TY - THES A1 - Dunkel, Marcel T1 - Untersuchungen zur Translokation und Funktion von Tandem-Poren Kaliumkanälen der TPK-Familie aus Arabidopsis thaliana T1 - Targeting and function of Arabidopsis thaliana tandem pore potassium channels belonging to the TPK family N2 - • Die Modellpflanze der Pflanzenphysiologen, Arabidopsis thaliana, besitzt mindestens 15 verschiedene kaliumselektive Kanäle, von denen 5 der Strukturklasse der Tandemporen-Kaliumkanäle angehören und daher TPK-Kanäle genannt werden. • Tandemporenkanäle findet man nur bei eukaryontischen Organismen. Die pflanzlichen Tandemporen Kaliumkanäle haben einen gemeinsamen phylogenetischen Ursprung und unterscheiden sich von den Tierischen und denen der Pilze und Einzeller. Die pflanzlichen TPK-Kanäle lassen sich wiederum in die TPK1-Unterfamilie und die TPK2-Unterfamilie unterteilen. Die weitere Evolution der TPK2-Unterfamilie von A. thaliana, TPK2, TPK3, TPK4 und TPK5, lässt sich eindeutig auf bestimmte Duplikationsereignisse im Genom von A. thaliana und dessen Ahnen zurückführen. Auch der Ein-Poren Kaliumkanal KCO3 geht sehr wahrscheinlich auf die Duplikation des TPK2 und einer anschließenden Deletion und nicht auf einen der prokaryontischen Ein-Poren-Kaliumkanal-Prototypen zurück. • Vier der A. thaliana TPK-Kanäle (TPK1, 2, 3 und 5) lokalisieren in der Vakuolenmembran, während einer, TPK4, zum großen Teil im ER, aber auch in der Plasmamembran zu finden ist. Die Translokation des TPK1 folgt dem sekretorischen Pfad vom ER, durch den Golgi und möglichen intermediären Kompartimenten hin zur Membran der lytischen Vakuole. Von entscheidender Bedeutung ist dabei der zytoplasmatische Carboxy-Terminus (CT) des TPK1. Deletionsmutanten des TPK1 CT zeigen, dass die Translokation mindestens zwei Sortierungsschritten, am Ausgang des ER und des Golgi, unterliegt. Fehlt der CT komplett bleibt der Kanal im ER. Die Sortierungssignale des TPK1 CT konnten auf die EF-Hand Domäne I eingegrenzt werden. Anschließende Punktmutationen in diesem Bereich konnten zeigen, dass TPK1 in der eigentlich für die Ca2+ Bindung zuständigen Domäne ein di-azidisches ER-Export Motiv bestehend aus Asparaginsäure, Leucin und Glutaminsäure enthält. Andere Arbeiten legen nahe, dass der Mechanismus des ER-exports von TPK1 auf der Interaktion mit COPII Vesikelhüllproteinen beruht; TPK1 also in Vesikel sortiert wird, die sich am ER abschnüren und mit dem cis-Golgi fusionieren. Der Vergleich mit anderen pflanzlichen TPK Kanälen lässt vermuten, dass TPK1 Orthologe, nicht aber die A. thaliana Homologen ein di-azidisches ER-Exportmotiv besitzen. Die Translokation des TPK3 erwies sich dementsprechend als unabhängig von dessen CT. Weitere Experimente schließen außerdem eine Beteiligung der 14-3-3 Bindung an der Translokation aus. • TPK4 ist der einzige TPK der heterolog in Xenopus Oozyten funktionell exprimiert werden kann. Wie Mutationen an einem essentiellen Aspartat (Asp86, Asp200) in der Pore zeigten, sind beide tandem repetierten Porendomänen einer Kanaluntereinheiten an der Porenbildung beteiligt. Somit formt sich TPK4 ähnlich wie die tierischen TPK-Kanäle voraussichtlich aus zwei Untereinheiten. Ein Austausch der zweiten Porendomäne von TPK4 konnte zeigen, dass TPK2, TPK3 und TPK5, mit ihrer zweiten Porendomäne und TPK4 mit seiner ersten Porendomäne den TPK4 zu einem funktionellen Kaliumkanal komplementieren können. Da keine der TPK4 Eigenschaften, außer geringfügig die relative Permeabilität für Rb+, verändert wurde, kann man absehen, dass die homologen TPK2, TPK3 und TPK5 als instantan aktivierte, spannungsunabhängige Kaliumkanäle der Vakuolenmembran fungieren. Dazu kommt wahrscheinlich ähnlich wie bei TPK1 ein 14-3-3 und Ca2+ abhängiges Öffnen und Schließen. • Weiterführende elektrophysiologische Untersuchungen am TPK4 zeigten eine Beteiligung einer transmembranen Asparaginsäure (Asp110) an der Kaliumpermeation und der schwachen Einwärtsgleichrichtung. Der Aspartatrest ist in die wassergefüllte Aussparung der zytoplasmatischen Porenhälfte orientiert. Damit kann er über ionische Wechselwirkungen sowohl Kalium in der Pore konzentrieren als auch potentielle Kanalblocker wie Mg2+ oder Polyamine binden. Die Konservierung des Aspartats unter anderem bei TPK2, TPK3 und TPK5 deutet daraufhin, dass auch die vakuolären TPK-Kanäle eine Einwärtsgleichrichtung vermitteln, die auf einem spannungsabhängigen Block von zytoplasmatischer Seite basiert. • Im Gegensatz zum zytoplasmatischen Block ist das Schließen des TPK4 durch zytoplasmatische Ansäuerung spannungsunabhängig und ist daher von einer Protonierungsreaktion abhängig. Über zahlreiche Deletionen und Chimären des TPK4 wurde der Bereich, in dem sich pH-Sensor und pH-Tor befinden, auf den Bereich zwischen transmembranen und zytoplasmatischen Domänen eingegrenzt. Darüber hinaus fungieren Histidine nicht als pH-Sensor. N2 - • The model plant Arabidopsis harbours 15 genes encoding potassium selective channels. Five of them belong to the structural class of tandem-pore K+ channels and are therefore called TPK channels. • Blast searches revealed the occurrence of TPK channels in many eucaryots, but not in procaryots. Plant TPK channels cluster in a phylogenetic analysis and branch into a TPK1- and a TPK2-subfamily. The evolution Arabidopsis TPK2-subfamily members (TPK2, TPK3, TPK4, and TPK5) can be attributed to distinct large-scale duplication events in ancestral genomes. Further more phylogenetic analysis showed the relatedness of the one-pore potassium channel KCO3 to TPK2. • The trafficking of the four vacuolar membrane intrinsic TPK channels (TPK1, TPK2, TPK3, and TPK5) utilizes the secretory path, from the endoplasmic reticulum (ER), via Golgi apparatus and maybe intermediate compartments to the lytic vacuole. The carboxy terminus (CT) of TPK1 was critically involved in both ER and Golgi sorting steps. The minimal requirement for vacuolar localisation was the proximal CT up to the Ca2+-binding EF-hand I. Due to mutational analyses one of several di-acidic motifs consisting of aspartate, leucin, and glutamate (aa 296-298) could be identified as the essential ER-export motif. By this TPK1 likely interacts with the coat of COPII vesicles, which adopt the ER to Golgi transport. Like TPK1 the orthologs of the TPK1-subfamily, but not the Arabidopsis homologs, exhibit the same di-acidic motif. In agreement vacuolar trafficking of TPK3 was independent of its CT. • TPK4 is the solely plasma membrane integral AtTPK channel and thus its currents can be recorded at the plasma membrane of Xenopus leavis oocytes. Mutation of in plant TPK channels perfectly conserved pore aspartates (D86N; D200N) knock-out TPK4 channel function and suggest a dimeric assembly similar to that of animal tandem-pore channels. Employing TPK4 as matrix for the expression of the pore domains of the vacuolar TPKs in Xenopus oocytes, I could show the capability of TPK2, TPK3 and TPK5 to complement TPK4. Therefore these channels probably form instantaneous, voltage-independent and potassium selective channels in the vacuolar membrane. Existence of one 14-3-3 binding motif each and one EF-hand (except TPK5) implicates Ca2+ and 14-3-3 dependent activation of those channels like seen for TPK1. • Further combination of structural, mutational and electrophysiological analyses led to the identification of another pore aspartat (Asp 110) essential for the potassium permeation and responsible for the inward rectification. The charged side chain of this Asp 110 faces the water cavity and thus could concentrate and coordinate potassium in the pore as well as interact with cationic blockers like e.g. Mg2+ or polyamine. Again, conservation among the Arabidopsis TPK2-subfamily members suggests that the vacuolar TPKs (except TPK1) are regulated by cytoplasmic blockers and exhibit weak inward rectifiying properties, too. • In contrast to inward rectification current reduction due to cytoplasmic acidification is voltage-independent and thus likely protonation dependent. Due to chimera and deletion mutants of TPK4 the possible sites of the pH-Sensor as well as the gate could be narrowed down to a few residues in the transition zone of transmembrane and cytoplasmic domains, but the essential residues remain elusive. KW - Vakuole KW - Translokation KW - Endoplasmatisches Retikulum KW - Kaliumkanal KW - TPK KW - KCO KW - ER-Export KW - diazidisches Motiv KW - DEVC KW - particle bombardment KW - double electrode voltage clamp KW - targeting Y1 - 2008 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-34743 ER - TY - THES A1 - Krause, Diana T1 - Transport der Hauptosmotika an der vakuolären Membran von Schließzellen T1 - Transport of the main osmotic substances on the vacuolar membrane of guard cells N2 - Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurden neue Einblicke bezüglich des Transport-prozesses vakuolärer Protonenpumpen, Zuckertransporter und des SV-Kanals von Arabidopsis thaliana gewonnen: 1. Mittels Patch-clamp-Technik wurden ATP- und Pyrophosphat-induzierte Pump-ströme an Mesophyllvakuolen des Wildtyps gemessen. Die durch ATP hervor-gerufenen Pumpströme konnten durch den spezifischen V-ATPase-Inhibitor Concanamycin A vollständig inhibiert werden. Messungen an der V-ATPase-Doppelmutante vha-a2-vha-a3 hingegen zeigten eine kaum vorhandene ATPase-Aktivität auf. Die vakuoläre Pyrophosphatase-Aktivität der vha-a2-vha-a3-Mutante war mit dem WT vergleichbar und konnte die verminderten Pumpströme der V-ATPase nicht kompensieren. Zudem wurde an A. thaliana WT-Pflanzen die Expressionsrate und Pumpstromdichte der V-ATPase von Schließzellen und Mesophyllzellen untersucht. Dabei konnte bei Schließzellen eine höhere Expressionsrate sowie Pumpleistung im Vergleich zu Mesophyllzellen detektiert werden, wodurch an der vakuolären Membran von Schließzellen eine starke protonenmotorische Kraft generiert werden kann. 2. Des Weiteren wurden die Transporteigenschaften des im Tonoplasten lokalisierten Transportproteins AtINT1 an Arabidopsis Mesophyllzellen des Wildtyps näher untersucht. Unter inversen pH-Wert-Bedingungen konnte AtINT1 als Symporter identifiziert werden, welcher myo-Inositol H+-gekoppelt aus der Vakuole in das Cytosol transportiert. 3. Überdies wurde eine elektrophysiologische Charakterisierung des AtSUC4-Transporters durchgeführt. Unter einem physiologischen Protonengradienten konnte bei WT- und Atsuc4.1-Vakuolen ausschließlich ein Saccharose/H+ ge-triebener Antiportmechanismus detektiert werden. Im Gegensatz dazu zeigten 60 % der AtSUC4-ÜE unter inversen pH-Gradienten während Saccharose-Applikation Ströme, die auf einen Saccharose/H+-Symportmechanismus hinweisen. Bei der Atsuc4.1-Verlustmutante hingegen konnten unter gleichen Lösungsbedingungen ausschließlich Ströme detektiert werden, die mit einem Saccharose/H+-gekoppelten Antiportmechanismus in Einklang zu bringen sind. Durch die Erkenntnisse der Arbeitsgruppe unter Norbert Sauer, Universität Erlangen, wird die Vermutung untermauert, dass AtSUC4 Saccharose im Symport mit H+ aus der Vakuole in das Cytosol transportiert und somit eine Rolle bei der Remobilisierung der in der Vakuole gespeicherten Saccharose übernimmt. 4. Darüber hinaus konnten Studien am nichtselektiven spannungsabhängigen „slow-vacuolar-channel“ (SV-Kanal) von Arabidopsis Mesophyllvakuolen durchgeführt werden. Dabei wurde das 14-3-3-Protein GRF6 als regulatorisches Protein identifiziert, welches die SV-Kanalaktivität stark verringert. Die gain-of-function Mutante fou2 mit der Punktmutation D454N im TPC1-Kanalprotein zeigt abweichende Kanaleigenschaften zum WT auf. Das Aktivie-rungspotential des fou2-SV-Kanals liegt bei 30 mV negativeren Membranspan-nungen, was die Offenwahrscheinlichkeit des SV-Kanals unter physiologischen Membranspannungen erhöht. Die fou2-Mutation beeinflusst außerdem die luminale Ca2+-Bindestelle des SV-Kanals, wodurch die Affinität bzgl. luminalem Ca2+ geringer ist und die fou2-SV-Kanalaktivität bei hohen luminalen Ca2+-Konzentrationen bestehen bleibt. Die absolute Offenwahrscheinlichkeit des WT-SV-Kanals nimmt mit Ansäuern des vakuolären Lumens im Gegensatz zum fou2-SV-Kanal stark ab, die Einzelkanalleitfähigkeit des WT- als auch des fou2-SV-Kanals dagegen zu. Anhand der durchgeführten Messungen konnte eine regulatorische, vakuolär gelegene Ca2+-Bindestelle des TPC1-kodierten Kanals lokalisiert und charakterisiert werden, welche sich vermutlich nahe am Spannungssensor befindet und unter physiologischen Membranspannungen einen einwärtsgerichteten Kationenstrom ermöglicht. 5. Ferner wurden SV-Kanäle von Schließzellen untersucht und deren spezifische Eigenschaften mit Mesophyll-SV-Kanälen verglichen. In Schließzellen liegt neben einer erhöhten Transkriptmenge des single-copy Gens TPC1 eine höhere Stromdichte des SV-Kanals vor. Unter einwärtsgerichtetem K+-Gradienten liegt das Aktivierungspotential von Schließzell-SV-Kanäle um 30 mV negativer als bei Mesophyllvakuolen, was unter physiologischen Membranspannungen zu einem ausgeprägtem K+-Einstrom führt. Darüber hinaus zeigte der Schließzell-SV-Kanal eine höhere Permeabilität von Na+- gegenüber K+-Ionen (1,3:1) auf. Während Schließzell- und Mesophyll-SV-Kanäle eine vergleichbare luminale Ca2+-Sensitivität aufweisen, zeigen Schließzell-SV-Kanäle eine höhere cytosoli-sche Ca2+- und vakuoläre pH-Sensitivität auf. Sequenzanalysen der TPC1-cDNA zeigten, dass die Zelltypspezifischen Unterschiede des SV-Kanals nicht durch posttranskriptionale Modifikation hervorgerufen werden. N2 - As an output of this dissertation, the following new insights into vacuolar transport pro-cesses of proton pumps, sugar transporters and slow vacuolar channels (SV-channels) via the patch clamp technique were gained: 1. The vacuolar V-ATPase of A. thaliana mesophyll cells of the WT as well as of the double mutant vha-a2-vha-a3 were analyzed. The specific V-ATPase-inhibitor concanamycin A inhibits the WT V-ATPase activity completely. In vha-a2-vha-a3 mutant the V-ATPase activity was completely absent and shows no ATP induced H+ currents. However, the vacuolar vha-a2-vha-a3 pyrophosphatase current density was indistinguishable from the WT and could not compensate the missing V-ATPase pump currents. Additionally, the V-ATPase expression rate and H+ currents of A. thaliana guard cells and mesophyll cells were examined. In guard cells the expression rate as well as the pump currents were higher compared to mesophyll cells which resulted in a stronger proton motive force. 2. Furthermore, the transport mechanism of the vacuolar membrane protein AtINT1 was studied on Arabidopsis WT mesophyll cells. At high vacuolar and low cytoplasmic pH values AtINT1 could be identified as an H+/inositol symporter. These data was confirmed by further measurements of the mutant lines Atint1.1 and Atint1.2. After application of myo-inositol the currents were completely absent in Atint1.1 and strongly reduced in the Atint1.2 mutant. 3. Besides transport characteristics of the tonoplast localized AtSUC4 protein was analyzed. After application of cytosolic sucrose, WT as well as Atsuc4.1 vacuoles showed an H+/sucrose driven Antiport mechanism in presence of physiological H+-gradient. However, in the presence of an inverse pH gradient, 60 % of the AtSUC4-overexpressing mutant showed sucrose induced currents indicating an H+/sucrose Symport mechanism of the AtSUC4 transport protein. Corresponding currents could not be detected in AtSUC4 less vacuoles (Atsuc4.1). In the inverse system sucrose induced currents of the Atsuc4.1 mutant were in accordance with an H+/sucrose coupled antiport mechanism. These patch clamp measurements confirm the findings of the working group of Norbert Sauer, University of Erlangen. AtSUC4 acts as a symporter by transporting sucrose coupled with H+ out of the vacuole into the cytosol and therefore plays a role in the remobilization of stored vacuolar sucrose. 4. Additionally the non-selective voltage dependent slow vacuolar channel (SV channel) of Arabidopsis mesophyll vacuoles was electrophysiologically characterized. Thereby the 14-3-3 protein GRF6 could be identified as a regulatory protein of the SV channel, which down-regulates the SV channel activity. The gain-of-function mutant fou2 containing the point mutation D454N on the vacuolar lumen side of the SV channel protein, shows different channel proper-ties compared to WT. The fou2 channel activation was shifted to 30 mV more negative membrane potentials which resulted in higher open probability than WT SV channels. The fou2 mutation also affected the luminal Ca2+ binding site of the SV channel and lowered the affinity to vacuolar Ca2+. fou2 channel activity remained high even at inhibitory vacuolar Ca2+ concentrations. The WT SV channel open probability decreased strongly with luminal acidification in contrast to fou2. However, the single channel conductance of WT and fou2 SV channels increased. The regulatory vacuolar Ca2+ binding site of the TPC1 channel seems to be located nearby the voltage sensor and enables a pronounced fou2 inward current under physiological membrane voltages. 5. The A. thaliana guard cell SV channel features were compared with mesophyll cells. In guard cells the transcript number of the single copy gene TPC1 was elevated which resulted in a higher SV current density than in mesophyll cells. When the K+ gradient was directed out of the vacuolar lumen the guard cell SV channel activated at about 30 mV less negative voltages compared to mesophyll cells and mediated distinct inward currents. The guard cell SV channel showed permeability for Na+ over K+ (1,3:1). SV channels from guard cells and mesophyll cells exhibited comparable luminal Ca2+ sensitivities. However, the guard cell SV channel is more sensitive to cytosolic Ca2+ and vacuolar pH. Sequence analyses of the TPC1 cDNA showed that the varying features of the guard cell and mesophyll cell SV channels are not related to posttranscriptional modifications. KW - Ackerschmalwand KW - Schließzelle KW - Vakuole KW - Saccharose KW - Inosite KW - Spannungskontrollierter Ionenkanal KW - Protonenpumpe KW - AtTPC1 KW - AtSUC4 KW - Protonenpumpe KW - Vakuole KW - Schließzelle KW - AtTPC1 KW - AtSUC4 KW - proton pump KW - vacuole KW - guard cell Y1 - 2012 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-75043 ER - TY - THES A1 - Reuter-Weissenberger, Philipp T1 - The role of a fungal-specific transcription regulator on vacuolar biology and host interaction in \(Candida\) \(albicans\) T1 - Die Rolle eines pilzspezifischen Transkriptionsfaktors für die Vakuole und Wirtsinteraktion von \(Candida\) \(albicans\) N2 - Microorganisms that colonize the human body face large fluctuations in their surroundings. Therefore, those microbes developed sophisticated mechanisms that allow them to adapt their cell biology and maintain cellular homeostasis. One organelle vital to preserve cell physiology is the vacuole. The vacuole exhibits a wide range of functions and is able to adjust itself in response to both external and internal stimuli. Moreover, it plays an important role in host interaction and virulence in fungi such as Candida albicans. Despite this connection, only a few regulatory proteins have been described to modulate vacuolar biology in fungal pathogens. Furthermore, whether such regulation alters fungus-host interplay remains largely unknown. This thesis focuses on the characterization of ZCF8, a fungus-specific transcription regulator in the human-associated yeast C. albicans. To this end, I combined genome-wide protein-DNA interaction assays and gene expression analysis that identified genes regulated by Zcf8p. Fluorescence microscopy uncovered that several top targets of Zcf8p localize to the fungal vacuole. Moreover, deletion and overexpression of ZCF8 resulted in alterations in vacuolar morphology and in luminal pH and rendered the fungus resistant or susceptible to a vacuole-disturbing drug. Finally, in vitro adherence assays showed that Zcf8p modulates the attachment of C. albicans to human epithelial cells in a vacuole-dependent manner. Given those findings, I posit that the previously uncharacterized transcription regulator Zcf8p modulates fungal attachment to epithelial cells in a manner that depends on the status of the fungal vacuole. Furthermore, the results highlight that vacuolar physiology is a substantial factor influencing the physical interaction between Candida cells and mammalian mucosal surfaces. N2 - Mikroorganismen, die den Menschen besiedeln, sind großen Schwankungen in ihrer Umgebung ausgesetzt. Daher haben sie ausgeklügelte Mechanismen entwickelt, die es ihnen ermöglichen, ihre Zellbiologie anzupassen und die zelluläre Homöostase aufrechtzuerhalten. Eine für die Aufrechterhaltung der Zellphysiologie wichtige Organelle ist die Vakuole. Sie verfügt über ein breites Spektrum an Funktionen und ist in der Lage, auf externe und interne Stimuli zu reagieren. Außerdem spielt dieses Organell eine wichtige Rolle bei der Pilz-Wirt-Interaktion und somit für die Pathogenität von Pilzen wie Candida albicans. Trotz dieses Zusammenhangs wurden bisher nur wenige regulatorische Proteine beschrieben, welche die Biologie der Vakuolen in pathogenen Pilzen modulieren. Zudem ist weitgehend unbekannt, ob eine solche Regulierung das Zusammenspiel von Pilz und Wirt verändert. Diese Arbeit konzentriert sich auf die Charakterisierung von ZCF8, einem pilzspezifischen Transkriptionsregulator in der pathogenen Hefe C. albicans. Zu diesem Zweck wurden Protein-DNA-Interaktionstests und Genexpressionsanalysen kombiniert, um Gene zu identifizieren, die direkt von Zcf8p reguliert werden. Fluoreszenzmikroskopie zeigte zudem, dass mehrere der wichtigsten Ziele von Zcf8p in der Pilzvakuole lokalisiert sind. Darüber hinaus führte die Deletion und Überexpression von ZCF8 zu Veränderungen der Morphologie und des luminalen pH-Werts der Vakuole, und veränderte die Sensitivität des Pilzes gegenüber Stoffen, welche Funktionen der Vakuole beeinträchtigen. Schließlich deuteten In-vitro-Adhärenztests daraufhin, dass Zcf8p die Anheftung von C. albicans an menschliche Epithelzellen auf eine Weise moduliert, die abhängig von der Vakuole ist. Angesichts dieser Ergebnisse kann davon ausgegangen werden, dass der bisher unbekannte Transkriptionsregulator ZCF8 die Interaktion zwischen Pilz- und Epithelzellen des Wirts kontrolliert, und das auf eine Weise, die von der Pilzvakuole abhängig ist. Des Weiteren, unterstreichen die Ergebnisse, dass die Physiologie der Vakuole ein wesentlicher Faktor ist, welcher die Interaktion zwischen C. albicans und dem Wirt beeinflusst. KW - Vakuole KW - Transkriptionsfaktor KW - Candida albicans KW - vacuole KW - host colonization KW - Candida albicans KW - transcription regulator Y1 - 2022 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-259287 ER - TY - THES A1 - Schulz, Alexander T1 - Molekulare Mechanismen des protonengekoppelten Zuckertransportes in Mesophyllvakuolen von Arabidopsis thaliana T1 - Molecular mechanism of the proton-coupled sugar transport in mesophyll vacuoles of Arabidopsis thaliana N2 - Im Rahmen dieser Arbeit konnten neue Erkenntnisse zum Zuckertransport über die Vakuolenmembran von Arabidopsis thaliana sowie dessen Energetisierung durch die V-ATPase erlangt werden. Hierfür wurden Patch-Clamp-Experimente konzipiert, die eine direkte Erfassung der Transportmechanismen, Transporteigenschaften sowie Triebkräfte des vakuolären Zuckertransportes ermöglichten. Zusätzlich wurden Lokalisations- und Interaktionsstudien zu ausgewählten Transportern mit Hilfe der konfokalen Laser Scanning Mikroskopie durchgeführt. Im Einzelnen wurden folgende Aspekte hinsichtlich des pflanzlichen Zuckertransports und dessen Energetisierung bearbeitet. Mittels der Patch-Clamp-Technik konnten vakuoläre glucose- und saccharose-induzierte Protonen-Transportkapazitäten in Mesophyllvakuolen von Wildtyp-pflanzen aufgelöst werden, die eindeutig einen Antiportmechanismus für beide Zucker zur Beladung der Vakuole vorschlagen. Dabei zeigten die Glucose- und Saccharoseantiporter eine geringe Affinität und hohe Transportkapazität für den jeweiligen Zucker. Auf molekularer Ebene konnte die protonengekoppelte Glucose- und Saccharoseaufnahme in die Vakuolen maßgeblich dem putativen Monosaccharid¬transporter AtTMT1/2 zugeordnet werden, der folglich als erster Glucose-Saccharose/Protonen-Antiporter identifiziert wurde. Im Zuge dieser Untersuchungen wurden der Zucker- und der pH-Gradient als Triebkräfte der Zuckertransportaktivität herausgearbeitet. In diesem Zusammenhang konnte ferner ein Beitrag zur quan¬titativen Charakterisierung der V-ATPase geleistet werden, welche den Einfluss der V-ATPase aufgrund ihrer pH-abhängigen H+-Pumpaktivität auf die pH-Homöostase belegt. Demzufolge scheint die V-ATPase als pH-regulierter Energielieferant für die Zuckertransporter zu fungieren. Darüber hinaus wurde die mitogenaktivierte Proteinkinase AtVIK1 als potentieller Regulationsfaktor von AtTMT1 identifiziert. Dies gelang durch den Nachweis einer spezifischen physikalischen Interaktion zwischen AtTMT1 und AtVIK1 mittels der Bimolekularen Fluoreszenzkomplemen¬tation. Neben der AtTMT1/2-vermittelten Aufnahme der beiden Zucker Glucose und Saccharose wurde ebenso die Zuckerentlassung aus der Vakuole näher charakterisiert. Mit Hilfe vergleichender Patch-Clamp-Analysen von verschiedenen Zuckertransporter-Verlustmutanten konnte AtERDl6 als Glucose/Protonen-Symporter identifiziert werden, der sich für den Glucoseexport aus der Vakuole verantwortlich zeigt. In Bezug auf den Saccharosetransport aus der Vakuole konnte erstmals die Saccharose/Protonen-Symportfunktion von AtSUC4 in planta nach dessen transienter Überexpression in Zuckertransporter-Verlustmutanten eindeutig aufgelöst und nachgewiesen werden. Desweiteren offenbarten die hier erlangten Ergebnisse bezüglich der Glucose/Saccharose-Beladung und -Entladung von Mesophyllvakuolen, dass weitere protonengekoppelte Zuckertransporter, neben AtTMT1/2 and AtERDl6, in diesem Zelltyp existieren, deren molekulare Natur es jedoch noch gilt herauszufinden. N2 - This work provides new insights into the sugar transport across the vacuolar membrane of Arabidopsis thaliana and its energization by the V-ATPase. For this, patch-clamp experiments were specifically designed enabling low-resolution current recordings for the direct detection and characterization of the transport mechanisms, transport properties and driving forces of the vacuolar sugar transport. In addition, localization and interaction studies on selected transporters have been performed by using the confocal laser scanning microscopy. In particular, following aspects of plant sugar transport and its energization were studied. In patch-clamp experiments on mesophyll vacuoles of wild type plants, prominent glucose- and sucrose-induced proton transport capacities were resolved, which could be clearly related to an antiport mechanism used for loading the vacuole with both sugars. Thereby, the vacuolar glucose and sucrose antiporter showed a low-affinity and a high transport-capacity for the respective sugar. On the molecular level, the proton-coupled uptake of both sugars, glucose and sucrose, into the vacuole could be mainly associated with the putative monosaccharide transporter AtTMT1/2, which was consequently identified as the first glucose-sucrose/proton-antiporter. In the course of these studies, the sugar- and the pH-gradient were revealed as driving forces of the sugar transport activity. In this context, a contribution was made to a quantitative characterization of the V-ATPase that proved the influence of the V-ATPase on the pH homeostasis based on the pH dependency of the H+-pump activity. Hence, the V-ATPase seems to function as a pH-regulated energy source for the sugar transporters. Moreover, a specific physical interaction between AtTMT1 and the mitogen-activated protein kinase AtVIK1 was detected via bimolecular fluorescence complementation assays identifiying AtVIK1 as a potential regulatory factor of AtTMT1. Beside the AtTMT1/2-mediated glucose and sucrose uptake into the vacuole, the sugar release from the vacuole was also characterized. By means of comparative patch-clamp studies on mutants lacking different sugar transporters, AtERDl6 was identified as glucose/proton symporter and appears to be responsible for glucose export from the vacuole. Concerning the export of sucrose out of the vacuole, for the first time direct evidence for the sucrose/proton symport function of AtSUC4 in planta was provided after its transient overexpression in certain sugar-transporter knockout lines. Furthermore, the studies on wild type and sugar-transporter knockout lines regarding vacuolar glucose/sucrose loading and unloading also revealed that in addition to AtTMT1/2 and AtERDl6 further proton-coupled sugar transporters - of yet unknown molecular identity - must be present in mesophyll cells. KW - Ackerschmalwand KW - Vakuole KW - Saccharose KW - Glucose KW - Mesophyll KW - Protonenpumpe KW - AtTMT1/2 KW - AtSUC4 KW - AtERDl6 KW - V-ATPase KW - Mesophyllvakuole KW - Glucose/Saccharose Transport KW - Antiport KW - Symport KW - AtTMT1/2 KW - AtSUC4 KW - AtERDl6 KW - V-ATPase KW - mesophyll vacuole KW - glucose/sucrose transport KW - antiport KW - symport KW - Glucosetransport Y1 - 2012 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-85596 ER - TY - THES A1 - Latz, Andreas T1 - Lokalisation, Funktion und Regulation pflanzlicher Tandem-Poren-Kaliumkanäle in Arabidopsis thaliana T1 - Localization, function and regulation of plant tandem-pore potassium-channels in Arabidopsis thaliana N2 - Lokalisation - Alle TPKs bis auf TPK4, der in der Plasmamembran lokalisiert ist, sind im Tonoplasten lokalisiert. - Das 14-3-3-Bindemotiv bzw. der komplette N-Terminus spielt im Gegensatz zu den tierischen TPK´s keine Rolle beim Targeting (und evtl. auch beim Assembly), da ein Austausch der N-Termini bzw. Mutationen im 14-3-3- Bindemotiv keinen Einfluss auf die subzelluläre Lokalisation hat. - Im C-Terminus ist möglicherweise ein strukturelles Motiv bzw. eine Erkennungssequenz für das Targeting in unterschiedliche Zielmembranen lokalisiert. Eventuell ist hier auch eine Assembly-Domäne für den Zusammenbau der unterschiedlichen Kanaluntereinheiten vorhanden. TPK4 - Der Kaliumkanal TPK4 wird nach Agro-Infiltration in dem pflanzlichen Expressionssystem Nicotiana benthamiana exprimiert. - TPK4 ist auch in diesem Expressionssystem in der Plasmamembran der Zelle lokalisiert. - Die Ströme, welche aus Mesophyllzellen von TPK4 infiltrierten Blättern abgeleitet wurden, gleichen denen, von TPK4 exprimierenden Oocyten von Xenopus laevis. Somit hat TPK4 in beiden Expressionssystemen die gleichen elektrophysiologischen Eigenschaften. TPK1 - TPK1 bindet über die C-terminalen EF-Hände Calcium und wird durch diese Interaktion aktiviert. - TPK1 interagiert phosphospezifisch und isotypspezifisch mit dem 14-3-3- Protein GRF6. Diese Interaktion führt zur Aktivierung des Kanals. - Die Kinasen CPK3 und CPK29, welche das 14-3-3-Bindemotiv von TPK1 phosphorylieren um eine Interaktion mit 14-3-3-Proteinen zu ermöglichen, gehören zur Familie der CDPKs - Diese Kinasen sind selbst Calcium aktiviert und aller Wahrscheinlichkeit nach unter physiologischen Bedingungen inaktiv. Erst ein Anstieg der freien Calciumkonzentration führt zur Aktivierung der Kinase in der Zelle und damit zur Aktivierung des Kanals. - Das 14-3-3-Bindemotiv ist das einzige Target der CDPK´s im N-Terminus von TPK1 - Die Phosphatase, welche das 14-3-3-Bindemotiv von TPK1 dephosphoryliert gehört zur Familie der PP2A-Proteinphosphatasen. - Es ist möglich, dass die Kinase und damit auch der Kanal durch Salzstress und durch Kaliumunterversorgung aktiviert werden und somit die Signalkaskade für die Aktivierung von TPK1 über Kinasen/14-3-3/Calcium in einen stressphysiologischen Kontext involviert ist. - tpk1.3- und cpk3.1-Verlustmutanten zeigen eine Reduktion in der Keimungsrate unter Salzstress und limitierten Kaliumangebot. Es kann über einen funktionalen Komplex bestehend aus TPK1 und TPC1 zur Aufrechterhaltung der Na+/K+-Homeostase und der elektroneutralen Aufnahme von Na+ in die Vakuole unter Salzstressbedingungen spekuliert werden. N2 - Localization - All TPK´s with the exception of TPK4 are located in the tonoplast. TPK4 however is localized in the plasmamembrane. - The 14-3-3 binding motif and the whole N-terminus does not play a role in the targeting process because swapping the N-termini has no effect on the targeting - The C-terminus might harbour a targeting motif as well as an assembly domain TPK4 - TPK4 is expressed in Nicotiana benthamiana after agro-infiltration and is localized in the plasmamembrane. - The electrophysiological properties of TPK4 expressed in tobacco are similar to TPK4 expressed in oocytes of Xenopus laevis. TPK1 - TPK1 interacts with the 14-3-3 protein GRF6 in a phosphospecific and isotypspecific manner. - Interaction of TPK1 with GRF6 leads to channel activation. - The kinases CPK3 and CPK29 are able to phosphorylate the 14-3-3 binding motif of TPK1 in vitro. - These kinases are activated by elevated levels of free cytosolic calcium. - The phosphatase responsible for the dephosphorylation of the 14-3-3 binding domain of TPK1 belongs to the family of the PP2A proteinphosphatases. - It is possible that the kinases are activated under salt stress conditions and thereby phosphorylate the 14-3-3 binding domain of TPK1 leading to the interaction with GRF1 and activation of TPK1. - Germination is reduced under salt stress conditions and limited K+ supply in tpk1.3 and cpk3.1 knockout plants. KW - Ackerschmalwand KW - Signaltransduktion KW - Vakuole KW - Kaliumkanal KW - Salzstress KW - 14-3-3 KW - Calcium KW - Proteinkinase KW - 14-3-3 . calcium KW - protein kinase Y1 - 2007 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-24915 ER - TY - THES A1 - Herweg, Jo-Ana T1 - Die Simkania-Vakuole: Die Rolle von ER, retro-/anterograden Protein- und Lipidtransport T1 - The Simkania-vacuole: the role of ER, retro-/anterograde protein- and lipid-transport N2 - Simkania negevensis (Sn) is a Chlamydia-like obligate intracellular bacterium which replicates within a membrane bound vacuole, termed SCV (Simkania-containing vacuole). The SCV is a unique compartment closely associated with ER-membranes, consequently ER-stress is blocked by the bacteria. SCV morphology is similar among epithelial cells (HeLa229, A549, HEp-2) and macrophages (THP1). The SCV represents the first intracellular interface between the host and pathogen which serves as a replication niche. Identifying human and bacterial factors associated with ER-SCV-membranes should contribute towards the understanding of SCV composition and formation as well as interactions with ER or transports. Comparative studies of the SCV should indicate similarities to the chlamydial inclusion since some host cell factors are already known for Chlamydia. In this thesis, a purification protocol has been established that is applicable to HeLa229 and THP1 ER-SCV-membranes and has been further utilized for proteome and lipidome analyses. 302 bacterial and 1178 human proteins composing ER-SCV-membranes and 885 bacterial proteins composing purified Sn have been identified by using label-free mass spectrometry measurements. Among the human factors of non or Sn infected ER-(SCV-) membranes we found 51 enriched or depleted proteins in addition to 57 transport associated ones that indicated infection induced differences among intracellular protein transport. Contrary regulation of retrograde and anterograde transported proteins could be confirmed by using RNA interference and inhibitor tests, whereby Clathrin-associated and COPI vesicles seem to play a central role. Application of Retro-inhibitors, which interfered with retrograde transport processes between endosome to Golgi or early to late endosomes, as well as Bafilomycin A1 (retrograde, late endosomes and lysosomes) and Brefeldin A (anterograde, ER and Golgi) exerted a strong influence on SCV formation, morphology and intracellular lipid transport. By using label-free mass spectrometry measurements and thin layer chromatography we could determine differences in lipid levels within Sn infected cells, ER-SCV-membranes and purified Sn in comparison to uninfected cells. In addition to lipid enrichment or depletion in whole-cell extracts and ER-SCV-membranes, we identified two infection-specific lipids, cholesterol-ß-Dglucoside and PE 30:0. Further, high-throughput RNA interference tests indicated a dependence of Sn infections on endosome to Golgi and Clathrin-associated vesicle transports. Taken together, we were able to identify initial potential SCV-associated proteins and lipids that were connected to bacterial infection. Furthermore, SCV formation and Sn infectiousness depends on retrograde transport processes and therefore also on acquisition of nutrients, such as lipids. N2 - Simkania negevensis (Sn) repliziert als Chlamydia-ähnliches obligat intrazelluläres Bakterium auch in einer membranumschlossenen Vakuole, die als SCV (engl. Simkania-containing vacuole) bezeichnet wird. Die SCV ist ein bis jetzt einzigartiges Kompartiment, das stark mit ER-Membranen assoziiert ist, wobei ER-Stress von den Bakterien blockiert wird. Die Morphologie der SCV scheint dabei in Epithelzellen (HeLa229, A549, HEp-2) als auch in Makrophagen (THP1) gleich zu sein. Die SCV stellt die erste intrazelluläre Berührungsfläche dar, an der Interaktionen zwischen Wirt und Pathogen erfolgen, und dient gleichzeitig als Replikationsnische. Mithilfe der Identifizierung von humanen und bakteriellen Faktoren, die mit der ER-SCV-Membran assoziiert sind, sollten die Zusammensetzung der SCV sowie mögliche Interaktionen mit dem ER oder zellulären Transportwegen ermittelt werden. Vergleichsstudien von SCV-assoziierten Proteinen sollten Ähnlichkeiten zur chlamydialen Inklusion aufzeigen, für die bereits einige interagierende Wirtszellfaktoren beschrieben wurden. In dieser Arbeit wurde ein Aufreinigungsprotokoll etabliert, das sowohl für ER-SCVMembranen aus HeLa229 als auch THP1 geeignet war und für spätere Proteom- oder Lipidomanalysen diente. Über markierungsfreie massenspektrometrische Messungen konnten 302 bakterielle und 1178 humane Proteine in ER-(SCV-) Membranen und 885 bakterielle Proteine in aufgereinigten Sn identifiziert werden. In ER-(SCV-) Membranen von nicht und Sn-infizierten HeLa229 Zellen befanden sich 51 unterschiedlich verteilte und 57 transportassoziierte humane Proteine, die auf infektionsinduzierte Unterschiede beim intrazellulären Proteintransport hindeuteten. Eine entgegengesetzte Regulation von retro- und anterograd transportierten Proteinen konnte mithilfe von RNA-Interferenz und dem Einsatz geeigneter Inhibitoren bestätigt werden, wobei sich zeigte, dass Clathrin-assoziierte und COPI-Vesikel eine zentrale Rolle spielen. Retro-Inhibitoren, die den retrograden Transport zwischen Endosomen zum Golgi oder zwischen frühen und späten Endosomen inhibieren, sowie Bafilomycin A1 (retrograd, späte Endosomen und Lysosomen) und Brefeldin A (anterograd, ER und Golgi), beeinflussten massiv die SCV-Ausbildung, SCV-Morphologie und den intrazellulären Lipidtransport. Über markierungsfreie massenspektrometrische und dünnschichtchromatographische Analysen konnten erste Unterschiede im Lipidvorkommen in Sn-infizierten Zellen, an ER-SCVMembranen und in aufgereinigten Sn im Vergleich zu nicht infizierten Zellen ermittelt werden. Dabei konnten neben An- und Abreicherungen in Gesamtzellextrakten sowie ER-SCVMembranen zwei infektionsspezifische Lipide, Cholesterol-ß-D-Glykosid und PE 30:0, identifiziert werden. Weiterführende umfangreiche RNA-Interferenzstudien weisen darauf hin, dass die Sn-Infektion vom Endosomen-zum-Golgi-Transport und vom Clathrin-assoziierten Vesikeltransport abhängig ist. Zusammenfassend konnten erste mögliche SCV-assoziierte Proteine und Lipide identifiziert werden, die mit der bakteriellen Infektion verbunden waren. Des Weiteren hängen eine stabile SCV-Ausbildung und Sn-Infektivität von verschiedenen retrograden Transportwegen und damit von dem Erwerb von Nährstoffen wie bspw. Lipiden ab. KW - Simkania KW - Vakuole KW - Proteintransport KW - Lipidtransport Y1 - 2018 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-136844 ER - TY - THES A1 - Dindas, Julian T1 - Cytosolic Ca\(^2\)\(^+\), a master regulator of vacuolar ion conductance and fast auxin signaling in \(Arabidopsis\) \(thaliana\) T1 - Zytosolisches Ca\(^2\)\(^+\), ein zentraler Regulator der vakuolären Ionenleitfähigkeit und der schnellen Auxin-Signaltransduktion in \(Arabidopsis\) \(thaliana\) N2 - Das Phytohormon Auxin erfüllt wichtige Funktionen bei der Initiierung von pflanzlichen Geweben und Organen, wie auch in der Steuerung des Wurzelwachstums im Zusammenspiel mit äußeren Reizen wie Schwerkraft, Wasser- und Nähstoffverfügbarkeit. Diese Funktionen basieren dabei vor allem auf der Auxin-abhängigen Regulation von Zellteilung und -streckung. Wichtig für letzteres ist dabei die Kontrolle des Zellturgors durch die Vakuole. Als Speicher für Nährstoffe, Metabolite und Toxine sind Vakuolen von essentieller Bedeutung. Vakuolär gespeicherte Metabolite und Ionen werden sowohl über aktive Transportprozesse, als auch passiv durch Ionenkanäle, über die vakuoläre Membran mit dem Zytoplasma ausgetauscht. In ihrer Funktion als second messenger sind Kalziumionen wichtige Regulatoren, aber auch Gegenstand vakuolärer Transportprozesse. Änderungen der zytosolischen Kalziumkonzentration wirken nicht nur lokal, sie werden auch mit einer Signalweiterleitung über längere Distanzen in Verbindung gebracht. Im Rahmen dieser Arbeit wurden elektrophysiologische Methoden mit bildgebenden Methoden kombiniert um Einblicke in das Zusammenspiel zwischen zytosolischen Kalziumsignalen, vakuolärer Transportprozesse und der Auxin-Physiologie im intakten pflanzlichen Organismus zu gewinnen. Kalziumsignale sind an der Regulierung vakuolärer Ionenkanäle und Transporter beteiligt. Um dies im intakten Organismus zu untersuchen wurden im Modellsystem junger Wurzelhaare von Arabidopsis thaliana Messungen mit intrazellulären Mikroelektroden durchgeführt. Mittels der Zwei-Elektroden-Spannungsklemm-Technik konnte bestätigt werden, dass die vakuoläre Membran der limitierende elektrische Wiederstand während intravakuolärer Messungen ist und so gemessene Ionenströme in der Tat nur die Ströme über die vakuoläre Membran repräsentieren. Die bereits bekannte zeitabhängige Abnahme der vakuolären Leitfähigkeit in Einstichexperimenten konnte weiterhin mit einer einstichbedingten, transienten Erhöhung der zytosolischen Kalziumkonzentration korreliert werden. Durch intravakuoläre Spannungsklemmexperimente in Wurzelhaarzellen von Kalziumreporterpflanzen konnte dieser Zusammenhang zwischen vakuolärer Leitfähigkeit und der zytosolischen Kalziumkonzentration bestätigt werden. Die Vakuole ist jedoch nicht nur ein Empfänger zytosolischer Kalziumsignale. Da die Vakuole den größten intrazellulären Kalziumspeicher darstellt, wird seit Langem diskutiert, ob sie auch an der Erzeugung solcher Signale beteiligt ist. Dies konnte in intakten Wurzelhaarzellen bestätigt werden. Änderungen des vakuolären Membranpotentials wirkten sich auf die zytosolische Kalziumkonzentration in diesen Zellen aus. Während depolarisierende Potentiale zu einer Erhöhung der zytosolischen Kalziumkonzentration führten, bewirkte eine Hyperpolarisierung der vakuolären Membran das Gegenteil. Thermodynamische Überlegungen zum passiven und aktiven Kalziumtransport über die vakuoläre Membran legten dabei den Schluss nahe, dass die hierin beschriebenen Ergebnisse das Verhalten von vakuolären H+/Ca2+ Austauschern wiederspiegeln, deren Aktivität durch die protonenmotorische Kraft bestimmt wird. Im Rahmen dieser Arbeit stellte sich weiterhin heraus, dass zytosolisches Kalzium ebenso ein zentraler Regulator eines schnellen Auxin-induzierten Signalweges ist, über den der polare Transport des Hormons reguliert wird. Im gleichen Modellsystem junger Wurzelhaare konnte gezeigt werden, dass die externe Applikation von Auxin eine sehr schnelle, Auxinkonzentrations- und pH-abhängige Depolarisation des Plasmamembranpotentials zur Folge hat. Synchron zur Depolarisation des Plasmamembranpotentials wurden im Zytosol transiente Kalziumsignale registriert. Diese wurden durch einen von Auxin aktivierten Einstrom von Kalziumionen durch den Ionenkanal CNGC14 hervorgerufen. Experimente an Verlustmutanten als auch pharmakologische Experimente zeigten, dass zur Auxin-induzierten Aktivierung des Kalziumkanals die Auxin-Perzeption durch die F-box Proteine der TIR1/AFB Familie erforderlich ist. Durch Untersuchungen der Auxin-abhängigen Depolarisation wie auch des Auxin-induzierten Einstroms von Protonen in epidermale Wurzelzellen von Verlustmutanten konnte gezeigt werden, dass die sekundär aktive Aufnahme von Auxin durch das hochaffine Transportprotein AUX1 für die schnelle Depolarisation verantwortlich ist. Nicht nur die zytosolischen Kalziumsignale korrelierten mit der CNGC14 Funktion, sondern ebenso die AUX1-vermittelte Depolarisation von Wurzelhaaren. Eine unveränderte Expression von AUX1 in der cngc14 Verlustmutante legte dabei den Schluss nahe, dass die Aktivität von AUX1 posttranslational reguliert werden muss. Diese Hypothese erfuhr Unterstützung durch Experimente, in denen die Behandlung mit dem Kalziumkanalblocker Lanthan zu einer Inaktivierung von AUX1 im Wildtyp führte. Die zytosolische Beladung einzelner epidermaler Wurzelzellen mit Auxin hatte die Ausbreitung lateraler und acropetaler Kalziumwellen zur Folge. Diese korrelierten mit einer Verschiebung des Auxin-Gradienten an der Wurzelspitze und unterstützten somit eine hypothetische Kalziumabhängige Regulation des polaren Auxin Transports. Ein Model für einen schnellen, Auxin induzierten und kalziumabhängigen Signalweg wird präsentiert und dessen Bedeutung für das gravitrope Wurzelwachstum diskutiert. Da die AUX1-vermittelte Depolarisation in Abhängigkeit von der externen Phosphatkonzentration variierte, wird die Bedeutung dieses schnellen Signalwegs ebenso für die Anpassung des Wurzelhaarwachstums an eine nicht ausreichende Verfügbarkeit von Phosphat diskutiert. N2 - The phytohormone auxin performs important functions in the initiation of plant tissues and organs, as well as in the control of root growth in conjunction with external stimuli such as gravity, water and nutrient availability. These functions are based primarily on the auxin-dependent regulation of cell division and elongation. Important for the latter is the control of the cell turgor by the vacuole. As storage for nutrients, metabolites and toxins, vacuoles are of vital importance. Vacuolar stored metabolites and ions are exchanged across the vacuolar membrane with the cytoplasm via active transport processes as well as passively through ion channels. In their function as second messenger, calcium ions are important regulators but also subject to vacuolar transport processes. Changes in the cytosolic calcium concentration not only act locally, but are also associated with signal transduction over longer distances. In this work, electrophysiological methods were combined with imaging techniques to gain insights into the interaction between cytosolic calcium signals, vacuolar transport processes and auxin physiology in the intact plant organism. Calcium signals are involved in the regulation of vacuolar ion channels and transporters. In order to investigate this in the intact organism, intracellular microelectrode measurements were performed in the model system of bulging Arabidopsis thaliana root hairs. By means of the two-electrode voltage-clamp technique, it could be confirmed that the vacuolar membrane is the limiting electrical resistance during intravacuolar measurements and thus measured ion currents actually represent only the currents across the vacuolar membrane. The already known time-dependent decrease of vacuolar conductivity during intravacuolar experiments could be further correlated with an impalement-related, transient increase of the cytosolic calcium concentration. Intravacuolar voltage-clamp experiments in root hair cells of calcium reporter plants confirmed this relationship between vacuolar conductivity and the cytosolic calcium concentration. However, the vacuole is not just a recipient of cytosolic calcium signals. Since the vacuole represents the largest intracellular calcium reservoir, it has long been argued that it is also involved in the generation of such signals. This could be confirmed in intact root hair cells. Changes in the vacuolar membrane potential affected the cytosolic calcium concentration in these cells. While depolarizing potentials led to an increase of the cytosolic calcium concentration, hyperpolarization of the vacuolar membrane caused the opposite. Thermodynamic considerations of passive and active calcium transport across the vacuolar membrane suggested that the results described herein reflect the behaviour of vacuolar H+/Ca2+ exchangers whose activity is determined by the proton motive force. In addition, cytosolic calcium has been shown to be a key regulator of a rapid auxin-induced signaling pathway that regulates polar transport of the hormone. In the same model system of bulging root hairs it could be shown that the external application of auxin results in a very fast, auxin concentration- and pH-dependent depolarization of the plasma membrane potential. Synchronous with the depolarization of the plasma membrane potential, transient calcium signals were recorded in the cytosol. These were caused by an auxin-activated influx of calcium ions through the ion channel CNGC14. Experiments on loss-of-function mutants as well as pharmacological experiments showed that the auxin-induced activation of the calcium channel requires auxin-perception by the F-box proteins of the TIR1/AFB family. Investigations of auxin-dependent depolarization as well as the auxin-induced influx of protons into epidermal root cells of loss-of-function mutants showed that the secondary active uptake of auxin by the high-affinity transport protein AUX1 is responsible for the rapid depolarization Not only the cytosolic calcium signals correlated with CNGC14 function, but also the AUX1-mediated depolarization of root hairs. An unchanged expression of AUX1 in the cngc14 loss-of-function mutant suggested that the activity of AUX1 must be post-translationally regulated. This hypothesis was supported by experiments in which treatment with the calcium channel blocker lanthanum led to inactivation of AUX1 in the wild type. The cytosolic loading of individual epidermal root cells with auxin resulted in the spread of lateral and acropetal calcium waves. These correlated with a shift of the auxin gradient at the root apex and thus supported a hypothetical calcium-dependent regulation of polar auxin transport. A model for a rapid, auxin-induced and calcium-dependent signaling pathway is presented and its importance for gravitropic root growth is discussed. Since AUX1-mediated depolarization varied with external phosphate concentration, the importance of this rapid signaling pathway is also discussed for the adaptation of root hair growth to an inadequate availability of phosphate. KW - Ackerschmalwand KW - Auxine KW - Vakuole KW - Calcium KW - Elektrophysiologie KW - Pflanzenhormone KW - Hormontransport KW - Ionenleitfähigkeit KW - Signaltransduktion KW - Arabidopsis thaliana Y1 - 2019 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-158638 ER - TY - THES A1 - Graus, Dorothea T1 - Auswirkungen einer V-PPase-Überexpression auf Nicotiana benthamiana Blattzellen und deren physiologische Bedeutung unter Salzbelastung T1 - The Effects of V-PPase overexpression on Nicotiana benthamiana leaf cells and their physiological significance under saline load N2 - Vakuoläre PPasen (V-PPase) in Landpflanzen dienen dem Transport von Protonen in die Vakuole und dem Aufbau eines elektrochemischen Gradienten, während sie gleichzeitig durch Hydrolyse eine Anreicherung des toxischen PPi im Cytosol verhindern. Zahlreiche Publikationen bewiesen bereits positive Effekte der stabilen V-PPase-Überexpression in Pflanzen. Unter anderem zeigte die Ackerschmalwand, Tabak, Reis und Tomate eine erhöhte Biomasse und gesteigerte Stresstoleranz auf Grund einer erhöhten stabilen V-PPase Ex-pression. Um die zugrundeliegenden Prozesse ohne potenzielle pleiotropische Effekte während der Pflanzenentwicklung zu analysieren, wurden in der vorliegenden Dissertation die physiologischen Auswirkungen einer transienten V-PPase-Überexpression in Nicotiona benthamiana Blättern und die Einflussnahme von NaCl quantitativ erfasst. Zu diesem Zweck wurden zwei endogene V-PPasen (NbVHP1 und NbVHP2) aus N. bentha-miana zunächst bioinformatisch und dann auf Transkriptionsebene mittels quantitativer Real-Time-PCR identifiziert. Die endogenen V-PPasen wurden mittels der Agrobakterien-Infiltrationstechnik transient in N. benthamiana Blättern und ihre vakuoläre Lokalisation mit Hilfe von Fluoreszenzmarkern bestätigt. Die Protonenpump-Funktion der überexprimierten NbVHPs konnte mit der Patch-Clamp-Technik anhand des vier-fach erhöhten Protonenpump-stroms in den isolierten Mesophyllvakuolen verifiziert werden. Im Zuge der elektro-physiologischen Charakterisierung der endogenen N. benthamiana V-PPasen konnte die für V-PPasen typische Sensitivität gegenüber cytosolischem Calcium bestätigt werden, welche sich bei einem erhöhten Calcium-Spiegel in einer Hemmung der Pumpströme äußerte. Ferner wurde ihre gleichartige Substrataffinität (Km von 65 µM PPi) unabhängig des vakuolären pHs zwischen 5,5 und 7,5 festgestellt. Der Vergleich dieser Ergebnisse mit analog durchgeführten Messungen an der bereits publizierten AtVHP1 von A. thaliana bestätigte die große Homo-logie der V-PPasen von Landpflanzen. Im Gegensatz zu den erwünschten Auswirkungen der stabilen V-PPase Überexpression resultierte diese starke transiente Überexpression nach drei Tagen im Absterben makroskopischer Blattbereiche. Das Ausmaß dieser Nekrosen wurde anhand des vorhandenen PhotosystemII in den transformierten Blättern mit der Puls-Amplituden-Modulations-Technik quantifiziert. Die analoge transiente Überexpression einer löslichen PPase (IPP1) führte allerdings zu keinerlei negativen Effekten für die Pflanze, wodurch die erhöhte Protonentransportaktivität im Gegensatz zur Hydrolyseaktivität der V-PPasen als Ursache des Zellsterbens verifiziert werden konnte. Aufgrund dieser unerwarteten negativen Auswirkungen der transienten V-PPase-Überex-pression auf die Blattvitalität wurde zusätzlich die Salzstresstoleranz der Blätter untersucht. Unter Berücksichtigung des kurzen Transformations- und damit Beobachtungszeitfensters wurde ein Salzapplikationsverfahren etabliert, bei dem simultan mit der Agrobakterien-infiltration 200 mM NaCl direkt in den Blattapoplasten eingeführt wurde. Anhand einer Zu-nahme in sowohl der Transskriptmenge der V-PPase als auch des PPi-induzierten Protonen-pumptransportes über den Tonoplasten wurde gezeigt, dass die NaCl-Anwesenheit im Blatt eine erhöhte Aktivität der endogenen V-PPasen des N. benthaminan Pflanzen bewirkte. Der gleichzeitige tendenzielle Rückgang der V-ATPase-Pumpaktivität in salzbehandelten Mesophyllvakuolen lässt vermuten, dass die V-PPasen eine größere Rolle bei der Bewahrung des vakuolären pH-Wertes und der protonenmotorische Kraft (PMF) unter Salzstress ein-nimmt. Interessanterweise führte die Salzapplikation bei einer V-PPase-Überexpression zu keinen additiven negativen Effekten, sondern verhinderte sogar das Auftreten der Nekrosen. Um dieses Phänomen zu ergründen, wurde zunächst mit Hilfe von Apoplastenwaschungen und Natrium-Konzentrationsmessungen bestätigt, dass das injizierte NaCl im Blatt verblieb und von den Blattzellen aufgenommen wurde. Für weitere Studien der Ursachen der Nekrosen wurden in-vivo-pH-, Membranpotenzial- und Metabolitmessungen durchgeführt. Während in V-PPase-überexprimierenden Zellen der vakuoläre pH-Wert zu Kontrollvakuolen signifikant sank, blieb er mit zusätzlicher Salzbehandlung auf Kontrollniveau. Des Weiteren schwächte die Salzapplikation die starke Depolarisation der Plasmamembran nach V-PPase-Über-expression um mehr als die Hälfte ab. Hingegen konnten keine nennenswerten Ver-änderungen im Metabolit- und Ionengehalt des Blattgewebes bei V-PPase-Überexpression festgestellt werden. Lediglich der Natrium- und Chlorid-Spiegel waren bei salz-behandelten Blättern erwartungsgemäß erhöht. Diese Ergebnisse bekräftigten, dass der stark erhöhte V-PPase-vermittelte Protonenpumpstrom und weniger metabolische Veränderungen für die Nekrosen von V-PPase-überexprimierte Pflanzen verantwortlich ist. Diese negativen Auswirkungen werden offensichtlich durch die Salzbehandlung stark vermindert, da die Aufnahme der Salz-ionen über Protonen-Na+/K+-Antiporter wie NHX antagonistisch auf die V-PPase verursachte Protonenanreicherung und die daraus folgende Veränderung des Membran-potentials und der PMF entgegenwirkt. In diese Arbeit wurde in einem neuen Blickwinkel deutlich, dass die natürliche Expressions-kontrolle der V-PPase in ausdifferenzierten Pflanzenzellen sich den Umweltbedingungen anpasst, um das Gleich-gewicht zwischen den positiven und negativen Auswirkungen der Pumpaktivität zu halten. N2 - The plant vacuolar PPases (V-PPase) transport protons across the tonoplast from the cytosol into the vacuole. This establishes a trans-tonoplast electrochemical gradient and prevents the accumulation of toxic PPi in the cytosol. Many publications have already shown positive effects of stable V-PPase overexpression in plants. Arabidopsis, tobacco, rice and tomato for example, all showed increased biomass and greater stress tolerance with stable V-PPase overexpression. To understand the underlying processes without potential pleiotropic effects during plant development, we characterised V-PPase in Nicotiana benthamiana leaves using an electrophysiological approach, and investigated its physiology in overexpressing plants, concentrating on its regulation by NaCl. Two endogenous V-PPases (NbVHP1 and NbVHP2) from N. benthamiana were identified using bioinformatics and quantified with real-time PCR. Endogenous V-PPases were transiently overexpressed using Agrobacteria in N. benthamiana leaves, with their vacuolar localisation confirmed by fluorescence labelling. The proton pump activity of the NbVHPs was verified by a fourfold increase in the patch clamp-recorded proton current response of isolated mesophyll vacuoles. For the electrophysiological characterisation of the endogenous V-PPases, the V-PPase-typical cytosolic calcium sensitivity was confirmed; the proton pump became inhibited with increased calcium levels. Furthermore, their similar substrate affinity, a Km of 65 μM PPi, was found to be independent of the vacuolar pH between 5.5 and 7.5. Both attributes were comparable to the already published AtVHP1 of Arabidopsis thaliana, showing a high homology of plant V-PPases. The physiological effects of V-PPase overexpression was obvious from the time-delayed death of transformed cells. In contrast to the desired effects of stable V-PPase over-expression, this strong transient overexpression resulted in macroscopic dead leaf areas after three days. The extent of these necroses was quantified by counting the existing photosystems in the transformed leaves using the pulse-amplitude modulation technique (PAM). In contrast, no necrosis was found in plants where a soluble PPase (IPP1) was over-expressed. This supports the hypothesis that the increased proton transport activity of V-PPases, not the hydrolysis activity, is the cause of cell death. Because of these unexpected negative effects of transient V-PPase over-expression on leaf vitality, the salt stress tolerance of the leaves was also examined. The short transformation and observation time window meant we needed to establish a new way of salt application; we injected 200 mM NaCl directly into the leaf apoplast simultaneously with the agrobacterial material. Absorption of NaCl by leaf cells was confirmed by apoplast washing and sodium concentration measurements. The NaCl treatment increased the amount of transcripts of endogenous V-PPases in tobacco and increased the PPi-induced proton transport across the vacuolar membrane. The concomitant decline in V-ATPase pumping activity in saline-treated mesophyll vacuoles indicates that V-PPases have a significant role in maintaining the vacuolar pH and proton motive force (PMF) under saline conditions. Interestingly, simultaneous salt administration with V-PPase overexpression did not result in an additive negative effect but did prevent the occurrence of necrotic leaf areas. For further analysis of the necrosis, in vivo pH, membrane potential and metabolite measurements were performed. Under V-PPasen over-expression and salt treatment, the vacuolar pH remained constant and did not decrease as it did in non-salt-treated V-PPase over-expressing cells. Furthermore, the salt application attenuated the strong depolarisation of the plasma membrane by more than a half in V-PPase overexpressing plants, but no noteworthy changes in cell metabolism could be detected by metabolite and ion concentration measurements. Only the Na+ and Cl- levels were, as expected, increased in salt-treated leaves. This decrease in vacuolar pH alongside a membrane depolarisation confirms that the strong proton pump current of the V-PPase overexpressing vacuoles is the cause of the observed necrosis. These negative effects are obviously greatly reduced by salt treatment, since the uptake of the salt ions via proton:Na+/K+ antiporters such as NHX acts as an antagonist to V-PPase-induced proton accumulation in the vacuole and the consequent change in membrane potential and PMF. This work reveals in a new perspective, that the natural expression control of V-PPase in differentiated plant cells adapts to environmental conditions to balance the positive and negative effects of pumping activity. KW - Pyrophosphatase KW - Vakuole KW - Nicotiana benthamiana KW - Membrantransport KW - Salzstress KW - transiente Transformation Y1 - 2020 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-193676 ER - TY - THES A1 - Fernández-Mora, Eugenia T1 - Analysis of the maturation of Rhodococcus equi-containing vacuoles in macrophages T1 - Analyse der Reifung von Rhodococcus equi-enthaltenden Phagosomen in Makrophagen N2 - Rhodococcus equi is a Gram-positive intracellular pathogen which can cause severe bronchopneumonia in foals. In recent years, the role of this bacterium as human pathogen has been noted, as R.equi infections in humans have increase in frequency. This increase is associated with the rise in immunosupressed individuals, specially AIDS patients, where infection leads to symptoms and pathology similar to those seen in foals with a high mortality rate. Due to its capability to survive and multiply in murine and equine macrophages, R.equi has been classified as a facultative intracellular bacterium. R.equi is found frequently in macrophages in alveolar infiltrate from infected animals. The pathogenicity of R.equi depends on its ability to exist and multiply inside macrophages and has been associated with the presence of virulence plasmids. It has been observed that, inside foal alveolar macrophages, R.equi-containing vacuoles (RCVs) do not mature into phagolysosomes. However, most of the intracellular events during R.equi infection have not been investigated in detail. The aim of this study was to elucidate the intracellular compartmentation of R.equi and the mechanism by which the bacteria avoid destruction in host macrophages. The importance of the virulence-associated plasmids of R.equi for the establishment of RCVs was also evaluated. Furthermore, the intracellular fate of viable and non-viable R.equi was compared in order to study whether viability of R.equi influeciantes the establishment of RCVs. In this study, the RCV was characterized by using a variety of endocytic markers to follow the path of the bacteria trhough murine macropages. Transmission electron microscopy-base analysis showed that R.equi was found equally frequently in phagosomes with loosely or thightly apposed membranes, and RCV often contains numerous membranous vesicles. Laser scanning microscopy of infected macrophages showed that the majority of phagosomes containing R.equi acquired transiently the early endosomal markers Rab5, Ptlns3P, and EEA-1, suggesting initially undisturbed phagosome maturation. Although the RCV acquired some late endosomal markers, such as Rab7, LAMP-1, and Lamp-2, they did not acquired vATPase, did not interact with pre-labeled lysosomes, and failed to acidify. These data clearly suggest that the RCV is a compartment which has left vacuoles that resemble multivesicular body compartments (MVB), which are transport intermediates between early and late endosomes and display internal vesicles very similar to the ones observed within RCVs. Analyisis of several R.equi strains containing either VapA- or VapB-expressing plasmids or neither demonstrated that the possession of the virulence-associated plasmids does not affect phagosome trafficking over a two hour period of infection. The finding that non-viable R.equi was still able to inhibit phagosome maturation (although not to the same extent as viable R.equi did) suggests that heat-insensitive factors, such as cell periphery lipids, may play a major role in inhibition of phagosome maturation, although heat-sensitive factors may also be involved. N2 - Rhodococcus equi ist ein Gram-positives, fakultativ intrazelulläres Bakterium, das unter anderem die Ursache von Bronchopneumonien bei Fohlen ist. Menschen und andere Säugetiere können ebenfalls von Infektionen mit R. equi betroffen sein. In den letzten Jahren ist die Häufigkeit klinischer Infektionen mit R. equi bei Menschen gestiegen. Die wachsende Anzahl an mmunosupprimierten Patienten (hauptsächlich AIDS-Patienten) liegt dieser Zunahme an Infektionen zugrunde. Die Symptomatologie und Pathologie der Infektion mit R. equi ist bei AIDS-Patienten und Fohlen ähnlich. Die Sterblichkeitsrate ist in beiden Fällen hoch. Die Fähigkeit der Rhodokokken, innerhalb von Makrophagen zu überleben und sich zu vermehren, ist mit dem Vorhandensein von Virulenzplasmiden (virulence-associated plasmids) verbunden. Innerhalb des Makrophagen befinden sich die Rhodokokken in einem Phagosom, das nicht mit Lysosomen fusioniert. Die genaue Kompartimentierung der Rhodococcus equi-enthaltenden Phagosomen in Makrophagen war bisher unbekannt und wurde deshalb in der vorliegenden Promotionsarbeit untersucht. Mit Hilfe mehrerer endozytischer Marker wurde das R. equi-enthaltende Kompartiment charakterisiert. Mögliche Unterschiede zwischen der Kompartimentierung von R. equi(+)- und R. equi(-)-enthaltenden Phagosomen ist ebenfalls Thema dieser Promotionsarbeit. Weiterhin wurde die Etablierung des phagosomalen Kompartiments für jeweils lebende und tote Rhodokokken verglichen. Transmissionselektronenmikroskopische Analysen haben gezeigt, dass die Phagosomenmembran Rhodococcus equi-enthaltender Phagosomen sowohl locker als auch eng anliegend sein kann (50%). Darüber hinaus wurden häufig zahlreiche, membranöse Vesikel in R. equi-enthaltenden Phagosomen gefunden. Diese Phagosomen zeigen somit Ähnlichkeiten zu Multivesicular Bodies. Multivesicular Bodies sind intermediäre Kompartimente zwischen frühen und späten Endosomen und zeigen ebenfalls eine Vielzahl von internen Vesikeln. Untersuchungen am konfokalen Lasermikroskop ergaben, dass die Mehrheit der R. equi-enthaltenden Phagosomen die früh endosomalen Marker Rab5, PtIns3P und EEA-1 transient akquirieren. Dieser Befund deutet auf eine ungestörte phagosomale Reifung im frühen Stadium hin. Trotz der beobachteten Akquisition der spät endosomalen Marker Rab7, LAMP-1 und LAMP-2 konnte keine Akquisition der vATPase, keine Interaktion mit vormarkierten Lysosomen und keine Ansäuerung von R.equi-enthaltenden Phagosomen nachgewiesen werden. Diese Ergebnisse weisen darauf hin, dass R. equi-enthaltende Phagosomen das früh endosomale Stadium abschließen, aber einen typisch spät endosomale Zustand nicht erreichen. Die Analyse unterschiedlicher R. equi-Stämme, die entweder vapA- oder vapB-exprimierende Virulenzplasmide enthalten, hat gezeigt, dass die Anwesenheit von Virulenzplasmiden die phagosomale Reifung über eine Infektionsperiode von zwei Stunden nicht beeinflusst. Getötete Rhodokokken waren in der Lage, die phagosomale Reifung zu inhibieren, aber in geringerem Ausmaß als lebende Rhodokokken. Das weist darauf hin, dass hitze-insensitive Faktoren (wie zum Beispiel Lipide der Zellwand) zur Inhibierung der phagosomalen Reifung entscheidend sind, obwohl dazu auch hitze-sensitive Faktoren (wie Proteine) relevant sein können. KW - Rhodococcus equi KW - Makrophage KW - Vakuole KW - Endosome KW - Phagosome KW - Rhodococcus KW - Mycobacterium KW - Reifung KW - endosome KW - phagosome KW - Rhodococcus KW - Mycobacterium KW - maturation Y1 - 2005 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-14049 ER -