TY - THES A1 - Altmann, Stephan T1 - Characterization of Metabolic Glycoengineering in Mesenchymal Stromal Cells for its Application in thermoresponsive Bioinks T1 - Charakterisierung von Metabolic Glycoengineering in mesenchymalen Stromazellen für die Anwendung in thermoresponsiven Biotinten N2 - This work developed during the first funding period of the subproject B05 in the framework of the interdisciplinary research consortium TRR 225 ‘From the Fundamentals of Biofabrication toward functional Tissue Models’ and was part of a cooperation between the Orthopedic Department represented by Prof. Dr. Regina Ebert and the Institute of Organic Chemistry represented by Prof. Dr. Jürgen Seibel. This project dealed with cellular behavior during the bioprinting process and how to influence it by modifying the cell glycocalyx with functional target molecules. The focus was on the impact of potential shear stress, that cells experience when they get processed in thermoresponsive bioinks, and a way to increase the cell stiffness via metabolic glycoengineering to attenuate shear forces. For the characterization of the metabolic glycoengineering, four different peracetylated and four non-acetylated modified monosaccharides (two mannose and two sialic acid sugars) were tested in primary human mesenchymal stromal cells (hMSC) and telomerase-immortalized hMSC (hMSC-TERT). Viability results demonstrated a dose-dependent correlation for all sugars, at which hMSC-TERT seemed to be more susceptible leading to lower viability rates. The assessment of the incorporation efficiencies was performed by click chemistry using fluorescent dyes and revealed also a dose-dependent correlation for all mannose and sialic acid sugars, while glucose and galactose variants were not detected in the glycocalyx. However, incorporation efficiencies were highest when using mannose sugars in the primary hMSC. A subsequent analysis of the temporal retention of the incorporated monosaccharides showed a constant declining fluorescence signal up to 6 d for azido mannose in hMSC-TERT, whereas no signal could be detected for alkyne mannose after 2 d. Investigation of the differentiation potential and expression of different target genes revealed no impairment after incubation with mannose sugars, indicating a normal phenotype for hMSC-TERT. Following the successful establishment of the method, either a coumarin derivative or an artificial galectin 1 ligand were incorporated into the cell glycocalyx of hMSC-TERT as functional target molecule. The biophysical analysis via shear flow deformation cytometry revealed a slightly increased cell stiffness and lowered fluidity for both molecules. A further part of this project aimed to control lectin-mediated cell adhesion by artificial galectin 1 ligands. As that hypothesis was settled in the work group of Prof. Dr. Jürgen Seibel, this work supported with an initial characterization of galectin 1 as part of the hMSC biology. A stable galectin 1 expression at gene and protein level in both hMSC and hMSC-TERT could be confirmed, at which immunocytochemical stainings could detect the protein only in the glycocalyx. The treatment of hMSC-TERT with a galectin 1 ligand in different concentrations did not show an altered gene expression of galectin 1. However, these first data in addition to the investigation of stiffness confirmed the applicability of specific and artificial IV galectin 1 ligands in biofabrication approaches to alter cell properties of hMSC. To conclude, metabolic glycoengineering has been successfully implemented in hMSC and hMSC-TERT to introduce glycocalyx modifications which reside there for several days. A proof of concept was carried out by the increase of cell stiffness and fluidity by the incorporation of a coumarin derivative or an artificial galectin 1 ligand. For the characterization of shear stress impact on cells after printing in thermoresponsive bioinks, the processing of hMSC-TERT (mixing or additionally printing) with Pluronic F127 or Polyoxazoline-Polyoxazine (POx-POzi) polymer solution was investigated. While there were no changes in viability when using POx-POzi bioink, processing with Pluronic F127 indicated slightly lower viability and increased apoptosis activity. Assessment of cellular responses to potential shear stress showed no reorganization of the cytoskeleton independent of the bioink, but highly increased expression of the mechanoresponsive proto-oncogene c Fos which was more pronounced when using Pluronic F127 and just mixed with the bioinks. Interestingly, processing of the mechanoresponsive reporter cell line hMSC-TERT-AP1 revealed slightly elevated mechanotransduction activity when using POx-POzi polymer and just mixed with the bioinks as well. In conclusion, hMSC-TERT embedded in thermoresponsive bioinks might shortly experience shear stress during the printing process, but that did not lead to remarkable cell damage likely due to the rheological properties of the bioinks. Furthermore, the printing experiments also suggested that cells do not sense more shear stress when additionally printed. N2 - Diese Arbeit entstand aus dem Projekt B05 während der ersten Förderperiode im Rahmen des interdisziplinären Sonderforschungsbereiches TRR 225 „Von den Grundlagen der Biofabrikation zu funktionalen Gewebemodellen“ und beinhaltete eine Kooperation zwischen dem Lehrstuhl für Orthopädie repräsentiert durch Prof. Dr. Regina Ebert und dem Institut für Organische Chemie repräsentiert durch Prof. Dr. Jürgen Seibel. Das Projekt beschäftigte sich mit den Auswirkungen des 3D Drucks auf Zellen während und nach dem Druck mit thermoresponsiven Biotinten. Hierbei lag der Fokus auf Scherkräften, die Zellen während des Drucks erfahren, und der Möglichkeit, deren nachteilige Auswirkungen durch gezielte Erhöhung der Zellsteifigkeit via Metabolic Glycoengineering zu minimieren. Zur Etablierung dieser Methode wurden vier azetylierte sowie vier nicht-azetylierte modifizierte Einfachzucker (zwei Mannosen und zwei Sialinsäuren) hinsichtlich ihrer Zellkompatibilität und Einbaurate in primären humanen mesenchymalen Stromazellen (hMSC) und Telomerase-immortalisierten hMSC (hMSC-TERT) charakterisiert. Bei der Viabilität zeigte sich für alle untersuchten Zucker ein konzentrationsabhängiges Verhalten, wobei die hMSC-TERT generell empfindlicher reagierten. Eine Untersuchung von verschiedenen Zielgenen nach Zuckerinkubation gab keine Hinweise auf biologisch veränderte Expressionsmuster und auch das phänotypische Differenzierungspotenzial (adipogen und osteogen) blieb erhalten. Der Einbau der modifizierten Zucker in Proteoglykane sowie Glykoproteine der Glykokalyx wurde mikroskopisch mittels Fluoreszenzfarbstoffen charakterisiert. Dabei zeigte sich ebenfalls ein konzentrationsabhängiges Verhalten für alle Mannosen und Sialinsäuren, wohingegen die Glukose- und Galaktosevarianten nicht nachgewiesen werden konnten. Die Mannosezucker zeigten die höchsten Einbauraten, welche in primären hMSC noch stärker ausfielen als in hMSC-TERT. Ein Langzeitversuch zur Beurteilung der zeitlichen Stabilität der Glykokalyxmodifikation konnte für die azetylierte Azidomannose ein abnehmendes Fluoreszenzsignal bis zum sechsten Tag nach der Klickreaktion ermitteln. Im Gegensatz dazu konnte die azetylierte Alkinmannose bereits ab dem zweiten Tag nicht mehr nachgewiesen werden. Nach der erfolgreichen Optimierung der Methodik wurde der Effekt eines Kumarinderivates oder eines künstlichen Galektin 1 Liganden auf die Zellsteifigkeit sowie die -fluidität mit Hilfe der Deformationszytometrie untersucht. Die Modifikation der Glykokalyx mit beiden untersuchten Molekülen führte zu einer leichten Erhöhung der Steifigkeit in Kombination mit einer leicht erniedrigten Fluidität. In einem weiteren Teil des Projekts sollte die Lektin-vermittelte Adhäsion von Zellen an Polymerstränge initiiert werden, indem sie mit künstlichen Galektin 1 Liganden modifiziert werden. Da diese Hypothese in der Forschungsgruppe von Prof. Dr. Jürgen Seibel bearbeitet wurde, unterstützte diese Arbeit mit einer anfänglichen Charakterisierung von Galektin 1 als Teil der hMSC Zellbiologie. In hMSC und hMSC-TERT konnte eine VI stabile Expression auf Gen- und Proteinebene nachwiesen werden, wobei das Lektin in der Glykokalyx lokalisiert war. Ein Inkubationsversuch mit einem spezifischen Liganden zeigte in hMSC-TERT unabhängig von der Konzentration keine veränderte Galektin 1 Genexpression. In Verbindung mit den Steifigkeitsuntersuchungen bestätigt diese anfängliche Charakterisierung die Anwendbarkeit von künstlichen Galektin 1 Liganden in der Biofabrikation um hMSC zu modifizieren. Somit konnte gezeigt werden, dass Metabolic Glycoengineering sich für die gezielte Einbringung von Molekülen in die Zellglykokalyx von primären hMSC sowie der entsprechenden TERT-Zelllinie zur mittelfristigen Modifikation eignet. Dies wurde durch einen funktionellen Ansatz bestätigt, indem die Zellsteifigkeit und -fluidität durch den Einsatz zwei verschiedener Moleküle erwartungsgemäß beeinflusst wurden. Für die Charakterisierung der Scherstressauswirkungen auf Zellen nach 3D Druck in thermoresponsiven Biotinten wurden hMSC und hMSC-TERT in Pluronic F127 oder Polyoxazolin-Polyoxazin (POx-POzi) Polymerlösung prozessiert (gemischt oder zusätzlich verdruckt) und direkt danach analysiert. Während letztere die Viabilität nicht verschlechterte, zeigten hMSC-TERT nach Verarbeitung in Pluronic F127 eine leicht erniedrigte Viabilität sowie leicht erhöhte Apoptoseraten. Im Zuge von Analysen der Mechanotransduktion und deren Auswirkungen konnte unabhängig von der Biotinte sowie der Behandlung kein Umbau des Zytoskeletts immunzytochemisch nachgewiesen werden. Im Gegensatz dazu zeigten Genexpressionsanalysen eine starke Hochregulierung des mechanoresponsiven Proto-Onkogens c Fos unter allen Bedingungen, wobei diese stärker ausfiel bei Verwendung der Pluronic F127 Biotinte und nur nach Mischen (gilt für beide Biotinten). Um den Scherstress quantitativ zu beurteilen, wurde die Reporterzelllinie hMSC-TERT-AP1 verwendet, welche das Auslesen der Mechanotransduktion durch eine gekoppelte Luziferase-Proteinexpression ermöglicht. Interessanterweise zeigte sich eine leicht erhöhte Luziferaseaktivität nur nach Verarbeitung mit der POx-POzi Polymerlösung, welche stärker ausfiel wenn die Zellen mit der Biotinte lediglich gemischt wurden. Zusammengenommen bestätigten die Ergebnisse die zelluläre Wahrnehmung von Scherstress in thermoresponsiven Biotinten, allerdings scheint dieser nur schwache Auswirkungen auf die Zellen zu haben, was auf die rheologischen Eigenschaften beider untersuchten Biotinten zurückgeführt werden kann. Die Druckergebnisse legten außerdem nahe, dass die Zellen nicht mehr Scherstress erfahren, wenn sie zusätzlich verdruckt wurden. KW - Glykobiologie KW - Glykokalyx KW - Tissue Engineering KW - Galectine KW - Metabolic Glycoengineering KW - Biofabrication KW - Galectin 1 KW - Glycocalyx KW - Shear Stress KW - Scherstress Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-291003 ER - TY - THES A1 - Zeller, Michael-Wulf T1 - Untersuchungen zum Scherstress-responsiven Element des PDGF-Promotors T1 - research on the shearstress-responsive element of the PDGF promotor N2 - Untersuchungen zum Scherstress-responsiven Element des PDGF-Promotors Zellen sind im menschlichen Organismus ständig mechanischen Kräften ausgesetzt. Eine dieser Kräfte ist die spezielle Schubkraft, die durch Flüssigkeitsstrom auf Zellen ausgeübt wird und als Scherstress bezeichnet wird. Die Stimulation von Zellen durch Scherstress führt zu diversen Reaktionen, die von Wanderungsvorgängen, über Umbau des Zytoskeletts bis hin zur gesteigerten Expression verschiedener Gene reichen. Für die Induktion des Gens der B-Kette des Plättchen-Wachstumsfaktors (PDGF) wurde von Resnick 1993 ein sechs Basenpaare langes cis-aktives Scherstress-responsives Promotorelement (SSRE) identifiziert, das an der Transkriptionsinduktion des Gens durch Scherstress beteiligt ist. In der hier vorliegenden Arbeit sollten die Eigenschaften dieses SSRE gezeigt werden, indem ein Reportergen-Assay mit dem grün fluoreszierenden Proteins EGFP in Zellen der Linie ECV304 ausgetestet wurde. Eine Fragestellung der Arbeit bestand darin, zu prüfen ob das SSRE notwendig und ausreichend für die Scherstressresponsivität eines Promotors ist und ob die Expressionsstärke des Reporterproteins EGFP mit der Stärke und Dauer der Scherstressstimulation korreliert. Zudem sollte der Effekt verschiedenar-tiger pharmakologischer Substanzen auf den PDGF-Promotor unter Scherstress gezeigt werden. Dazu wurde ein neues arithmetisches Verfahren entwickelt, das erlaubt, Zellen unter Einwirkung von Scherkraft angemessen zu vermessen und statistisch auszuwerten. Durch den Einsatz des EGFP und einer hochsensitiven ICCD-Photonenkamera war es möglich, die Messung der Expressionskinetik des Reportergens in Echtzeit durchzufüh-ren. Dabei konnte gezeigt werden, dass in ECV304-Zellen unter Scherstress von 0,5, 12 und 30 dyn/cm² die Expression des intakten PDGF-Promotors mit der Stärke und Dauer der Scherstressstimulation korreliert. Dieser Effekt ist nicht zu beobachten, wenn das SSRE aus dem PDGF-Promotor entfernt wird. Ebenfalls zu keiner Steigerung der Genexpression kommt es, wenn das Reportergen hinter den Promotor des Cytomegalie-Virus (CMV) geschaltet ist, der kein bekanntes Scherstress-responsives Promotor-Element enthält. Inseriert man in den CMV-Promotor das SSRE, so zeigt der Promotor unter Scherstress-Einwirkung ebenfalls eine gesteiger-te Expression, die allerdings hinter der des PDGF-Vollkonstrukts zurückbleibt. Es konnte damit gezeigt werden, dass das SSRE in einen nicht Scherstress-responsiven Promotor verbracht diesen für Strömungskräfte suszeptibel macht. Der PDGF-Promotor enthält eine bekannte Phorbolester-Bindungsstelle. In der vorlie-genden Arbeit konnte gezeigt werden, dass ECV304-Zellen bei Inkubation in mit Phor-bolester versetztem Medium die Transkription des Reportergens deutlich steigern. Ebenfalls zu einer Steigerung der Expression des PDGF-Vollkonstrukts kommt es bei appliziertem Scherstress von 12 dyn/cm² und gleichzeitiger Hemmung der Proteinkinase C (PK-C). Zwar zeigt die Hemmung mit Chelerythrin eine schwächere Lichtintensitäts-zunahme, wie sie beim Einsatz von Calphostin C, beide Messungen ergaben aber eine Steigerung der Lichtintensität gegenüber der Messung des PDGF-Vollkonstrukts bei 12 dyn/cm² in normalem Kulturmedium. N2 - Cells of the human body are always influenced by mechanical power. One of these is the so called shear stress caused by liquids like blood running on the surface of cells. Some promotors of genes of the human body are susceptible to the shear stress especially endothelial cells. This dissertation shows the influence of shear stress on the expression of the PDGF gene in human endothelial cells under different rates of shear stress. To do so a special reporter gene assay a work station and a special algorithmus were established that gave the possibility to look at living cells in real time. In the second part of the examination the influence of different pharmaka like calphostin C, chelerythrine, phorbolic ester and cycloheximide was mesured. KW - Scherstress KW - SSRE KW - PDGF KW - ECV304 KW - shear stress KW - SSRE KW - PDGF KW - ECV304 Y1 - 2004 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-15779 ER - TY - THES A1 - Dziewior, Frank T1 - Messung der intrazellulären Ca2+-Konzentration in Gefäßendothelzellen unter rheologischer Beanspruchung T1 - Measurement of intracellular Ca2+-concentration in vessel endothelial cells subjected to rheological demand N2 - Die den Zellstoffwechsel und das Zytoskelett betreffenden Adaptationsvorgänge in Endothelzellen unter rheologischer Beanspruchung sind von besonderem klinischen Interesse, da Gefäßwandschäden eine entscheidende pathogenetische Relevanz bei der Entstehung vaskulärer Erkrankungen wie z.B. der Arteriosklerose zukommt. Der intrazelluläre Signalweg, über den die Zelle einen rheologischen Reiz in eine entsprechende Zellantwort umsetzt, ist bisher weitgehend ungeklärt geblieben, wobei eine Erhöhung der zytosolischen Calciumkonzentration als Signalgeber diskutiert wurde. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit ist es gelungen, einen Messplatz zu etablieren, der es gestattet, Veränderungen in der zytosolischen Calciumkonzentration in kultivierten Endothelzellen nach Applikation von Ca2+-erhöhenden Agonisten, Calciumionophoren sowie während rheologischer Beanspruchung in Echtzeit zu dokumentieren. Die Eignung des verwendeten rheologischen Systems für Scherstressexperimente konnte durch die Beobachtung der für Endothelzellen unter rheologischer Beanspruchung typischen zytoskelettalen Umbauvorgänge im Sinne einer Neuordnung der Aktinfilamente mit der Ausbildung von Stressfasern gezeigt werden. Erstmalig konnte dabei auch die Reaktion mikrovaskulärer Endothelzellen der MyEnd-Zelllinie der Maus auf Scherstressbeanspruchung gesehen werden. Bei diesen Zellen konnte eine Vermehrung des F-Aktin-Gehaltes beobachtet werden, im Gegensatz zu kultivierten Endothelzellen des Truncus pulmonalis des Hausschweins blieb aber eine signifikante Bildung von Stressfasern aus. Diese unterschiedliche Verhalten ist wahrscheinlich der andersartigen Zellmorphologie der MyEnd-Zellen zuzuschreiben. Es konnte in zwei verschiedenen Endothelzellsystemen gezeigt werden, daß Gefäßendothelzellen den Kontakt mit verschiedenen endogenen Stimuli bzw. Calciumionophoren mit einer zytosolischen Calciumerhöhung unterschiedlichen Ausmaßes beantworten. Bei einsetzendem oder sich verstärkenden Flüssigkeitsscherstress konnte von uns hingegen keine Calciumantwort beobachtet werden. An der Induktion zytoskelettaler Umbauvorgänge scheint Calcium als Botenstoff in den hier untersuchten Zellsystemen also nicht primär beteiligt zu sein N2 - The adjustment processes in endothelial cells under rheological demand induced by changes in cell metabolism are of particularly clinical interest, as vessel wall damage has a decisive influence on formation of vascular deseases as e.g. atherosclerosis. The intracellular signal pathway the cell uses to transmit a rheological stimulus into a corresponding cell answer has previously remaind unclarified. In this publication we were able to establish a measuring technique that allows to document changes in cytosolic free calcium in the presence of Ca2+-increasing agonist, calcium ionophores as well as during rheological demand. The suitability of the used rheological system could be proved by observation of the cytoskeleton reorganization processes, that are typical for endothelial cells under rheological demand. A reorientation of actin filaments and formation of shear stress fibers could be observed. For the first time we could see in this context the reaction of microvacular endothelial cells of the mice MyEnd-population on rheological demand. In these cells we could notice an increase of F-actin, but in contrast to cultivated pulmonary endothelial cells of the pig we could not observe a significant formation of shear stress fibers. This different behaviour is probably due to the different cell morphology of MyEnd cells. In two different endothelial cell systems could be shown that vessel endothelial cells answer on stimulation with varying endogeneous agonists and calcium ionophores with an elevation of cytosolic free calcium. No increase in cytosolic free calcium could be shown subsequently to starting or increasing rheological demand. In the investigated cell populations calcium seems not to be involved as a messenger for cytoskeletal reorganization. KW - Endothel KW - Calcium KW - Scherstress KW - Stressfasern KW - Aktin KW - Arteriosklerose KW - endothelium KW - calcium KW - shear stress KW - shear stress fibers KW - actin KW - atherosclerosis Y1 - 2001 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-1181128 ER -