TY - THES A1 - Moradi, Mehri T1 - Differential roles of α-, β- and γ-actin isoforms in regulation of cytoskeletal dynamics and stability during axon elongation and collateral branch formation in motoneurons T1 - Rolle der α-, β- und γ-Aktin Isoformen bei Regulation von Dynamik und Stabilität des Zytoskeletts während des Axonwachstums und beim Ausbilden von axonalen Verzweigungen in Motoneuronen N2 - In highly polarized cells like neurons, cytoskeleton dynamics play a crucial role in establishing neuronal connections during development and are required for adult plasticity. Actin turnover is particularly important for neurite growth, axon path finding, branching and synaptogenesis. Motoneurons establish several thousand branches that innervate neuromuscular synapses (NMJs). Axonal branching and terminal arborization are fundamental events during the establishment of synapses in motor endplates. Branching process is triggered by the assembly of actin filaments along the axon shaft giving rise to filopodia formation. The unique contribution of the three actin isoforms, α-, β- and γ-actin, in filopodia stability and dynamics during this process is not well characterized. Here, we performed high resolution in situ hybridization and qRT-PCR and showed that in primary mouse motoneurons α-, β- and γ-actin isoforms are expressed and their transcripts are translocated into axons. Using FRAP experiments, we showed that transcripts for α-, β- and γ-actin become locally translated in axonal growth cones and translation hot spots of the axonal branch points. Using live cell imaging, we showed that shRNA depletion of α-actin reduces dynamics of axonal filopodia which correlates with reduced number of collateral branches and impairs axon elongation. Depletion of β-actin correlates with reduced dynamics of growth cone filopoida, disturbs axon elongation and impairs presynaptic differentiation. Also, depletion of γ-actin impairs axonal growth and decreases axonal filopodia dynamics. These findings implicate that actin isoforms accomplish unique functions during development of motor axons. Depletions of β- and γ-actin lead to compensatory upregulation of other two isoforms. Consistent with this, total actin levels remain unaltered and F-actin polymerization capacity is preserved. After the knockdown of either α- or γ-actin, the levels of β-actin increase in the G-actin pool indicating that polymerization and stability of β-actin filaments depend on α- or γ-actin. This study provides evidence both for unique and overlapping function of actin isoforms in motoneuron growth and differentiation. In the soma of developing motoneurons, actin isoforms act redundantly and thus could compensate for each other’s loss. In the axon, α-, β- and γ-actin accomplish specific functions, i.e. β-actin regulates axon elongation and plasticity and α- and γ-actin regulate axonal branching. Furthermore, we show that both axonal transport and local translation of α-, β- and γ-actin isoforms are impaired in Smn knockout motoneurons, indicating a role for Smn protein in RNA granule assembly and local translation of these actin isoforms in primary mouse motoneurons. N2 - In stark polaren Zellen wie den Neuronen ist die Etablierung neuronaler Netzwerke ein entscheidender Faktor bei der Entwicklung des zentralen Nervensystems und spielt für die adulte Plastizität eine wesentliche Rolle. Besonders die Aktindynamik ist wichtig für das Neuritenwachstum, die axonale Wegfindung und Verzweigung, sowie die Synaptogenese. Motoneurone bilden mehrere tausend terminale Verzweigungen aus, um neuromuskuläre Endplatten (NMJ) zu innervieren. Die axonale Verzweigung ist ein fundamentales Ereignis bei Ausbildung synaptischer Verbindungen zwischen Motoneuron und innerviertem Muskel. Die Axonverzweigung geschieht durch die Polymerisierung von Aktin entlang des Axonschafts, was zur Entstehung von Filopodien und Lamellopodien führt. Allerdings ist die genaue Funktion der drei Aktin-Isoformen (α-, β- and γ-Actin), im Zusammenhang mit der Regulation der Filopodienstabilität und deren Dynamik, noch weitestgehend unbekannt. Somit konnten wir in dieser Arbeit mit Hilfe hoch sensitiver in situ Hybridisierungs- und qRT PCR Techniken zeigen, dass in primären Mausmotoneuronen alle drei Aktinisoformen (α-, β- und γ) exprimiert, und deren Transkripte entlang des axonalen Kompartiments transportiert werden. Unsere FRAP Daten weisen darauf hin, dass α-, β- und γ-Aktin sowohl im Wachstumskegel als auch an sogenannten „Translation Hot Spots“ innerhalb axonaler Verzweigungspunkte lokal synthetisiert werden. Anhand von „Live Cell Imaging“ Experimenten konnten wir dann zeigen, dass ein α-Aktin Knockdown die Dynamik axonaler Filopodien stark reduziert, und als Folge, die Anzahl von axonalen Verzweigungen und die Axonlänge verringert ist. Hingegen geht ein β-Aktin Knockdown mit reduzierter Filopodiendynamik im Wachstumskegel und betroffener Differenzierung präsynaptischer Strukturen einher. Veränderungen des axonalen Wachstum und der Filopodiendynamik sind ebenfalls bei einem γ-Aktin Knockdown zu beobachten. Diese Daten weisen darauf hin, dass die drei Aktinisoformen unterschiedliche Funktionen bei der Entwicklung von Motoraxonen haben. Darüber hinaus zeigen unsere Daten, dass die Herunterregulation einer Aktinisoform durch eine erhöhte Expression der beiden anderen Isoformen kompensiert wird. Dieser Kompensationsmechanismus erlaubt es, die gesamte Aktinmenge und somit die F-Aktin-Polymerisation in der Zelle aufrechtzuerhalten. Sehr interessant dabei ist die Beobachtung, dass nach einem α- oder γ-Actin Knockdown das G/F-Verhältnis verändert ist, so dass die Menge an β-Aktin im G-Aktin Pool steigt und im F-Aktin Pool abnimmt. Daher beruhen Polymerisation und Stabilität von β-Aktin auf den α-, und γ-Aktinisoformen. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass alle drei Aktinisoformen übergreifende Funktionen während Wachstum und Differenzierung von Motoneuronen haben. Im Zellkörper von sich entwickelnden Motoneuronen übernehmen sie ähnliche Aufgaben und können sich somit gegenseitig kompensieren. Im Gegensatz dazu sind die Funktionen im axonalen Kompartiment wesentlich spezifischer. Hier reguliert β-Aktin axonales Wachstum und Plastizität, während α- und γ-Aktin eine entscheidende Rolle bei der Ausbildung axonaler Verzweigungen haben. Unsere Arbeit lässt nun Rückschlüsse über mögliche Funktionen des SMN Proteins beim Aufbau der sogenannten „RNA Granules“ und lokaler Proteinbiosynthese der verschiedenen Aktinisoformen in primären Mausmotoneuronen zu. KW - Motoneuron KW - Spinale Muskelatrophie KW - Actin KW - Actin Dynamics KW - Isomer KW - Motoneurons KW - Axon Branching KW - Spinal Muscular Atrophy Y1 - 2017 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-147453 ER - TY - JOUR A1 - Dombert, Benjamin A1 - Balk, Stefanie A1 - Lüningschrör, Patrick A1 - Moradi, Mehri A1 - Sivadasan, Rajeeve A1 - Saal-Bauernschubert, Lena A1 - Jablonka, Sibylle T1 - BDNF/trkB induction of calcium transients through Ca\(_{v}\)2.2 calcium channels in motoneurons corresponds to F-actin assembly and growth cone formation on β2-chain laminin (221) JF - Frontiers in Molecular Neuroscience N2 - Spontaneous Ca\(^{2+}\) transients and actin dynamics in primary motoneurons correspond to cellular differentiation such as axon elongation and growth cone formation. Brain-derived neurotrophic factor (BDNF) and its receptor trkB support both motoneuron survival and synaptic differentiation. However, in motoneurons effects of BDNF/trkB signaling on spontaneous Ca\(^{2+}\) influx and actin dynamics at axonal growth cones are not fully unraveled. In our study we addressed the question how neurotrophic factor signaling corresponds to cell autonomous excitability and growth cone formation. Primary motoneurons from mouse embryos were cultured on the synapse specific, β2-chain containing laminin isoform (221) regulating axon elongation through spontaneous Ca\(^{2+}\) transients that are in turn induced by enhanced clustering of N-type specific voltage-gated Ca\(^{2+}\) channels (Ca\(_{v}\)2.2) in axonal growth cones. TrkB-deficient (trkBTK\(^{-/-}\)) mouse motoneurons which express no full-length trkB receptor and wildtype motoneurons cultured without BDNF exhibited reduced spontaneous Ca\(^{2+}\) transients that corresponded to altered axon elongation and defects in growth cone morphology which was accompanied by changes in the local actin cytoskeleton. Vice versa, the acute application of BDNF resulted in the induction of spontaneous Ca\(^{2+}\) transients and Ca\(_{v}\)2.2 clustering in motor growth cones, as well as the activation of trkB downstream signaling cascades which promoted the stabilization of β-actin via the LIM kinase pathway and phosphorylation of profilin at Tyr129. Finally, we identified a mutual regulation of neuronal excitability and actin dynamics in axonal growth cones of embryonic motoneurons cultured on laminin-221/211. Impaired excitability resulted in dysregulated axon extension and local actin cytoskeleton, whereas upon β-actin knockdown Ca\(_{v}\)2.2 clustering was affected. We conclude from our data that in embryonic motoneurons BDNF/trkB signaling contributes to axon elongation and growth cone formation through changes in the local actin cytoskeleton accompanied by increased Ca\(_{v}\)2.2 clustering and local calcium transients. These findings may help to explore cellular mechanisms which might be dysregulated during maturation of embryonic motoneurons leading to motoneuron disease. KW - growth cone KW - BDNF KW - trkB KW - Ca\(_{v}\)2.2 KW - F-actin KW - motor axon Y1 - 2017 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-159094 VL - 10 IS - 346 ER -