhersage von Lerneffekten. GEtiT und Kerbal Space Program erzielen ein ähnliches Lernergebnis bei einer höheren Motivation im Vergleich zu einer traditionellen Lernmethode. Als Endergebnis erweitert das präsentierte Forschungsprojekt das generelle Verständnis über die Verwendung von Spielmechaniken für ein effektives Lernen. Die präsentierten Ergebnisse sind von großer Bedeutung für Forscher, Pädagogen und Entwickler, da sie auch Richtlinien für die Entwicklung effektiver Serious Games hervorbringen. KW - Serious game KW - Gamification KW - Lernen KW - Game mechanic KW - Spielmechanik KW - Knowledge encoding KW - Wissensencodierung KW - Virtuelle Realität Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-219707 ER - TY - THES A1 - Eißler, Christoph Marcel T1 - Assessment of the left ventricular systolic and diastolic function in rats using electrocardiogram-gated cardiac positron emission tomography T1 - Bestimmung der linksventrikulären systolischen und diastolischen Funktion in Ratten durch Elektrokardiogramm-getriggerte kardiale Positronen-Emissions-Tomographie N2 - DD is a cardiac disturbance, which has gained increasing importance in recent years due to its important role in different cardiac disease and cardiomyopathies including ischemic cardiomyopathy, arterial hypertension and diabetic cardiomyopathy. ECG-gated 18F-FDG PET is an imaging technique, that can distinguish between districts of myocardial viability and myocardial scars and further provides information of great interest on the efficacy of experimental approaches designed to improve the cardiac function and/or myocardial metabolism in experimental small animal models. However, ECG-gated 18F-FDG PET is a technique whose feasibility in the assessment of the LV diastolic function in small animals has not been a subject of study. In this thesis, the ability of the ECG-gated 18F-FDG PET for the assessment of both the systolic and diastolic function in eight control rats and in seven ZDF rats, which are an experimental animal model mimicking T2DM conditions and diabetic related complications in humans including DCM, has been investigated The ECG-gated 18F-FDG PET imaging was performed under hyperinsulinemic-euglycemic clamping and the data were stored in list mode files and retrospectively reconstructed. The systolic and diastolic parameters were achieved from the time/volume and the time/filling curve calculated from the software HFV. Additionally, the influence of the number of gates per cardiac cycle on the LV volumes and function parameters has been studied. Hyperinsulinemic-euglycemic clamp procedure and blood glucose measurement did confirm the development of a manifest diabetes in the ZDF rats at the timepoint of the experiments. Regarding the systolic parameters, no significant difference could be detected between the ZDF and ZL rats. The values for the CO were similar in both groups, which demonstrates a similar LV systolic function in the ZDF and the ZL rats at the age of 13 weeks. Values for the systolic parameters are in good line with previous PET, MRI and cardiac catheterization-based studies in diabetic rats. The main finding of this study was that by using in vivo ECG-gated 18F-FDG PET and the software HFV, reliable diastolic parameters could be calculated. Moreover, it was possible to detect the presence of a mild impaired diastolic filling in the ZDF rats in absence of any systolic alteration. This impaired diastolic function in an early stage of diabetes could also be detected by other investigators, who used echocardiography or cardiac catheterization. Therefore, this is the first study showing, that the assessment of the diastolic function in rats can be carried out by ECG-gated 18F-FDG PET imaging. In conclusion, additionally to calculating LV volumes and LV EF, ECG-gated 18F-FDG PET can evaluate the diastolic function of healthy and diabetic rats and is able to detect a DD in ZDF rats. N2 - Die DD ist eine Störung der Herzdynamik, welche, aufgrund ihrer Beteiligung in verschiedenen Herzerkrankungen und Kardiomyopathien wie der ischämischen Kardiomyopathie, der arteriellen Hypertonie und der diabetischen Kardiomyopathie, in den letzten Jahren zunehmend in das Interessenzentrum der Herzforschung gerückt ist. Die EKG-getriggerte 18F-FDG PET ist eine Bildgebungsmethode, welche die Unterscheidung von vitalem Myokard und Narben ermöglicht und zusätzlich noch in der Lage ist, wichtige Informationen zu erheben, welche von Bedeutung für die Beurteilung von experimentelle Behandlungen zur Verbesserung der Herzfunktion und/oder des kardialen Stoffwechsels in präklinischen Tiermodellen sind. Trotz dieser Möglichkeiten wurde bisher noch nicht die Fähigkeit der EKG-getriggerten 18F-FDG PET zur Bestimmung der LV diastoischen Funktion in Kleintiermodellen untersucht. Deshalb wurde in dieser Arbeit das Potential der EKG-getriggerten 18F-FDG PET in Bezug auf die Bestimmung der LV systolischen und diastolischen Funktion in acht Kontrollratten (ZL) und sieben ZDF-Ratten, welche eine experimentelles Tiermodell für T2DM und die damit verbundenen Komplikationen einschließlich der diabetischen Kardiomyopathie sind, untersucht. Die EKG-getriggerte 18F-FDG PET wurde unter der hyperinsulinämischen euglykämischen Klemm Methode durchgeführt, die Daten in „list-mode“ Dateien gespeichert und retrospektiv rekonstruiert. Die Berechnung der LV systolischen und diastolischen Parameter erfolge aus der Zeit-Volumen-Kurve und der Zeit-Füllungs-Kurve durch das Programm HFV. Zudem wurde der Einfluss der pro Rekonstruktion verwendeten „frames“ pro kardialen Zyklus auf die LV Volumina und die linksventrikulären Funktionsparameter untersucht. Durch die hyperinsulinämische euglykämische Klemm Methode und durch Blutglukose Messungen konnte die Entwicklung eines manifesten Diabetes zum Zeitpunkt der Experimente in den ZDF Ratten nachgewiesen werden. Es konnte kein signifikanter Unterschied zwischen den systolischen Parametern der ZDF und der ZL Ratten gefunden werden. Der kardiale Auswurf war nahezu identisch in den beiden Gruppen zum Zeitpunkt der Experimente, was eine vergleichbare systolische Funktion in beiden Gruppen demonstriert. Die erhobenen Werte für die systolischen Parameter befinden sich in guter Übereinstimmung mit den Werten der Literatur von vorherigen PET, MRT und Katheter-gestützten Experimenten in diabetischen Rattenmodellen. Ein wichtiges Ergebnis dieser Arbeit ist die Erhebung von verlässlichen diastolischen Parametern durch den kombinierten Einsatz von EKG-getriggerter 18F-FDG PET und HFV. Zudem war es möglich, eine gestörte diastolische Füllung des LV in den ZDF Ratten nachzuweisen, in Abwesenheit von systolischen Funktionseinschränkungen. Eine Beeinträchtigung der diastolischen Funktion in der frühen Phase des Diabetes wurde bereits in anderen Rattenstudien mittels Echokardiografie und Katheter basierten Untersuchungen gezeigt. Dennoch ist dies hier die erste Studie, welche demonstriert, dass die Bestimmung der diastolischen Funktion auch mit Hilfe der EKG-getriggerten 18F-FDG PET durchgeführt werden kann. In Zusammenfassung lässt sich festhalten, das zusätzlich zu der Bestimmung der LV-Volumina und der LVEF durch EKG-getriggerten 18F-FDG PET auch die Bestimmung der diastolischen Funktion in gesunden und diabetischen Ratten möglich ist und dass durch EKG-getriggerten 18F-FDG PET die Identifikation einer DD in ZDF Ratten möglich ist. KW - Positronen-Emissions-Tomografie KW - preclinical PET KW - ECG-gated PET KW - diastolic dysfunction KW - diabetic cardiomyopathy KW - HFpEF Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-219765 ER - TY - THES A1 - Saedtler, Marco T1 - Pharmaceutical formulation strategies for novel antibiotic substances utilizing salt formation and two- and three-dimensional printing techniques T1 - Pharmazeutische Formulierungsstrategien für neuartige, antibiotische Substanzen unter Verwendung von Salzbildung sowie zwei- und dreidimensionalen Drucktechniken N2 - Salt formation is a routinely used strategy for poorly water-soluble drugs and traditionally performed with small inorganic counterions. High energy crystal lattices as well as effects on the local pH within the aqueous boundary layer during dissolution drive the increased dissolution rate and apparent solubility. Ionic liquids however, by definition low melting ionic salts with often large organic counterions, combine an increased dissolution rate with solubilization of the drug by the counterion itself. Long lasting supersaturation profiles of increased kinetic solubility were reported for several drugs formulated as ionic liquids increasing their overall bioavailability. Furthermore, aggregation and micellization between highly lipophilic compounds and amphiphilic bile acids was described before, demonstrating the capabilities of the human body itself to utilize solubilization of poorly water-soluble compounds. Development of novel counterions not only tailoring the desired physicochemical properties e.g. dissolution rate of the parent drug but adding – in a best-case scenario synergistic – pharmacological activity has been driven forward in the last years. However, salt formation can only be applied for ionizable i.e. acidic or basic compounds. While co-crystals can be used as a nonionized alternative, their formation is not always successful leading to an urgent need for other formulation strategies. In these lines, development of 2D and 3D printing techniques has been ongoing for the last decades and their pharmaceutical application has been demonstrated. The versatile nature and commercial availability allow a decentralized production further elaborating this technique for a highly flexible and patient-oriented supply with medication. This thesis focuses on the theoretical background and potential application of salt formation in the pharmaceutical development of a drug candidate. The first section presents the current knowledge and state of the art in preparation of low melting ionic liquids i.e. salts and is translated to the in vitro investigation of molecular interaction between the poorly water-soluble drug imatinib and components of the human intestinal fluid in the second section. Development of novel antibiotic counterions and assessment of their potential use in pharmaceutical formulations with fluoroquinolones is described in the last two sections. Chapter I describes the application of low melting ionic liquids in pharmaceutical formulation and details their development in the last two decades from versatile organic solvents in chemical synthesis towards amorphous strategies for drug delivery. The chapter gives a general overview on molecular structure and physicochemical properties of several drug containing ionic liquids and details the mechanisms which attribute to a typically fast dissolution, increased aqueous solubility as well as enhanced permeation which was reported in several publications. Chapter II translates the increased aqueous solubility of drugs by an organic counterion to the human gastrointestinal tract with taurocholate and lecithin as main drivers for the solubilization of highly lipophilic and poorly water-soluble drugs. Investigation of the interaction of imatinib – a poorly water-soluble weak base – with fasted- and fed state simulated intestinal fluids revealed a complex interplay between the components of the intestinal fluid and the drug. Mixed vesicles and micelles were observed in concentration dependent aggregation assays and revealed differences in their size, molecular arrangement as well as composition, depending on the tested drug concentration. Overall, the study outlines the effective interaction of weakly basic drugs with taurocholate and lecithin to minimize recrystallization during intestine passage finally leading to favorable supersaturation profiles. Chapter III focuses on the development of novel antibiotic counterions which potentially move the evolution of ionic liquids from a pharmaceutical salt with tailored physicochemical properties to a synergistic combination of two active pharmaceutical ingredients. The natural occurring anacardic acid derived from the cashew nut shell inspired a series of antibacterial active acidic compounds with increasing alkyl chain length. Their physicochemical properties, antibacterial activity, bacterial biofilm inhibition and cytotoxicity were detailed and in vivo activity in a Galleria mellonella model was assessed. This group of anacardic acid derivatives is synthetically accessible, easily modifiable and yielded two compounds with favorable activity and physicochemical profile for further drug development. Chapter IV outlines the potential application of anacardic acid derivatives in pharmaceutical formulations by salt formation with fluoroquinolone antibiotics as well as novel techniques such as 2D/3D printing for preparation of drug imprinted products. Despite anacardic acid derivatives demonstrated promising physicochemical properties, salt formation with fluoroquinolone antibiotics was not feasible. However, 2D/3D printed samples with anacardic acid derivative alone or in combination with ciprofloxacin demonstrated physical compatibility between drug and matrix as well as antibacterial activity against three S. aureus strains in an agar diffusion assay. Conclusively, drug printing can be applied for the herein tested compounds, but further process development is necessary. In summary, preparation of low melting ionic liquids, salts or co-crystals is an appropriate strategy to increase the aqueous solubility of poorly water-soluble drugs and tailor physicochemical properties. The counterion itself solubilizes the drug and furthermore potentially interferes with the complex micellar environment in the human intestine. However, salt formation as routinely used formulation strategy is not feasible in every case and development of alternative techniques is crucial to hurdle challenges related to unfavorable physicochemical properties. The outlined techniques for 2D/3D drug printing provide versatile production of drug products while extending the design space for novel drug development. N2 - Die Salzbildung mit pharmazeutischen Wirkstoffen – als routinemäßig durchgeführte Strategie für schlecht wasserlösliche Substanzen – wird traditionell mit kleinen, anorganischen Gegenionen durchgeführt. Eine tragende Rolle spielen hierbei ein hochenergetisches Kristallgitter sowie die Beeinflussung des pH-Wertes in der ruhenden Grenzschicht während des Auflösungsprozesses. Diese treiben eine beschleunigte Auflösungsrate sowie eine Erhöhung der scheinbaren Löslichkeit an. Ionische Flüssigkeiten stellen per Definition niederschmelzende ionische Salze mit oftmals großen, organischen Gegenionen dar. Sie kombinieren, aufgrund ihrer hohen Gitterenergie, eine beschleunigte Auflösungsratemit der Solubilisierung des Wirkstoffs durch das Gegenion. Langanhaltende Übersättigungen mit erhöhter kinetischer Löslichkeit und eine damit einhergehende, verbesserte Bioverfügbarkeit, wurden bereits bei verschiedenen Wirkstoffen beobachtet, die als ionische Flüssigkeiten formuliert wurden. Auch der menschliche Körper nutzt diesen Effekt und solubilisiert schlecht wasserlösliche Substanzen durch Aggregation und Mizellisierung lipophiler Substanzen mit amphiphilen Gallensäuren. Die Entwicklung neuartiger – meist kationischer – Gegenionen wurde in den letzten Jahren vorangetrieben. Vor allem Gegenionen, die nicht nur die gewünschten physikochemischen Eigenschaften (z.B. Auflösungsrate) hervorbringen, sondern einen eigenen – im besten Fall synergistischen – pharmakologischen Effekt aufweisen. Jedoch kommt eine Salzbildung nur für ionisierbare Substanzen respektive Säuren und Basen in Frage. Während Co-Kristalle als Alternative für nicht-ionisierbare Substanzen dienen können, ist deren Herstellung nicht immer erfolgreich und neue Formulierungsstrategien werden notwendig. Deshalb wurde unter anderem die Entwicklung von 2D- und 3D-Druckverfahren in den letzten Jahrzehnten vorangetrieben und deren Relevanz für pharmazeutische Fragestellungen aufgezeigt. Die vielseitige Natur und kommerzielle Verfügbarkeit des 2D/3D-Drucks erlaubt eine dezentrale Produktion und ermöglicht eine flexible und patientenorienterte Medikamentenversorgung. Diese Dissertation beschäftigt sich vorrangig mit den theoretischen Hintergründen und den praktischen Anwendungsmöglichkeiten der Salzbildung in der pharmazeutischen Entwicklung eines potenziellen Wirkstoffes. Das erste Kapitel präsentiert den gegenwärtigen Stand der Technik zur Verwendung von niederschmelzenden ionischen Flüssigkeiten. Diese Erkenntnisse werden im Anschluss auf eine Untersuchung der Interaktionen des schlecht wasserlöslichen Wirkstoffs Imatinib und den Bestandteilen der menschlichen Verdauungssäfte übertragen. Die Entwicklung neuartiger, antibiotisch wirksamer Gegenionen und deren potenzielle Verwendung in pharmazeutischen Formulierungen mit Fluorchinolonen ist Gegenstand der letzten zwei Kapitel. Kapitel I beschreibt niederschmelzende ionische Flüssigkeiten in pharmazeutischen Formulierungen und führt deren Entwicklung in den letzten drei Jahrzehnten aus: Vom vielfältig anwendbaren, organischen Lösemittel für die chemische Synthese hin zur amorphen Darreichungsform. Das Kapitel gibt einen Überblick über die molekularen Strukturen und physikochemischen Eigenschaften verschiedener wirkstoffbeinhaltender, ionischer Flüssigkeiten. Hierbei werden die zugrundeliegenden Mechanismen dargelegt, was im Besonderen die rasche Auflösung, eine erhöhte Löslichkeit in wässrigen Medien sowie eine Beeinflussung der Permeation meint. Kapitel II überträgt die Beobachtung einer erhöhten Löslichkeit in Gegenwart eines organischen Gegenions auf den menschlichen Verdauungstrakt, in dem Taurocholat und Lecithin hauptverantworlich für die Solubilisierung von liphilen und schlecht wasserlöslichen Substanzen sind. Untersuchungen der Interaktion von Imatinib, einer schlecht wasserlöslichen, schwachen Base, mit simulierten, intestinalen Flüssigkeiten zeigten ein komplexes System aus Bestandteilen der intestinalen Flüssigkeit und dem Wirkstoff. Gemische aus Vesikel und Mizellen, die mithilfeeines Aggregationsassays untersucht wurden, zeigten, in Abhängigkeit von momentanen Wirkstoffkonzentrationen, Unterschiede in ihrer Größe sowie der molekularen Anordnung und Zusammensetzung. Zusammenfassend beschreibt dieses Kapitel die effektive Interaktion von schwachen Basen mit Taurocholat und Lecithin sowie eine Möglichkeit zur Minimierung von Rekristallisation und damit der Aufrechterhaltung von übersättigten Zuständen während der Wirkstoff den Verdauungstrakt passiert. Kapitel III befasst sich mit der Entwicklung neuartiger antibiotischer Gegenionen. Diese treiben möglicherweise die Weiterentwicklung von ionischen Flüssigkeiten mit optimierten physikochemischen Eigenschaften zu synergistischen Kombinationen aus zwei pharmakologisch aktiven Substanzen voran. Die natürlich vorkommende Anacardsäure, welche sich aus der Schale der Cashewnuss gewinnen lässt, hat eine Reihe von antibakteriellen, sauren Substanzen inspiriert, die sich allein in der Länge ihrer Alkylkette unterschieden. Physikochemische Eigenschaften, antibakterielle Aktivität, Inhibition des bakteriellen Biofilms sowie Zytotoxizität wurden untersucht und anschließend in vivo mittels Galleria mellonella-Modell beleuchtet. Diese Gruppe aus Anacardsäurederivaten ist synthetisch zugänglich, einfach chemisch modifizierbar und brachte zwei Substanzen mit vorteilhafter Aktivität und physikochemischen Eigenschaften zur weiteren Entwicklung hervor. Kapitel IV beschreibt die potenzielle Anwendung der Anacardsäurederivate in pharmazeutischen Formulierungen. Durch Salzbildung mit Fluorchinolon-Antibiotika sowie Nutzung neuerer Techniken, wie dem 2D/3D-Druck, wurden wirkstoffbedruckte Darreichungsformen hergestellt. Obwohl die Anacardsäurederivate vielversprechende physikochemische Eigenschaften zeigten, eigneten sie sich nicht für eine Salzbildung mit Fluorchinolonen. Trotzdem war es möglich Anacardsäurederivate allein oder in Kombination mit Ciprofloxacin auf Oberflächen zu drucken, wobei keine physische Inkompatibilität zwischen Wirkstoff und Matrix erkennbar war jedoch eine antibakterielle Wirkung gegen drei S. aureus Stämme gezeigt werden konnte. Abschließend stellte sich der Druck von Wirkstoffen, mit den untersuchten Techniken, als machbar heraus, wobei eine Weiterentwicklung des Prozesses sicherlich notwendig ist. Zusammenfassend stellt die Herstellung von niederschmelzenden, ionischen Flüssigkeiten, Salzen oder Co-Kristallen eine geeignete Strategie dar, die Löslichkeit schlecht wasserlöslicher Substanzen zu verbessern und deren physikochemische Eigenschaften zu optimieren. Das Gegenion kann dabei dazu beitragen den Wirkstoff zu solubilisieren, wobei es sehr wahrscheinlich ist, dass er auch mit dem komplexen mizellaren System des menschlichen Verdauungstrakts interagiert. Trotzdem ist eine routinemäßige Salzbildung nicht in allen Fällen zielführend und alternative Technologien müssen entwickelt werden, um die Herrausforderungen mit unvorteilhaften physikochemischen Eigenschaften zu meistern. Die beschriebenen 2D/3D-Druckverfahren bieten hierbei eine Produktion variabler und vielfältiger Darreichungsformen und erweitern den Gestaltungsraum für neuartige Wirkstoffentwicklungen. KW - Löslichkeit KW - Solubilisation KW - Antibiotikum KW - Formulierung KW - Anacardic acid derivatives KW - Formulation development KW - Anacardsäurederivate KW - Formulierungsentwicklung Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-219784 ER - TY - THES A1 - Bauer, André T1 - Automated Hybrid Time Series Forecasting: Design, Benchmarking, and Use Cases T1 - Automatisierte hybride Zeitreihenprognose: Design, Benchmarking und Anwendungsfälle N2 - These days, we are living in a digitalized world. Both our professional and private lives are pervaded by various IT services, which are typically operated using distributed computing systems (e.g., cloud environments). Due to the high level of digitalization, the operators of such systems are confronted with fast-paced and changing requirements. In particular, cloud environments have to cope with load fluctuations and respective rapid and unexpected changes in the computing resource demands. To face this challenge, so-called auto-scalers, such as the threshold-based mechanism in Amazon Web Services EC2, can be employed to enable elastic scaling of the computing resources. However, despite this opportunity, business-critical applications are still run with highly overprovisioned resources to guarantee a stable and reliable service operation. This strategy is pursued due to the lack of trust in auto-scalers and the concern that inaccurate or delayed adaptations may result in financial losses. To adapt the resource capacity in time, the future resource demands must be "foreseen", as reacting to changes once they are observed introduces an inherent delay. In other words, accurate forecasting methods are required to adapt systems proactively. A powerful approach in this context is time series forecasting, which is also applied in many other domains. The core idea is to examine past values and predict how these values will evolve as time progresses. According to the "No-Free-Lunch Theorem", there is no algorithm that performs best for all scenarios. Therefore, selecting a suitable forecasting method for a given use case is a crucial task. Simply put, each method has its benefits and drawbacks, depending on the specific use case. The choice of the forecasting method is usually based on expert knowledge, which cannot be fully automated, or on trial-and-error. In both cases, this is expensive and prone to error. Although auto-scaling and time series forecasting are established research fields, existing approaches cannot fully address the mentioned challenges: (i) In our survey on time series forecasting, we found that publications on time series forecasting typically consider only a small set of (mostly related) methods and evaluate their performance on a small number of time series with only a few error measures while providing no information on the execution time of the studied methods. Therefore, such articles cannot be used to guide the choice of an appropriate method for a particular use case; (ii) Existing open-source hybrid forecasting methods that take advantage of at least two methods to tackle the "No-Free-Lunch Theorem" are computationally intensive, poorly automated, designed for a particular data set, or they lack a predictable time-to-result. Methods exhibiting a high variance in the time-to-result cannot be applied for time-critical scenarios (e.g., auto-scaling), while methods tailored to a specific data set introduce restrictions on the possible use cases (e.g., forecasting only annual time series); (iii) Auto-scalers typically scale an application either proactively or reactively. Even though some hybrid auto-scalers exist, they lack sophisticated solutions to combine reactive and proactive scaling. For instance, resources are only released proactively while resource allocation is entirely done in a reactive manner (inherently delayed); (iv) The majority of existing mechanisms do not take the provider's pricing scheme into account while scaling an application in a public cloud environment, which often results in excessive charged costs. Even though some cost-aware auto-scalers have been proposed, they only consider the current resource demands, neglecting their development over time. For example, resources are often shut down prematurely, even though they might be required again soon. To address the mentioned challenges and the shortcomings of existing work, this thesis presents three contributions: (i) The first contribution-a forecasting benchmark-addresses the problem of limited comparability between existing forecasting methods; (ii) The second contribution-Telescope-provides an automated hybrid time series forecasting method addressing the challenge posed by the "No-Free-Lunch Theorem"; (iii) The third contribution-Chamulteon-provides a novel hybrid auto-scaler for coordinated scaling of applications comprising multiple services, leveraging Telescope to forecast the workload intensity as a basis for proactive resource provisioning. In the following, the three contributions of the thesis are summarized: Contribution I - Forecasting Benchmark To establish a level playing field for evaluating the performance of forecasting methods in a broad setting, we propose a novel benchmark that automatically evaluates and ranks forecasting methods based on their performance in a diverse set of evaluation scenarios. The benchmark comprises four different use cases, each covering 100 heterogeneous time series taken from different domains. The data set was assembled from publicly available time series and was designed to exhibit much higher diversity than existing forecasting competitions. Besides proposing a new data set, we introduce two new measures that describe different aspects of a forecast. We applied the developed benchmark to evaluate Telescope. Contribution II - Telescope To provide a generic forecasting method, we introduce a novel machine learning-based forecasting approach that automatically retrieves relevant information from a given time series. More precisely, Telescope automatically extracts intrinsic time series features and then decomposes the time series into components, building a forecasting model for each of them. Each component is forecast by applying a different method and then the final forecast is assembled from the forecast components by employing a regression-based machine learning algorithm. In more than 1300 hours of experiments benchmarking 15 competing methods (including approaches from Uber and Facebook) on 400 time series, Telescope outperformed all methods, exhibiting the best forecast accuracy coupled with a low and reliable time-to-result. Compared to the competing methods that exhibited, on average, a forecast error (more precisely, the symmetric mean absolute forecast error) of 29%, Telescope exhibited an error of 20% while being 2556 times faster. In particular, the methods from Uber and Facebook exhibited an error of 48% and 36%, and were 7334 and 19 times slower than Telescope, respectively. Contribution III - Chamulteon To enable reliable auto-scaling, we present a hybrid auto-scaler that combines proactive and reactive techniques to scale distributed cloud applications comprising multiple services in a coordinated and cost-effective manner. More precisely, proactive adaptations are planned based on forecasts of Telescope, while reactive adaptations are triggered based on actual observations of the monitored load intensity. To solve occurring conflicts between reactive and proactive adaptations, a complex conflict resolution algorithm is implemented. Moreover, when deployed in public cloud environments, Chamulteon reviews adaptations with respect to the cloud provider's pricing scheme in order to minimize the charged costs. In more than 400 hours of experiments evaluating five competing auto-scaling mechanisms in scenarios covering five different workloads, four different applications, and three different cloud environments, Chamulteon exhibited the best auto-scaling performance and reliability while at the same time reducing the charged costs. The competing methods provided insufficient resources for (on average) 31% of the experimental time; in contrast, Chamulteon cut this time to 8% and the SLO (service level objective) violations from 18% to 6% while using up to 15% less resources and reducing the charged costs by up to 45%. The contributions of this thesis can be seen as major milestones in the domain of time series forecasting and cloud resource management. (i) This thesis is the first to present a forecasting benchmark that covers a variety of different domains with a high diversity between the analyzed time series. Based on the provided data set and the automatic evaluation procedure, the proposed benchmark contributes to enhance the comparability of forecasting methods. The benchmarking results for different forecasting methods enable the selection of the most appropriate forecasting method for a given use case. (ii) Telescope provides the first generic and fully automated time series forecasting approach that delivers both accurate and reliable forecasts while making no assumptions about the analyzed time series. Hence, it eliminates the need for expensive, time-consuming, and error-prone procedures, such as trial-and-error searches or consulting an expert. This opens up new possibilities especially in time-critical scenarios, where Telescope can provide accurate forecasts with a short and reliable time-to-result. Although Telescope was applied for this thesis in the field of cloud computing, there is absolutely no limitation regarding the applicability of Telescope in other domains, as demonstrated in the evaluation. Moreover, Telescope, which was made available on GitHub, is already used in a number of interdisciplinary data science projects, for instance, predictive maintenance in an Industry 4.0 context, heart failure prediction in medicine, or as a component of predictive models of beehive development. (iii) In the context of cloud resource management, Chamulteon is a major milestone for increasing the trust in cloud auto-scalers. The complex resolution algorithm enables reliable and accurate scaling behavior that reduces losses caused by excessive resource allocation or SLO violations. In other words, Chamulteon provides reliable online adaptations minimizing charged costs while at the same time maximizing user experience. N2 - Heutzutage leben wir in einer digitalisierten Welt. Sowohl unser berufliches als auch unser privates Leben ist von verschiedenen IT-Diensten durchzogen, welche typischerweise in verteilten Computersystemen (z.B. Cloud-Umgebungen) betrieben werden. Die Betreiber solcher Systeme sind aufgrund des hohen Digitalisierungsgrades mit schnellen und wechselnden Anforderungen konfrontiert. Insbesondere Cloud-Umgebungen unterliegen starken Lastschwankungen und entsprechenden schnellen und unerwarteten Änderungen des Bedarfs an Rechenressourcen. Um dieser Herausforderung zu begegnen, können so genannte Auto-Scaler, wie z.B. der schwellenwertbasierte Mechanismus von Amazon Web Services EC2, eingesetzt werden, um eine elastische Skalierung der Rechenressourcen zu ermöglichen. Doch trotz dieser Gelegenheit werden geschäftskritische Anwendungen nach wie vor mit deutlich überdimensionierten Rechenkapazitäten betrieben, um einen stabilen und zuverlässigen Dienstbetrieb zu gewährleisten. Diese Strategie wird aufgrund des mangelnden Vertrauens in Auto-Scaler und der Sorge verfolgt, dass ungenaue oder verzögerte Anpassungen zu finanziellen Verlusten führen könnten. Um die Ressourcenkapazität rechtzeitig anpassen zu können, müssen die zukünftigen Ressourcenanforderungen "vorhergesehen" werden. Denn die Reaktion auf Veränderungen, sobald diese beobachtet werden, führt zu einer inhärenten Verzögerung. Mit anderen Worten, es sind genaue Prognosemethoden erforderlich, um Systeme proaktiv anzupassen. Ein wirksamer Ansatz in diesem Zusammenhang ist die Zeitreihenprognose, welche auch in vielen anderen Bereichen angewandt wird. Die Kernidee besteht darin, vergangene Werte zu untersuchen und vorherzusagen, wie sich diese Werte im Laufe der Zeit entwickeln werden. Nach dem "No-Free-Lunch Theorem" gibt es keinen Algorithmus, der für alle Szenarien am besten funktioniert. Daher ist die Auswahl einer geeigneten Prognosemethode für einen gegebenen Anwendungsfall eine wesentliche Herausforderung. Denn jede Methode hat - abhängig vom spezifischen Anwendungsfall - ihre Vor- und Nachteile. Deshalb basiert üblicherweise die Wahl der Prognosemethode auf Trial-and-Error oder auf Expertenwissen, welches nicht vollständig automatisiert werden kann. Beide Ansätze sind teuer und fehleranfällig. Obwohl Auto-Skalierung und Zeitreihenprognose etablierte Forschungsgebiete sind, können die bestehenden Ansätze die genannten Herausforderungen nicht vollständig bewältigen: (i) Bei unserer Untersuchung zur Zeitreihenvorhersage stellten wir fest, dass die meisten der überprüften Artikel nur eine geringe Anzahl von (meist verwandten) Methoden berücksichtigen und ihre Performanz auf einem kleinen Datensatz von Zeitreihen mit nur wenigen Fehlermaßen bewerten, während sie keine Informationen über die Ausführungszeit der untersuchten Methoden liefern. Daher können solche Artikel nicht als Hilfe für die Wahl einer geeigneten Methode für einen bestimmten Anwendungsfall herangezogen werden; (ii) Bestehende hybride open-source Prognosemethoden, die sich mindestens zwei Methoden zunutze machen, um das "No-Free-Lunch Theorem" anzugehen, sind rechenintensiv, schlecht automatisiert, für einen bestimmten Datensatz ausgelegt oder haben eine unvorhersehbare Laufzeit. Methoden, die eine hohe Varianz in der Ausführungszeit aufweisen, können nicht für zeitkritische Szenarien angewendet werden (z.B. Autoskalierung), während Methoden, die auf einen bestimmten Datensatz zugeschnitten sind, Einschränkungen für mögliche Anwendungsfälle mit sich bringen (z.B. nur jährliche Zeitreihen vorhersagen); (iii) Auto-Scaler skalieren typischerweise eine Anwendung entweder proaktiv oder reaktiv. Obwohl es einige hybride Auto-Scaler gibt, fehlt es ihnen an ausgeklügelten Lösungen zur Kombination von reaktiver und proaktiver Skalierung. Beispielsweise werden Ressourcen nur proaktiv freigesetzt, während die Ressourcenzuweisung vollständig reaktiv (inhärent verzögert) erfolgt; (iv) Die Mehrheit der vorhandenen Mechanismen berücksichtigt bei der Skalierung einer Anwendung in einer öffentlichen Cloud-Umgebung nicht das Preismodell des Anbieters, was häufig zu überhöhten Kosten führt. Auch wenn einige kosteneffiziente Auto-Scaler vorgeschlagen wurden, berücksichtigen sie nur den aktuellen Ressourcenbedarf und vernachlässigen ihre Entwicklung im Laufe der Zeit. Beispielsweise werden Ressourcen oft vorzeitig abgeschaltet, obwohl sie vielleicht bald wieder benötigt werden. Um den genannten Herausforderungen und den Defiziten der bisherigen Arbeiten zu begegnen, werden in dieser Arbeit drei Beiträge vorgestellt: (i) Der erste Beitrag - ein Prognosebenchmark - behandelt das Problem der begrenzten Vergleichbarkeit zwischen bestehenden Prognosemethoden; (ii) Der zweite Beitrag stellt eine automatisierte hybride Zeitreihen-Prognosemethode namens Telescope vor, die sich der Herausforderung des "No-Free-Lunch Theorem" stellt; (iii) Der dritte Beitrag stellt Chamulteon, einen neuartigen hybriden Auto-Scaler für die koordinierte Skalierung von Anwendungen mit mehreren Diensten, bereit, der Telescope zur Vorhersage der Lastintensität als Grundlage für eine proaktive Ressourcenbereitstellung nutzt. Im Folgenden werden die drei Beiträge der Arbeit zusammengefasst: Beitrag I - Prognosebenchmark Um gleiche Ausgangsbedingungen für die Bewertung von Prognosemethoden anhand eines breiten Spektrums zu schaffen, schlagen wir einen neuartigen Benchmark vor, der Prognosemethoden auf der Grundlage ihrer Performanz in einer Vielzahl von Szenarien automatisch bewertet und ein Ranking erstellt. Der Benchmark umfasst vier verschiedene Anwendungsfälle, die jeweils 100 heterogene Zeitreihen aus verschiedenen Bereichen abdecken. Der Datensatz wurde aus öffentlich zugänglichen Zeitreihen zusammengestellt und so konzipiert, dass er eine viel höhere Diversität aufweist als bestehende Prognosewettbewerbe. Neben dem neuen Datensatz führen wir zwei neue Maße ein, die verschiedene Aspekte einer Prognose beschreiben. Wir haben den entwickelten Benchmark zur Bewertung von Telescope angewandt. Beitrag II - Telescope Um eine generische Prognosemethode bereitzustellen, stellen wir einen neuartigen, auf maschinellem Lernen basierenden Prognoseansatz vor, der automatisch relevante Informationen aus einer gegebenen Zeitreihe extrahiert. Genauer gesagt, Telescope extrahiert automatisch intrinsische Zeitreihenmerkmale und zerlegt die Zeitreihe dann in Komponenten, wobei für jede dieser Komponenten ein Prognosemodell erstellt wird. Jede Komponente wird mit einer anderen Methode prognostiziert und dann wird die endgültige Prognose aus den vorhergesagten Komponenten unter Verwendung eines regressionsbasierten Algorithmus des maschinellen Lernens zusammengestellt. In mehr als 1300 Experiment-Stunden, in denen 15 konkurrierende Methoden (einschließlich Ansätze von Uber und Facebook) auf 400 Zeitreihen verglichen wurden, übertraf Telescope alle Methoden und zeigte die beste Prognosegenauigkeit in Verbindung mit einer niedrigen und zuverlässigen Ausführungszeit. Im Vergleich zu den konkurrierenden Methoden, die im Durchschnitt einen Prognosefehler (genauer gesagt, den symmetric mean absolute forecast error) von 29% aufwiesen, wies Telescope einen Fehler von 20% auf und war dabei 2556 mal schneller. Insbesondere die Methoden von Uber und Facebook wiesen einen Fehler von 48% bzw. 36% auf und waren 7334 bzw. 19 mal langsamer als Telescope. Beitrag III - Chamulteon Um eine zuverlässige Auto-Skalierung zu ermöglichen, stellen wir einen hybriden Auto-Scaler vor, der proaktive und reaktive Techniken kombiniert, um verteilte Cloud-Anwendungen, die mehrere Dienste umfassen, koordiniert und kostengünstig zu skalieren. Genauer gesagt, werden proaktive Anpassungen auf der Grundlage von Prognosen von Telescope geplant, während reaktive Anpassungen auf der Grundlage tatsächlicher Beobachtungen der überwachten Lastintensität ausgelöst werden. Um auftretende Konflikte zwischen reaktiven und proaktiven Anpassungen zu lösen, wird ein komplexer Konfliktlösungsalgorithmus implementiert. Außerdem überprüft Chamulteon Anpassungen im Hinblick auf das Preismodell des Cloud-Anbieters, um die anfallenden Kosten in öffentlichen Cloud-Umgebungen zu minimieren. In mehr als 400 Experiment-Stunden, in denen fünf konkurrierende Auto-Skalierungsmechanismen unter fünf verschiedene Arbeitslasten, vier verschiedene Anwendungen und drei verschiedene Cloud-Umgebungen evaluiert wurden, zeigte Chamulteon die beste Auto-Skalierungsleistung und Zuverlässigkeit bei gleichzeitiger Reduzierung der berechneten Kosten. Die konkurrierenden Methoden lieferten während (durchschnittlich) 31% der Versuchszeit zu wenige Ressourcen. Im Gegensatz dazu reduzierte Chamulteon diese Zeit auf 8% und die SLO-Verletzungen (Service Level Objectives) von 18% auf 6%, während es bis zu 15% weniger Ressourcen verwendete und die berechneten Kosten um bis zu 45% senkte. Die Beiträge dieser Arbeit können als wichtige Meilensteine auf dem Gebiet der Zeitreihenprognose und der automatischen Skalierung in Cloud Computing angesehen werden. (i) In dieser Arbeit wird zum ersten Mal ein Prognosebenchmark präsentiert, der eine Vielzahl verschiedener Bereiche mit einer hohen Diversität zwischen den analysierten Zeitreihen abdeckt. Auf der Grundlage des zur Verfügung gestellten Datensatzes und des automatischen Auswertungsverfahrens trägt der vorgeschlagene Benchmark dazu bei, die Vergleichbarkeit von Prognosemethoden zu verbessern. Die Benchmarking-Ergebnisse von verschiedenen Prognosemethoden ermöglichen die Auswahl der am besten geeigneten Prognosemethode für einen gegebenen Anwendungsfall. (ii) Telescope bietet den ersten generischen und vollautomatischen Zeitreihen-Prognoseansatz, der sowohl genaue als auch zuverlässige Prognosen liefert, ohne Annahmen über die analysierte Zeitreihe zu treffen. Dementsprechend macht es teure, zeitaufwändige und fehleranfällige Verfahren überflüssig, wie z.B. Trial-and-Error oder das Hinzuziehen eines Experten. Dies eröffnet neue Möglichkeiten, insbesondere in zeitkritischen Szenarien, in denen Telescope genaue Vorhersagen mit einer kurzen und zuverlässigen Antwortzeit liefern kann. Obwohl Telescope für diese Arbeit im Bereich des Cloud Computing eingesetzt wurde, gibt es, wie die Auswertung zeigt, keinerlei Einschränkungen hinsichtlich der Anwendbarkeit von Telescope in anderen Bereichen. Darüber hinaus wird Telescope, das auf GitHub zur Verfügung gestellt wurde, bereits in einer Reihe von interdisziplinären datenwissenschaftlichen Projekten eingesetzt, z.B. bei der vorausschauenden Wartung im Rahmen von Industry 4.0, bei der Vorhersage von Herzinsuffizienz in der Medizin oder als Bestandteil von Vorhersagemodellen für die Entwicklung von Bienenstöcken. (iii) Im Kontext der elastischen Ressourcenverwaltung ist Chamulteon ein wichtiger Meilenstein für die Stärkung des Vertrauens in Auto-Scaler. Der komplexe Konfliktlösungsalgorithmus ermöglicht ein zuverlässiges und genaues Skalierungsverhalten, das Verluste durch übermäßige Ressourcenzuweisung oder SLO-Verletzungen reduziert. Mit anderen Worten, Chamulteon bietet zuverlässige Ressourcenanpassungen, die die berechneten Kosten minimieren und gleichzeitig die Benutzerzufriedenheit maximieren. KW - Zeitreihenanalyse KW - Prognose KW - Cloud Computing KW - Auto-Scaling KW - Feature Engineering & Extraction KW - Skalierbarkeit KW - Benchmarking KW - Forecasting Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-220255 ER - TY - THES A1 - Böttcher, Jan Frederic T1 - Fate of Topological States of Matter in the Presence of External Magnetic Fields T1 - Schicksal von topologischen Zuständen in der Gegenwart von externen magnetischen Feldern N2 - The quantum Hall (QH) effect, which can be induced in a two-dimensional (2D) electron gas by an external magnetic field, paved the way for topological concepts in condensed matter physics. While the QH effect can for that reason not exist without Landau levels, there is a plethora of topological phases of matter that can exist even in the absence of a magnetic field. For instance, the quantum spin Hall (QSH), the quantum anomalous Hall (QAH), and the three-dimensional (3D) topological insulator (TI) phase are insulating phases of matter that owe their nontrivial topology to an inverted band structure. The latter results from a strong spin-orbit interaction or, generally, from strong relativistic corrections. The main objective of this thesis is to explore the fate of these preexisting topological states of matter, when they are subjected to an external magnetic field, and analyze their connection to quantum anomalies. In particular, the realization of the parity anomaly in solid state systems is discussed. Furthermore, band structure engineering, i.e., changing the quantum well thickness, the strain, and the material composition, is employed to manipulate and investigate various topological properties of the prototype TI HgTe. Like the QH phase, the QAH phase exhibits unidirectionally propagating metallic edge channels. But in contrast to the QH phase, it can exist without Landau levels. As such, the QAH phase is a condensed matter analog of the parity anomaly. We demonstrate that this connection facilitates a distinction between QH and QAH states in the presence of a magnetic field. We debunk therefore the widespread belief that these two topological phases of matter cannot be distinguished, since they are both described by a $\mathbb{Z}$ topological invariant. To be more precise, we demonstrate that the QAH topology remains encoded in a peculiar topological quantity, the spectral asymmetry, which quantifies the differences in the number of states between the conduction and valence band. Deriving the effective action of QAH insulators in magnetic fields, we show that the spectral asymmetry is thereby linked to a unique Chern-Simons term which contains the information about the QAH edge states. As a consequence, we reveal that counterpropagating QH and QAH edge states can emerge when a QAH insulator is subjected to an external magnetic field. These helical-like states exhibit exotic properties which make it possible to disentangle QH and QAH phases. Our findings are of particular importance for paramagnetic TIs in which an external magnetic field is required to induce the QAH phase. A byproduct of the band inversion is the formation of additional extrema in the valence band dispersion at large momenta (the `camelback'). We develop a numerical implementation of the $8 \times 8$ Kane model to investigate signatures of the camelback in (Hg,Mn)Te quantum wells. Varying the quantum well thickness, as well as the Mn-concentration, we show that the class of topologically nontrivial quantum wells can be subdivided into direct gap and indirect gap TIs. In direct gap TIs, we show that, in the bulk $p$-regime, pinning of the chemical potential to the camelback can cause an onset to QH plateaus at exceptionally low magnetic fields (tens of mT). In contrast, in indirect gap TIs, the camelback prevents the observation of QH plateaus in the bulk $p$-regime up to large magnetic fields (a few tesla). These findings allowed us to attribute recent experimental observations in (Hg,Mn)Te quantum wells to the camelback. Although our discussion focuses on (Hg,Mn)Te, our model should likewise apply to other topological materials which exhibit a camelback feature in their valence band dispersion. Furthermore, we employ the numerical implementation of the $8\times 8$ Kane model to explore the crossover from a 2D QSH to a 3D TI phase in strained HgTe quantum wells. The latter exhibit 2D topological surface states at their interfaces which, as we demonstrate, are very sensitive to the local symmetry of the crystal lattice and electrostatic gating. We determine the classical cyclotron frequency of surface electrons and compare our findings with experiments on strained HgTe. N2 - Der Quanten-Hall (QH) Effekt, welcher in einem zwei-dimensionalen (2D) Elektronengas durch ein externes Magnetfeld erzeugt werden kann, ebnete den Weg für topologische Konzepte in der Physik der kondensierten Materie. Während der QH Effekt aus diesem Grund nicht ohne Landau Level existieren kann, gibt es eine Vielzahl von neuartigen topologischen Phasen, die auch in der Abwesenheit von Magnetfeldern existieren können. Zum Beispiel stellen die Quanten-Spin-Hall (QSH), die Quanten-Anomale-Hall (QAH) und die drei-dimensionale (3D) topologische Isolator-Phase isolierende, topologische Phasen dar, die Ihre nicht-triviale Topologie einer invertierten Bandstruktur verdanken. Letztere wird durch eine starke Spin-Bahn Wechselwirkung, oder im Allgemeinen durch starke relativistische Korrekturen, erzeugt. Das Hauptziel dieser Thesis ist es dabei das Schicksal dieser bereits bestehenden topologischen Zustände in Magnetfeldern zu erforschen und deren Verbindungen zu Quantenanomalien aufzuzeigen. In diesem Zusammenhang werden wir insbesondere die Realisierung der Paritätsanomalie in Festkörpersystemen diskutieren. Weitergehend wenden wir Bandstruktur-Engineering an, d.h. die Veränderung der Quantentrogdicke, der Verspannung und der Materialkomposition, um die vielfältigen topologischen Eigenschaften des topologischen Isolators (TIs) HgTe zu manipulieren und zu untersuchen. Wie die QH Phase, zeichnet sich die QAH Phase durch unidirektional propagierende, metallische Randkanäle aus. Aber im Vergleich zur QH Phase, kann sie auch ohne Landau Level existieren. Die QAH Phase stellt daher ein Kondensierte-Materie-Analogon zur Paritätsanomalie dar. Wir zeigen, dass diese Verbindung es uns ermöglicht in der Gegenwart eines Magnetfelds zwischen QH und QAH Zuständen zu unterscheiden. Damit widerlegen wir den weitverbreiten Glauben, dass diese zwei topologischen Phasen nicht unterschieden werden können, da beide durch eine $\mathbb{Z}$ topologische Invariante beschrieben sind. Etwas genauer gesagt, zeigen wir, dass die QAH Topologie in einer besonderen topologischen Invarianten kodiert bleibt, der spektralen Asymmetrie. Diese quantifiziert die Differenz in der Anzahl von Zuständen in Leitungs- und Valenzbändern. Indem wir die effektive Wirkung eines QAH Isolators im Magnetfeld herleiten, zeigen wir, dass die spektrale Asymmetrie dabei mit einem einzigartigen Chern-Simons Term verbunden ist, welcher die Information über die QAH Randkanäle beinhaltet. Wenn ein QAH Isolator einem externen Magnetfeld ausgesetzt wird, kann dies zur Bildung von gegenläufigen QH und QAH Randkanälen führen. Diese helikalartigen Randzustände besitzen exotische Eigenschaften, die es uns ermöglichen QH und QAH Phasen zu unterscheiden. Unsere Ergebnisse sind insbesondere für paramagnetische TIs von Bedeutung, da für diese ein externes Magnetfeld von Nöten ist, um die QAH Phase zu induzieren. Ein Nebenprodukt der Bandinversion ist die Bildung von zusätzlichen Extrema in der Dispersion des Valenzbands bei großen Impulsen (oft auch als `Kamelrücken' bezeichnet). Wir entwickeln eine numerische Implementierung des $8 \times 8$ Kane Modells um die Signaturen des Kamelrückens in (Hg,Mn)Te Quantentrögen zu untersuchen. Indem die Quantentrogdicke und die Mn-Konzentration variiert wird, zeigen wir, dass die Klasse von topologisch nicht-trivialen Materialien weiter in direkte und indirekte TIs unterteilt werden kann. Für direkte TIs mit $p$-Ladungsträgerdichten, zeigen wir, dass die Anheftung des chemischen Potentials an den Kamelrücken zu einem Beginn von QH-Plateaus bei ungewöhnlich kleinen Magnetfeldern (zweistelliger mT-Bereich) führen kann. Im Gegensatz dazu verhindert der Kamelrücken bei indirekten TIs die Beobachtung von QH Plateaus im $p$-Bereich bis zu großen Magnetfeldern (einige Tesla). Diese Ergebnisse erlauben es uns jüngste experimentelle Beobachtungen in (Hg,Mn)Te Quantentrögen der Existenz des Kamelrückens zuzuschreiben. Obwohl sich unsere Diskussion dabei auf (Hg,Mn)Te beschränkt, sollte sich unser Modell leicht auch auf andere topologische Materialien mit einer kamelartigen Struktur im Valenzband übertragen lassen. Zusätzlich haben wir die numerische Implementierung des $8 \times 8$ Kane Modells verwendet, um den Übergang von einer 2D QSH zu einer 3D TI Phase in verspannten HgTe Quantentrögen zu untersuchen. Diese Halbleitermaterialien zeichnen sich durch 2D topologische Oberflächenzustände an Grenzflächen aus, welche, wie wir zeigen, sehr sensitiv für die lokale Kristallsymmetrie des Gitters und elektrostatische Ladung sind. Wir bestimmen die klassische Zyklotronfrequenz der Oberflächenelektronen und vergleichen diese mit experimentellen Messungen an verspannten HgTe Qunatentrögen. KW - Topologie KW - Festkörperphysik KW - Magnetfeld KW - Feldtheorie KW - Topological Insulators KW - Parity Anomaly Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-220451 ER - TY - THES A1 - Aurbach, Katja T1 - Studies on the role of the cytoskeleton in platelet production T1 - Studien über die Rolle des Zytoskeletts in der Produktion von Thrombozyten N2 - Platelets are small anucleated cell fragments that originate from megakaryocytes (MKs), which are large cells located in the bone marrow (BM). MKs extend long cytoplasmic protrusions, a process which is called proplatelet formation, into the lumen of the sinusoidal vessels where platelets are sized by the bloodstream. During the process of platelet biogenesis, segments of the MK penetrate the endothelium and, through cytoskeletal remodeling inside the MK, proplatelet fragments are released. Rho GTPases, such as RhoA and RhoB, are critically involved in cytoskeletal rearrangements of both the actin and the tubulin cytoskeleton. The first part of this thesis concentrated on the protein RhoB and its involvement in cytoskeletal organization in MKs and platelets. Single knockout (KO) mice lacking RhoB had a minor microthrombocytopenia, which means a smaller platelet size and reduced platelet number, accompanied by defects in the microtubule cytoskeleton in both MKs and platelets. In particular, tubulin organization and stability, which is regulated by posttranslational modifications of α-tubulin, were disturbed in RhoB-/- platelets. In contrast, RhoB-/- MKs produced abnormally shaped proplatelets but had unaltered posttranslational modifications of α-tubulin. The second part focused on the influence of RhoA and RhoB on MK localization and platelet biogenesis in murine BM. Many intact RhoA-/- MKs are able to transmigrate through the endothelial layer and stay attached to the vessel wall, whereas only 1% of wildtype (wt) MKs are detectable in the intrasinusoidal space. Concomitant deficiency of RhoA and RhoB reverts this transmigration and results in macrothrombocytopenia, MK clusters around the vessel in the BM and defective MK development. The underlying mechanism that governs MKs to distinct localizations in the BM is poorly understood, thus this thesis suggests that this process may be dependent on RhoB protein levels, as RhoA deficiency is coincided with increased RhoB levels in MKs and platelets. The third part of this thesis targeted the protein PDK1, a downstream effector of Rho GTPases, in regard to MK maturation and polarization throughout thrombopoiesis. MK- and platelet-specific KO in mice led to a significant macrothrombocytopenia, impaired actin cytoskeletal reorganization during MK spreading and proplatelet formation, with defective MK maturation. This was associated with decreased PAK activity and, subsequently, phosphorylation of its substrates LIMK and Cofilin. Together, the observations of this thesis highlight the importance of Rho GTPases and their downstream effectors on the regulation of the MK and platelet cytoskeleton. N2 - Thrombozyten sind kleine Zellfragmente ohne Zellkern, die von Megakaryozyten (MKs) produziert werden. MKs sind riesige Zellen im Knochenmark, welche lange zytoplasmatische Ausläufer in die sinusoidalen Blutgefäße strecken, woraus durch den Blutstrom Thrombozyten abgeschnürt werden. Während der Thrombozyten-Biogenese penetrieren Teile des MKs das Endothel und durch zytoskeletales Umorganisieren innerhalb des MKs werden Proplättchen-Fragmente gebildet. Rho GTPasen wie die Proteine RhoA und RhoB sind maßgebliche Regulatoren des Zytoskeletts, sowohl des Aktins als auch des Tubulin Zytoskeletts. Der erste Teil dieser Thesis konzentrierte sich auf das Protein RhoB und dessen Einfluss auf die Organisation des Zytoskeletts. Mäuse mit einer Defizienz für das Protein RhoB zeigen eine Microthrombozytopenie und eine Reduktion der Thrombozytenzahl und -größe. Dies ist begleitet von Defekten des Mikrotubuli Zytoskeletts sowohl in MKs als auch in Blutplättchen. In Thrombozyten waren insbesondere Tubulin Organisation und Stabilisation betroffen, welche durch posttranslationale Modifizierungen von α-Tubulin bestimmt wurde. RhoB-negative MKs hingegen produzierten abnormal geformte Proplättchen, hatten jedoch unveränderte posttranslationale Modifizierungen von α-Tubulin. Der zweite Teil dieser Thesis fokussierte sich auf den Einfluss von RhoA und RhoB auf die Lokalisation von MKs im Knochenmarkt von Mäusen. Eine große Anzahl von RhoA-negativen MKs können durch das Endothel in die Blutgefäße wandern und bleiben dort adhärent, während nur etwa 1% wildtypischer MKs am Blutgefäß detektierbar sind. Gleichzeitige Defizienz von RhoA und RhoB revertiert die Translokation von RhoA-negativen MKs und führt in Mäusen zu Makrothrombozytopenie, die Formierung von MK Clustern um die Gefäßwand im Knochenmarkt und eine fehlerhafte MK Entwicklung. Der Mechanismus, der MKs zu bestimmten Positionen im Knochenmarkt führt, ist bisher kaum verstanden. In dieser Thesis konnte gezeigt werden, dass dieser Prozess von dem Level an RhoB Protein abhängig sein könnte, da eine Defizienz von RhoA zu einer Hochregulierung von RhoB in MKs und Thrombozyten führte. Der dritte Teil dieser Thesis zielte auf ein Signalprotein der Rho GTPasen ab, dem Protein PDK1. Es wurde die Rolle von PDK1 in der Regulation von MK Reifung und Polarisation während der Bildung von Thrombozyten untersucht. Ein MK und Thrombozyten spezifischer KO von PDK1 führte zu einer signifikanten Makrothrombozytopenie, einem gestörten Aktin Zytoskelett, während des MK Spreadings und der Proplättchen Bildung, begleitet von einer fehlerhaften MK Reifung. Dies war mit einer Reduktion in der Aktivität von PAK und folglich dem Phosphorylierungsstatus seiner Substrate LIMK und Cofilin assoziiert. Die Beobachtungen dieser Doktorarbeit arbeiteten die Relevanz von Rho GTPasen und ihren Signalproteinen für die Regulation des MK und Thrombozyten Zytoskelettes im Maus-Modell hervor. KW - Megakaryozyt KW - Thrombozyt KW - Zellskelett KW - Thrombopoiesis KW - Cytoskeleton Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-234669 ER - TY - THES A1 - Wang, Zhenjiu T1 - Numerical simulations of continuum field theories and exotic quantum phase transitions T1 - Numerische Simulationen von Kontinuumsfeldtheorien und exotisch Quantenphasenübergänge N2 - In this thesis, we investigate several topics pertaining to emergent collective quantum phenomena in the domain of correlated fermions, using the quantum Monte Carlo method. They display exotic low temperature phases as well as phase transitions which are beyond the Landau–Ginzburg theory. The interplay between three key points is crucial for us: fermion statistics, many body effects and topology. We highlight the following several achievements: 1. Successful modeling of continuum field theories with lattice Hamiltonians, 2. their sign-problem-free Monte Carlo simulations of these models, 3. and numerical results beyond mean field descriptions. First, we consider a model of Dirac fermions with a spin rotational invariant inter- action term that dynamically generates a quantum spin Hall insulator. Surprisingly, an s-wave superconducting phase emerges due to the condensation of topological de- fects of the spin Hall order parameter. When particle-hole symmetry is present, the phase transition between the topological insulator and the superconducting phase is an example of a deconfined quantum critical point(DQCP). Although its low energy effec- tive field theory is purely bosonic, the exact conservation law of the skyrmion number operator rules out the possibility of realizing this critical point in lattice boson models. This work is published in Ref. [1]. Second, we dope the dynamically generated quantum spin Hall insulator mentioned above. Hence it is described by a field theory without Lorentz invariance due to the lack of particle-hole symmetry. This sheds light on the extremely hot topic of twisted bilayergraphene: Why is superconductivity generated when the repulsive Coulomb interaction is much stronger than the electron-phonon coupling energy scale? In our case, Cooper pairs come from the topological skyrmion defects of the spin current order parameter, which are charged. Remarkably, the nature of the phase transition is highly non-mean-field-like: one is not allowed to simply view pairs of electrons as single bosons in a superfluid-Mott insulator transition, since the spin-current order parameter can not be ignored. Again, due to the aforementioned skyrmions, the two order parameters are intertwined: One phase transition occurs between the two symmetry breaking states. This work is summarized in Ref. [2]. Third, we investigate the 2 + 1 dimensional O(5) nonlinear sigma model with a topological Wess-Zumino-Witten term. Remarkably, we are able to perform Monte Carlo calculations with a UV cutoff given by the Dirac Landau level quantization. It is a successful example of simulating a continuous field theory without lattice regularization which leads to an additional symmetry breaking. The Dirac background and the five anti-commuting Dirac mass terms naturally introduce the picture of a non-trivial Berry phase contribution in the parameter space of the five component order parameter. Using the finite size scaling method given by the flux quantization, we find a stable critical phase in the low stiffness region of the sigma model. This is a candidate ground state of DQCP when the O(5) symmetry breaking terms are irrelevant at the critical point. Again, it has a bosonic low energy field theory which is seemingly unable to be realized in pure boson Hamiltonians. This work is summarized in Ref. [3]. N2 - In dieser Arbeit untersuchen wir verschiedene Themen über emergente kollektive Quan- tenphänomene im Bereich der korrelierten Fermionen unter Verwendung der Quanten- Monte-Carlo-Methode. Sie zeigen sowohl exotische Tieftemperaturphasen als auch Phasenübergänge, die jenseits der Landau-Ginzburg-Theorie liegen. Das Zusammen- spiel von drei Schlüsselpunkten ist für uns entscheidend: Fermionenstatistik, Vielteilch- eneffekte und Topologie. Es sind bemerkenswerte Erfolge erzielt worden: 1. Erfolgre- iche Modellierung mehrerer kontinuierlicher Feldtheorien über Gitter-Hamiltonians. 2. Vorzeichenproblem-freie Monte-Carlo-Simulation von ihnen. 3. Numerische Ergebnisse jenseits des Molekularfeld-Verständnisses. Zunächst betrachten wir ein Modell von Dirac-Fermionen mit einem spinrotations- invarianten Wechselwirkungsterm, der dynamisch einen Quanten-Spin-Hall-Zustand erzeugt. Überraschenderweise entsteht eine s-Wellen-supraleitende Phase durch die Kondensation von topologischen Defekten des Spin-Hall-Ordnungsparameters. Wenn Teilchen-Loch-Symmetrie vorhanden ist, ist dieser Phasenübergang zwischen topologis- chem Isolator und Supraleiter ein Beispiel für einen dekondefinierten quantenkritischen Punkt (DQCP). Obwohl seine niedrigenergetische effektive Feldtheorie rein bosonisch ist, schließt der exakte Erhaltungssatz des Skyrmionenzahloperators die Möglichkeit aus, diesen kritischen Punkt in Gitter-Boson-Modellen zu realisieren. Diese Arbeit ist veröffentlicht in Ref. [1]. Zweitens dotieren wir den dynamisch erzeugten Quanten-Spin-Hall-Isolator von oben. Er wird aufgrund der fehlenden Teilchen-Loch-Symmetrie durch eine Feldtheorie ohne Lorenzt-Invarianz beschrieben. Dies wirft ein Licht auf das extrem heiße Thema des verdrehten Doppelschichtgraphens: Warum wird Supraleitung erzeugt, wenn die ab- stoßende Coulombwechselwirkung viel stärker ist als die Elektron-Phonon Kopplungsen- ergie? In unserem Fall kommen Kupferpaare aus den topologischen Skyrmiondefekten der Parameter der Spinstromordnung, die geladen sind. Bemerkenswerterweise ist die Art des Phasenübergangs in hohem Maße nicht molekularfeldartig: Es ist nicht erlaubt, ein Elektronenpaar einfach als einzelnes Boson in einem Superfluid-Mott- Isolator-Übergang zu betrachten, da der Parameter der Spin-Strom-Ordnung nicht ignoriert werden kann. Wiederum aufgrund der oben erwähnten Skyrimionen, sind zwei Ordnungsparameter miteinander verbunden: ein Phasenübergang findet zwischen den beiden Zuständen mit gebrochener Symmetrie statt. Diese Arbeit ist in Ref. [2]. Drittens untersuchten wir das 2 + 1-dimensionale nichtlineare O(5)-Sigma-Modell mit einem topologischen Wess-Zumino-Witten-Term. Bemerkenswerterweise sind wir in der Lage, Monte-Carlo-Berechnungen durchzuführen, mit UV-Cutoff gegeben durch die Quantifizierung der Dirac-Landau-Ebenen. Es ist ein erfolgreiches Beispiel für die Simulation einer kontinuierlichen Feldtheorie ohne Gitterregularisierung, die zu zusätzlichen Symmetriebrechungen führt. Der Dirac-Hintergrund und die 5 antikom- mutiernenden Dirac-Massenterme führen natürlich das Bild eines nicht-trivialen Berryphasen Beitrags im Parameterraum des Ordnungsparameters mit fünf Komponenten ein. Unter Verwendung der Methode der endlichen Größenskalierung, die durch Flussquantisierung gegeben ist, fanden wir eine stabile kritische Phase im Bereich der niedrigen Steifigkeit des Sigma-Modells. Dies ist ein Kandidat für den Grundzustand des DQCP, wenn die O(5)-Symmetrie brechenden Terme am kritischen Punkt irrelevant sind. Auch hier handelt es sich um eine niedrigenergetische bosonische Feldtheorie, die scheinbar durch reine Boson-Hamiltonians nicht realisiert werden kann. Diese Arbeit ist in Ref. [3]. KW - Quanten-Monte-Carlo-Methode KW - Quantenphasenübergänge KW - Stark korrelierte Elektronen KW - Quantum Monte Carlo method KW - Quantum phase transitions KW - Strongly correlated electrons Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-238001 ER - TY - THES A1 - Kasper, Christian Andreas T1 - Engineering of Highly Coherent Silicon Vacancy Defects in Silicon Carbide T1 - Erzeugung hochkohärenter Silizium Fehlstellen in Siliziumkarbid N2 - In this work the creation of silicon vacancy spin defects in silicon carbide with predictable properties is demonstrated. Neutron and electron irradiation was used to create silicon vacancy ensembles and proton beam writing to create isolated vacancies at a desired position. The coherence properties of the created silicon vacancies as a function of the emitter density were investigated and a power-law function established. Sample annealing was implemented to increase the coherence properties of existing silicon vacancies. Further, spectral hole burning was used to implement absolute dc-magnetometry. N2 - In dieser Arbeit wird die Erzeugung von Silizium Fehlstellen in Siliziumkarbid mit vorhersagbaren Eigenschaften nachgewiesen. Neutronen- und Elektronenbestrahlung wurden zur Erzeugung von Ensembles von Silizium Fehlstellen verwendet, während isolierte Fehlstellen an einer gewünschten Position mit Hilfe eines Protonenstrahls erzeugt wurden. Die Kohärenz der erzeugten Silizium Fehlstellen wurde in Abhängigkeit der Emitterdichte untersucht und eine Gesetzmäßigkeit hierfür eingeführt. Um die Kohärenz der Silizium Fehlstellen zu erhöhen, wurden Annealing Experimente durchgeführt. Des Weiteren wurde spektrales Holeburning verwendet, um absolute DC-Magnetometrie nachzuweisen. KW - Störstelle KW - Siliciumcarbid KW - Kohärenz KW - Irradiation KW - Color Center KW - Spin defect KW - Bestrahlung KW - Farbzentrum KW - Spin Defekt Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-237797 ER - TY - THES A1 - Pöhner, Nicolai T1 - Educational robotics competitions as out-of-school learning setting for STEM education: An empirical study on students’ learning of problem solving skills through participation in the World Robot Olympiad T1 - Roboterwettbewerbe als außerschulisches Lernangebot für den MINT-Unterricht: Eine empirische Untersuchung zur Förderung der Problemlösefähigkeiten von Schülerinnen und Schülern durch Teilnahme an der World Robot Olympiad N2 - Educational robotics is an innovative approach to teaching and learning a variety of different concepts and skills as well as motivating students in the field of Science, Technology, Engineering, and Mathematics (STEM) education. This especially applies to educational robotics competitions such as, for example, the FIRST LEGO League, the RoboCup Junior, or the World Robot Olympiad as out-of-school and goal-oriented approach to educational robotics. These competitions have gained greatly in popularity in recent years and thousands of students participate in these competitions worldwide each year. Moreover, the corresponding technology became more accessible for teachers and students to use it in their classrooms and has arguably a high potential to impact the nature of science education at all levels. One skill, which is said to be benefitting from educational robotics, is problem solving. This thesis understands problem solving skills as engineering design skills (in contrast to scientific inquiry). Problem solving skills count as important skills as demanded by industry leaders and policy makers in the context of 21st century skills, which are relevant for students to be well-prepared for their future working life in today’s world, shaped by an ongoing process of automation, globalization, and digitalization. The overall aim of this thesis is to try to answer the question if educational robotics competitions such as the World Robot Olympiad (WRO) have a positive impact on students’ learning in terms of their problem solving skills (as part of 21st century skills). In detail, this thesis focuses on a) if students can improve their problem solving skills through participation in educational robotics competitions, b) how this skill development is accomplished, and c) the teachers’ support of their students during their learning process in the competition. The corresponding empirical studies were conducted throughout the seasons of 2018 and 2019 of the WRO in Germany. The results show overall positive effects of the participation in the WRO on students’ learning of problem solving skills. They display an increase of students’ problem solving skills, which is not moderated by other variables such as the competition’s category or age group, the students’ gender or experience, or the success of the teams at the competition. Moreover, the results indicate that students develop their problem solving skills by using a systematic engineering design process and sophisticated problem solving strategies. Lastly, the teacher’s role in the educational robotics competitions as manager and guide (in terms of the constructionist learning theory) of the students’ learning process (especially regarding the affective level) is underlined by the results of this thesis. All in all, this thesis contributes to the research gap concerning the lack of systematic evaluation of educational robotics to promote students’ learning by providing more (methodologically) sophisticated research on this topic. Thereby, this thesis follows the call for more rigorous (quantitative) research by the educational robotics community, which is necessary to validate the impact of educational robotics. N2 - Die Robotik stellt einen handlungsorientierten („hands-on“) Zugang zur Bildung in Mathematik, Informatik, Naturwissenschaften und Technik (MINT) dar. Dabei fördert sie das Lernen von Schülerinnen und Schülern nicht nur auf kognitiver Ebene, sondern trägt auch zu einer erhöhten Motivation und erhöhtem Interesse bei (affektive Ebene). In den letzten Jahren erfreuen sich gerade Roboterwettbewerbe als außerschulisches Lernangebot steigender Beliebtheit und verzeichnen weltweit jährlich wachsende Teilnehmerzahlen. Beispiele dafür sind die FIRST LEGO League, der RoboCup Junior und die World Robot Olympiad. Zudem steigt auch die Verfügbarkeit der nötigen Robotersysteme für Schülerinnen und Schüler sowie Lehrkräfte, um sie in der Schule einzusetzen und damit verschiedenste Lerninhalte in allen Jahrgangsstufen zu vermitteln. Ein Lerninhalt, der durch die Robotik besonders gefördert werden können soll, ist das Problemlösen. Problemlösen wird in dieser Arbeit als ingenieurwissenschaftliche Denk- und Arbeitsweise verstanden (im Gegensatz zu naturwissenschaftlichen Denk- und Arbeitsweisen). Das Problemlösen gilt dabei als eine wichtige Fähigkeit im Kontext von sog. 21st century skills. Diese beschreiben wichtige Fähigkeiten für die Arbeitswelt von morgen. Sie resultieren aus einer fortschreitenden Automatisierung, Globalisierung und Digitalisierung unserer Welt und werden regelmäßig von Vertretern von Industrie und Politik gefordert. Eine Forschungslücke stellt aber weiterhin die unzureichende systematische wissenschaftliche Forschung und Evaluation hinsichtlich des positiven Einflusses der Robotik auf das Lernen dar. Die fehlende Systematik geht dabei vor allem die Verwendung wenig aussagekräftiger Methodik (z.B. deskriptive Erfahrungsberichte von einzelnen Lehrkräften) zurück. Das übergreifende Ziel dieser Arbeit ist es, zu untersuchen, ob eine Teilnahme an der World Robot Olympiad (WRO) (als Beispiel für einen beliebten Roboterwettbewerb) einen positiven Einfluss auf die Problemlösefähigkeiten (als Teil der 21st century skills) der Schülerinnen und Schüler hat. Dabei wird im Detail untersucht, a) ob die Problemlösefähigkeiten der Schülerinnen und Schüler durch eine Teilnahme an Roboterwettbewerben verbessert werden können, b) wie diese Verbesserung zustande kommt und c) wie die Team-Coaches die Schülerinnen und Schüler während ihres Lernprozesses unterstützen. Die dazu durchgeführten empirischen Studien fanden in den beiden Jahren 2018 und 2019 im Rahmen der WRO in Deutschland statt. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen einen insgesamt positiven Einfluss einer Teilnahme an der WRO auf die Problemlösefähigkeiten der Schülerinnen und Schüler. Dies zeigt sich in einer Verbesserung ihrer Problemlösefähigkeiten durch die Teilnahme, die nicht durch andere Variablen wie der Kategorie und Altersklasse der WRO, dem Geschlecht und der Erfahrung der Schülerinnen und Schüler sowie deren Erfolg beim Roboterwettbewerb moderiert wurde. Die Verbesserung der Problemlösefähigkeiten erfolgt durch die Verwendung von systematischen ingenieurwissenschaftlichen Denk- und Arbeitsweisen sowie fortgeschrittenen Problemlösestrategien. Die Rolle des Team-Coaches als Manager und Lernbegleiter (im Sinne einer konstruktionistischen Didaktik) im Roboterwettbewerb (besonders bezüglich der affektiven Ebene) wird durch die Ergebnisse der Arbeit ebenfalls unterstrichen. Zusammenfassend lässt sich also sagen, dass diese Arbeit einen Beitrag hinsichtlich der Forschungslücke leistet und damit dem Aufruf der Community nach weiterer (quantitativer) wissenschaftlicher Forschung nachkommt, der nötig ist, um den positiven Einfluss der Robotik auf das Lernen der Schülerinnen und Schüler zu bestätigen. KW - Fachdidaktik KW - Außerschulische Bildung KW - Computer Science education KW - Educational robotics KW - Educational robotics competitions KW - problem solving skills KW - Didaktik der Informatik KW - Robotik KW - Roboterwettbewerbe KW - Problemlösefähigkeiten KW - Informatik Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-243179 ER -