TY - THES A1 - Nikulin, Joanna T1 - Untersuchungen zu intrazellulären Folgereaktionen von Neisseria meningitidis und Escherichia coli K1 in HBMEC (human brain microvascular endothelial cells) T1 - Intracellular survival and replication of Neisseria meningitidis and Escherichia coli K1 in HBMEC (human brain microvascular endothelial cells) N2 - Neisseria meningitidis ist einer der wichtigsten Erreger bakterieller Meningitiden und gefürchtet für das Potential Epidemien auszulösen. Die Meningokokken-Meningitis bleibt bis heute auch in Industrieländern mit hoher Mortalität verbunden. Um eine Meningitis verursachen zu können, müssen Meningokokken die Blut-Hirn/Liquor-Schranke überqueren. Dies erfolgt vermutlich über den transzellulären Weg durch die Endothelzellbarriere der Gehirnkapillare. Ereignisse unmittelbar vor der bakteriellen Internalisierung sind vielfach untersucht, noch wenig erforscht sind jedoch die in der Endothelzelle durch den initialen Kontakt des Erregers ausgelösten Signalkaskaden. Die Rolle des für eine ADP-Ribosyltransferase kodierenden narE Gens in der Pathogenese der Meningokokken-Infektion und die mögliche Bedeutung in der Aktivierung von Signaltransduktionsmechanismen wird diskutiert. Eine narE Insertionsmutante wurde hergestellt und charakterisiert. Anschließend wurde die Aktivierung der extracellular signal regulated kinase (ERK) im Verlauf von Infektionsassays in HBMEC (human brain microvascular endothelial cell) mittels Western Blot untersucht. Eine Zu- oder Abnahme in der Phosphorylierung von ERK und folglich eine Aktivierung oder Deaktivierung der ERK-vermittelten Signalkaskaden in HBMEC konnte jedoch im Laufe der Infektion bei der narE Mutante im Vergleich zum Wildtypstamm nicht festgestellt werden. Elektronenmikroskopische Aufnahmen zeigen Meningokokken intrazellulär einzeln aber auch zu mehreren in phagosomenähnlichen membranumgebenen Strukturen. Die Fähigkeit von N. meningitidis sich intrazellulär zu replizieren wurde mittels Infektions-assay untersucht. Bekapselte Meningokokken waren in der Lage, sich sowohl in Epithel- als auch in Endothelzellen zu replizieren, während unbekapselte Erreger intrazellulär abgetötet wurden. Bei Meningokokken wie auch beim Erreger neonataler Meningitiden E. coli K1 wird eine O-Acetylierung des Kapselpolysaccharids beobachtet. Die biologische Bedeutung der O-Acetylierung der Sialinsäure wurde in Infektionsassays mit einem nicht acetylierten E. coli K1 Stamm und einer isogenen konstitutiv acetylierten Mutante untersucht. In der Adhärenz an und Invasion in HBMEC konnten keine signifikanten Unterschiede festgestellt werden. Eine stärker ausgeprägte intrazelluläre Replikation wurde jedoch nach einer Verzögerung von mehreren Stunden bei dem nicht acetylierten Isolat beobachtet. Um die Neisseria containing Vacuole (NCV) näher zu charakterisieren und mögliche Interaktionen mit dem Endozytoseweg in HBMEC zu untersuchen, wurde eine dreifache Immunfluoreszenzfärbung zur simultanen Darstellung intrazellulärer Meningokken und spezifischer Marker des frühen bzw. späten Endosoms und Lysosoms etabliert. Eine Akquirierung des Transferrinrezeptors als Marker für das frühe Endosom und des Lamp-1 (lysosomal associated membrane protein 1) als Marker für das späte Endosom konnte durch Kolokalisationsstudien mittels Immunfluoreszenzmikroskopie gezeigt werden. N2 - In order to cause meningitis the extracellular pathogen Neisseria meningitidis has to traverse the blood-brain-barrier (BBB). It remains unclear, if the passage occurs through a transcellular or paracellular pathway. Postulating a transcellular passage, meningococci (MC) have been shown to adhere to and enter into BBB forming human brain microvascular endothelial cells (HBMECs). Furthermore, electron microscopy studies demonstrate that intracellular MC reside within membrane-bound compartments both solitary and in groups. Whether this is a result of simultaneous uptake or vacuole fusion or possible intracellular replication needs to be assessed. In order to investigate the ability of MC to survive and replicate intracellularly, prolonged gentamicin protection assays were performed using human epithelial (HEp-2) and endothelial (HBMEC) cells. Cells were infected with encapsulated and unencapsulated N. meningitidis serogroup B mutants in order to identify the potential role of the polysaccharide capsule for the intracellular survival. Encapsulated bacteria were found to be able to survive and, after an initial delay, to replicate within both endothelial and epithelial cells, whereas the number of intracellular capsule-deficient mutants decreased continuously. This strongly suggests that the capsule plays a pivotal role for the intracellular survival of MC both in epithelial and endothelial cells. Further investigations were initiated to characterise the membran-bound compartment, the Neisseria containing vacuole (NCV). Immunfluorescence microscopy studies showed that NCV acquire the early endosomal marker protein transferrin receptor and the lysosomal marker protein Lamp-1 respectively. The acquisition of further marker proteins as well as the kinetics of the association of these with NCV remain to be studied. KW - Neisseria meningitidis KW - Escherichia coli K1 KW - Meningitis KW - HBMEC KW - intrazellulär KW - Neisseria meningitidis KW - Escherichia coli K1 KW - meningitis KW - HBMEC KW - intracellular Y1 - 2005 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-16552 ER - TY - THES A1 - Aumann, Ralf T1 - Vorkommen und Expression des opcA Gens in Meningokokkenstämmen von Erkrankten und asymptomatischen Trägern T1 - Prevalence and expression of the opcA gene in meningococci from invasive and carrier strains N2 - Das Opc-Protein ist ein Außenmembranprotein von Meningokokken, das über extrazelluläre Matrixproteine mit Integrinen der Wirtszelle interagiert. Opc ist in Menschen immunogen und induziert bakterizide Antikörper. Das Opc-Protein wurde daher als aussichtsreicher Impfstoff-Kandidat angesehen, da es außerdem relativ gut konserviert ist. Allerdings wird das Opc-Protein nicht von allen Meningokokkenstämmen exprimiert. Einerseits fehlt das opc-Gen in einigen klonalen Komplexen (z.B. ST-8, ST-11, ST-53), andererseits ist die Opc-Expression nicht konstitutiv wegen einer phasenvariablen Transkription, die auf einem Poly-Cytidin-Bereich im Promotor des opc-Gens beruht. In dieser Arbeit wurde die Präsenz des opc-Gens und die Opc-Expression in zwei großen Sammlungen deutscher Meningokokkenisolate von invasiven Erkrankungen (n=1141) und gesunden Trägern (n=792) untersucht. Das opc-Gen war bei 71% der invasiven und 77% der Trägerstämme nachweisbar. Der größte Teil der opc-Gen negativen Stämme gehörte zu den klonalen Komplexen ST-8, ST-11, ST-213, ST-231, ST-334 und ST-53. Der Anteil opc-positiver Stämme, die Opc in vitro exprimieren, war bei den invasiven Stämmen kleiner als bei den Trägerstämmen (13% vs. 29%, p<0,001, Chi-square-Test). Der größere Anteil Opc-exprimierender Trägerstämme ist u.a. am ehesten mit der Überrepräsentation von wenig pathogenen klonalen Komplexen (ST-23, ST-35, ST-198) mit einer hohen Opc-Expressionsrate zu erklären. 24 von den 176 invasiven Stämmen mit einer Anzahl von 11 - 14 Cs in der Promotor-Region, die die Opc-Expression begünstigt, zeigten weder im ELISA noch im Westernblot eine Opc-Expression. Bei 14 dieser 24 Stämme wurde als Ursache ein phasenvariabler, intragenischer Poly-Adenin-Bereich identifiziert, der zu einer Leserasterverschiebung führte. Die Vermutung mehrerer Autoren, dass die Opc-Expression mit dem klinischen Bild der Meningitis verknüpft ist, konnte mit der hier genutzten großen Stammsammlung nicht bestätigt werden. Invasive Stämme, die das Opc-Protein exprimierten, wurden genauso häufig von Patienten mit dem klinischen Bild der Meningitis isoliert wie Stämme, die das Opc-Protein nicht exprimierten (46% vs. 47%, Chi-square-Test: p<0,9). Allerdings gibt es eine starke Assoziation der Gegenwart des opc-Gens mit dem klinischen Merkmal Meningitis. Dieser Befund gibt Anlass zu der Hypothese, dass in vitro und in vivo Expression von Opc sich unterscheiden. Zusammenfassend lässt sich festhalten, dass das Opc-Protein nur in 19,8% aller Isolate (invasive und Trägerstämme zusammengenommen) exprimiert wurde. Es zeigte sich eine Tendenz zu häufigerer Opc-Expression in apathogenen Trägerisolaten. Das Vorhandensein des opc-Gens, nicht aber die in vitro Expression konnten mit dem klinischen Merkmal Meningitis assoziiert werden. Zusätzlich wurde ein weiterer Mechanismus der intragenischen Phasenvariation beschrieben. N2 - Presence of opc was associated with meningitis, mostly because ST-11/ST-8 cc meningococci with low meningitis rates were consistently opc negative. On the other hand, lack of opc did not exclude meningitis. Opc was expressed in only 13% of all invasive isolates. In vitro Opc expression was not associated with meningitis. Limitation: Definite conclusion about expression in vivo is not possible with cultured isolates. Evidence for intragenic opc phase-variation was provided. KW - Neisseria meningitidis KW - opc KW - Medizin KW - Mikrobiologie KW - Meningitis Y1 - 2018 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-157278 ER -