TY - THES A1 - Herrmann, Thomas T1 - Sequenz-spezifische Interaktion des murinen präreplikativen Komplexes mit Origin-DNA T1 - Sequence specific interaction of the murine prereplicative Complex with origin DNA N2 - Mit Hilfe von in vivo ChIP-Experimenten identifizierten wir eine präRC Bindungsstelle von -2519 bis -2152 (Fragment B) innerhalb eines „origin of bidirectional replication (OBR)“ der 44 kb langen Maus-rDNA-Einheit. Diese Bindungsstelle befindet sich ungefähr 2,3 kb ubstream des Transkriptionsstartpunktes der RNA-Poymerase I. An dieser Bindungsstelle konnte in der G1-Phase der komplette ORC-Komplex sowie Geminin, MCM3 und -6 nachgewiesen werden. Für den G1/S-Phasenübergang deuten die Ergebnisse darauf hin, dass sich ORC6 und Geminin von Fragment B ablösen, während sich CDC6 und -45 an den ORC-Komplex anlagern. Mit Erreichen der S-Phase konnte gezeigt werden, dass sich CDC6 und -45 sowie ORC1 wieder ablösen und ein Core-Komplex von ORC2-5 sowie MCM3 und -6 gebunden bleibt. Außerdem konnte an Fragment B eine spezifische Bindung eines aus FM3A-Zellkernprotein angereicherten präRC-Komplexes (Komplex A) auch in vitro mit Hilfe von EMSA-Experimenten beobachtet werden. Die Bindungsaktivität von Komplex A an Fragment B konnte durch ATP verstärkt werden. N2 - Using chromatin immunoprecipitation assays (ChIP) we identified in vivo a preRC binding site located from -2519 to –2152 (fragment B) within a previously mapped origin of bidirectional replication of the murine rDNA locus located approximately 2.3 kb upstream of the transcription start site of RNA polymerase I. At this sequence, ORC1, -2, -3, -4, -5 -6 as well as Geminin, MCM3 and -6 are bound in G1 phase; at the G1/S transition also CDC6, and -45 interact whereas ORC6 as well as Geminin dissociates. In S phase, ORC1, CDC6 and -45 are released from the preRC. We have reproduced an ATP-dependent assembly of the preRC at origin DNA in vitro using EMSA-Experiments with partially purified proteins from murine nuclear extracts. KW - Maus KW - Zellzyklus KW - Replikation KW - Replikationsursprung KW - präRC KW - Zellzyklus KW - ATP-Abhängigkeit KW - Maus KW - Origin of Recognition KW - preRC KW - Cell cycle KW - ATP-dependent KW - murine KW - Origin of Recognition Y1 - 2004 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-11241 ER - TY - THES A1 - Faul, Thomas T1 - Lokalisation und Dynamik der Replikationsproteine des murinen prä-replikativen Komplexes T1 - Localization and dynamics of replication proteins of the murine pre-replicative complex N2 - Ein Ziel der vorliegenden Arbeit war die Untersuchung der Lokalisation und der Dynamik der Replikationsproteine des murinen prä-replikativen Komplexes in vivo. Dazu wurden die zu untersuchenden Replikationsproteine als EGFP-Fusionsproteine in LTK--Zellen exprimiert und am konfokalen Laserscanning-Mikroskop untersucht. CDC6-EGFP war in der G1-Phase diffus in Zellkern und Cytoplasma verteilt, am G1/S-Übergang ausschließlich im Zellkern lokalisiert und während der S-Phase in zahlreichen Foci im Kern akkumuliert. CDC6-EGFP war mit Replikationsfoci colokalisiert. Endogenes Cdc6p wies dieselbe subzelluläre Verteilung wie CDC6-EGFP auf. Auch Fusionsproteine des humanen Proteins Cdc6p waren in HEK-293T-Zellen in Replikationsfoci lokalisiert. FRAP-Studien ergaben, dass 80-90 % von CDC6-EGFP während der gesamten S-Phase stabil mit der Replikationsmaschinerie assoziiert sind. Durch Mutation der Phosphoryliersstellen für Cyclin-abhängige Proteinkinasen wurde der Einfluss des Phosphorylierungsstatus der konservierten Serinreste der Cdk-Phosphorylierungsstellen auf die Lokalisation von CDC6-EGFP in vivo untersucht. Alle Mutanten bei denen die Cdk-Serinreste zu nicht-phosphorylierbaren Alaninresten mutiert wurden waren in Replikationsfoci lokalisiert. Dies zeigt, dass die Phosphorylierung dieser Serinreste für die Lokalisation von CDC6-EGFP an Stellen aktiver DNA-Replikation nicht essentiell ist. Durch Mutation der Serinreste zu Phosphatreste-simulierenden Aspartatresten konnte gezeigt werden, dass die Phosphorylierung des Serinrests S102 zum Export von CDC6-EGFP aus dem Zellkern führt. FRAP-Studien ergaben, dass CDC6-EGFP in Replikationsfoci an Serinrest 82 phosphoryliert und an Serinrest 102 dephosphoryliert vorliegt. Mit Immunfluoreszenz-Analysen konnte gezeigt werden, dass Chromatin in Replikationsfoci nicht acetyliert ist. Dies deutet darauf hin, dass die Elongation der DNA-Replikation an nicht-acetyliertem Chromatin erfolgt. Trichostatin A-induzierte Hyperacetylierung des Chromatins hatte keinen Einfluss auf Lokalisation und Mobilität von CDC6-EGFP in Replikationsfoci. Die Mobilität des nucleoplasmatischen CDC6-EGFP-Pools wurde dadurch erhöht. In der G1-Phase wurde die Mobilität von CDC6-EGFP durch TSA verringert, woraus gefolgert werden kann, dass der Acetylierungsstatus des Chromatins in der G1-Phase die Mobilität von CDC6-EGFP beeinflusst. ORC1-EGFP war im Zellkern in großen kugelförmigen Strukturen lokalisiert, ORC2-EGFP war diffus in Cytoplasma und Zellkern verteilt. ORC3-EGFP akkumulierte in PML nuclear bodies. Während ORC4-EGFP und ORC5-EGFP am Centrosom lokalisiert waren konnte ORC6-EGFP in Nucleoli nachgewiesen werden. Die EGFP-Fusionsproteine von Cdc45p, PCNA und DNA-Ligase-I waren im Zellkern lokalisiert, die Nucleoli waren ausgespart. Ein weiterer Aspekt dieser Arbeit war die Untersuchung der Substratspezifität der murinen Cdc7p/Dbf4p-Proteinkinase. Die in Sf9-Zellen exprimierte und aufgereinigte Kinase phosphorylierte Orc2p, Orc6p, Cdc45p und Mcm6p. Mit Phosphopeptidkartierungen konnte gezeigt werden, dass Cdc7p von CylinE/Cdk2 an zwei Stellen und von CyclinA/Cdk2 an einer Stelle in vitro phosphoryliert wird. CDC7-EGFP war in der G1-Phase, am G1/S-Übergang und in der S-Phase im Kern lokalisiert. Durch FISH-Experimente konnte der genomische Locus des murinen Cdc7-Gens der Bande E von Chromosom 5 zugeordnet werden. Mit Kinase-Assays wurde untersucht, ob die murine Plk1p-Kinase Initiationsfaktoren der DNA-Replikation in vitro phosphoryliert. Die in Sf9-Zellen exprimierte Plk1p phosphorylierte Cdc7p, Orc2p und Orc6p. Cdc7p und Orc6p sind mit Plk1p am Midbody während der Telophase in vivo colokalisiert. Ein weiteres Ziel dieser Arbeit war die Messung der Mobilität des murinen Transkriptions-Terminationsfaktors TTF-I mittels FRAP. EGFP-TTF-I und EGFP-NRD waren diffus in den Nucleoli verteilt, einzelne Areale waren ausgespart. EGFP-TTFdeltaN185 war hingegen in distinkten nucleolären Stellen akkumuliert. Mit FRAP-Studien konnte gezeigt werden, dass EGFP-TTFdeltaN185 in einer 10 %igen immobilen Fraktion vorlag während das Gesamtprotein EGFP-TTF-I zu 100% mobil war. Das Protein TIP5 interagiert mit TTF-I. EGFP-TIP5 war diffus im Nucleoplasma verteilt, die Ncleoli waren ausgespart. Durch Cotransfektionen verschiedener EYFP-TTF-I-Konstrukte mit EGFP-TIP5 konnte gezeigt werden, dass EGFP-TIP5 von EYFP-TTFdeltaN185 nicht in Nucleoli cotransportiert wird. Mit BRET-Studien ergaben, dass Orc6p mit TTF-I in vivo interagiert. Eine Interaktion mit TTFdeltaN185 war nicht nachweisbar. N2 - One task of this work was to analyze the localization and the dynamics of murine replication proteins in murine fibroblasts in vivo. Therefore, these proteins were expressed as EGFP fusion proteins and analyzed with a confocal laser scanning microscope in vivo. During G1 phase CDC6-EGFP was diffusely distributed throughout the cell. At entry into S phase an increased intensity of CDC6-EGFP staining was found throughout the nucleus, concurrent with the appearance of numerous foci. CDC6-EGFP localized during S phase in replication foci. Endogenous Cdc6p showed an identical cell cycle-specific distribution pattern as CDC6-EGFP in transfected cells. The distribution pattern of fusion proteins of human Cdc6p in HEK-293T was identical to that of murine CDC6-EGFP in L cells. FRAP experiments demonstrated that ~80-90% of CDC6-EGFP were stably associated with the replication apparatus during S phase. To investigate the influence of the phosphorylation status of the three Cdk sites on subcellular localization of CDC6-EGFP in vivo, these sites were mutated. Mutation of conserved serine residues within these consensus sites to nonphosphorylatable alanine residues had no effect on localization of corresponding mutants in replication factories, indicating that phosphorylation of these Cdk sites is dispensable for localization of CDC6-EGFP in replication factories. Mutation of serine residues to aspartates to mimic the negative charge of a phosphate indicated that phosphorylation of serine residue 102 mediates cytoplasmatic localization of CDC6-EGFP. FRAP studies of CDC6-EGFP mutants documented that serine residue 82 of CDC6-EGFP in replication factories was phosphorylated while serine residue 102 was non-phosphorylated. Interestingly, no colocalization of replication foci and acetylated proteins was observed, indicating hypoacetylation of chromatin in replication foci during DNA replication. Treatment of cells expressing CDC6-EGFP with TSA had no influence on localization and dynamics of CDC6-EGFP in replication foci. However, the mobility of the nucleoplasmatic pool of CDC6-EGFP was enhanced. The dynamics of CDC6-EGFP were reduced after TSA treatment during G1 phase. ORC1-EGFP accumulated in globular structures in the nucleus while ORC2-EGFP was diffusely distributed throughout the cells. ORC3-EGFP was localized in “PML nuclear bodies”. ORC4-EGFP and ORC5-EGFP were found to be localized at the centrosome. ORC6-EGFP accumulated in nucleoli. EGFP fusion proteins of Cdc45p, DNA ligase I and PCNA were diffusely distributed in the nucleus. Another task of this work was the identification of in vitro substrates of murine Cdc7p/Dbf4p kinase. Recombinant in Sf9 cells expressed Cdc7p/Dbf4p phosphorylated Orc2p, Orc6p, Cdc45p and Mcm6p in vitro. Phosphopeptide maps of phosphorylated Cdc7p revealed, that Cdc7p was phosphorylated by CyclinE/Cdk2 at one site, whereas CyclinA/Cdk2 phosphorylated Cdc7p at two different sites. CDC7-EGFP was diffusely distributed in the nucleus during G1 phase, G1/S and S phase. Using FISH chromosomal localization of mouse Cdc7 gene was mapped to chomosome 5, band 5E. To identify in vitro substrates of murine Plk1p, kinase assays were performed using pre-RC proteins as substrate. Recombinant in Sf9 cells expressed Plk1 kinase phosphorylated Cdc7p, Orc2p and Orc6p in vitro. Immunofluorescence studies indicated a colocalization of Plk1p with Cdc7p and Orc6p at midbody in telophase of mitosis. In the last part of this work, the mobility of murine transcription termination factor TTF-I was analyzed by FRAP. EGFP-tagged full-length TTF-I and EGFP-NRD were distributed throughout the whole nucleolus. The localization of EGFP-TTFdeltaN185, on the other hand, was more distinct. FRAP experiments with cells expressing EGFP-TTFdeltaN185 indicated the presence of a immobile fraction of ~10% while full-length EGFP-TTF-I was 100% mobile. The nucleolar protein TIP5 interacts with TTF-I. EGFP-TIP5 was freely distributed in the nucleus, whereas nucleolar regions were excluded from nuclear localization. Cotransfections of EGFP-TIP5 with EYFP-TTFdeltaN185 demonstrated, that EGFP-TIP5 was not coimported into nucleoli by EYFP-TTFdeltaN185. By use of BRET, protein-protein interactions between Orc6p and TTF-I were detected while interaction between Orc6p and TTFdeltaN185 were not observed. KW - Maus KW - Replikation KW - Proteine KW - DNA-Replikation KW - Cdc6 KW - FRAP KW - FLIP KW - BRET KW - DNA-replication KW - Cdc6 KW - FRAP KW - FLIP KW - BRET Y1 - 2004 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-10473 ER - TY - THES A1 - Stürmer, Andrea T1 - Interaktionen und Lokalisationen der Replikationsproteine der Maus T1 - Interactions and Localizations of murine Replication Proteins N2 - Die Initiation der DNA-Replikation in Eukaryonten ist ein hochkonservierter Prozess, der in drei Stufen unterteilt werden kann. Im ersten Schritt bindet der „origin recognition complex“ (ORC) an Replikationsorigins innerhalb chromosomaler DNA, wodurch eine Assemblierung des präreplikativen Komplexes an diesen Startpunkten ausgelöst wird. An den ORC lagern sich anschließend die Proteine CDC6 und RLF-B/CDT1 an, die beide schließlich für die Rekrutierung des heterohexameren MCM-Komplexes verantwortlich sind. Durch die Aktivität der Kinase CDC7/DBF4 wird der Origin für den Start der DNA-Replikation lizenziert, sobald die finale Anlagerung des Initiationsfaktors CDC45 den präreplikativen Komplex vervollständigt hat. Ein Ziel der vorliegenden Arbeit war es, das komplexe Netzwerk von Protein-Protein-Interaktionen zwischen den verschiedenen Initiationsfaktoren durch FRET-Studien aufzuklären. Es konnten Interaktionen zwischen MCM5 und MCM3, MCM5 und MCM7, ORC5 und MCM7, sowie CDT1 und MCM6 in vivo nachgewiesen werden. Die vorliegende Arbeit hatte weiterhin die Untersuchung der intrazellulären Lokalisation der sechs murinen MCM-Proteine in Fibroblasten-Zellen der Maus zum Ziel.Lokalisationsstudien der EGFP-gekoppelten MCM-Proteine zeigten, dass die Proteine EGFP-MCM4, MCM4-EGFP, MCM4-NLS-EGFP, EGFP-MCM5, MCM5-EGFP, MCM5-NLS-EGFP, und EGFP-MCM7 u.a. am Centrosom lokalisiert sind. Durch Immunfluoreszenz-Färbung mit Antikörpern gegen eine konservierte Domäne aller sechs MCM-Untereinheiten sowie mit spezifischen MCM3- und MCM6-Antikörpern konnte eine centrosomale Lokalisation auch für die endogenen Proteine nachgewiesen werden. Zusätzlich zu den Lokalisationsanalysen konnte über Immunpräzipitationsstudien gezeigt werden, dass MCM3 und MCM6 mit dem centrosomalen Protein g-Tubulin präzipitierbar sind. Die Tatsache, dass alle Untereinheiten des MCM-Komplexes mit dem Centrosom assoziiert sind, deutet darauf hin, dass die MCM-Proteine am Centrosom als Multiproteinkomplex gebunden sind. Da MCM3 und MCM6 auch in allen Mitose-Stadien an das Centrosom gebunden sind, kann von einer funktionellen Aufgabe dieser Proteine während der Zellteilung ausgegangen werden. Im letzten Teil dieser Arbeit sollte die Funktion der MCM-Proteine am Centrosom durch „knock-down“ des Proteins MCM3 mittels RNA-Interferenz-Studien untersucht werden. Ziel war, ein induzierbares MCM3-siRNA-exprimierendes System zu etablieren. Das gezielte An- und Abschalten der MCM3siRNA-Transkription sollte durch das TetOn-System ermöglicht werden. Bei diesem System wird durch Zugabe von Doxycyclin die Transkription aktiviert, bei Abwesenheit von Doxycyclin wird sie abgeschaltet. Auf dieser Basis wurde der Einfluss von Doxycyclin auf das Wachstumsverhalten der MCM3siRNA-exprimierenden Zelllinie untersucht. Im Vergleich zu NIH/3T3-Zellen und NIH/3T3-TetOn-Zellen konnte eine deutlich reduzierte Proliferation bei Behandlung der Zellen mit Doxycyclin beobachtet werden. Diese Ergebnisse deuten auf eine durch Produktion von MCM3siRNA verursachte Störung des Zellwachstums hin. Zusätzlich beeinflusst die durch Doxycyclin induzierte Synthese von MCM3siRNA die Zellzyklusverteilung. So befinden sich nach Doxycyclinbehandlung mehr Zellen in der G2/M-Phase als in unbehandelten, asynchronen NIH/3T3-Zellen. Die MCM3-Proteinmenge wurde nach 19 Tagen Doxycyclinbehandlung fast vollständig durch die produzierte MCM3siRNA herunterreguliert. Um einen möglichen Einfluss der MCM3siRNA auf andere MCM-Proteine zu untersuchen, wurde der Protein-Level von MCM6 analysiert. Dabei wurde eine vermehrte MCM6-Expression nachgewiesen. Diese Beobachtung deutet darauf hin, dass durch Bildung von MCM3siRNA der Expressions-Level von MCM6 beeinflusst wird. Auffällig häufig lagen in MCM3-„knock-down“-Zellen mehrere Zellkerne vor. Neben Zellen mit zwei Zellkernen finden sich auch Zellen mit einer ungeraden Anzahl an Zellkernen. Demnach durchlaufen die Zellkerne in einer Zelle unterschiedliche Zellzyklusstadien. Die Phänotypen, die nach Transkription der MCM3siRNA beobachtet wurden, sind komplex und zeigen Defekte in zahlreichen Mitose-Stadien. Das Auftreten multinukleärer Zellen ist auf eine fehlende Cytokinese zurückzuführen. Die Mikrotubuli waren in den MCM3-„knock-down“-Zellen nur unzureichend organisiert, wobei sie kaum mit der Zellperipherie verankert waren. Diese Resultate weisen darauf hin, dass die MCM-Proteine neben ihrer essentiellen Rolle in der Ausbildung des präreplikativen Komplexes eine zusätzliche Funktion in der Mitose ausüben. N2 - The initiation of DNA replication is a highly conserved process which is subdivided into three steps. The first step is the binding of the “origin recognition complex” (ORC) to the replication origins in chromosomal DNA which triggers the assembly of the prereplicative complex at the origins. Subsequently the proteins CDC6 and the RLF-B/CDT1 bind to ORC which are both responsible for the recruitment of the heterohexameric MCM-complex to the prereplicative complex (preRC). The kinase CDC7/DBF4 licenses the origin after completion of the preRC by binding of the CDC45 protein. One task of this work was to dissolve the complex network of protein-protein interactions between the different initiator proteins using the method of FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer). Interactions were found between MCM5 and MCM3, MCM5 and MCM7, ORC5 and MCM7 as well as between CDT1 and MCM6. A further task of this work was to study the intracellular localization of the six murine MCM proteins in murine fibroblasts.In a MCM2-EGFP expressing cell population multinucleated cells occurred frequently. This indicates an incorrect cell division caused by overexpression of MCM2-EGFP and to a possible role of MCM2 in mitosis. Inspecting the intracellular localization of EGFP-fused MCM-proteins was shown, that EGFP-MCM4, MCM4-EGFP, MCM4-NLS-EGFP, EGFP-MCM5, MCM5-EGFP, MCM5-NLS-EGFP, and EGFP-MCM7 were localized in the centrosomes. In contrast, the proteins MCM2-EGFP, EGFP-MCM2, MCM3-EGFP, EGFP-MCM3, MCM6-EGFP, MCM6-NLS-EGFP, MCM7-EGFP and MCM7-NLS-EGFP are not associated with centrosomes. The localization of endogeneous MCM proteins was analyzed by immunostaining using antibodies against a conserved region among all MCM proteins and also with specific antibodies against MCM3 and MCM6. Centrosomal localization was observed for the MCM proteins and in particular for MCM3 and MCM6. In addition to localization studies, immunoprecipitations showed that MCM3 and MCM6 precipitate with the centrosomal protein g-tubulin. The fact that all MCM proteins assemble at the centrosome, indicates that the MCM proteins act as a multiprotein complex at the centrosome. Since MCM3 and MCM6 are bound to centrosomes in all stages of mitosis these proteins may play a role in the progression of cell division. In the last part of this work, the function of MCM3 at the centrosome was analyzed by protein knock-down using the method of RNA interference. To approach this, an inducible MCM3siRNA-expressing system was established. Switching the transcription of MCM3siRNA on and off was made feasible using the TetOn-System. In this system the transcription is activated by addition of doxycycline, without doxycycline the transcription is switched-off. The influence of doxycycline on cell growth of the MCM3siRNA-expressing cell line was analyzed. By comparison to NIH/3T3 cells and NIH/3T3-TetOn cells a significantly reduced proliferation rate was observed after treatment with doxycycline. These results suggest a disturbance of cell growth by MCM3siRNA production. After treatment with doxycycline more cells are accumulated in G2/M phase compared to untreated cells. The expression of MCM3 was almost completely knocked-down by treatment of cells with doxycycline for 19 days. To analyze the influence of MCM3siRNA on other MCM proteins, the protein level of MCM6 was examined. An increased MCM6 expression was observed. This implies that MCM3siRNA influences the expression level of MCM6. More nuclei were frequently observed in MCM3 knocked-down cells. Cells with two nuclei as well as cells with an impaired number of nuclei were observed, indicating that probably the nuclei pass thruogh different cell cycle stages. Phenotypes observed after expression of MCM3siRNA showed defects in multiple stages of mitosis. The presence of multinucleated cells is apparently due to a blocked cytokinesis. Microtubuli were insufficiently organized and were deficiently bound to the cellular periphery. These results indicate an essential role of the MCM proteins in mitosis besides its described role in the establishment of the prereplicative complex. KW - Replikation KW - Maus KW - Proteine KW - Interaktion KW - Replikation KW - Lokalisation KW - Interaktion KW - Proteine KW - replication KW - localization KW - interaction KW - proteins Y1 - 2004 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-9563 ER - TY - THES A1 - Schulz, Carsten T1 - Analyse des Replikationsprozesses der Maus T1 - Analysis of the murine replication process N2 - Die Initiation der DNA-Replikation ist in Eukaryonten ein hochkonservierter Prozess. Zuerst bindet der „origin recognition complex“ (ORC) an Replikationsstartpunkte chromosomaler DNA und stellt das Startsignal für die Assemblierung des präreplikativen Komplexes (pre-RC) dar. Anschließend assoziieren die Initiationsfaktoren CDC6 und CDT1 mit dem ORC. Durch die Rekrutierung des MCM-Komplexes wird der pre-RC schließlich vervollständigt. Die Aktivität der CDC7/DBF4-Kinase und die Anlagerung von CDC45 lizensiert den Origin für die DNA-Replikation. Ein Ziel dieser Arbeit war, den vollständigen murinen ORC rekombinant darzustellen. Um den gesamten Komplex durch Copräzipitation zu isolieren, wurden ORC1, 3, 4, 5 und 6 als Wildtyp-Proteine und ORC2 mit einer N-terminalen Poly-His-Domäne mit Hilfe von Baculoviren koexprimiert. Nach der Aufreinigung konnten, mit Ausnahme von ORC3, alle ORC-Untereinheiten in den Elutionsfraktionen immundetektiert werden. Eine Gelfiltration der Fraktionen ließ auf die Isolierung eines 450 kD großen Komplexes schließen, der mindestens fünf der sechs ORC-Untereinheiten enthielt. Dies zeigt, dass der murine ORC als Holokomplex rekombinant isoliert werden kann. In einem weiteren Teil dieser Arbeit sollte die Rolle des MCM-Komplexes bei der Termination der DNA-Replikation am 3'-Ende muriner rDNA-Transkriptionseinheiten untersucht werden. Durch polare Replikationsgabelbarrieren im 3'-Bereich der ribosomalen Gene wird über die Kontrahelikaseaktivität von TTF-I die Bewegungsrichtung der Replikation auf die Richtung der Transkription limitiert. In dieser Arbeit sollte festgestellt werden, ob dies auch bei der murinen MCM4/6/7-Helikase der Fall ist. Um MCM4/6/7-Hexamere zu isolieren, wurden die Untereinheiten MCM4 und 7 in Wildtyp-Form und MCM6 mit einem N-terminal fusionierten HA-Tag mittels Baculoviren koexprimiert. Zur Durchführung der Kontrahelikasestudien musste die Helikaseaktivität der isolierten Komplexe ermittelt werden. Bereits mit kurzen partiell doppelsträngigen M13-Substraten (17 nt) zeigte sich eine geringere Entwindungsfähigkeit als in der Literatur beschrieben. Bei weiteren Helikasestudien wurden DNA-Substrate (30 nt) mit einem 5'-Überhang sowie SSB bzw. RPA eingesetzt. Zwar konnte so eine Steigerung der Helikaseaktivität von MCM4/6/7 verzeichnet werden, jedoch fand diese nicht in ausreichendem Maße statt. Zudem war das entwundene Oligonukleotid einem Abbau unterworfen, dessen Ursache nicht aufgeklärt werden konnte. Aufgrund der zu geringen Helikaseaktivität im Hinblick auf die TTF-I-Kontrahelikasestudien wurden diese Arbeiten eingestellt. Ein weiterer Aspekt dieser Arbeit war der Transport von MCM-Proteinen in den Zellkern. Der MCM-Komplex ist in fast allen Organismen konstitutiv im Zellkern lokalisiert. Die Überexpression einzelner exogener MCM-Proteine zeigte allerdings, dass nur MCM2 und 3 mit Hilfe ihrer ihrer NLS-Motive in den Kern transportiert werden, während dies bei MCM4 bis 7 nicht erfolgt. Two-Hybrid-Studien unserer Arbeitsgruppe ließen auf paarweise Wechselwirkungen der MCM4 bis 7-Untereinheiten mit MCM2 bzw. MCM3 schließen. Deshalb wurden EGFP-MCM-Proteine zusammen mit Wildtyp-MCM-Proteinen in Mauszellen koexprimiert. Dabei zeigte sich, dass MCM2 die Proteine MCM4, 6 und 7 in den Kern transportiert, während MCM3 nur MCM5 in den Zellkern einschleust. Weitere Interaktionen zwischen MCM6 und 4 sowie zwischen MCM6 und 7 konnten bei MCM4/6/7-Aufreinigungen beobachtet werden. Zuletzt wurde noch die Lokalisation von CDT1 in der OBR-Region des murinen rDNA-Cistrons untersucht. Bislang wurde nur in S. cerevisiae eine sequenzspezifische ORC-Bindung an ACS-Bereiche identifiziert. In unserer Arbeitsgruppe konnte im murinen rDNA-Cluster stromaufwärts des Transkriptionsstartpunktes ein Origin charakterisiert und die Bindungstelle verschiedener Initiatorproteine um die Position -2500 eingegrenzt werden. Die Assoziation von CDT1 mit derselben Region würde die Assemblierung eines pre-RC in dem untersuchten Bereich zusätzlich bestätigen. Zur Umsetzung von ChIP-Studien wurden CDT1-Antikörper hergestellt. Um die Assemblierung von CDT1 mit dem Origin in Abhängigkeit des Zellzyklus zu untersuchen, wurden FM3A-Mauszellen in früher G1-, später G1-, G1/S-, S- und in der G2/M-Phase arretiert. Die Auswertung der ChIP-Analysen, die den zu analysierenden Bereich von -2837 bis -1820 umspannten, zeigte, dass CDT1 ausschließlich während der G1-Phase mit dem Chromatin assoziiert ist. Dies ist konsistent mit der Aktivität von CDT1 während des Zellzyklus in Säugern. Der höchste Anteil an DNA-gebundenem CDT1 konnte in dem Bereich -2519 bis -2152 festgestellt werden. Eine Sequenzanalyse des OBR der murinen rDNA lieferte keine Homologie zu anderen bekannten Origins. Jedoch wurden diverse DNA-Strukturelemente, wie z.B. HSS, DUEs oder CpG-Inseln, sowie verschiedene Protein-Bindungsstellen gefunden, die potentiellen Einfluss auf die Festlegung des murinen OBR haben könnten. N2 - The eukaryotic initiation of DNA replication is a highly conserved process. In the first step the binding of the "origin recognition complex" (ORC) to replication origins of chromosomal DNA acts as a start signal for the assembly of the pre-replicative complex (pre-RC). Subsequently the initiation factors CDC6 and CDT1 associate with ORC. The following recruitment of the MCM complex finally completes the pre-RC. The activity of the CDC7/DBF4 kinase and the binding of CDC45 license the origin and allow the initiation of DNA replication. One aim of this work was to purify a recombinant murine ORC. In order to isolate the entire complex by co-precipitation, wild-type ORC1, 3, 4, 5 and 6 and ORC2 that contained a His6 epitope tag at its N-terminus were co-expressed by means of baculoviruses. After the following purification, all ORC subunits with the exception of ORC3 were detected in the isolated fractions by immunoplotting. Analysis of the fractions after gel filtration indicated the isolation of a large complex corresponding to a molecular mass of 450 kD, which contained at least five of the six ORC subunits. Therefore, we assume that the recombinant murine ORC was isolated as a holo-complex. A further part of this work deals with the role of the MCM complex in the termination of DNA replication at the 3' end of murine rRNA transcription units. Polar replication fork barriers in the 3' region of ribosomal genes limit progression of DNA replication to the same direction as rDNA transcription by the contrahelicase activity of TTF-I. In this study it should be determined whether murine MCM4/6/7 helicase activity is impaired in the same manner. In order to isolate hexameric MCM4/6/7 complexes wild-type MCM4 and MCM7 proteins and MCM6 with an N-terminal fused HA epitope tag were coexpressed by means of baculoviruses. For contrahelicase experiments, the helicase activity of the isolated complexes had to be obtained. The unwinding activity of short partial duplex M13-substrates (17 nt) was lower than described in literature. For subsequent contrahelicase studies DNA substrates (30 nt) with a 5' tail as well as SSB or RPA were applied. Though it was possible to increase the helicase activity of MCM4/6/7 by forked DNA substrates, this was not sufficient for our studies. Moreover, the unwound oligonucleotide was subjected to degradation, the cause of which could not be explained. The work on this topic was stopped since the helicaseactivity of MCM4/6/7 was insufficient regarding further TTF-I contrahelikase studies. A further aspect of this work was the transport of MCM proteins into the nucleus. The MCM complex is constitutively located in the nucleus of almost all organisms. However, the overexpression of individual ectopically expressed MCM proteins showed that only MCM2 and 3 are transported into the nucleus due to their NLS motives, while this is not possible for MCM4 to 7. Two-hybrid studies of our group suggested pairwise interactions of MCM4, 6, 5 and 7 with MCM2 and/or MCM3. Therefore, various EGFP-MCM proteins were coexpressed together with wild-type MCM proteins in mice cells. It was shown that MCM2 directs MCM4, 6 and 7 into the nucleus, whereas MCM3 transfers only MCM5 into the nucleus. This behaviour reflects possible pairwise interactions within MCM subcomplexes. Further interactions of MCM6 with MCM4 and MCM7 were observed at MCM4/6/7 purifications described above. Further the cell cycle-dependent localization of CDT1 in the OBR region of the murine rRNA transcription unit was examined. So far only in S. cerevisiae a sequence-specific ORC assembly at the ACS region has been identified. In our group a murine OBR has been characterized upstream to the rDNA transcription start site und the binding site of various initiation factors has been localized around position -2500. The association of CDT1 within the same region would confirm the assembly of a pre-RC. For ChIP studies monospecific antibodies against CDT1 have been produced. In order to examine the cell cycle-dependent assembly of CDT1 within the initiation site, FM3A cells were arrested in early G1 phase, in late G1 phase, at the G1/S transition, in S phase and in the G2/M phase. The evaluation of the ChIP studies, which encompassed the range from -2837 to -1820 revealed, however, that CDT1 is associated with the chromatin exclusively during the G1-Phase. This is consistent with the activity of CDT1 during the cell cycle in mammalian cells. The major part of DNA-bound CDT1 was observed within the range -2519 to -2152. The sequence of the murine OBR exhibits no homology to other origins described in the literature. But sequence analysis revealed various DNA structure elements, e.g. HSS, DUEs or CpG islands, as well as several protein binding sites of potential importance for determination of the murine OBR. KW - Maus KW - Replikation KW - Replikationsursprung KW - Replikation KW - Initiation KW - ORC KW - MCM KW - CDT1 KW - replication KW - initiation KW - ORC KW - MCM KW - CDT1 Y1 - 2004 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-11199 ER -