TY - JOUR A1 - Hetzer, Benjamin A1 - Orth-Höller, Dorothea A1 - Würzner, Reinhard A1 - Kreidl, Peter A1 - Lackner, Michaela A1 - Müller, Thomas A1 - Knabl, Ludwig A1 - Geisler-Moroder, Daniel Rudolf A1 - Mellmann, Alexander A1 - Sesli, Özcan A1 - Holzknecht, Jeanett A1 - Noce, Damia A1 - Akarathum, Noppadon A1 - Chotinaruemol, Somporn A1 - Prelog, Martina A1 - Oberdorfer, Peninnah T1 - “Enhanced acquisition of antibiotic-resistant intestinal E. coli during the first year of life assessed in a prospective cohort study” JF - Antimicrobial Resistance & Infection Control N2 - Background Increasing bacterial resistance to antibiotics is a serious problem worldwide. We sought to record the acquisition of antibiotic-resistant Escherichia coli (E. coli) in healthy infants in Northern Thailand and investigated potential determinants. Methods Stool samples from 142 infants after birth, at ages 2wk, 2mo, 4 to 6mo, and 1y, and parent stool samples were screened for E. coli resistance to tetracycline, ampicillin, co-trimoxazole, and cefazoline by culture, and isolates were further investigated for multiresistance by disc diffusion method. Pulsed-field gel electrophoresis was performed to identify persistent and transmitted strains. Genetic comparison of resistant and transmitted strains was done by multilocus sequence typing (MLST) and strains were further investigated for extra- and intra-intestinal virulence factors by multiplex PCR. Results Forty-seven (33%) neonatal meconium samples contained resistant E. coli. Prevalence increased continuously: After 1y, resistance proportion (tetracycline 80%, ampicillin 72%, co-trimoxazole 66%, cefazoline 35%) almost matched those in parents. In 8 infants (6%), identical E. coli strains were found in at least 3 sampling time points (suggesting persistence). Transmission of resistant E. coli from parents to child was observed in only 8 families. MLST showed high diversity. We could not identify any virulence genes or factors associated with persistence, or transmission of resistant E. coli. Full-term, vaginal birth and birth in rural hospital were identified as risk factors for early childhood colonization with resistant E. coli. Conclusion One third of healthy Thai neonates harboured antibiotic-resistant E. coli in meconium. The proportion of resistant E. coli increased during the first year of life almost reaching the value in adults. We hypothesize that enhancement of infection control measures and cautious use of antibiotics may help to control further increase of resistance. KW - Escherichia coli KW - antibiotic resistance KW - multiresistance KW - transmission KW - persistence KW - children KW - neonates Y1 - 2019 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-320284 VL - 8 ER - TY - THES A1 - Reichardt, Elisabeth T1 - Untersuchungen zur Verbreitung von Virulenzfaktoren extraintestinal pathogener Escherichia coli-Stämme bei Isolaten boviner Mastitiden T1 - Studies on the spread of virulence factors of extra intestinal Pathogenic Escherichia coli strains in isolates of bovine Mastitiden N2 - In dieser Arbeit werden die Ergebnisse der molekular-epidemiologischen Analyse von Virulenzgenen im Genom von insgesamt 222 Escherichia coli (E. coli)-Isolaten dargestellt, die von Mastitis-Fällen bei Rindern isoliert wurden. Mit Hilfe der Multiplex-Polymerase-Kettenreaktion wurde die Verbreitung von 42 potentiellen Virulenzfaktor-Genen extraintestinal pathogener E. coli (ExPEC) analysiert. Neben der quantitativen Bestimmung des Vorkommens jedes Einzelgens wurde in dieser Arbeit eine differenzierte Auswertung von Genkombinationen bei E. coli Mastitis-Isolaten vorgenommen. Diese ermittelten genetischen Muster werden zur 1. Prävalenz der in der Gesamtheit der Isolate, 2. Prävalenz in den phylogenetischen ECOR-Gruppen, 3. akut klinischen und chronischen Mastitis-Episoden und 4. dem Vorkommen spezifisch tierpathogener Adhäsine korreliert. Die Mastitis-Isolate konnten aufgrund der Virulenzmarkerverteilung und Phylogenie keinem bestimmten charakteristischen Pathotyp zugeordnet werden. Die überwiegende Mehrzahl der Mastitis-Isolate zeigte aufgrund einer geringen Prävalenz Virulenz-assoziierter Gene sowie der Zugehörigkeit zu den phylogenetischen Entwicklungslinien A und B1 ein geringes Virulenzpotential extraintestinal pathogener E. coli. Die Mehrzahl der Stämme enthielt eine singuläre Virulenzdeterminante (83 Stämme; 37,4 %), eine Zweierkombination (69 Stämme; 31,1 %) oder eine Dreierkombination von Virulenzgenen (34 Stämme; 15,3 %). Vier Gene für Virulenzfaktoren in Kombination zeigten sich lediglich in sieben Stämmen (3,1 %). Insbesondere die Anwesenheit von 5 bis 18 differenten Virulenzgenen pro Genom traten nur mit einer geringen Frequenz in zusammen 16 Isolaten (7,2 %) auf. Das absolut häufigste Virulenz-assoziierte Gen, das nachgewiesen wurde, war fimH, das für die mannosespezifische Adhäsinuntereinheit der Typ1-Fimbrien kodiert. Insgesamt gaben 88,7 % aller 222 untersuchten Stämme ein positives Signal in der Multiplex-PCR, und zwar 89,9 % der 199 klinischen Isolate sowie 85,7 % der Isolate chronischer Mastitiden. In etwa der Hälfte aller untersuchten Stämme trat auch das Gen traT auf, das Serumresistenz vermittelt (43,7 %). Die Genkombination fimH-traT wurde in wechselnden Konstellationen in insgesamt 83 Stämmen (37,3 %) gefunden. Sie ist damit die häufigste Virulenzgenkombination in den untersuchten E. coli-Genomen mit multiplen Virulenzdeterminanten. Da bei Rinder-Mastitis besonders in den schweren Fällen systemische Verläufe fördernde Faktoren wie Serumresistenz eine bedeutende Rolle spielen, könnte hier eine Selektion auf genetische Kopplung von traT mit fimH vorliegen. Deutlich geringere Prävalenzen wiesen die Virulenzgene für α-Hämolysin (hlyA, 10,8 %), den Yersiniabactinrezeptor (fyuA, 12,2 %) sowie das ebenfalls an der Serumresistenz beteiligte Gen iss (8,5 %) auf. Nur 13 (5,8 %) der 222 E. coli-Isolate besaßen keines der untersuchten Virulenzgene. Das Fehlen bekannter Virulenzgene in diesen Stämmen deutet darauf hin, dass weitere unberücksichtigte Faktoren eine Rolle bei der Virulenz von Mastitisisolaten spielen könnten oder der Status des Wirtsorganismus in diesen Fällen ausschlaggebend für eine erfolgreiche Infektion des Euters sein könnte. Offensichtlich sind die meisten der untersuchten E. coli- Virulenzfaktoren für die Pathogenese der Rindermastitis von untergeordneter Bedeutung. Von den 222 Isolaten zählten insgesamt 137 Stämme zur phylogenetischen Linie (ECOR-Gruppe) A, 62 zur ECOR-Gruppe B1, 20 zur ECOR-Gruppe B2 und 14 zur Gruppe D. Die Stämme, die zu den phylogenetischen Entwicklungslinien A, B1 und D gehören, unterschieden sich hinsichtlich der Prävalenz der Virulenzfaktormuster nicht vom Gesamtbild. Lediglich Isolate der ECOR-Gruppe B2 wiesen eine für sie typische Häufung von Virulenzgenclustern auf. Das relativ geringe Vorkommen bzw. weitgehende Fehlen (5 von 8) von Adhäsingenen spezifisch tierpathogener E. coli lässt darauf schließen, dass bislang beschriebenen Rinder-pathogenen E. coli keine Bedeutung als Verursacher einer Rindermastitis zukommt. Für die Analyse der chronischen Verlaufsform der Mastitis standen nur 21 Isolate zur Verfügung, die keinen hinreichend gesicherten Vergleich zu den Fällen mit akuter klinischer Mastitis (199 Stämme insgesamt) erlauben. Die auffällige Zunahme des Hämolysingens hlyA (23,8 %) gegenüber 9,5 % in den klinischen Isolaten (und 10,8 % in allen Stämmen) müsste in künftigen Untersuchungen invasiven Verhaltens der ExPEC beobachtet werden. Die Ergebnisse dieser Arbeit legen nahe, dass eine bovine Mastitis durch verschiedene E. coli-Varianten hervorgerufen werden kann und ein großes Potential extraintestinaler Virulenzfaktoren dazu nicht erforderlich ist. Entscheidend ist eine durch das fimH-Gen vermittelte Adhäsion, in der Hälfte der untersuchten Fälle unterstützt durch das Serumresistenz vermittelnde Gen traT. N2 - Studies on the spread of virulence factors of extra intestinal Pathogenic Escherichia coli strains in isolates of bovine Mastitiden KW - Escherichia coli KW - Escherichia coli-Stämme KW - extraintestinal pathogener E. coli KW - Virulenzfaktoren KW - Mastitis KW - Escherichia coli strains Y1 - 2010 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-53884 ER - TY - THES A1 - Frank, Astrid Christina T1 - Untersuchungen zur Verbreitung von Pathogenitätsinseln unter pathogenen Escherichia coli T1 - Investigation on the distribution of pathogenicity islands in pathogenic Escherichia coli N2 - Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen erstmals die weite Verbreitung des IS100 innerhalb der Spezies E. coli und große Ähnlichkeiten bezüglich der chromosomalen Lokalisationen einzelner Kopien in einem heterogenen Kollektiv von E. coli-Stämmen. N2 - The results of the present study attest to the wide distribution of the IS100 element among bacteria of the E. coli species and reveal significant similarities with regard to the chromosomal localisation of numerous single copies within a heterogenous E. coli strain collection. KW - Escherichia coli KW - Transposon KW - IS100 KW - Pathogenitätsinsel KW - Escherichia coli KW - transposon KW - IS100 KW - pathogenicity islands Y1 - 2010 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-54111 ER - TY - THES A1 - Krumbholz, Grit T1 - Untersuchungen zur Struktur, Regulation und Funktion des nichtribosomalen Peptid-Polyketids Colibactin aus E. coli T1 - Examination of structure, regulation, and function of the non-ribosomal peptide-polyketide colibactin in E. coli N2 - Polyketide (PK) und nichtribosomale Peptide (NRP) sind zwei grosse Klassen von Naturstoffen, die eine grosse Vielfalt hinsichtlich ihrer Struktur und Funktion aufweisen. Sie werden von einer Reihe von Bakterien, Pilzen und Pflanzen als Sekundärmetabolite produziert und besitzen eine Vielzahl pharmakologisch wichtiger Aktivitäten, wie z.B. antimikrobielle, antimykotische, antitumorale oder antiparasitische Wirkungen. Ein Grossteil der bakteriellen Produzenten findet sich im Phylum Firmicutes, innerhalb der Gattungen Bacillus, Streptomyces und Mycobacterium. In E. coli sind Polyketide und nichtribosomale Proteine von eher geringer Bedeutung, mit Ausnahme der Siderophore Enterobactin und Yersiniabactin. Unerwartet war daher die Identifizierung eines neuen PKS/ NRPS-Gencluster in verschiedenen E. coli-Stämmen. Das 2006 durch NOUGAYRÈDE et al. zuerst beschriebene Colibactin-Gencluster kodiert für ein hybrides System aus modularen Polyketidsynthasen und nichtribosomalen Peptidsynthetasen sowie für zusätzliche editierende Enzyme und einen möglichen transkriptionellen Regulator (ClbR). Das Produkt der PKS/NRPS-Synthasen, Colibactin, übt in vitro einen zytopathischen Effekt (CPE) auf Säugerzelllinien aus. Die zytopathische Aktivität Colibactins zeichnet sich u.a. durch die Induktion von Doppelstrangbrüchen in der DNA der eukaryotischen Zellen aus. Darüber hinaus kommt es zu einer Unterbrechung des Zellzyklus in der G2-Phase nach einer transienten in vitro Infektion mit Colibactin-positiven Bakterienstämmen. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit war besonders die weitere Aufklärung der Struktur des Colibactinclusters sowie die regulatorischen Mechanismen, die die Exression des hybriden nichtribosomalen Peptid-Polyketids von Interesse. Eine Transkriptionsanalyse führte zur Identifizierung der Transkriptionsstartpunkte der meisten relevanten Gene des Colibactinclusters. Basierend auf diesen neugewonnenen Informationen war eine Sequenzanalyse der upstream-Bereiche der Gene möglich, in deren Ergebnis neben den Elementen eines Sigma70-abhängigen Promotors, putative Bindestellen für mehrere Transkriptionsfaktoren identifiziert wurden. Untersuchungen zur Regulation der Colibactinsynthese zeigten, dass die Expression der Colibactin-Gene sowohl unter Kontrolle des Transkriptionsfaktors H-NS als auch des Colibactin-spezifischen Regulators ClbR stehen. Neben der Aufklärung der Struktur und Regulation der Colibactin-Gene bestand das Ziel dieser Arbeit in der Optimierung der Synthese des nichtribosomalen Peptid-Polyketids. Hierfür durchgeführte Expressionstudien zeigten einen Einfluss von Fettsäuren und Indol sowie von der Sauerstoffverfügbarkeit auf die Promotoraktivität einzelner Gene des Colibactin-Genclusters. Darüberhinaus konnte das pks-Genclusters erfolgreich in Pseudomonas putida KT2440 transferiert werden sowie der Nachweis der Funktionsfähigkeit Colibactins in diesem Wirtsorganismus nachgewiesen werden. Wenngleich die Stabilität des für diesen Zweck konstruierten Shuttle-Vektors nicht von Dauer ist, konnte gezeigt werden dass Pseudomonas putida prinzipiell als Wirtssystem für die Realisierbarkeit der heterologen Expression von Colibactin, geeignet ist. Zusätzlich zur Strukturanalyse des pks-Clusters und den Studien zur Expression der Colibactin-Gene befasste sich die hier vorliegende Arbeit mit der Fragestellung nach der biologischen Funktion Colibactins. Phänotypische Untersuchungen zeigen sowohl eine Beeinflussung der Eisenaufnahme als auch der Biofilmbildung durch das nichtribosomale Peptid-Polyketid. Dies sind die ersten Hinweise die zur Aufklärung der Funktion Colibactins beitragen könnten. N2 - Polyketides (PK) and nonribosomal peptides (NRP) are two large classes of natural products showing a great variety in structure and function. They are produced as secondary metabolites by a range of bacteria, fungi and plants and exhibit a wealth of pharmacologically important activities, including antimicrobial, antifungal, antitumor or antiparasitic properties. The vast majority of bacterial producers belong to the phylum Firmicutes, especially to the genera Bacillus, Streptomyces and Mycobacterium. With the exception of the siderophores enterobactin and yersiniabactin polyketides and nonribosomal peptides are of minor relevance within E. coli. Therefore unexpected was the identification of a new PKS/ NRPS gene cluster in several E. coli strains. The colibactin gene cluster being described for the first time in 2006 by NOUGAYRÈDE et al. is coding for a hybrid system of modular polyketide synthases and nonribosomal petid synthetases as well as editing enzymes and a putative transcriptional regulator (ClbR). The product of these PKS/ NRPS synthases, termed colibactin, induces in vitro a cytopathic effect (CPE) on mammalian cell lines. The cytopathic activity of colibactin is characterized by the induction of double strand breaks in the DNA of eukaryotic cells as well as the arrest of the cell cycle in G2 phase after transient infection with E. coli strains expressing colibactin. In context of this thesis especially the elucidation of the regulation of clb operon transcription and the organisation of transcriptional units within the colibactin-encoding genomic island were of main interest. A transcriptional analysis led to the identification of the transcriptional starting points of most of the relevant genes within the colibactin cluster. Based on these newly obtained information it was possible to perform a sequence analysis of the upstream regions of the genes resulting in the detection of sigma70 depending promoter elements and several putative transcription factor binding sites. Studies on the regulation of the colibactin synthesis could also demonstrate that the expression of colibactin genes are under control of the transcription factor H-NS as well as the colibactin specific regulator ClbR. Beside the studies concerning the structure and regulation of colibactin genes optimization of the nonribosomal peptid-polyketid was object of this work. Therefor performed expression analysis showed an influence of fatty acids and indole, as well as the oxygen availability on the promoter activities of single genes within the colibactin gencluster. Further investigations belonging the transcriptome and the proteome of the Colibactin expressing strain E. coli Nissle 1917 showed an over all influence of Colibactin synthesis on the amino acid and carbohydrate metabolism of this strain. Further more a successful transfer of the pks gene cluster into Pseudomonas putida KT2440 was carried out as well as the demonstration of functionality of colibactin in this host organism. Even though long term stability of the constructed shuttle vector was not given it was shown that Pseudomonas putida is a suitable host for realizing the heterologous expression of colibactin. Additionally to the structural analysis of the pks cluster and the studies on expression of the colibatin genes this thesis questioned on the biological function of Colibactin. Phenotypical examination showed an influence of the iron upake as well as on biofilm formation due to the nonribosomal peptid – polyketide. These are the first evidences that could contribute the elucidation of Colibactin function. KW - Polyketid-Synthasen KW - Escherichia coli KW - polyketide synthases KW - Escherichia coli Y1 - 2010 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-64789 ER - TY - THES A1 - Homburg, Stefan T1 - Untersuchungen zur Molekularbiologie von Escherichia coli-Wildstämmen T1 - Investigations on the molecular biology of Escherichia coli wildtype strains N2 - Eine eindeutige Unterscheidung zwischen extraintestinal pathogenen (ExPEC) und kommensalen E. coli-Stämmen zu treffen, fällt häufig schwer, da Virulenz-assoziierte Faktoren von ExPEC auch in kommensalen Stämmen gefunden werden können. Als naher Verwandter des uropathogenen Isolates E. coli CFT073 weist der apathogene, kommensale Stamm E. coli Nissle 1917 (O6:K5:H1) die Expression einer Vielzahl solcher „ExPEC-Virulenzfaktoren“ auf. Dazu gehören verschiedene Fimbrien, Siderophore und Proteine, die an der Biofilmbildung beteiligt sind. Der Vergleich des Stammes mit ExPEC-Isolaten lässt daher Rückschlüsse auf die Funktion dieser Faktoren im jeweiligen ökologischen Kontext zu. E. coli Nissle 1917 bildet den sog. rdar-Morphotyp aus, eine multizelluläre Struktur, die auf der Koexpression von Zellulose und Curli-Fimbrien beruht. Dieser findet sich bei vielen E. coli und Salmonella-Spezies, tritt aber in der Regel nur bei Temperaturen unterhalb 30 °C auf. E. coli Nissle 1917 hingegen weist diesen Phänotyp auch bei 37 °C auf, was vermutlich die Kolonisierungsfähigkeit gegenüber anderen kommensalen E. coli erhöht. Hier konnte demonstriert werden, dass die Expression des rdar-Morphotyps bei E. coli Nissle 1917 unabhängig von den bisher beschriebenen Regulatoren CsgD und YaiC ist. Mittels Mutagenese mit dem Transposon miniTn5 wurde nach rdar-negativen Klonen gesucht mit dem Ziel, einen möglichen übergeordneten Regulator dieses Phänotyps zu identifizieren. Bei dieser Untersuchung wurden einige Gene ermittelt, die bislang nicht dafür bekannt waren, die Expression von Zellulose oder Curli-Fimbrien zu beeinflussen. Während die Funktion vieler der ermittelten ORFs unbekannt war, hatte vor allem die Inaktivierung von Genen, die an der Biosynthese von Oberflächenstrukturen (Fimbrien, Kapsel, Colansäure, LPS) einen veränderten Phänotyp zur Folge. Allerdings konnte in den wenigsten Fällen ein Zusammenhang zu Curli- oder Zellulosesynthese hergestellt werden. Es zeigte sich, dass die Regulation des rdar-Morphotyps offenbar komplexer und von mehr Faktoren zumindest indirekt abhängig ist, als bislang beschrieben. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde eine 55 kb große genomische Insel untersucht, die im asnW-tRNA-Lokus inseriert ist und die Proteine für die Synthese eines hybriden nichtribosomalen Peptid-Polyketids kodiert. Die Insel konnte mittels PCR in extraintestinal pathogenen sowie kommensalen Isolaten der phylogenetischen Gruppe B2 nachgewiesen werden, darunter die Stämme E. coli Nissle 1917, IHE3034, CFT073 und J96. Eine Kokultivierung von HeLa-Zellen mit diesen Bakterien hatte eine Blockierung des Zellzyklus und Megalozytose (zytopathischer Effekt) zur Folge. Die Deletion der asnW-Insel führte zur Aufhebung des zytopathischen Phänotyps, der durch Einbringen des Genclusters auf einem BAC-Vektor wieder hergestellt werden konnte. Der zytopathische Effekt konnte nur nach direktem Kontakt der Bakterien mit HeLa-Zellen beobachtet werden und war weder durch Bakterienlysate, abgetötete Bakterien oder Kulturüberstände zu erzielen. Das PKS/NRPS-Gencluster umfasst 18 ORFs (clbA bis clbR), von denen 17 an der Synthese der aktiven Komponente beteiligt sind. Die Anzahl der Genprodukte und die Abfolge der putativen Domänen unterscheidet sich dabei von allen bislang beschriebenen PKS/NRPSSystemen. Untersuchungen zur Transkription ergaben drei monocistronisch und vier teilweise sehr große (bis 23 kb) polycistronisch transkribierte Einheiten aus bis zu sechs ORFs. Zudem konnte eine konstitutive Transkription aller ORFs festgestellt werden, wenngleich in unterschiedlicher Stärke. Nach Kontakt mit HeLa-Zellen wurde keine erhöhte Transkription oder Promotoraktivität einzelner ORFs festgestellt. Daher scheint die Kontaktabhängigkeit des zytopathischen Effekts nicht auf einer durch HeLa-Zellen hervorgerufenen Induktion der PKS/NRPS-Expression zu beruhen. Die Kontaktabhängigkeit konnte durch die Induktion bzw. Überexpression einer PKS/NRPS (clbB), den putativen Schlüsselenzymen Thioesterase (clbQ) und Phosphopantetheinyl-Transferase (clbA) oder dem möglichen Regulator clbR nicht überwunden werden. Mittels Luziferase-Reportergenfusionen konnte ein Einfluss unterschiedlicher Medien und Kulturbedingungen auf die Promotoraktivität einzelner Gene festgestellt werden. Dies wurde auf den Einfluss des BarA/UvrY- Zweikomponentensystems zurückgeführt, welches über CsrA/CsrBC den Kohlenstoff-Metabolismus von E. coli post-transkriptional reguliert. Die natürliche uvrY-Deletionsmutante UPEC 536 wies trotz des Besitzes des kompletten PKS/NRPS-Genclusters keinen zytopathischen Effekt auf. Dieser konnte jedoch durch Komplementation mit uvrY wieder hergestellt werden. Dies ist der erste Hinweis für einen außerhalb der asnW-Insel liegenden Regulationsmechanismus der PK/NRP-Synthese. Die Funktion des Peptid-Polyketids in vivo bleibt weiterhin unklar und könnte sowohl Fitness als auch Virulenz von E. coli beeinflussen. N2 - In many cases, it is difficult to draw a clear distinction between extraintestinal pathogenic (ExPEC) and commensal E. coli strains as virulence-associated factors of ExPEC can also be found in commensal strains. Being closely related to the uropathogenic strain CFT073 E. coli Nissle 1917 (O6:K5:H1) exhibits expression of several of such “ExPEC virulence factors”. Belonging to those are various fimbriae, siderophores, and proteins involved in biofilm formation. Therefore, the comparison of ExPEC isolates and E. coli Nissle 1917 can reveal insights into the function of these factors within the respective ecological context. E. coli Nissle 1917 exhibits the so-called rdar morphotype, a multicellular structure based on the co-expression of cellulose and curli fimbriae. It can be found in many E. coli and Salmonella species, but is usually restricted to temperatures below 30 °C. However, E. coli Nissle 1917 features this phenotype also at 37 °C which might increase its colonization ability compared to other commensal E. coli. Here, it could be demonstrated that expression of the rdar morphoype in E. coli Nissle 1917 is independent of the two regulators described so far, CsgD and YaiC. Thus, by applying transposon mutagenesis using miniTn5 it was screened for rdar-negative mutants. The aim was to discover a superordinate regulator of this phenotype. During this investigation, several genes were identified which so far had not been reported to influence expression of cellulose or curli fimbriae. While the function of many of the determined ORFs was unknown, the inactivation primarily of genes involved in the biosynthesis of surface structures (fimbriae, capsule, colanic acid, LPS) resulted in an altered phenotype. However, only in a few cases a connection to the biosynthesis of curli fimbriae or cellulose could be established. In conclusion, the regulation of curli and cellulose biosysnthesis proved to be more complex and dependent – at least indirectly – on more factors than previously described. In the second part of this thesis, a genomic island, 55 kb in size and inserted into the asnW-tRNA locus, was investigated, which encodes proteins necessary for the synthesis of a hybrid nonribosomal peptide-polyketide. By PCR the island was proven to be present in extraintestinal pathogenic as well as in commensal isolates of the phylogenetic group B2, among those the strains E. coli Nissle 1917, IHE3034, CFT073, and J96. Cocultivation of HeLa cells with those bacteria induced cell cycle arrest and megalocytosis (cytopathic effect). Deletion of the asnW island resulted in abolition of the cytopathic effect, which could be restored by introduction of a BAC vector containing the gene cluster. The cytopathic effect was only observed after direct contact of the bacteria with HeLa cells and could not be achieved using bacterial lysates, killed bacteria or culture supernatants. The PKS/NRPS gene cluster comprises 18 ORFs (clbA to clbR) of which 17 are involved in the synthesis of the active compound. The number of gene products and the sequence of putative domains differ from those of all PKS/NRPS systems described so far. Investigations on the transcription of the island revealed three monocistronically transcribed units and four polycistrons of sizes up to 23 kb. In addition, a constitutive transcription of every ORF was observed, albeit at variable levels. Upon cell contact, neither elevated transcription nor different promoter activities of single ORFs were observed. Thus, the contact dependence of the cytopathic effect does not seem to result from an induction of expression caused by HeLa cells. The contact dependence could not be overcome by induction or overexpression of either a PKS/NRPS (clbB), the putative key enzymes thioesterase (clbQ) and phosphopantetheinyl transferase (clbA), or the potential regulator clbR. Using luciferase reporter gene fusions an influence of diverse media and culture conditions on the promoter activities of singele genes was detected. This was ascribed to the influence of the BarA/UvrY two-component system, which regulates the carbon metabolism of E. coli on the post-transcriptional level via CsrA/CsrBC. The natural uvrY deletion mutant UPEC 536, despite containing the complete PKS/NRPS gene cluster, did not exhibit an cytopathic effect. However, this feature could be restored by complementation with uvrY. This is the first evidence for an regulatory mechanism of the PK/NRP synthesis located beyond the asnW island. The in vivo function of the peptide-polyketide so far remains unclear, but it might affect fitness as well as virulence of E. coli. KW - Escherichia coli KW - Virulenzfaktor KW - Biofilm KW - Molekulargenetik KW - Fitness KW - Biofilm KW - Polyketid KW - Regulation KW - fitness KW - biofilm KW - polyketide KW - regulation Y1 - 2007 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-22884 ER - TY - THES A1 - Middendorf, Barbara T1 - Untersuchungen zur Instabilität von Pathogenitätsinseln des uropathogenen Escherichia coli Stammes 536 : "Island Probing" von PAI I(536) - PAI V(536) T1 - Studies on the instability of pathogenicity islands of the uropathogenic Escherichia coli strain 536: 'Island Probing' of PAI I(536) - PAI V(536) N2 - Der uropathogene Escherichia coli Stamm 536 (O6:K15:H31) stammt aus einem Patienten mit akuter Pyelonephritis und ist heute einer der Hauptmodellorganismen für Studien zum Vorkommen und zur Funktionalität von Pathogenitätsinseln (PAIs). Sein Genom enthält sechs genetische Elemente (PAI I(536) bis PAI VI(536)), die an unterschiedlichen Stellen des Chromosoms integriert sind und die Hauptkriterien für PAIs erfüllen. Sie kodieren für viele Virulenzfaktoren des Stammes, sind am 3' Ende von tRNA Genen integriert, enthalten teils kryptische Fragmente mobiler genetischer Elemente wie Integrase- oder Transposasegene und werden meist von IS Elementen oder 'direct repeats' (DRs) flankiert. Darüber hinaus haben sie die Tendenz, instabil zu sein und aus dem Chromosom zu deletieren. Mit Ausnahme von PAI IV(536) sind alle PAIs von E. coli 536 mit intakten Integrasegenen assoziiert, die zu int Genen des Coliphagen P4 bzw. des Shigella flexneri Phagen SfX ähnlich sind. Neuere Untersuchungen zeigen, daß diese Gene exprimiert werden und für funktionelle Enzyme kodieren. Zusätzlich werden die PAIs ebenfalls mit Ausnahme von PAI IV(536) von DRs unterschiedlicher Größe flankiert, die den Randbereichen von Prophagen im prokaryontischen Chromosom entsprechen. Es ist daher wahrscheinlich, daß PAI-Deletionen vergleichbar zum Insertions-/Exzisionsmechanismus von Bakteriophagen durch die jeweilige PAI-assoziierte Integrase vermittelt werden und durch ortsspezifische Rekombination zwischen den flankierenden DRs erfolgen. Die Instabilität von PAI I(536) und PAI II(536) ist schon früh belegt worden. Jede Insel kodiert für eine Hämolysindeterminante und ihre Kodeletion führt zu einem ahämolytischen Phänotyp, der mit einer Häufigkeit von 3×10(-5) in vivo und bis 1x10(-3) in vitro auftritt. Die Exzision erfolgt durch ortsspezifische Rekombination zwischen den 16 bp bzw. 18 bp großen flankierenden DRs der PAIs. Da den übrigen E. coli 536-spezifischen PAIs entsprechende phänotypische Marker fehlen, wurde in der hier vorliegenden Arbeit das 'Island Probing'-Verfahren angewendet, um die Instabilität von PAI I(536) bis PAI V(536) im Detail zu untersuchen. Dazu wurde der negative Selektionsmarker sacB separat in die PAIs integriert. Zellen, die diesen Marker tragen, sind saccharosesensitiv und können nur in Gegenwart hoher Saccharosekonzentrationen wachsen, nachdem die sacB-markierte PAI aus dem Chromosom deletiert wurde. Auf diese Weise konnten von sacB-markierten Derivaten des Stammes E. coli 536 gezielt PAI-negative Zellen isoliert werden, um die Grunddeletionsraten der PAIs zu bestimmen und ihre Randbereiche zu analysieren. Zusätzlich wurde der Einfluß verschiedener Umwelteinflüsse wie niedrige/hohe Temperatur, osmotischer Streß, Nährstoffmangel, subinhibitorische Antibiotikakonzentrationen oder die Gegenwart konjugativer Plasmide auf die Exzisionsrate untersucht. Die in dieser Arbeit vorgestellten Daten zeigen, daß PAIs von E. coli 536 mit unterschiedlicher Häufigkeit deletieren. Während PAI II(536) und PAI III(536) mit Deletionsraten von 2×10(-5) bzw. 5x10(-5) am instabilsten sind, liegen die Exzisionsraten von PAI I(536) und PAI V(536) mit 2x10(-6) bzw. 1×10(-6) niedriger und deuten auf eine fortschreitende Stabilisierung dieser PAIs hin. Im Gegensatz dazu ist PAI IV(536) bereits vollständig stabil in das Chromosom eingebettet. Während die Exzision von PAI I(536), PAI II(536) und PAI V(536) RecA-unabhängig ist und auf ortsspezifischer Rekombination zwischen ihren flankierenden DRs beruht, treten bei PAI III(536) zwei alternative Deletionsmechanismen auf. Die Exzision dieser PAI erfolgt entweder vollständig durch ortsspezifische Rekombination zwischen den flankierenden DRs oder partiell durch homologe Rekombination zwischen zwei IS100 Elementen innerhalb der PAI. Unabhängig vom Rekombinationsmechanismus führt die Deletion aber in allen Fällen zur Bildung zirkulärer Intermediate (CIs), die vermutlich aufgrund fehlender Replikationsstartpunkte bei nachfolgenden Zellteilungen verlorengehen. Obwohl CIs von PAI II(536) und PAI III(536) mit Hilfe spezifischer PCR-Reaktionen identifiziert werden konnten, war ein PCR-Nachweis PAI I(536)- und PAI V(536)-spezifischer CIs bedingt durch die niedrigen Deletionsraten dieser Inseln nicht möglich. Interessanterweise konnte in dieser Arbeit erstmalig gezeigt werden, daß die Deletion von PAI II(536) und PAI III(536) bei niedriger Wachstumstemperatur, hoher Zelldichte und Nährstoffmangel in vitro induzierbar ist, d. h. unter Bedingungen, die auch in natürlichen Biofilmen auftreten können. Andere Bedingungen wie osmotischer Streß, subinhibitorische Antibiotikakonzentrationen oder die Anwesenheit konjugativer Plasmide haben keinen Einfluß auf die Deletionsrate der PAIs. Insgesamt deuten die Ergebnisse darauf hin, daß die Instabilität von PAIs bei E. coli 536 in vivo eine wichtige Rolle spielt indem sie zur Genomflexibilität und Evolution sowie zur Modulation der Virulenzgenexpression der Bakterien beiträgt. N2 - The uropathogenic Escherichia coli strain 536 (O6:K15:H31) was originally isolated from a patient suffering from acute pyelonephritis and is now one of the best-characterized model organisms to study the existence and functionality of pathogenicity islands (PAIs). Its genome carries six genetic elements (PAI I(536)-PAI VI(536)), which are inserted at different sites of the chromosome and exhibit the main features of PAIs: They encode many virulence genes of this strain, they are inserted at the 3’ end of tRNA genes, they are associated with sometimes cryptic fragments of mobile genetic elements such as integrase genes or transposase genes, and they are flanked by IS elements or direct repeats (DRs). Furthermore, they have the tendency to be instable and to delete from the chromosome. With the exception of PAI IV(536) all PAIs of E. coli strain 536 are associated with intact integrase genes, which are similar to the int genes of coliphage P4 and the Shigella flexneri phage SfX, respectively. Recently, it was shown, that these genes can be expressed and code for functional enzymes. Furthermore, with exception of PAI IV(536), the PAIs of strain 536 are flanked by DRs of different size, which correspond to the left and right end junctions of prophages in the prokaryotic chromosome. Therefore, it is very likely, that comparable to the insertion/excision mechanism of bacteriophages the deletion of PAIs is mediated by the respective PAI-encoded integrase and functions via site-specific recombination between the flanking DRs. Instability of PAI I(536) and PAI II(536) has been described very early. Each island encodes a hly gene cluster and their co-deletion leads to a non-hemolytic phenotype, which can appear with a frequency of 3x10(-5) in vivo and up to 1x10(-3) in vitro. The excision of both PAIs is the result of site-specific recombination between their 16 bp and 18 bp flanking DRs, respectively. Since all other E. coli 536-specific PAIs lack a comparable phenotypic marker, we used the 'Island Probing' approach to investigate the instability of PAI I(536) to PAI V(536) in more detail. For this purpose, the counterselectable marker sacB was integrated separately into the PAIs. Cells carrying this marker have a sucrose sensitive phenotype and are only able to grow on high concentrations of sucrose after the deletion of the sacB-labeled PAI from the chromosome. Thus, we were able to isolate PAI-negative cells systematically from sacB-positive derivatives of E. coli strain 536 to estimate the basic deletion rate of the PAIs and to analyze their junctions to the chromosome in more detail. Additionally, the influence of different environmental conditions such as low or elevated temperature, osmotic stress, depletion of nutrients, subinhibitory concentrations of antibiotics, and the presence of conjugative plasmids on the excision rate of the PAIs was investigated. According to the data presented in this study, PAIs of E. coli strain 536 delete with different frequencies. While PAI II(536) and PAI III(536) are the most unstable islands with deletion rates of 2×10(-5) and 5×10(-5), respectively, the excision rates of PAI I(536) and PAI V(536) are lower with values of 2×10(-6) and 1×10(-6), respectively, which indicates a progressive stabilization of these PAIs. In contrast, PAI IV(536) is already stably embedded in the chromosome. While the excision of PAI I(536), PAI II(536), and PAI V(536) is RecA-independent and is based on site-specific recombination between their flanking DRs, two alternative deletion mechanisms were identified in case of PAI III(536). This PAI either deletes in its entirety by site-specific recombination between its flanking DRs or partially by homologous recombination between two IS100 elements located within the PAI. Independent of the recombination mechanism, deletion leads in all cases to the formation of so-called circular intermediates (CIs), which lack an origin of replication and are probably lost during the following cell divisions. Such CIs of PAI II(536) and PAI III(536) were detected by specific PCR reactions, but an experimental proof of PAI I(536)- and PAI V(536)-specific CIs was not possible probably because of the low deletion rate of these islands. Interestingly, this study demonstrates for the first time that deletion of PAI II(536) and PAI III(536) is inducible by low incubation temperature, high cell density, and low nutrient supply, i.e. conditions that can also occur in natural biofilms. Other stimuli such as osmotic stress, subinhibitory antibiotic concentrations, or the presence of conjugative plasmids seem to have no effect on the deletion rates of the PAIs. In summary, the presented results suggest that instability of PAIs of the E. coli strain 536 is important in vivo by contributing to genome flexibility and evolution as well as to the modulation of virulence gene expression of the bacteria. KW - Escherichia coli KW - Virulenzfaktor KW - Pathogenitätsinseln KW - Genomplastizität KW - Deletionsrate KW - ortsspezifische/homologe Rekombination KW - zirkuläre Intermediate KW - pathogenicity islands KW - genome plasticity KW - deletion rate KW - site-specific/homologous recombination KW - circular intermediates Y1 - 2005 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-16573 ER - TY - THES A1 - Michaelis, Kai T1 - Untersuchungen zur Genomstruktur und Biofilmbildung von pathogenen Escherichia coli Isolaten T1 - Analysis of genome structure and biofilm formation of pathogenic Escherichia coli strains N2 - Das Kerngenom pathogener Escherichia coli Isolate wird von zahlreichen variablen Regionen unterbrochen, die meist durch horizontalen Gentransfer erworben wurden und über das ganze Chromosom verteilt sind. Diese variablen Bereiche tragen häufig Gene für Virulenz- und Fitnessfaktoren und sind oftmals nur instabil in das Chromosom integriert. Um die Verbreitung variabler Bereiche, die insbesondere Virulenzfaktoren kodieren, innerhalb verschiedener klinischer Isolate näher untersuchen zu können, wurde im Rahmen dieser Arbeit ein spezieller DNA-Array entwickelt. Dieser enthielt zahlreiche Sonden für Gene, die für die Virulenz von verschiedenen Erregern der Gattung E. coli als auch der Untergruppe Shigella charakteristisch sind. Mit diesem "Pathoarray" wurde die Verbreitung von Virulenzgenen in unterschiedlichen E. coli Isolaten untersucht. Zusätzlich wurden Unterschiede im Kerngenom mit Hilfe eines kommerziell erwerbbaren DNA-Arrays bestimmt. Ein Vergleich des Kerngenoms von uropathogenen Stämmen mit Derivaten, bei denen Pathogenitätsinseln deletiert sind, bestätigte die Auffassung, dass der Deletion von Pathogenitätsinseln ein spezieller Mechanismus zu Grunde liegt, von dem das Kerngenom nicht betroffen ist. Das Kerngenom der untersuchten Stämme war prinzipiell sehr konserviert und unterschied sich lediglich durch wenige Gene aus Bakteriophagen. Die größten Unterschiede wurden bei Genen beobachtet, die zum variablen Teil des Genoms gehören und charakteristisch für das jeweilige Isolat waren. Mit Hilfe der DNA-Array Technologie lassen sich auch Änderungen von Expressionsprofilen studieren, die von Mutationen oder durch Umwelteinflüsse bedingt werden. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde durch Transkriptomanalysen das RfaH-abhängige Regulon untersucht, insbesondere im Hinblick auf solche Gene, die die Biofilmbildung beeinflussen. Beim Vergleich der Transkriptome von E. coli 536rfaH mit dem Wildtyp wurde eine signifikant erhöhte Expression von Antigen 43 festgestellt. Im E. coli K-12 Stammhintergrund konnte dieses Oberflächenprotein als Hauptfaktor für die RfaH-abhängige Biofilmbildung identifiziert werden. Das verkürzte LPS-Kernoligosaccharid im Stamm MG1655rfaH hatte ebenfalls einen großen Einfluss auf die verstärkte Biofilmbildung. Vermutlich verstärkte die verbesserte Präsentation von Agn43 durch ein verkürztes LPS die Biofilmbildung signifikant. Andere Oberflächenstrukturen, wie die Colansäure-Kapsel, zeigten keinen Effekt auf die Biofilmbildung von E. coli MG1655rfaH. Neben den Expressionsprofilen der Stämme 536 und 536rfaH bei 37 Grad C wurden auch die Expressionsprofile bei 30 Grad C sowie von Biofilmen analysiert. Prinzipiell konnten bei allen untersuchten Wachstumsbedingungen nur geringe Unterschiede zwischen 536 und 536rfaH festgestellt werden. Beim Vergleich der unterschiedlichen Wachstumsbedingungen (Temperatureffekt und planktonische Zellen vs. Biofilm) wurden jedoch deutliche Unterschiede beobachtet. Sowohl Gene des Kerngenoms als auch Gene von Pathogenitätsinseln waren temperaturabhängig reguliert. Bei E. coli Isolaten lassen sich neben genomischen Unterschieden auch phänotypische Unterschiede beobachten. Es wurde festgestellt, dass die Biofilmbildung von E. coli Isolaten abhängig von verschiedenen Faktoren und molekularen Mechanismen ist. Zudem konnte dargelegt werden, wie Unterschiede in der Zusammensetzung der äußeren Membran durch eine veränderte LPS-Struktur und die Expression von Adhäsinen die Biofilmbildung beeinflussen können. N2 - Evolutionary adaptation is the driving force for the variability observed within genomes of all different Escherichia coli pathotypes. Beside the core genome, shared by all strains, also variable regions, which can be strain-specific, are scattered on the chromosome. These flexible regions mostly encode virulence factors as well as other fitness factors and are acquired through horizontal gene transfer but are also characterised by their instability. To shed a closer light on the distribution of these virulence factors among different clinical isolates, DNA-arrays were used for genome comparisons. One aim of this Ph.D. thesis was the design of a DNA-array with specific probes for typical virulence-related genes of pathogenic E. coli. With this tool in hand, the distribution of virulence genes among several E. coli isolates was analysed. In addition to virulence related genes, also differences in the core genome of well-known uropathogenic isolates of E. coli were detected using DNA-array technology. Furthermore, the core genome of different wildtype strains was compared with derivatives shown to have lost pathogenicity islands. The results confirmed the assumption that PAI deletion from core genome is a specific process and underlies a specific mechanism. The core genome itself was very conserved and the observed small differences related to genes derived from different bacteriophages. The majority of differences were detected for the flexible regions, which differ in a strain-specific manner. DNA-array technology is also a versatile tool to gain insights in changes of gene expression levels caused by gene function disorders or environmental differences. The expression profiling approach using DNA-arrays was employed in the second part of this thesis. In this work, the RfaH-related regulon was studied by transcriptome analysis. Besides the already known effect of RfaH on facilitated capsule, LPS and alpha-haemolysin expression, the focus was set on genes involved in biofilm formation. Comparison of the 536rfaH and the wildtype strain transcriptomes revealed a significant upregulation of agn43 transcript levels. In order to study the underlying mechanisms of RfaH-dependent increased biofilm formation, selected mutants of E. coli K-12 and 536 were generated and tested for their biofilm forming capacities. In MG1655rfaH we could show that Agn43 is the major factor leading to biofilm formation. In addition, this phenotype was dependent on the LPS core truncation coming along within rfaH deficient strains. In conclusion, these results demonstrated that the LPS core truncation leads to unshielding of Agn43 in this strain, thus supporting autoaggregation and biofilm formation. Other surface structures like colanic acid had no influence on this effect. Besides the expression profiles of strains E. coli 536 and 536rfaH at 37 degrees, also expression profiles at 30 degrees and in biofilms were analysed. Typical differences in either stage were characterised. In general, when comparing the expression profiles from wildtype and mutant the changes observed were very small. However, the influence of temperature and also the mode of growth (planktonic cells vs. biofilm) affected the expression profiles in both strains more severely. In conclusion, E. coli strains not only differ in their genotypes, moreover complex phenotypic differences are observable. The obtained phenotypic differences in biofilm formation were shown to be multifactorial. The phenotype was attributed to variances in the composition of the outer membrane. In this context, the influence of LPS structures and adhesin expression was pointed out. KW - Escherichia coli KW - Virulenzfaktor KW - Transkriptomanalyse KW - Genomvariabilität KW - DNA-Array KW - Transkriptomanalyse KW - Biofilmbildung KW - Phasenvariation KW - genome variability KW - DNA-array KW - transcriptome analysis KW - biofilm formation KW - phase variation Y1 - 2005 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-17593 ER - TY - THES A1 - Hüttinger, Christian T1 - Untersuchungen zur Aufklärung der In-vivo-Funktion des Zytolysins ClyA von Escherichia coli T1 - Analysis of the in vivo-function of the cytolysin ClyA from Escherichia coli N2 - Porenbildende Zytolysine stellen wichtige Virulenzfaktoren von vielen pathogenen Bakterien dar. In Escherichia coli-Stämmen wurden bisher drei verschiedene porenbildende Zytolysine identifiziert, nämlich das alpha-Hämolysin (HlyA), das EHEC-Hämolysin (EHEC-HlyA, Ehx) und das latente Hämolysin ClyA. Alpha-Hämolysin und EHEC-Hämolysin, die beide zur Familie der RTX-Toxine gehören, werden häufig von uropathogenen bzw. enterohämorrhagischen E. coli-Stämmen gebildet. Verschiedene Untersuchungen haben gezeigt, daß das alpha-Hämolysin maßgeblich an der Pathogenität von uropathogenen E. coli-Stämmen beteiligt ist. Das Hämolysin ClyA, ein Protein von 34 kDa das keine Homologien zu den RTX-Toxinen aufweist, wurde zuerst im Laborstamm E. coli K-12 identifiziert, wo es unter normalen in vitro-Kulturbedingungen nur in sehr geringem Ausmaß exprimiert wird. Ein funktionales clyA-Gen wurde kürzlich aber auch in verschiedenen pathogenen E. coli-Stämmen, u. a. in enteroinvasiven E. coli (EIEC)-Stämmen, gefunden. Bislang ist jedoch unbekannt, ob ClyA eine Rolle in der Virulenz von pathogenen E. coli-Stämmen spielt. Die vorliegende Arbeit sollte deshalb zur Aufklärung der in vivo-Funktion von ClyA in E. coli beitragen. Im Mittelpunkt des Interesses stand dabei die Frage nach der Bedeutung von ClyA für EIEC-Stämme, die zur fakultativ intrazellulären Lebensweise befähigt sind. Ausgewählte wildtypische EIEC-Stämme (EIEC 12860, EIEC 4608-58) zeigten von sich aus bzw. bei Überexpression des Transkriptionsregulators SlyA phänotypisch sichtbare hämolytische Aktivität, während in vitro konstruierte isogene clyA-"knock-out"-Mutanten dieser Stämme stets nichthämolytisch waren. Daraus konnte geschlossen werden, daß die wildtypischen EIEC-Stämme in der Lage sind, ClyA in signifikanten Mengen zu exprimieren. Vergleichende Infektionsstudien, die mit dem EIEC-Stamm 4608-58 und der entsprechenden clyA-Mutante unter Verwendung von J774-Makrophagen durchgeführt wurden, ergaben außerdem, daß ClyA wesentlich zur Zytotoxizität des wildtypischen EIEC-Stamms beiträgt. Eine spezielle Bedeutung von ClyA für die fakultativ intrazelluläre Lebensweise von EIECs konnte mit diesen Versuchen allerdings nicht nachgewiesen werden. Frühere Untersuchungen hatten gezeigt, daß im Fall des fakultativ intrazellulären Bakteriums Listeria monocytogenes ein porenbildendes Toxin, Listeriolysin O (LLO), nach der Invasion in phagozytische Zellen die Befreiung der Bakterien aus dem Phagosom ermöglicht. Es stellte sich deshalb die Frage, ob ClyA bei EIECs möglicherweise eine ähnliche Rolle spielt. Um dies herauszufinden, wurde in der vorliegenden Arbeit untersucht, inwieweit ClyA von E. coli in der Lage ist, LLO in L. monocytogenes funktional zu ersetzen. Hierzu wurden L. monocytogenes-Mutanten, die aufgrund von chromosomalen Deletionen nicht in der Lage waren, LLO zu produzieren, mit verschiedenen Plasmiden komplementiert, welche clyA bzw. clyA-Derivate unter der Kontrolle der Promotorregion des LLO-Gens (hly) enthielten. Einige dieser komplementierten Stämme exprimierten und sezernierten tatsächlich das ClyA-Protein und zeigten dementsprechend auch einen hämolytischen Phänotyp. Dieselben Stämme waren jedoch bei Infektionen in J774-Zellen nicht in der Lage, sich intrazellulär signifikant zu vermehren, obwohl teilweise eine Befreiung der Bakterien aus dem Phagosom zu beobachten war. Diese Daten zeigten, daß das ClyA-Protein von E. coli das Listeriolysin O von L. monocytogenes nicht funktional ersetzen kann. Eine mögliche Funktion von ClyA als Phagosomenöffner in EIECs kann aufgrund der vorliegenden Ergebnisse jedoch nicht ausgeschlossen werden. N2 - Pore-forming cytolysins are important virulence factors of many pathogenic bacteria. In E. coli strains, three different pore-forming cytolysins have been identified so far:alpha-hemolysin (HlyA), EHEC-hemolysin (EHEC-HlyA; Ehx) and the cryptic hemolysin (ClyA). alpha-hemolysin and EHEC-hemolysin are frequently produced by uropathogenic and enterohaemorrhagic strains. Both toxins are related cytolysins and belong to a large family referred to as RTX-toxins. Among these, alpha-hemolysin has been most extensively studied. Futher experiments have shown that alpha-hemolysin which is produced by uropathogenic E. coli strains (UPEC), contributes to the virulence of UPEC. Recently, the cryptic hemolysin ClyA, a protein of about 34 kDa showing no homology to any member of the RTX-family was identified in the laboratory strain E. coli K-12. Under standard in-vitro-laboratory conditions ClyA is not produced at detectable levels. Further studies demonstrated that clyA is not only present in E. coli K12 but also a functional clyA-gene has been detected in various pathogenic E. coli isolates (p.e. enteroinvasive E. coli strains). So far, the role of ClyA for the virulence of pathogenic E. coli strains is unknown. Therefore, in that work the in-vivo function of ClyA of pathogenic E. coli strains was investigated. Especially, in enteroinvasive E. coli (EIEC) strains, which are able to replicate intracellulary in mammalian cells and to evade into the cytoplasm of the host cell, the relevance of ClyA for EIEC strains is unknown. Carefully selected wildtyp EIEC strains (EIEC 12860, EIEC 4608-58) showed a clear hemolytic phenotyp per se and after overproduction of the positive regulatory protein SlyA, respectively, while in ClyA-knock-out-mutants of these wildtyp EIEC strains a hemolytic phenotyp has never been observed. All these findings indicate that ClyA is expressed in significant amounts in wildtyp EIEC strains under standard in-vitro-laboratory conditions. Further infection studies with J774 macrophages by using the EIEC strain 4608-58 and a isogenic ClyA deletion mutante, respectively, revealed that ClyA is a strong cytolysin in wildtyp EIEC strains, which contributes to the cytotoxicity of these wildtyp EIEC strains. But a special relevance of ClyA for the intracellulary growth of EIEC could not be seen in any of these experiments. Recent studies showed that the facultative intracellulary bacteria Listeria monocytogenes produce the poreforming toxin listeriolysin O (LLO), which allows L. monocytogenes by opening the phagosomal membrane to evade into the cytoplasma of the host cell after invasion into a phagocytic cells. However, the mechanism which allows EIEC strains to penetrate the phagosomal membran is still unknown. ClyA might play a similar role for opening the phagosomal membran after invasion of EIEC into host cells. In this work it has been investigated wether ClyA of E. coli might functionally replace LLO of L. monocytogenes. In addition, L. monocytogenes LLO mutants which have a chromosomal deletion of the LLO gene and thereby lost the ability to produce LLO, were complemented with several plasmids. These plasmids carrying clyA and clyA-derivates under the control of the listeriolysin O promotorregion, respectively, were substituted for the listeriolysin O gene in the L. monocytogenes LLO mutants. Some of the recombinant L. monocytogenes strains expressed ClyA and showed hemolytic activity and a hemolytic phenotyp. Further experiments with J774 macrophages revealed that some of these recombinant L. monocytogenes strains seemed to open the phagosomal membrane. In consequence some bacteria were able to escape from the phagosomal compartment, but were not able to grow in the cytosol of infected cells. However, when ClyA were expressed in recombinant L. monocytogenes strains, a fully virulence phenotype could not be restored in-vitro. Due to these findings, ClyA of E. coli might be involved in the opening of the phagosomal membrane and the virulence of EIEC strains. KW - Escherichia coli KW - Perforine KW - Zytolsin KW - Hämolysin KW - ClyA KW - EIEC KW - cytolysin KW - ClyA KW - EIEC Y1 - 2003 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-6817 ER - TY - THES A1 - Piechaczek, Katharine T1 - Untersuchungen zum Einfluß der Pathogenitätsinseln I536 und II536 auf die Genexpression des uropathogenen Escherichia coli Stammes 536 T1 - Studies on the influence of the pathogenicity islands I536 and II536 on the gene expression of the gene expression of the uropathogenic Escherichia coli strain 536 N2 - Escherichia coli wird als der häufigste Erreger von Harnwegsinfektionen des Menschen beschrieben. Um die Krankheit auslösen zu können, benötigen die Bakterien ganz bestimmte Eigenschaften, die als Virulenzfaktoren bezeichnet werden und durch die sie sich von apathogenen Stämmen unterscheiden. Der uropathogene E. coli Stamm 536 (O6:K15:H31) exprimiert verschiedene Virulenzfaktoren wie a-Hämolysin, die Adhäsine S-, P-related (Prf) und Typ 1-Fimbrien sowie das Kapselantigen K15. Außerdem wurden auch Enterobaktin- und Yersiniabaktin-Produktion sowie Serumresistenz nachgewiesen. Die Ausprägung der Virulenz hängt unter anderem mit dem Vorhandensein von Pathogenitätsinseln (PAI I536-V536) zusammen, die mit seltenen tRNA-Genen assoziiert sind. Die Deletion der Inseln PAI I536 und PAI II536 führt zum Verlust der Virulenz und zur Zerstörung der entsprechenden tRNA Gene. Es wurde festgestellt, daß die leuX-kodierte tRNA5Leu, die mit der PAI II536 assoziiert ist, einen Einfluß auf die Expression von Typ 1-Fimbrien sowie auf die Serumresistenz, Motilität und die Enterobaktin- und a-Hämolysin-Produktion hat. Ziel dieser Arbeit war die Analyse der Bedeutung der leuX-kodierten tRNA5Leu und der Pathogenitätsinseln I536 und II536 für die Expression von Proteinen sowie Typ 1-Fimbrien bei dem E. coli Stamm 536. Dazu wurde zunächst eine Proteomanalyse durchgeführt. Mit der Hilfe von 2D-Gelen wurde der Einfluß von leuX-kodierten tRNA5Leu und PAI I536 und PAI II536 auf die Expression verschiedener Proteine im E. coli Stamm 536 (PAI I536+, PAI II536+, leuX+) und seinen Mutanten: 536-21 (PAI I536-, PAI II536-, leuX-), 536D102 (PAI I536+, PAI II536+, leuX-) und 536R3 (PAI I536-, PAI II536-, leuX+) untersucht. Mit Hilfe von präparativen Gelen konnten in den zytosolischen Fraktionen 39 Unterschiede in der Expression von Proteinen nachgewiesen werden. Von diesen differentiell exprimierten Proteinen wurden 37 mit Hilfe von MALDI-TOF-MS identifiziert. Die zwei weiteren Proteine konnten nicht identifiziert werden. In den Kulturüberstandsfraktionen der untersuchten Stämme konnten drei Unterschiede in der Expression von Proteine nachgewiesen werden. Außerdem wurde der Einfluß der leuX-kodierten tRNA5Leu auf die Expression der Membranproteine der jeweiligen Stämme untersucht. Zu diesem Zwecke wurden sowohl ein- wie auch zweidimensionale Gele durchgeführt. Mit Hilfe von zweidimensionalen Gelen konnten zwischen den untersuchten Stämmen mehrere Unterschiede in der Expression von Proteinen festgestellt werden. Dabei konnten vier Unterschiede in der Proteinexpression detektiert werden. Mit Hilfe der 2 D-Gelelektrophorese wurde ein leuX-abhängiges Protein (YgaG), das ein Analogon des LuxS-Proteins ist, gefunden. Das LuxS-Protein ist ein Bestandteil des "Quorum sensing"-Systems von Vibrio harveyi und wird in ähnlicher Form bei vielen Bakterien beschrieben. Sein Einfluß auf die Pathogenität wurde bei vielen Bakterien beschrieben. Aus diesem Grund wurde eine ygaG-Mutante im E. coli Stamm 536 hergestellt. Anschließend wurde der Einfluß des YgaG-Proteins auf die Expression von Virulenzfaktoren überprüft und ein Proteomvergleich zwischen dem Wildtyp Stamm E. coli 536 und der ygaG-Mutante wurde durchgeführt. Die Expression der bekannten Virulenzfaktoren wurde von YgaG nicht beeinflußt. Weiterhin wurden Transkriptionsfusionen zwischen den Promotoren der fimB- und fimE-Gene mit dem promotorlosen ß-Galaktosidase-Gen (lacZ) konstruiert. Es sollte damit die Frage beantwortet werden, ob die leuX-kodierte tRNA5Leu als potentieller Regulator die Transkription von Typ 1-Fimbrien beeinflußt. Es konnten jedoch keine signifikanten Unterschiede in der Transkription von fimB und fimE zwischen dem Wildtyp Stamm 536 und der leuX-Mutante 536D102 festgestellt werden. N2 - Escherichia coli is one of the common causes of urinary tract infections. Pathogenic E. coli differ from non-pathogenic E. coli variants by the presence of certain virulence factors which contribute to their ability to cause disease. The uropathogenic E. coli strain 536 (O6:K15:H31) is able to produce different virulence factors such as a-hemolysin, fimbrial adhesins (P-, type 1 and S-fimbriae) and specific capsules. Furthermore the bacteria produce iron uptake systems like enterobactin and yersiniabactin and have the capacity to survive in human serum. The development of pathogenicity is connected to pathogenicity islands (PAI I536-V536). All four PAIs are associated with tRNA genes. The deletion of PAI I536 and PAI II536 results in the truncation of the associated tRNA gene and loss of virulence. The deletion of PAI II536 results in the truncation of the leuX gene. PAI II536 as well as leuX deletion mutants show a reduced production of type 1 fimbriae, flagellae and of the iron uptake system enterobactin. Furthermore, they show delayed hemolysin production and a reduced serum resistance. Additionally, the leuX-encoded tRNA5Leu may also regulate the expression of various other genes. The aim of this work was the further characterization and analysis of the role of PAI I536/II536 and of the tRNA5Leu for protein expression as well as for the regulation and expression of two site-specific recombinases, FimB and FimE, of the E. coli strain 536. Firstly, the protein expression patterns of E. coli 536 and different derivatives were studied. Differences in the protein expression pattern of the wild-type strain E. coli 536, its mutants 536-21 (PAI I536-, PAI II536-, leuX-), 536D102 (PAI I536+, PAI II536+, leuX-) and strain 536R3 (PAI I536-, PAI II536-, leuX+) were analyzed by two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis. With the help of preparative 2 D-gel electrophoresis 39 differentially expressed intracellular proteins could be identified. The identities of 37 proteins have been determined by MALDI-TOF mass spectrometry in Halle. Two of these proteins show no matches in sequence databases. The preparations of the culture supernatants resulted in 2 D proteinpatterns from which three protein spots whose expression is markedly altered in the different strains are identified. The influence of the tRNA5Leu on the expression of outer membrane proteins was also studied. Differences in the protein expression patterns of the wild-type strain 536 and the mutants were analyzed by one- and two-dimensional gel electrophoresis. The analysis of 2 D protein patterns of outer membrane preparation resulted in the detection of some proteinspots whose expression was altered in the different strain backgrounds. It was identified during the proteom analysis that tha expression of the YgaG protein was shown to be reduced in a leuX-negative background. This protein shows a strong homology to the LuxS protein of Vibrio harveyi. The LuxS protein is a component of the quorum sensing system. It has been shown that many bacteria express proteins similar to LuxS of V. harveyi and that quorum sensing may play a role in pathogenicity. To investigate whether YgaG contributes to the virulence of the E. coli strain 536, a ygaG deletion mutant was made. In addition, differences in the protein expression pattern of the wild-type strain E. coli 536 and the ygaG mutant were analyzed by 2 D gel electrophoresis. Whether YgaG contributes to the virulence of the E. coli Strain 536 has not be investigated. In order to get a deeper insight into the role of the tRNA5Leu as a potential regulator of the expression of the typ 1-fimbriae, a transcriptional fusion between the promotor area of fimB and fimE and the lacZ gene lacking its own promotor was constructed. However the transcription of fimB and fimE did not show any significant differences between the wild-type strain 536 and the leuX-mutant 536D102. KW - Escherichia coli KW - Harnwegskrankheit KW - Virulenzfaktor KW - Proteom KW - Proteom KW - Pathogenitätsinseln KW - leuX-tRNA KW - uropathogener E. coli Stamm 536 KW - Proteomics KW - Pathogenicity islands KW - leuX-tRNA KW - uropathogenic E. coli strain 536 Y1 - 2001 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-1862 ER - TY - THES A1 - Lindner, Karin T1 - Untersuchungen zum Einfluss der ATP-abhängigen Protease ClpXP auf die Regulation und Expression Virulenz-assoziierter Gene des uropathogenen E. coli Stammes 536 T1 - Influence of the ATP-dependent protease ClpXP on regulation and expression of virulence-associated genes of uropathogenic E. coli strain 536 N2 - Die ATP-abhängige Serinprotease ClpXP ist für die Kontrolle und Verfügbarkeit einer großen Anzahl von Enzymen und regulatorischer Proteine sowie für den Abbau fehlge-falteter Proteine verantwortlich. Sie besteht aus zwei Komponenten, der Protease ClpP und der ATPase ClpX, welche für die Substratspezifität verantwortlich ist und zusätzlich als Chaperon wirken kann. Durch den gezielten Abbau globaler Regulatoren wie dem alternativen Sigmafaktor RpoS kommt die regulatorische Funktion der Protease auf post-translationaler Ebene zum Tragen. Um den Einfluss der Protease ClpXP auf die Virulenz-eigenschaften uropathogener Escherichia coli zu studieren, wurde der uropathogene E. coli Stamm 536 als Modellorganismus verwendet. Uropathogene E. coli Stämme werden als häufigste Erreger von Harnwegsinfektionen des Menschen beschrieben. Der E. coli Stamm 536 (O6:K15:H31) unterscheidet sich von apathogenen Stämmen durch die Anwesenheit von bislang sechs charakterisierten Pathogenitätsinseln (PAIs), die für eine Reihe verschiedener Virulenzfaktoren wie Prf- und S-Fimbrien, alpha-Hämolysin, dem Kapselantigen K15 und Eisenaufnahmesystemen kodieren. Zudem exprimiert der Stamm Curli-Fimbrien, eine Flagelle vom Serotyp H31 und ist aufgrund seines glatten Lipopolysaccharid Phänotyps (O6 Antigen) serumresistent. Ziel dieser Arbeit war es, den Einfluss der Protease ClpXP auf die Regulation und Expression Virulenz-assoziierter Gene des E. coli Stammes 536 sowohl auf Protein-, als auch auf Transkriptebene näher zu charakterisieren. Um den Einfluss der clpX- und clpP-Deletion auf die Proteinexpression des E. coli Stammes 536 zu untersuchen, wurde die Methode der zweidimensionalen (2-D) Gelelektrophorese angewendet. Es wurden zytoplasmatische und extrazelluläre Proteine der logarithmischen und stationären Wachstumsphase untersucht und in diesem Zusammenhang jeweils ein internes Mastergel aller 93 identifizierten zytoplasmatischen und aller 127 identifizierten Proteinen des extrazellulären Proteoms angefertigt. In der zytoplasmatischen Fraktion konnte für 13 Proteine aus der logarithmischen und für 25 Proteine aus der stationären Wachstums-phase eine unterschiedliche Expression festgestellt werden. Die 2-D Analyse der Proteine aus dem Kulturüberstand ergab ein erhöhtes Sekretionsvermögen der clpX- und clpP-negativen Stämme sowohl in der logarithmischen als auch in der stationären Wachstums-phase. Darüber hinaus konnte eine reduzierte Expression von Hauptstrukturuntereinheiten der Prf-, S-, CS12-ähnlichen und Typ 1-Fimbrien sowie des Autotransporters Ag43 in den clpX- und clpP-Mutanten nachgewiesen werden. Zusätzlich wiesen diese Stämme eine verstärkte Expression des Flagellins FliC auf. Durch Western Blot-Analysen und weitere phänotypische Tests konnten die Ergebnisse aus den Proteomstudien für Prf-, S- und Typ 1-Fimbrien sowie für die Flagellenexpression bestätigt werden. Zudem war eine stark verlangsamte Expression von Curli und Cellulose bei Temperaturen unter 37 °C, eine erhöhte Motilität und ein „hyperflagellierter“ Phänotyp der clpX- und clpP-negativen Stämme zu beobachten. Demgegenüber hatte ClpXP keinen Einfluss auf die alpha-Hämolysinproduktion, die Expression des Lipopolysaccharides, die Serumresistenz und in vivo-Virulenz dieses Stammes. Bei anschließenden Transkriptionsanalysen (semiquantitative Real-Time Reverse Transkrip-tion (RT)-PCR) der Gene, welche für die Hauptstrukturuntereinheiten von Fimbrien kodieren, konnte eine reduzierte Transkription der Determinanten für Prf-, S-, und Curli-Fimbrien, aber eine erhöhte Transkription für Gencluster der Typ 1- und CS12-ähnlichen Fimbrien und keine Änderung der Transkriptmengen für Gene des Pix-Fimbrienoperons in den Mutantenstämmen nachgewiesen werden. Die Transkription der beiden Antigen 43 Varianten ORF52III und ORF47V war durch die Deletion von clpX und clpP gleichermaßen betroffen und deutlich reduziert. ClpXP hatte aber keinen Einfluss auf die Transkription des „Masterregulatorgens“ flhC der Flagellen-Regulationskaskade, beeinflusst jedoch die in der Hierarchie weiter unten liegender Operons positiv, da eine deutlich erhöhte Expression von fliA und fliC nachgewiesen werden konnte. Demzufolge hat ClpXP einen negativen regulatorischen Effekt auf die Flagellenexpression, der aber erst auf posttranskriptionaler oder posttranslationaler Ebene auftritt. Viele der beobachteten Einflüsse, v.a. auf die Flagellen- und Fimbrienexpression, konnten auf die fehlende regulatorische Wirkung von RpoS zurückgeführt werden, welches ausschließlich durch ClpXP degradiert wird. Zudem lassen die Ergebnisse vermuten, dass der globale Regulator Lrp, welcher eine wichtige Rolle bei der Regulation der Fimbrienexpression spielt, direkt oder indirekt durch ClpXP beeinflusst wird, wodurch die regulatorischen Netzwerke zusätzlich gestört werden. N2 - ClpXP is an ATP-dependent serine protease that controls the level and availability of key metabolic enzymes or regulatory proteins and plays a role in breakdown of abnormal and misfolded proteins. ClpXP consists of two independent components. ClpP has proteolytic activity, whereas ClpX has ATPase activity, provides the substrate specificity and function as a molecular chaperone. The proteolysis of global regulators such as the alternative sigma factor RpoS contributes to its function as a regulator on posttranslational level. To analyse the impact of the protease ClpXP on the virulence factors of uropathogenic Escherichia coli, the uropathogenic E. coli strain 536 was chosen as a model organism. Uropathogenic E. coli are the most frequently isolated causative agents of infections of the urinary tract in humans. The E. coli isolate 536 (O6:K15:H31) carries six pathogenicity islands (PAIs) that encode its key virulence factors such as alpha-hemolysins, P-related and S-fimbriae, capsule and iron-uptake systems, that are absent from non-pathogenic isolates. In addition, the strain expresses curli, flagella of serotype H31 and is due to its smooth lipopolysaccharide resistant to human serum. The aim of this study was to characterize the impact of the ATP-dependent protease ClpXP on the expression and regulation of virulence-associated genes of strain E. coli 536 and its clpX- and clpP-deficient mutants on the protein- as well as on the transcriptional level. In order to study the impact of ClpXP on global protein expression of E. coli strain 536, the proteome pattern of total cell extracts as well as of secreted proteins (“secretome”) from the exponential and stationary phase of strain 536 and its isogenic clpX and clpP mutants were compared by two-dimensional (2-D) gel electrophoresis. Internal master gels were prepared for all identified 93 proteins from the cytoplasmic and 127 proteins from the extracellular fraction. Analysis of the cytoplasmic fraction revealed an altered expression of 13 proteins from the exponential and 25 proteins from the stationary phase. 2-D analysis of the secretome exhibited a highly increased secretion ability of the clpX- and clpP-deficient strains in both, exponential and stationary phase, compared to wild type strain 536. In contrast, both mutant strains showed a reduced abundance of the major subunits of S-, P-related, putative CS12-like and type 1-fimbriae as well as the autotransporter protein antigen 43. Additionally, the mutant strains showed a higher expression of flagellin FliC compared to the wild type strain. Results from proteome studies concerning P-related, S- and type 1-fimbriae as well as flagella expression were confirmed by Western blot-analysis and further phenotypic assays. Additionally, a retarded expression of curli and cellulose at temperatures of 30 °C and below, as well as a “hyperflagellated” phenotype with higher motility could be detected upon clpX- and clpP deletion. In contrast, ClpXP had no influence on alpha-hemolysin- and lipopolysaccharide expression, serum resistance and in vivo virulence of strain 536. Following transcriptional analysis (semi-quantitative real-time reverse transcription (RT)-PCR) of genes coding for major fimbrial subunits, a reduced transcription of the determinants coding for S- and P-related fimbriae and curli was observed in the clpX- and clpP-deficient variants. Besides, enhanced transcription of CS12-like and type 1-fimbrial determinants and no differences with respect to transcription of the pix fimbrial gene cluster were detected in the clpX- and clpP mutants relative to the wild type. Transcription of both antigen 43 gene variants, ORF52III and ORF47V, was negatively influenced upon clpX- and clpP deletion and the relative expression was reduced compared to the wild type. Furthermore, it has been shown, that ClpXP had no influence on the “master regulator gene” flhC of flagellar regulation cascade, but enhanced transcription of genes from operons downstream of flhC, like fliA and fliC. These results suggest that ClpXP plays a role as a negative regulator of flagella regulation at the post-transcriptional or post-translational level. Many of the observed effects, particularly on flagellar- and fimbrial gene expression, are due to malfunction of RpoS, which is degraded especially by ClpXP. Additionally, the obtained results indicate that Lrp, a global regulator that plays a dominant role in fimbrial gene expression, is influenced, directly or indirectly by ClpXP and that therefore the corresponding regulatory networks are disordered in clpX and clpP mutants. KW - Escherichia coli KW - Virulenz KW - Genexpression KW - Clp KW - ClpX KW - ClpP KW - Regulation KW - Virulenz-assoziierte Gene KW - pathogene E. coli KW - ClpX KW - ClpP KW - regulation KW - virulence-associated genes KW - pathogenic E. coli Y1 - 2005 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-17627 ER - TY - THES A1 - Stegmeier, Johannes Friedrich T1 - Study of Omp85 Family Proteins YaeT and YtfM and Multidrug Export Machineries in Escherichia coli T1 - Charakterisierung von YaeT und YtfM sowie Multidrugefflux Systemen in Escherichia coli N2 - In this study the Omp85 family proteins YaeT and YtfM of Escherichia coli were investigated by using biochemical and electrophysiological methods as well as bioinformatical and structural analysis. In addition, knock-out strains were constructed to further study the relevance of these proteins in vivo. The prediction that Omp85 proteins are composed of two domains, a periplasmic amino-terminal POTRA (polypeptide translocation associated) domain and a carboxy-terminal domain anchoring these proteins in the outer membrane, was confirmed by the construction of mutants. It could be shown that the carboxy-terminal part of the proteins is able to insert into the outer bacterial membrane, even if the POTRA domain is removed. Furthermore, pore-forming activity in the black-lipid bilayer was observed for both full-length proteins as well as their carboxy-terminal membrane located parts. The channels formed by both proteins in the black lipid bilayer showed variable single channel conductance states rather than a defined value for conductance. In 1M KCl, e.g. YaeT forms pores with a channel conductance of 100 to 600 pS containing a most abundant value at 400 pS. This variability is at least reasonable for YaeT due to a prerequisite flexibility of its channel for OMP insertion. YaeT was identified to form a cation selective, YtfM an anion selective channel, which is less pH dependent than YaeT. Another feature of the YaeT channel is that its selectivity and conductance is influenced by charged detergent molecules indicating an accumulation of these molecules in hydrophobic pockets inside the compact channel. YaeT revealed heat-modifiable mobility in SDS-PAGE which is characteristic for β-barrel OMPs, whereas YtfM did not show this behaviour. This result could be explained by sequence alignment and structural comparison of YaeT and YtfM via CD and FTIR spectra displaying much higher β-strand content for the carboxy-terminal part of YaeT compared to YtfM. Since the carboxy-terminal parts were shown to have pore forming ability and are inserted in the OM in vivo, the substitution of the essential protein YaeT by its carboxy-terminal mutant was attempted in a yaeT knock-out strain. The carboxy-terminal half of YaeT was not sufficient to compensate depletion of the full-length protein indicating an important role of the amino-terminus for cell viability. In contrary, YtfM is shown to be a non-essential protein and lack of YtfM had no effects on the composition and integrity of the OM. However, chromosomal deletion of ytfM remarkably reduced the growth rate of cells. This study provides the first detailed investigation of the structure of YaeT and describes its electrophysiological behaviour, which could be a basis for further studies of YaeT and its substrate proteins. Furthermore, YtfM was characterised and its in vivo function was investigated revealing YtfM as the second Omp85 family protein of importance in E. coli. In a second part of this study assembly and function of multidrug efflux pumps were investigated. Drug efflux pumps are tripartite export machineries in the cell envelope of Gram-negative bacteria conferring multidrug resistance and therefore causing severe problems for medical treatment of diseases. Protein structures of all three efflux pump components are solved, but the exact interaction sites are still unknown. Assembly of a hybrid exporter system composed of the Pseudomonas aeruginosa channel tunnel OprM, the E. coli adaptor protein AcrA and its associated transporter AcrB could be shown by chemical cross-linking, even though this efflux pump is not functional. Exchange of the hairpin domain of AcrA by the corresponding hairpin from the adaptor protein MexA of P. aeruginosa restored functionality tested by antibiotic sensitivity assays. This shows the importance of the MexA hairpin domain for functional interaction with the OprM channel tunnel. Interestingly, the hybrid protein was also able to assemble with TolC as outer membrane component to form a functional efflux pump indicating a higher flexibility of TolC compared to OprM concerning interaction partners. Based on these results, an interaction model of the hairpin domain and the channel tunnel on molecular level for AcrA and TolC as well as MexA and OprM, respectively, is presented. This model provides a basis for directed mutagenesis to reveal the exact contact sites of the hairpin of the adapter protein and the outer membrane component N2 - In dieser Arbeit wurden die Omp85 Familienproteine YaeT und YtfM aus E. coli biochemisch und elektrophysiologisch charakterisiert, sowie bioinformatisch und strukturell analysiert. Des Weiteren wurden Bakterienstämme mit chromosomalen Deletionen der beiden zugehörigen Gene hergestellt, um die Relevanz der beiden Proteine in vivo zu untersuchen. Für Omp85 aus N. meningitdis wurde vorhergesagt, dass das Protein aus zwei strukturellen Untereinheiten besteht, einer periplasmatischen amino-terminalen Domäne, der POTRA – („polypeptide-transport-associated“ -) Domäne und einer carboxy-terminalen Domäne, die das Protein in der Außenmembran verankert. Diese Vorhersagen wurden für die Omp85 Homologen YaeT und YtfM mit Hilfe von geeigneten Mutanten bestätigt. Es konnte gezeigt werden, dass der carboxy-terminale Teil beider Proteine, YaeT und YtfM, auch bei Fehlen der amino-terminalen Domäne noch in der äußeren Membran zu finden ist. Bestätigt wurde dieses Ergebnis durch „Black Lipid Bilayer“ Experimente. Für beide nativen Proteine, sowie deren carboxy-terminale Mutanten, konnte der Einbau in eine künstliche Membran und Porenbildung gezeigt werden. Anders als bei herkömmlichen Porinen, die normalerweise eine sehr gut definierte Leitfähigkeit haben, musste man den beiden untersuchten Proteinen eher eine Leitfähigkeitsspanne zuordnen. Bei Messungen in 1M KCl wurden für YaeT beispielsweise Poren mit einer Leitfähigkeit von 100 bis 600 pS aufgezeichnet, wobei 400 pS der am häufigsten vorkommende Wert ist. Diese Variabilität ist bei YaeT zumindest dadurch begründbar, dass für den Einbau anderer Proteine in die äußere Membran ein flexibler Kanal mit einer möglichen lateralen Öffnung notwendig ist. Die YaeT Poren sind kationenselektiv, für YtfM wurde ein anionenselektiver Kanal nachgewiesen, welcher zusätzlich im Vergleich zu YaeT weniger pH anfällig ist. Weiterhin haben die elektrophysiologischen Experimente gezeigt, dass die Ionenselektivität und Leitfähigkeit von YaeT durch Detergenzmoleküle beeinflussbar ist. Dies lässt hydrophobe Bereiche im Kanalinnern vermuten, an denen sich die Moleküle mit ihrem unpolaren Teil anlagern und dann durch ihre polaren Köpfe die Nettoladungen im Kanalinnern verändern. Mittels Gelelektrophorese konnte für YaeT das typische Laufverhalten von Außenmembranproteinen gezeigt werden. Wenn YaeT ungekocht auf ein SDS-Gel aufgetragen wurde, wanderte es schneller, als wenn man es vorher auf 100°C erhitzte, was für eine kompakte Struktur spricht. Für YtfM wurde dieses Verhalten nicht festgestellt. Die Erklärung für diesen Unterschied lieferten ein Sequenzvergleich beider Proteine, sowie die strukturelle Untersuchung mittels CD- und FTIR-Spektroskopie, welche im Vergleich zu YtfM einen deutlich höheren β-Faltblatt-Anteil für den carboxy-terminalen Teil von YaeT ergaben. Da der carboxy-terminale Teil der Proteine in der Außenmembran zu finden ist und porenformende Aktivität besitzt, wurde versucht, YaeT durch seine carboxy-terminale Mutante in einem Knock-out Stamm zu ersetzen. Dies schlug jedoch fehl, was auf eine bestimmte Funktion der amino-terminalen Hälfte in vivo hindeutet. Im Vergleich zu YaeT ist YtfM kein essentielles Protein und sein Fehlen beeinflusst die Zusammensetzung und die Funktion der äußeren Membran nicht. Die chromosomale Deletion von ytfM führte jedoch zu einer deutlichen Reduktion der Wachstumsrate. Bei den Multidrug Efflux Pumpen AcrAB/TolC und MexAB/OprM sind mittlerweile Strukturen aller drei Pumpenkomponenten bekannt, ihre Interaktionsstellen sind allerdings noch nicht bekannt. Mit einem chemischen „Cross-linker“ konnte der Zusammenbau eines hybriden Exportsystems bestehend aus der Außenmembrankomponente OprM aus Pseudomonas aeruginosa, dem Adapterprotein AcrA aus E. coli, sowie dessen zugehörigem Innenmembrantransporter AcrB, nachgewiesen werden. Der Zusammenbau ist insofern erstaunlich, da diese hybride Effluxpumpe nicht funktionell ist. Die Funktionalität dieser Effluxpumpe, nachgewiesen durch Antibiotikasensitivitätstests, konnte jedoch durch den Austausch der „Hairpin“-Domäne von AcrA durch den „Hairpin“ von MexA wieder hergestellt werden. Dieses Ergebnis zeigt deutlich die Wichtigkeit dieser Haarnadelstruktur für die funktionelle Interaktion mit der Außenmembrankomponente OprM. Interessanterweise konnte das hybride Adapterprotein eine funktionelle Effluxpumpe mit TolC als Außenmembrankomponente bilden, was für eine höhere Flexibilität von TolC im Gegensatz zu OprM bezüglich der Interaktionspartner spricht. Aufgrund der oben genannten Ergebnisse wurde ein Interaktionsmodell der „Hairpin“-Domäne von AcrA bzw. MexA mit den Außenmembranproteinen TolC und OprM auf molekularer Ebene erstellt. Dieses Modell kann nun als Vorlage für zielgerichtete Mutationen dienen, um die Interaktionsstellen des Adapterproteins mit der zugehörigen Außenmembrankomponente genau zu beschreiben. KW - Escherichia coli KW - Porin KW - Omp85 KW - YaeT KW - YtfM KW - Multidrug Efflux KW - Omp85 KW - YaeT KW - YtfM KW - Multidrug Efflux Y1 - 2006 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-18171 ER - TY - THES A1 - Müller, Claudia Maria T1 - Studies on the Role of Histone-like Proteins in Gene Regulation in Uropathogenic Escherichia coli Isolate 536 T1 - Untersuchungen zur Rolle von Histon-ähnlichen Proteinen bei der Genregulation im Uropathogenen Escherichia coli Isolat 536 N2 - In this study, the role of histone-like proteins in gene regulation in uropathogenic Escherichia coli isolate 536 was monitored. The histone-like nucleoid structuring protein H-NS is a global regulator in Escherichia coli that has been intensively studied in non-pathogenic strains. No comprehensive study on the role of H-NS and it’s homolog StpA on gene expression in a pathogenic E. coli strain has been carried out so far. Moreover, we identified a third, so far uncharacterized member of the H-NS-like protein family in uropathogenic E. coli isolate 536, which was designated Hlp (H-NS-like protein). Hlp is a 134-amino acid protein, which shares 58 % sequence identity with H-NS. The gene coding for the Hlp protein, hlp, is found in several uropathogenic E. coli variants, but not in non-pathogenic E. coli K-12. In UPEC strains 536 and CFT073, Hlp is encoded on a possibly horizontally acquired 23-kb genomic region inserted into the serU locus. Studies on hlp transcription revealed, that the gene is transcribed monocistronically from a single promoter and that expression is repressed by H-NS. Purified Hlp protein was binding to its own and to the hns promoter, thereby mediating negative auto- and crossregulation. Furthermore, Hlp and H-NS were directly interacting, resulting in the formation of stable heteromers. Complementation studies with hns mutant strains in a K-12 background revealed that the Hlp protein had in vivo activity, being able to complement the lack of H-NS in terms of motility, growth, and repression of the proU, bgl, and clyA genes. When analyzing the role of the histone-like proteins in expression of virulence-associated genes by using DNA arrays and classical phenotypic assays, most of the observed effects were mediated by the H-NS protein alone. Expression profiling revealed that transcript level of more than 500 genes was affected by an hns mutation, resulting in increased expression of alpha-hemolysin, fimbriae and iron-uptake systems, as well as genes involved in stress adaptation. Furthermore, several other putative virulence factors were found to be part of the H-NS regulon. On the other hand, no effect of StpA alone was observed. An hns stpA double mutant, however, exhibited a distinct gene expression pattern that differed in great parts from that of the hns single mutant. This suggests a direct interaction between the two homologs and the existence of distinct regulons of H-NS and an H-NS/StpA heteromeric complex. Although the H-NS protein has – either as homomer or in complex with StpA – a marked impact on gene expression in pathogenic E. coli strains, its effect on urovirulence is ambiguous. At a high infection dose, hns mutants accelerate lethality in murine UTI and sepsis models relative to the wild type, probably due to increased production of alpha-hemolysin. At lower infectious dose, however, mutants lacking H-NS are attenuated through their impaired growth rate, which can only partially be compensated by the higher expression of numerous virulence factors. As seen with StpA, an hlp single mutant did not exhibit a notable phenotype under standard growth conditions. A severe growth defect of hns hlp double mutants at low temperatures, however, suggests a biological relevance of H-NS/Hlp heteromers under certain circumstances. Furthermore, these mutants expressed more capsular polysaccharide and curli fimbriae, thereby indicating a distinct role of H-NS and Hlp in regulation of these surface structures. The H-NS paralogs Hlp and StpA also modulated H-NS-mediated regulation of fimbrial adhesins, and are oppositely required for normal growth at low or high temperatures, respectively. Finally, expression levels of the three histone-like proteins H-NS, StpA and Hlp itself varied with different temperatures, thereby suggesting a flexible composition of the nucleoid-associated protein pool. Hence, we propose that the biological role of Hlp and StpA does not rely on a distinct function of the single protein, but rather on their interaction with the global regulator H-NS. N2 - In dieser Studie wurde die Rolle von Histon-ähnlichen Proteinen bei der Genregulation im uropathogenen Escherichia coli (UPEC) Isolat 536 untersucht. Das Histon-ähnliche Protein H-NS (engl. histone-like nucleoid structuring protein) ist ein globaler Regulator in E. coli, der in apathogenen Stämmen eingehend untersucht worden ist. Im Gegensatz dazu liegen noch keine umfassenden Studien zur Rolle von H-NS und des homologen Proteins StpA in einem pathogenen E. coli Stamm vor. Zudem konnten wir ein drittes, bis jetzt noch nicht charakterisiertes Mitglied der Familie von H-NS-ähnlichen Protein im uropathogenen E. coli Isolat 536 identifizieren, das Hlp benannt wurde (für H-NS-like protein). Hlp ist ein aus 134 Aminosäuren bestehendes Protein, dessen Sequenz zu 58 % identisch mit der des H-NS Proteins ist. Das Gen, das für das Hlp Protein kodiert, hlp, konnte in zahlreichen uropathogenen und Fäkalisolaten nachgewiesen werden, jedoch nicht im apathogenen E. coli K-12. In den UPEC Isolaten 536 und CFT073 ist das hlp Gen auf einer 23-kb großen genomischen Insel lokalisiert, die in den serU Lokus inseriert ist und möglicherweise über horizontalen Gentransfer erworben wurde. Untersuchungen zur Transkription des hlp Gens ergaben, dass das Gen monocistronisch von einem einzigen Promotor transkribiert, und dessen Expression durch H-NS reprimiert wird. Rekombinantes Hlp Protein war befähigt, sowohl an seinen eigenen, als auch an den hns Promotor zu binden, was zu negativer Auto- und Kreuzregulation führte. Zudem konnte gezeigt werden, dass Hlp und H-NS direkt miteinander interagieren, was zu stabilen Heteromeren führte. Komplementierungsstudien in hns Mutanten einiger K-12 Stämme ergaben, dass das Hlp Protein über in vivo Aktivität verfügt, was es befähigte, die Abwesenheit von H-NS bei zahlreichen Phänotypen wie z.B. Motilität, Wachstum, und Repression der proU, bgl und clyA Gene zu komplementieren. Die Rolle der Histon-ähnlichen Proteine bei der Expression von Virulenz-assoziierten Genen wurde mittels DNA Array Technologie, sowie klassischen phänotypischen Tests analysiert. Dabei wurden die meisten der beobachteten Effekte einzig durch das H-NS Protein bedingt. Die Expressionsstudien ergaben, dass über 500 Gene von einer hns Mutation beeinflusst wurden, was eine verstärkte Expression des alpha-Hämolysins, mehrerer Fimbrien und Eisenaufnahmesysteme sowie von Genen, die in Stress-Antworten involviert sind, bedingte. Des Weiteren konnten zahlreiche putative Virulenzfaktoren dem H-NS-Regulon zugeordnet werden. Andererseits konnten keine Effekt durch StpA beobachtet werden. Eine hns stpA Doppelmutante wies jedoch ein eindeutiges Expressionsmuster auf, das in großen Teilen von dem der hns Einzelmutante abwich. Dies legt nahe, dass beide Proteine direkt miteinander interagieren, was das Auftreten von unterschiedlichen Regulons zur Folge hat, die entweder durch H-NS oder einem heteromeren H-NS/StpA Komplex beeinflusst werden. Obwohl das H-NS Protein – entweder als Homomer oder als Komplex mit StpA – einen sehr starken Einfluss auf die Genexpression pathogener E. coli Stämme nimmt, bleiben dessen Effekte auf die tatsächliche Virulenz im Urogenitaltrakt unklar. In einem experimentellen Mausmodell der aufsteigenden Harnwegsinfektion bewirken hns Mutanten, in hoher Dosis verabreicht, eine rasch eintretende Lethalität, was vermutlich der verstärkten Produktion von alpha-Hämolysin zuzuschreiben ist. In verringerter Dosis verabreicht, sind diese Mutanten durch ihre langsameren Wachstumsraten jedoch attenuiert, was nur teilweise durch die vestärkte Expression zahlreicher Virulenzfaktoren kompensiert werden kann. Wie schon bei StpA beobachtet, besitzt eine hlp Mutante keinen offensichtlichen Phänotyp, zumindest unter Standard-Wachstumsbedingungen. Jedoch macht sich in hns hlp Doppelmutanten ein starker Wachstumsdefekt bei erniedrigten Temperaturen bemerkbar, was eine biologische Relevanz von H-NS/Hlp Heteromeren unter bestimmten Bedingungen nahe legt. Des Weiteren exprimierten diese Mutanten erhöhte Mengen an Kapsel-Polysacchariden und Curli-Adhesin, was als Indiz für eine besondere Rolle für H NS und Hlp bei der Regulation dieser Oberflächenstrukturen dienen kann. Zudem hatten beide H-NS-Paraloge Hlp und StpA einen modulierenden Effekt bei der H-NS-vermittelten Regulation weiterer Fimbrien-Adhesine und waren in gegenläufigen Maßen für normales Wachstum bei erhöhten bzw. erniedrigten Temperaturen notwendig. Zuletzt variierte das Expressionsniveau der drei Histon-ähnlichen Proteine H-NS, StpA und Hlp bei unterschiedlichen Temperaturen, was auf eine flexible Zusammensetzung verfügbarer Nucleoid-assoziierter Proteine hindeutet. Dies alles impliziert, dass die biologische Relevanz von Hlp, und StpA gleichermaßen, nicht auf gesonderten Funktionen des einzelnen Proteins beruht, sondern vielmehr auf deren Interaktionen mit dem globalen Regulatorprotein H-NS. KW - Escherichia coli KW - Pathogenität KW - Histone-like proteins KW - Genregulation KW - Histon-ähnliche Proteine KW - H-NS KW - StpA KW - Genregulation KW - UPECs KW - Histone-like proteins KW - H-NS KW - StpA KW - Gene regulation KW - UPECs Y1 - 2005 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-17617 ER - TY - THES A1 - Schneider, György T1 - Studies on the architecture and on transferability of pathogenicity islands of uropathogenic Escherichia coli strain 536 T1 - Untersuchungen zur genetischen Struktur und Übertragbarkeit von Pathogenitätsinseln des uropathogenen Escherichia coli Stammes 536 N2 - The establishment of genomic approaches including the sequence determination of complete bacterial genomes started a new era in microbiological research. Since then more than two hundred prokaryotic and eukaryotic genomes have been completely sequenced, and there are additional complete genome projects including different bacterial species and strains in progress (http://www.tigr.org, http://www.sanger.ac.uk). The continously growing amount of bacterial DNA sequence information gives us also the possibility to gain deeper insight into bacterial pathogenesis. With the help of comparative genomics, microbiological research can focus on those DNA sequences that are present in pathogenic bacteria but are absent in non-pathogenic strains. With this knowledge and with the help of molecular biological methods such as PCR,DNA-chip technology, subtractive hybridisation, transcriptomics and proteomics we can analyse in detail what makes a particular bacterial strain pathogenic. This knowledge also gives us the possibility to develop new vaccines, therapeutic approaches or diagnostic tools. The aim of this work was the structural and functional analysis of DNA regions of uropathogenic Escherichia coli strain 536 that belong to the flexible E. coli gene pool. The first part of this thesis focused on the identification and structural characterisation of pathogenicity island V of strain 536 (PAI V536). PAI V536 is integrated at the pheV tRNA gene at 64 minutes of the E. coli K-12 chromosome. In addition to the intact pheV tRNA gene, a truncated copy ('pheV) that represents the last 22 bp of this gene’s 3'-end was identified 49 kb downstream of pheV on PAI V536. The analysis of the DNA sequence flanked by pheV and 'pheV revealed characteristics that are typical of PAIs. This DNA region exhibits homology to IS-elements and prophages and also comprises determinants coding for the Pix fimbriae, a phosphoglycerate transport system, an autotransporter, as well as for hypothetical proteins. Downstream of 'pheV, the K15 capsule determinant (kpsK15) of this strain is located. Structural analysis of the 20-kb kpsK15 locus revealed a so far unknown genetic organisation indicative of recombination events between a group 2 and group 3 capsule gene cluster. Downstream of the capsule determinant, the genes encoding a type II secretion system (general secretion pathway -GSP) are located on PAI V536. The K15 capsule locus was functionally characterized. Specific inactivation of each of the regions 1 to 3 of the kpsK15 gene cluster, and the use of a K15 capsule-specific antiserum demonstrated that this determinant is the functional K15 capsule locus of strain 536. It has been shown in an experimental murine model of ascending urinary tract infection with suckling mice that the K15 capsule contributes to urovirulence. Interestingly, the K15 capsule is not involved in serum resistance of strain 536. Inactivation of the PAI V536-encoded type II secretion system excluded a role of this general secretion pathway for capsule biosynthesis and virulence of strain 536 in the murine ascending urinary tract infection model. In the second part of the thesis, the transferability of PAIs was further investigated. Using PAI II536 as a model, mobilisation of this island from strain 536 into suitable recipient strains was investigated. For this purpose, an antibiotic resistance cassette, the R6K origin of replication as well as plasmid pGP704 carrying the mobilisation region of plasmid RP4 have been inserted into PAI II536. Transformation with the helper plasmid RP4, resulted a derivative of strain 536 that was used as a donor for conjugation experiments, while for recipient the pir + laboratory strain SY327 was used. After deletion the circularised PAI II536 was mobilised with the help of the conjugative helper plasmid (RP4) into the recipient laboratory strain SY327. The frequency of this event was about 10-8. It was also demonstrated that in the transconjugant strains the mobilized PAI II536 could be permanently present as a circular form and also can be integrated into the chromosome at the same chromosomal insertion site (leuX) as in the donor strain 536. Furthermore, after mobilisation and chromosomal integration of PAI II536 it was possible to remobilise this PAI back to a PAI II536-negative derivative of strain 536. The results obtained in this thesis increase our knowledge of the structure and function of a pathogenicity island of uropathogenic E. coli strain 536 and shed some light on the mechanisms contributing to genome plasticity and evolution of pathogenic E. coli variants. N2 - Mit der Einführung von Genomanalytik einschließlich der Sequenzbestimmung bakterieller Genome, startete eine neue Ära in der mikrobiologischen Forschung. Seit Beginn dieser Ära sind mehr als 200 prokaryotische und eukaryotische Genome komplett sequenziert worden. Weitere Genomanalysen über verschiedene Bakterienspezies und Stämme sind in Arbeit(http://www.tigr.org, http://www.sanger.ac.uk). Durch die stetig anwachsende Menge an Informationen über bakterielle DNA Sequenzen, sind wir in der Lage, einen tieferen Einblick in die bakterielle Pathogenität zu bekommen. Mittels vergleichender Genomanalyse kann sich die mikrobiologische Forschung auf bestimmte DNA Sequenzen konzentrieren, welche in pathogenen Stämmen vorhanden sind, in apathogenen Stämmen aber fehlen. Mit diesem Wissen und durch molekularbiologische Methoden wie Polymerase Kettenreaktion, DNA-Chip- Technologie, Subtraktiver Hybridisierung, Transkriptom- und Proteom-Analyse können wir im Detail untersuchen, welche Faktoren für die Pathogenität eines speziellen Bakterienstammes verantwortlich sind. Diese Erkenntnisse geben uns auch die Möglichkeit neue Impfstoffe, therapeutische Verfahren und diagnostische Werkzeuge zu entwickeln. Ziel dieser Arbeit war die Untersuchung der Struktur und Funktion von DNA-Regionen des uropathogenen Escherichia coli Stammes 536, welche zum flexiblen Genpool von E. coli gehören. Der erste Teil dieser Arbeit konzentriert sich auf die Identifizierung und strukturelle Charakterisierung der Pathogenitätsinsel V des E. coli Stammes 536 (PAI V536). Die Integrationsstelle von PAI V536 liegt im E. coli K-12 Chromosom beim tRNA Gen pheV bei 64 Minuten. Zusätzlich zum intakten pheV tRNA Gen wurde auf der PAI V536 eine verkürzte Kopie des Gens (´pheV) 49 kb stromabwärts von pheV identifiziert. Diese Kopie repräsentiert die letzten 22 bp des 3´-Endes von pheV. Eine Analyse der von pheV und ´pheV eingeschlossenen DNASequenz zeigte typische Eigenschaften einer Pathogenitätsinsel. Die untersuchte DNA-Region besitzt Homologie zu IS-Elementen und Prophagen, außerdem beinhaltet sie Determinanten, die für Pix Fimbrien, ein Phosphoglycerat-Transportsystem, einen Autotransporter sowie für unbekannte Proteine kodieren können. Stromabwärts von ´pheV liegt die K15 Kapsel Determinante (kpsK15) des E. coli Stammes 536. Eine strukturelle Analyse des 20-kb kpsK15 Lokus zeigte eine bislang unbekannte genetische Anordnung, welche auf ein Rekombinationsereignis zwischen einem Gruppe 2 und einem Gruppe 3 Kapsel Gencluster hinweist. Stromabwärts der Kapsel Determinante sind auf der PAI V Gene lokalisiert, welche für ein Typ II Sekretionssystem („General Secretion Pathway“) kodieren. Der K15 Kapsel Lokus wurde funktional charakterisiert. Die spezifische Inaktivierung der Regionen 1 bis 3 des kpsK15 Genclusters und die Verwendung eines K15 Kapsel-spezifischen Antiserums zeigten, daß es sich tatsächlich um den funktionalen K15 Kapsellokus des E. coli Stammes 536 handelt. Im Tiermodel einer aufsteigenden Harnwegsinfektion bei neugeborenen und säugenden Mäusen, konnte gezeigt werden, daß die K15 Kapsel zur Urovirulenz beiträgt. Interessanterweise trägt die K15 Kapsel des E. coli Stammes 536 nicht zur Serumresistenz bei. Die Inaktivierung des in der PAI V536 kodierten Typ II Sekretionssystems schließt eine Rolle des „General Secretion Pathways“ bei der Kapsel Biosynthese und bei der Virulenz des E. coli Stammes 536 im Mausinfektionsmodel einer aufsteigenden Harnwegsinfektion aus. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde die Mobilisierung von Pathogenitätsinseln untersucht. PAI II536 wurde als Model genutzt, um den Transfer einer PAI von E. coli 536 in einen geeigneten Rezipientenstamm zu zeigen. Zu diesem Zweck wurde eine Antibiotikaresistenzkassette, der Replikationsstartpunkt RK6 und das Plasmid pGP704, das die Mobilisierungsregion des Plamides RP4 besitzt, in die PAI II536 inseriert. Nach Transformation des Helferplasmids RP4 wurde das daraus resultierende Derivat des E. coli Stammes 536 als Donor für Konjugationsexperimente mit dem Rezipientenstamm SY327 eingesetzt. Diese Mobilisierungsexperimente zeigten, daß die gesamte PAI II536 mit einer Frequenz von ungefähr 10-8 in einen Rezipientenstamm übertragen werden kann. In den Transkonjuganten konnte PAI II536 an derselben chromosomalen Insertionsstelle (leuX) wie im Donorstamm E. coli 536 inserieren. Weiterhin war es möglich PAI II536, nach Mobilisierung und chromosomaler Integration in einem Rezipientenstamm, wieder zurück in ein PAI II536 negatives Derivat von E. coli 536 zu transferieren. Die Ergebnisse dieser Arbeit erweitern unser Wissen hinsichtlich der Struktur und Funktion einer Pathogenitätsinsel des uropathogenen E. coli Stammes 536 und geben Aufschluß über den Mechanismus, der zur Genomplastizität und Evolution pathogener E. coli Varianten beiträgt. KW - Escherichia coli KW - Urogenitalsystem KW - Infektion KW - Pathogenität KW - Genanalyse KW - Escherichia coli KW - UTI KW - Pathogenitätsinseln KW - Kapsel KW - Übertrag KW - Escherichia coli KW - UTI KW - pathogenicity islands KW - capsule KW - transfer Y1 - 2005 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-14231 ER - TY - THES A1 - Schiller, Roswitha Dorothee T1 - Studien zu Virulenzeigenschaften typischer und atypischer uropathogener Escherichia coli T1 - Studies on virulence properties of typical and atypical uropathogenic Escherichia coli N2 - Die Forschungsergebnisse der letzten Jahre liefern immer mehr Hinweise darauf, dass eine klare Unterscheidung von Fitness- und Virulenzfaktoren in vielen Fällen, insbesondere bei extraintestinal pathogenen Escherichia coli, nicht möglich ist. So lässt sich auch bei Harnwegsinfektionen verursachenden E. coli den bakteriellen und teils stammspezifischen Faktoren oftmals nicht eindeutig eine typische Virulenz- oder Fitness-assoziierte Funktion zuordnen. Zudem werden in neueren Studien immer häufiger atypische uropathogene Isolate von E. coli beschrieben, die in ihrem „Virulenzrepertoire“ deutlich von typischen uropathogenen E. coli (UPEC) abweichen, da sie keine klassischen UPEC-Virulenzfaktoren aufweisen. In dieser Arbeit wurden daher Virulenzeigenschaften typischer als auch atypischer UPEC untersucht. Der Effekt eines bestimmten bakteriellen Faktors auf den Wirtsorganismus wird teilweise indirekt durch sekundäre Modifikation bedingt. Dies offenbart sich beispielsweise am Autotransporterprotein AIDA-I, dessen Konformation durch posttranslationale Glykosylierung stabilisiert wird, wodurch es seine Funktionalität als Adhäsin erhält. Da bisherige Studien zum AIDA-I homologen Autotransporterprotein Antigen 43 (Ag43) auf der Analyse von künstlich glykosyliertem Protein basieren, lag ein Schwerpunkt dieser Arbeit auf der Untersuchung der natürlichen Glykosylierung von Ag43 in UPEC Stamm 536. Es zeigte sich, dass beide Ag43-Varianten von E. coli Stamm 536 natürlicherweise glykosyliert vorliegen, der Grad der Glykosylierung jedoch wesentlich geringer ausfällt als bei natürlich glykosyliertem AIDA-I. Inwieweit die natürliche Glykosylierung von Ag43 zu dessen Funktionalität beiträgt, kann erst durch die Identifizierung der für die Ag43-Glykosylierung verantwortlichen Glykosyltransferase geklärt werden. Die in silico-Analyse des Genoms von UPEC Stamm 536 für potentielle Glykosyltransferasen von Ag43 lieferte neun Kandidatengene. Die Gene wurde teils im Wildtyp-Hintergrund, teils im rfaH-negativen Hintergrund von E. coli Stamm 536 deletiert und die Mutanten im Anschluss phänotypisch charakterisiert. Die Deletion der Kandidatengene waaF, waaG und waaQ, die für Glykosyltransferasen des LPS-Biosynthesesystems kodieren, führte zu den deutlichsten Unterschieden in Bezug auf Motilität, Curli/Zellulose-Produktion, Hämolyseaktivität und Expression von Typ 1 Fimbrien. Der Einfluss des „knock-out“ der Kandidatengene auf die Glykosylierung von Ag43 muss in weiterführenden Studien untersucht werden. Zur Charakterisierung des uropathogenen Virulenzpotentials verschiedener E. coli Stämme in vivo hat sich in den letzten Jahren das murine Modell der aufsteigenden Harnwegsinfektion etabliert. Mit Hilfe dieses Modells wurden in der vorliegenden Arbeit sowohl spezifische Deletionsmutanten prototypischer UPEC als auch atypische E. coli Harnwegsisolate bezüglich ihrer Urovirulenz getestet und verglichen. Bei der Untersuchung der klassischen UPEC lag der Fokus auf der möglichen Urovirulenzmodulation durch die folgenden spezifischen Faktoren: dem Autotransporterprotein Ag43, dem „Response regulator“ UvrY, dem Polyketid Colibactin sowie dem Exopolysaccharid poly-β-1,6-N-Acetylglucosamin (PGA). Für Ag43 war bei der Etablierung einer Harnwegsinfektion keine eindeutige Funktion feststellbar. Es ist jedoch denkbar, dass Ag43 zur Langzeitpersistenz im Harnwegstrakt beitragen kann, was in weiteren Studien belegt werden sollte. Die Expression von UvrY in der natürlichen uvrY-Deletionsmutante UPEC Stamm 536 ließ keine Erhöhung des Urovirulenzpotentials im Mausmodell erkennen. In diesem Zusammenhang konnte allerdings gezeigt werden, dass die Expression des Genotoxins Colibactin in UPEC Stamm 536 dessen Virulenz signifikant herabsetzte. Die Untersuchungen zur Relevanz des Exopolysaccharids PGA belegen deutlich, dass PGA für die Langzeitpersistenz von E. coli im murinen Harnwegstrakt benötigt wird. Für die initiale Kolonisierung scheint PGA hingegen keine Bedeutung zu haben. Für atypische UPEC Isolate, die Charakteristika von STEC und EAEC zeigen und sich in ihrem Virulenzmuster deutlich von prototypischen UPEC unterscheiden, ließ sich im murinen Modell der aufsteigenden Harnwegsinfektion, verglichen mit dem UPEC Modellorganismus 536, ein ähnliches, teils sogar erhöhtes uropathogenes Virulenzpotential nachweisen. Die Ergebnisse der Arbeit untermauern somit die heutige Vorstellung bezüglich der Entwicklung und Etablierung einer Harnwegsinfektion, dass verschiedene E. coli Stämme unterschiedliche (Kontroll-) Mechanismen entwickelt haben, um erfolgreich den Harnwegstrakt kolonisieren und eine Infektion auslösen zu können. Zudem weisen sie darauf hin, dass diese Fähigkeit nicht auf Isolate typischer phylogenetischer UPEC Entwicklungslinien beschränkt und auf das Vorhandensein charakteristischer UPEC Virulenzfaktoren angewiesen ist. N2 - Research findings over the last years indicate that in many cases, including extraintestinal pathogenic Escherichia coli, a clear distinction between fitness and virulence factors is not possible. Accordingly, the classical distinction of often strain-specific virulence- and fitness-related traits of uropathogenic E. coli (UPEC) can often not be made. Furthermore, recent studies describe atypical UPEC isolates. These isolates remarkably differ in their “virulence repertoire” compared to typical UPEC, because they lack classical UPEC-related virulence factors. Therefore, the aim of the present study was the investigation of virulence properties of typical as well as atypical UPEC strains. The effect of a certain bacterial factor upon the host organism is in part indirectly influenced by secondary modifications. For instance, the conformation of the autotransporter protein AIDA-I is stabilized by posttranslational glycosylation which in turn confers its functionality as an adhesin. Prior studies on the AIDA-I homologous autotransporter protein antigen 43 (Ag43) are based on the analysis of the artificially glycosylated protein. Thus, a key aspect of the current work was to elucidate the naturally occurring glycosylation of Ag43 in UPEC strain 536. For both Ag43 variants of E. coli 536 natural glycosylation was detected. However, Ag43 was less glycosylated than naturally glycosylated AIDA-I. The future identification of the glycosyltransferase responsible for natural glycosylation of Ag43 will help to determine the impact of this posttranslational modification on the functionality of Ag43. In silico analysis of the UPEC strain 536 genome regarding potential glycosyltransferases of Ag43 revealed nine candidate genes. Corresponding deletion mutants of the identified genes were constructed in part in the wild type strain background and in part in the rfaH-negative background of UPEC 536. The most prominent differences concerning motility, curli/cellulose production, hemolytic activity and expression of type 1 fimbriae were observed upon deletion of the genes waaF, waaG or waaQ coding for glycosyltransferases of the LPS biosynthesis pathway. The impact of the deleted candidate genes on the glycosylation of Ag43 has to be further investigated. In recent years the murine model of ascending urinary tract infection was established to characterize the uropathogenic potential of E. coli strains in vivo. By means of this model the uropathogenic potential of different specific “knock-out” mutants of prototypic UPEC strains as well as of atypical E. coli urinary tract isolates was tested and compared. The analysis of the impact of specific factors on the uropathogenic potential of classical UPEC strains focused on the autotransporter protein Ag43, the response regulator UvrY, the genotoxin colibactin, and the exopolysaccharide poly-β-1,6-N-acetylglucosamine (PGA). Ag43 did not exhibit a distinct function during the establishment of urinary tract infection in mice. However, it is conceivable that Ag43 can contribute to long-term persistence in the urinary tract, which should be covered in further studies. Expression of UvrY in the natural uvrY-negative UPEC strain 536 did not increase the uropathogenic potential. However, expression of the genotoxin colibactin significantly reduced the urovirulence of UPEC strain 536. The exopolysaccharide PGA was shown to contribute to long-term persistence of UPEC in the murine model of urinary tract infection. For the initial colonization of the urinary tract, PGA seems to be dispensable. The atypical UPEC isolates investigated in this study display typical characteristics of STEC and EAEC and differ significantly in their virulence gene content compared to prototypic UPEC strains. Nevertheless, in the murine model of ascending UTI many atypical UPEC isolates exhibited a comparable and sometimes even increased uropathogenic potential relative to UPEC model strain 536. The results of this work support the current idea regarding the development and establishment of a urinary tract infection that different E. coli strains have evolved diverse (control-) mechanisms to successfully colonize the urinary tract and provoke an infection. In addition, the findings point out that the ability to cause a urinary tract infection is not limited to phylogenetic lineages of classical UPEC isolates and the presence of characteristic UPEC virulence traits. KW - Escherichia coli KW - Harnwegsinfektion KW - Glykosylierung KW - UPEC KW - Autotransporterprotein KW - Glykosyltransferase KW - murines Modell der aufsteigenden Harnwegsinfektion Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-103907 ER - TY - THES A1 - Troge, Anja T1 - Studien am Flagellensystem des Escherichia coli Stammes Nissle 1917 (EcN) im Hinblick auf seine Funktion als Probiotikum T1 - Studies on the flagellar system of Escherichia coli Nissle 1917 (EcN) with regard to its function as a probiotic N2 - Escherichia coli Nissle 1917 (EcN) gehört zu den am besten untersuchten und charakterisierten probiotischen Bakterienstämmen. Seit Beginn des letzten Jahrhunderts wird er als Medikament eingesetzt, um verschiedene Darmerkrankungen wie z.B. Diarrhöe, entzündliche Darmerkrankungen und Verstopfung zu behandeln. Die Flagelle des EcN vermittelt Beweglichkeit und kann die Produktion von humanem β-Defensin 2 (hBD2) durch Epithelzellen induzieren. Somit ist dieses Organell direkt in die probiotische Funktion des EcN involviert. Es konnte gezeigt werden, dass die Flagellen anderer Bakterien, wie z.B. dem probiotischen Stamm Bacillus cereus CH oder den pathogenen Stämmen Pseudomonas aeruginosa und Clostridium difficile, die Adhäsion an intestinalen Mucus, welcher von Epithelzellen sekretiert wird, vermitteln. Allerdings blieb unklar, welcher Teil der Flagelle an welche Mucuskomponente bindet. Die Fähigkeit effizient an Wirtgewebe zu adhärieren wird als wichtiges Attribut eines probiotischen Stammes angesehen. Ex vivo Adhäsionsstudien mit Kryoschnitten humaner Darmbiopsien haben gezeigt, dass die Flagelle des EcN in die effiziente Adhäsion an humanes Darmgewebe involviert sein muss. Aus diesem Grund wurde in dieser Arbeit die Funktion der Flagelle des EcN als Adhäsin untersucht. Zunächst wurde die hyperflagellierte Variante EcN ATHF isoliert und durch verschiedene Experimente, z.B. Schwärmagartests und Elektronenmikroskopie, charakterisiert. Weitere ex vivo Adhäsionsstudien mit EcN ATHF zeigten eine höhere Adhäsionseffizienz dieser hyperflagellierten Variante und bestätigten damit die Rolle der Flagelle bei der effizienten Adhäsion von EcN an die Kryoschnitte der humanen Darmbiopsien. Interessanterweise fungierte die Flagelle in in vitro Studien mit den humanen Epithelzellen Caco-2 und T24 nicht als Adhäsin. Diese Unterschiede zwischen den in vitro und ex vivo Studien führten zu der Annahme, dass die Flagelle des EcN in vivo die Adhäsion an Mucus vermittelt, welcher von den Caco-2- und T24-Zellen nicht produziert wird, aber in den Kryoschnitten der Darmbiopsien nachgewiesen wurde. Diese Vermutung wurde durch in vitro Adhäsionsstudien mit der Mucin-produzierenden Epithelzelllinie LS174-T bestätigt, da die Flagellen für eine effektive Adhäsion an diese Zellen essentiell waren. Zudem reduzierte die Präinkubation flagellierter EcN-Stämme mit Mucin2 ihre Adhäsionseffizienz an Kryoschnitte humaner Darmbiopsien. Um die direkte Interaktion zwischen Flagellen des EcN Wildtyps und Mucus zu zeigen, wurde ein ELISA etabliert. Es konnte eine direkte konzentrationsabhängige Interaktion zwischen isolierten Flagellen des EcN Wildtyps und Mucin2, bzw. humanem Mucus (Kolon) beobachtet werden. Interessanterweise konnte keine Interaktion zwischen isolierten Flagellen des EcN Wildtyps und murinem Mucus (Duodenum, Ileum, Caecum, Colon) festgestellt werden. Dies weist darauf hin, dass die Mucuszusammensetzung zwischen verschiedenen Spezies variiert. Verschiedene Kohlenhydrate, welche bekannte Mucusbestandteile sind, wurden auf ihre Interaktion mit der Flagelle von EcN getestet und Gluconat wurde als ein Rezeptor identifiziert. Die Präinkubation isolierter Flagellen mit Gluconat reduzierte ihre Interaktion mit Mucin2, bzw. humanem Mucus signifikant. Zudem wurde die oberflächenexponierte Domäne D3 des Flagellins, der Hauptuntereinheit der Flagelle, als möglicher Interaktionspartner von Mucin2, bzw. humanem Mucus ausgeschlossen. Flagellen, die aus einer Domäne D3 Deletionsmutante isoliert wurden, zeigten sogar eine effizientere Bindung an Mucin2, bzw. humanen Mucus. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass Änderungen des pH-Wertes signifikante Effekte auf die Interaktion zwischen Mucus und isolierten Flagellen hatten, vermutlich aufgrund von Konformationsänderungen. Zusammenfassend wurde in dieser Arbeit die Flagelle als neues und scheinbar wichtigstes Adhäsin in vivo für den probiotischen Stamm EcN identifiziert. Hierfür wurden sowohl eine hyperflagellierte Variante, eine ΔfliC Mutante, sowie der dazugehörige komplementierte Stamm verwendet. EcN ist zudem der erste probiotische Stamm für den eine direkte Bindung der Flagellen an humanen Mucus nachgewiesen werden konnte. Die Mucuskomponente Gluconat konnte dabei als wichtiger Rezeptor identifiziert werden. Da einige pathogene Bakterien ihre Flagelle zur Adhäsion an Wirtsgewebe nutzen, könnte dieses Organell EcN dazu befähigen, mit Pathogenen um die erfolgreiche Kolonisierung des Darms zu konkurrieren, was als wichtige Eigenschaft eines Probiotikums betrachtet wird. N2 - Escherichia coli Nissle 1917 (EcN) is one of the best studied and characterized probiotic bacterial strains. It is in use as a drug since the beginning of last century to treat various diseases and dysfunctions of the human intestinal tract, e.g. diarrhea, inflammatory bowel diseases and obstipation. The flagellum of EcN mediates motility and is able to induce human beta defensin 2 (hBD2) production by epithelial cells. Therefore, this organelle is directly involved in EcN’s probiotic function. It has been shown that the flagella of several other bacteria, including the probiotic strain Bacillus cereus CH or the pathogenic strains Pseudomonas aeruginosa and Clostridium difficile, mediate adhesion to intestinal mucus, which is secreted by epithelial cells. However it remained unclear which part of the flagella binds to which mucus component. The ability to adhere efficiently to host tissue is considered to be an important attribute for a probiotic strain. Ex vivo adhesion studies with cryosections of human gut biopsies have revealed, that the flagellum of EcN must be involved in efficient adhesion to human intestinal tissue. Thus, the function of EcN’s flagellum as an adhesin was investigated in this work. First, the hyperflagellated variant EcN ATHF was isolated and characterized by several experiments, e.g. motility tests and electron microscopy. Further ex vivo adhesion studies with EcN ATHF demonstrated a higher adhesion efficiency of this hyperflagellated variant confirming the role of the flagellum for adhesion of EcN to cryosections of human gut biopsies. Interestingly, EcN’s flagellum did not function as an adhesin in in vitro adhesion studies with the human epithelial cells Caco-2 and T24. These differences between the in vitro and ex vivo studies led to the assumption, that in vivo the flagellum of EcN mediates adhesion to mucus, which is not produced by Caco-2 and T24 cells, but was shown to be present in the cryosections of human gut biopsies. This was confirmed by in vitro adhesion studies with the mucin-producing epithelial cell line LS174-T, as flagella were essential for efficient adhesion to these cells. Furthermore, preincubation of flagellated EcN strains with mucin2 (porcine stomach) reduced their adhesion effiency to cryosections of human gut biopsies. To demonstrate the direct interaction between flagella from EcN wildtype and mucus, an ELISA was established. A direct concentration-dependent interaction between isolated flagella from EcN wildtype and mucin2 as well as human mucus (Colon) could be observed. In contrast, there was no direct interaction between isolated flagella from EcN wildtype and murine mucus (Duodenum, Ileum, Ceacum, Colon), indicating that mucus composition varies among different species. By testing different carbohydrates - known to be constituents of mucus - for their interaction with the flagellum of EcN, gluconate was identified as one receptor. Preincubation of isolated flagella with gluconate significantly reduced their interaction with mucin2 or human mucus. Additionally, the surface exposed domain D3 of flagellin, the major subunit of the flagellum, could be excluded to be responsible for the interaction with mucin2 or human mucus. Flagella, which were isolated from a domain D3 deficient mutant, bound even more efficient to mucin2 as well as to human mucus. Furthermore the change of pH had significant effects on the interaction between mucus and isolated flagella, probably due to conformational changes. In summary, this study identified the flagellum as a novel and apparently major adhesin in vivo of the probiotic EcN by employing a hyperflagellated variant, a ΔfliC mutant as well as the corresponding complemented strain. Additionally, EcN is so far the first probiotic strain, for which it has been shown, that its flagella directly bind to human mucus. Thereby the mucus component gluconate was identified as an important receptor. As some pathogens have been reported to use their flagella for adhesion to human host tissue, this organelle might enable EcN to compete with pathogens for successful colonization of the gut, which has been postulated to be a prerequisite for probiotics. KW - Escherichia coli KW - Probiotikum KW - Geißel KW - Adhäsion KW - Adhärenz KW - E.coli Nissle 1917 KW - Flagelle KW - adhesion KW - E. coli Nissle 1917 KW - flagellum Y1 - 2012 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-74201 ER - TY - JOUR A1 - Okoro, Chinyere K. A1 - Barquist, Lars A1 - Connor, Thomas R. A1 - Harris, Simon R. A1 - Clare, Simon A1 - Stevens, Mark P. A1 - Arends, Mark J. A1 - Hale, Christine A1 - Kane, Leanne A1 - Pickard, Derek J. A1 - Hill, Jennifer A1 - Harcourt, Katherine A1 - Parkhill, Julian A1 - Dougan, Gordon A1 - Kingsley, Robert A. T1 - Signatures of adaptation in human invasive Salmonella Typhimurium ST313 populations from sub-Saharan Africa JF - PLoS Neglected Tropical Diseases N2 - Two lineages of Salmonella enterica serovar Typhimurium (S. Typhimurium) of multi-locus sequence type ST313 have been linked with the emergence of invasive Salmonella disease across sub-Saharan Africa. The expansion of these lineages has a temporal association with the HIV pandemic and antibiotic usage. We analysed the whole genome sequence of 129 ST313 isolates representative of the two lineages and found evidence of lineage-specific genome degradation, with some similarities to that observed in S. Typhi. Individual ST313 S. Typhimurium isolates exhibit a distinct metabolic signature and modified enteropathogenesis in both a murine and cattle model of colitis, compared to S. Typhimurium outside of the ST313 lineages. These data define phenotypes that distinguish ST313 isolates from other S. Typhimurium and may represent adaptation to a distinct pathogenesis and lifestyle linked to an-immuno-compromised human population. KW - genome sequence KW - infection KW - pathogenicity KW - children KW - disease KW - adults KW - identification KW - Escherichia coli KW - virulence Y1 - 2015 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-143779 VL - 9 IS - 3 ER - TY - JOUR A1 - Hacker, Jörg A1 - Hof, H. A1 - Hughes, C. A1 - Goebel, W. T1 - Salmonella typhimurium strains carrying hemolysin plasmids and cloned hemolysin. genes from Escherichia coli N2 - Like all other Salmonella typhimurium strains examined, the smooth variants SF1397 (L T2) and 1366 and also their semi-rough and rough derivatives are non-haemolytic. Nevertheless, two haemolysin (Hly) plasmids of E. coli belonging to the inc groups incFllI,lv (pSU316) and incIz (pHly152) were able to be introduced into these strains by conjugation and stably maintained. A considerable percentage of the Hly+ transconjugants obtained had lost parts of their O-side chains, a result of selection for the better recipient capability of « semi-rough» variants rather than the direct influence of the Hly+ plasmids themselves. In contrast to the incF1lI1V plasmid pSU316, which exhibited higher conjugation rates with rough recipients, the incIz plasmid pHly152 was accepted best by smooth strains. Transformation with cloned E. coli haemolysin (hly) determinant was inefficient ( <10-8) for smooth strains, but 102-103 times higher for rough recipients, and was increased by the use of Salmonella-modified DNA. The transform ants and transconjugants were relatively stable and showed the same haemolytic activity as the E. coli donor strains. The virulence of the Hly+ smooth, semi-rough and rough S. typhimurium strains was tested in two mouse models, and neither the mortality rate nor the ability to multiply within the mouse spleen was influenced by the hly determinants. KW - Salmonella typhimurium KW - Plasmid KW - Haemolysin KW - Escherichia coli KW - Virulence Y1 - 1985 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-40309 ER - TY - JOUR A1 - Hacker, Jörg A1 - Gadeberg, Ole V. A1 - Orskov, Ida T1 - Role of alpha-Hemolysin for the in vitro Phagocytosis and intracellular killing of Escherichia coli N2 - The_role of a-hemolysin for the elimination of Eschericbia coli by phagocyres in vitro was investigated using sets of isogenic strains which included wild-type a -hemolyric srrains, derived strains with a reduced production of a-hemolysin and derived nonhemolytic strains. Phagocyrosis and intracellular killing of the bacteria by human blood granulocytes or monocytes were measured using growth inhibition rechniques. a-hemolytic strains were phagocytosed and killed ro a Jesser extent than isogenic strains with a reduced production of o:hemoJysin and isogenic nonhemolytic strains. The results obrained with granulocyres were similar to rhose obtained with monocyres although the elimination of bacteria by monocytes was less than that by granulocytes. These resulcs strongJy suggest that production of ahemolysin is a means by which E. coli counteracrs the activity of phagocytes by injuring these cells with the toxin. N2 - Die Rolle von a-Hämolysin bei der in vitro·Eliminierung von Escherichia coli durch Phagozyten wurde unter Verwendung isogener Stämme einschließlich von a-hämolysierenden Wildstämmen, davon abstammenden Stämmen mit reduzierter a-Hämolysin-Bildung und davon abstammenden nicht hämolysierenden Stämmen untersuche. Phagozytose und intrazelluläre Abtötung der Bakterien durch Granulozyten oder Monozyten im menschlieben Blut wurden u.nter Verwendung von Wachstums-Hemmtechniken gemessen. o:-hämolysierende Stämme wurden in geringerem Maße als isogene Stämme mit einer geringeren Hämolysin-Bildung und isogene nicht hämolysierende Stämme pbago:z.ytiert und ;~bgetötet. Die mit Granulozyten erzielten Ergebnisse waren den bei Monozyten ähnlich, obwohl die Bakterienelimination durch Monozyten geringer war als durch Granulozyten. Diese Ergebnisse deuten stark darauf hin, daß die Bildung von a-Hämolysin ein Mine) ist, mit dem E. coli der Aktivität der Phagozyten durch Schädigung dieser Zellen mit dem Toxin entgegenwirkt. KW - Escherichia coli Y1 - 1989 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-73019 ER - TY - JOUR A1 - Tschäpe, Helmut A1 - Bender, Larisa A1 - Ott, Manfred A1 - Wittig, Walter A1 - Hacker, Jörg T1 - Restriction fragments length polymorphism and virulence pattern of the veterinary pathogen Escherichia coli O139:K82:H1 N2 - Escherichia coli 0139: K82: H1 strains originating from outbreaks and single cases of oedema disease in pigs were characterized by their genomic restriction fragment length polymorphism (RFLP), their virulence pattern, and by the occurrence as well as the genomic distribution of the determinants for hemolysin (hly) and verotoxins (shiga-like toxins; sltI, sltII). Whereas the RFLPs revealed considerable variation among the E. coli 0139: K82: H1 isolates depending the origin and epidemic source of the strains, the virulence gene slt II was found to be present in nearly all strains in a particular chromosomal region. Similar to RFLPs, the plasmid profiles are useful for epidemiological analysis. KW - Escherichia coli Y1 - 1992 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-86131 ER - TY - THES A1 - Götz, Andreas T1 - Replikation von enteroinvasiven Escherichia coli und Salmonella enterica Serovar Typhimurium Stämmen in Epithelzellen unter besonderer Betrachtung des Kohlenstoffmetabolismus T1 - Replication of enteroinvasive Escherichia coli and Salmonella enterica Serovar Typhimurium strains in epithelial cells with particular examination of the carbon metabolism N2 - Schlagwörter: Salmonella , Salmonella enterica , Salmonella typhimurium , Salmonellose , Escherichia coli , Shigella , Infektion , Bakterielle Infektion , Zellkultur , HeLa-Zelle , Apoptosis , Metabolismus , Stoffwechsel , Glucose , Glucosetransport , Glucosestoffwechsel , Katabolismus , Kohlenstoff , Kohlenstoffbedarf , Kohlenstoffhaushalt , Kohlenstoffstoffwechsel , Kohlenstoff-13 , Kohlenstoffisotop Salmonella Typhimurium und enteroinvasive E. coli (EIEC) sind fakultativ intrazelluläre Bakterien aus der Familie der Enterobacteriaceae. Während erstere sich nach der Internalisierung durch eukaryotische Zellen normalerweise in einem spezialisierten Phagosom, der Salmonella-enthaltenden Vakuole (SCV), vermehren, replizieren EIEC im Zytoplasma der Wirtszellen. In der vorliegenden Arbeit wurde zunächst durch Mikroinjektion die Fähigkeit von S. Typhimurium 14028s untersucht, ebenfalls im Zytoplasma von Caco-2-Zellen replizieren zu können. Dabei wurde festgestellt, daß ein früher als S. Typhimurium 14028s WT bezeichneter Stamm eine Insertion eines Desoxythymidins an Position 76 des offenen Leserasters von rfbP trägt, einem Gen, dessen Protein an der LPS-Synthese beteiligt ist. Weiterhin synthetisierte dieser Stamm ein rauhes LPS. Aufgrund von Agglutination konnte der Rauh-Stamm nur mit geringem Erfolg mikroinjiziert werden. Hingegen lag 5 h nach der Mikroinjektion einer nicht invasiven Mutante von Salmonella mit vollständigem LPS der Anteil an Caco-2-Zellen, die mehr als 32 Bakterien enthielten, bei etwa 30 %. Der Anteil war 2-3 mal höher als bei früheren Mikroinjektionen in HeLa-Zellen. Daher wurde das Verhalten von HeLa-Zellen nach einer Infektion durch S. Typhimurium ΔsifA - einer Mutante, die aus der SCV ins Zytoplasma entkommt - untersucht. Dabei wurde festgestellt, daß die sifA-Mutante 10 h nach der Infektion die Aktivität der Caspasen 9 und 3 in HeLa-Zellen, aber nicht in Caco-2-Zellen induziert. In weiteren Versuchen wurde die Bedeutung von Glukose, Glukose-6-phosphat und Mannose als Kohlenstoffquellen für die extra- und intrazelluläre Replikation zweier Isolate enteroinvasiver E. coli und eines S. Typhimurium Stammes analysiert. Zu diesem Zweck wurden zunächst definierte Mutanten in den beiden wichtigsten Phosphoenolpyruvat-abhängigen Phosphotransferasesystemen (PTS) für die Aufnahme von Glukose und Mannose, ptsG und manXYZ, sowie im Antiporter für die Aufnahme von Glukose-6-phosphat, uhpT, konstruiert. Bei Wachstum im Minimalmedium mit Glukose als einziger C-Quelle waren die Generationszeiten aller ΔptsG- und ΔptsG, manXYZ-Mutanten im Vergleich zu den Wildstämmen deutlich verlängert. Ebenso wuchsen ΔmanXYZ-Mutanten bzw. ΔuhpT-Mutanten deutlich langsamer auf Mannose bzw. Glukose-6-phosphat. Jedoch ergaben sich hierbei Stamm-spezifische Unterschiede. So erreichte EIEC 4608-58 ΔuhpT in der stationären Phase eine ähnliche Zelldichte wie der Wildstamm in Gegenwart von Glukose-6-phosphat und eine ΔptsG, manXYZ-Mutante von S. Typhimurium 14028s konnte immer noch effizient mit Glukose wachsen. Infektionsversuche mit Caco-2-Zellen zeigten weiterhin, daß die Deletion von ptsG zu einer signifikanten Erhöhung der Adhärenz und Invasivität von EIEC 4608-58 führt, während sich die intrazellulären Generationszeiten aller hier untersuchten Mutanten kaum veränderten. Selbst die ΔptsG, manXYZ, uhpT-Dreifachmutanten der drei hier verwendeten Enterobakterien und die ΔptsG, manXYZ, glk-Mutante von S. Typhimurium 14028s konnten immer noch in Caco-2-Zellen replizieren, wenn auch mit Stamm-spezifisch verringerten Geschwindigkeiten. 13C-Markierungsexperimente mit [U-13C6]-Glukose als Substrat ergaben jedoch, daß in der Tat alle hier untersuchten enterobakteriellen Wildstämme Glukose während der Replikation in Caco-2-Zellen unter Zellkulturbedingungen verwerten. Glukose-6-phosphat, Glukonat oder Fettsäuren konnten dagegen als wichtigste Kohlenstoffquellen für das intrazelluläre Wachstum ausgeschlossen werden. EIEC 4608-58 metabolisierte Glukose jedoch weniger effizient als EIEC HN280 und schien zudem noch zusätzlich C3-Substrate aus der Wirtszelle aufzunehmen. Das Markierungsmuster zeigte einen Stamm-spezifischen Kohlenstofffluß durch Glykolyse und/oder Entner-Doudoroff-Weg, Pentosephosphatzyklus, Citratzyklus und den anaplerotischen Reaktionen zwischen PEP und Oxalacetat. Mutanten mit Deletionen in ptsG und manXYZ konnten auf alternative C3-Substrate wechseln und glichen dies durch eine erhöhte Aufnahme von Aminosäuren aus den Wirtszellen aus. N2 - Salmonella Typhimurium and enteroinvasive E. coli (EIEC) are facultative intracellular bacteria belonging to the family of Enterobacteriaceae. After internalisation by eukaryotic cells Salmonella normally resides inside a specialised phagosome called Salmonella-containing vacuole (SCV) whereas EIEC replicates inside the cytosol of host cells. In this study the ability of S. Typhimurium 14028s to replicate inside the cytosol of Caco-2 host cells was investigated by microinjection. It was thereby observed that a formerly used strain also called S. Typhimurium 14028s WT harboured an insertion of one deoxythymidin at position 76 of the rfbP open reading frame, a gene whose protein is involved in the LPS biosynthesis. Furthermore this strain expressed a rough LPS. Due to agglutination the microinjection procedure of the rough strain had only little success. But the percentage of Caco-2 cells that harboured more than 32 bacteria was about 30 % 5 h after injection of a non invasive mutant of Salmonella expressing full-length LPS chains. This was 2-3 times higher than the results observed before using HeLa cells. Therefore, the behaviour of HeLa cells infected by S. Typhimurium ΔsifA - a mutant that escapes from the SCV into the cytosol - was studied. The results showed that the sifA mutant strain induced the activity of caspases 9 and 3 in HeLa cells 10 h after infection but not in Caco-2 cells. In further experiments the contribution of glucose, glucose 6-phosphate and mannose as carbon sources for extra- and intracellular growth of two enteroinvasive E. coli isolates and one S. Typhimurium strain was analysed. Therefore, defined mutants of the most important phosphoenolpyruvate-dependent phosphotransferase systems (PTS) taking up glucose or mannose, i.e. ptsG and manXYZ, were constructed as well as mutants carrying a deletion of uhpT the antiporter for uptake of glucose 6-phosphate. During growth of the resulting ΔptsG and ΔptsG, manXYZ mutants in minimal medium with glucose as sole carbon source considerably longer generation times were observed. Likewise, ΔmanXYZ mutants and ΔuhpT mutants grew significantly slower on mannose or glucose 6-phosphate, respectively. But there were also strain specific differences. EIEC 4608-58 ΔuhpT reached a similar cell density as the wild-type strain during stationary phase when grown in the presence of glucose 6-phosphate and S. Typhimurium ΔptsG, manXYZ could still grow efficiently on glucose. Infections of Caco-2 cells showed that the deletion of ptsG increased the ability of EIEC 4608-58 significantly to adhere and invade these cells. But the intracellular generation times of all mutants under study were hardly changed. Even the triple mutants ΔptsG, manXYZ, uhpT of all three enterobacterial strains and the ΔptsG, manXYZ, glk mutant of S. Typhimurium 14028s were still able to replicate in Caco-2 cells, albeit at strain specific lower rates. 13C-Isotopologue profiling using [U-13C6]glucose as precursor revealed that in deed all analysed enterobacterial wild-type strains utilised glucose for their replication in Caco-2 cells under the applied conditions. Glucose 6-phosphate, gluconate and fatty acids could be ruled out as main carbon sources for intracellular growth. EIEC 4608-58 metabolised the applied glucose less efficiently than EIEC HN280 and seemed to take up C3-compounds from the host cells in addition to glucose. The labelling patterns reflected strain specific carbon fluxes via glycolysis and/or Entner-Doudoroff pathway, pentose phosphate pathway, citric acid cycle and the anaplerotic reactions between PEP and oxaloacetate. Mutants carrying deletions in ptsG and manXYZ switched to alternative C3-substrates and counterbalanced this by an increased uptake of amino acids from the host cells. KW - Escherichia coli KW - Intrazellulärraum KW - Salmonella typhimurium KW - Vermehrung KW - Kohlenstoffstoffwechsel KW - Salmonella KW - Salmonella enterica KW - Salmonella typhimurium KW - Salmonellose KW - Escherichia coli KW - Shigella KW - Infektion KW - Bakterielle Infektion KW - sifA KW - enteroinvasive KW - CaCo-2 cell KW - 13C-isotopologue profiling KW - microinjection Y1 - 2010 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-57292 ER - TY - JOUR A1 - Morschhäuser, Joachim A1 - Vetter, Viktoria A1 - Korhonen, Timo A1 - Uhlin, Bernt Eric A1 - Hacker, Jörg T1 - Regulation and binding properties of S fimbriae cloned from E. coli strains causing urinary tract infection and meningitis N2 - S fimbriae are able to recognize receptor molecules containing sialic acid and are produced by pathogenic E. coli strains causing urinary tract infection and menigitis. In order to characterize the corresponding genetic determinant, termed S fimbrial adhesin ( sfa) gene duster, we have cloned the S-specific genes from a urinary pathogen and from a meningitis isolate. Nine genes are involved in the production of S fimbriae, two of these, sfaB and sfaC code for regulatory proteins being necessary for the expression of S fimbriae. Two promoters, PB and Pc, are located in front of these genes. Transcription of the sfa determinant is influenced by activation of the promotersvia SfaB and SfaC, the action of the H-NS protein and an RNaseE-specific mRNA processing. In addition, a third promoter, P A• located in front of the major subunit gene sfaA, can be activated under special circumstances. Four genes of the sfa determinant code for the subunit-specific proteins, SfaA (16 kda), SfaG (17 kda), SfaS (14 kda) and SfaH (29 kda). It was demonstrated that the protein SfaA is the major subunit protein while SfaS is identical to the sialic-acid-specific adhesin of S fimbriae. The introduction of specific mutations into sfaS revealed that a region of six amino acids of the adhesin which includes two lysine and one arginine residues is involved in the receptor specific interaction of S fimbriae. Additionally, it has been shown that SfaS is necessary for the induction of fimbriation while SfaH plays a role in the stringency of binding of S fimbriae to erythrocytes. KW - Escherichia coli KW - Harnwegsinfekt KW - Hirnhautentzündung Y1 - 1993 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-86140 ER - TY - THES A1 - Mordhorst, Ines Louise T1 - Phylogenetische und funktionelle Analysen zur Kapsel O-Acetyltransferase NeuO von Escherichia coli K1 T1 - Phylogenetic and functional analysis on the capsule O-acetyltransferase NeuO of Escherichia coli K1 N2 - Escherichia coli ist ein Kommensale des menschlichen und tierischen Gastrointestinaltraktes. Einige E. coli-Stämme sind in der Lage, extraintestinale Erkrankungen beim Menschen wie Harnwegsinfekte, Neugeborenen-Meningitis und Sepsis, sowie beim Tier aviäre Coliseptikämien, hervorzurufen. Ein wichtiger Virulenzfaktor des Bakteriums ist dabei die aus α-2,8-verknüpften Sialinsäuremonomeren aufgebaute K1-Kapsel, die phasenvariabel mit einer hohen Frequenz O-acetyliert werden kann. Im Jahr 2005 konnte gezeigt werden, dass es sich bei dem für die O-Acetylierung verantwortlichen Enzym um die O-Acetyltransferase NeuO handelt, die von dem K1-spezifischen Prophagen CUS-3 codiert wird. Die Verteilung von neuO in der E. coli K1-Population sowie die funktionelle Relevanz der K1-Kapsel O-Acetylierung für das Bakterium waren zu Beginn der vorliegenden Arbeit weitestgehend unklar. Eine E. coli K1-Stammsammlung mit 183 Isolaten wurde aufgebaut. Die E. coli K1-Isolate stammten sowohl aus Stuhlproben gesunder Freiwilliger, humanen Harnwegsinfekten, humanen invasiven Erkrankungen (Neugeborenen-Meningitis und Bakteriämie) und aus an Coliseptikämie erkrankten Vögeln. Die Isolate der E. coli K1-Stammsammlung wurden mit der Multilokus-Sequenztypisierung (MLST) typisiert. Es konnten 39 Sequenztypen (ST) sowie fünf Sequenztyp-Komplexe (STC) identifiziert werden. Bei dem mit Abstand häufigsten STC handelte es sich um den STC95, dem 80 Stämme (44%) angehörten. Insgesamt 103 der 183 E. coli K1-Stämme waren neuO-positiv (56%). Das Gen wurde in 78 (98%) der STC95-Isolate, aber nur in 25 (24%) der 103 nicht-STC95-Stämme gefunden. NeuO war also mit dem STC95 assoziiert. Über Sequenzanalysen des CUS-3-Prophagen konnten CUS-3-Genotypen bestimmt werden. Die Gruppierung der CUS-3-Genotypen und der E. coli K1-ST sowie der anschließende Vergleich beider Gruppierungen miteinander offenbarte eine Segregation der Prophagen-Genotypen entsprechend der ST. Daher legen die in dieser Arbeit ermittelten Ergebnisse eine Koevolution des Phagen mit seinem Wirt nahe. Einige humane und aviäre E. coli K1-Isolate waren weder auf Basis der MLST bzw. der CUS-3-Genotypisierung noch anhand des Vorhandenseins verschiedener, mit extraintestinal-pathogenen E. coli-assoziierter Gene voneinander unterscheidbar, was die Hypothese einer zoonotischen Transmission dieser Stämme unterstützt. In den in dieser Arbeit durchgeführten funktionellen Analysen konnte weder ein Effekt der NeuO-vermittelten E. coli K1-Kapsel O-Acetylierung auf die Fähigkeit der Bakterien an humane mikrovaskuläre Gehirnendothelzellen zu adhärieren oder in diese zu invadieren, noch auf die in vivo-Virulenz der Bakterien im Hühnermodell beobachtet werden. Die K1-Kapsel O-Acetylierung verringerte die in vivo-Kolonisierung des Hühner-Gastrointestinaltraktes und die in vitro-Biofilmbildung durch das Bakterium, wohingegen sie die Austrocknungsresistenz von E. coli K1 erhöhte. Möglicherweise dient die phasenvariable neuO-Expression und damit die E. coli K1-Kapsel O-Acetylierung der Anpassung des Bakteriums an wechselnde Umweltbedingungen. N2 - Escherichia coli is a commensal of the human and animal intestinal tract. Some strains have the ability to cause extraintestinal disease in humans such as urinary tract infections, neonatal meningitis and septicemia, but also animal infection such as avian colisepticemia. A major virulence factor of the bacterium is the K1 capsule composed of α-2,8-linked sialic acid monomers, which can be phase variably O-acetylated at a high frequency. In 2005, it was shown that the enzyme responsible for O-acetylation is the O-acetyltransferase NeuO, which is encoded by the K1-specific prophage CUS-3. The distribution of neuO as well as the functional relevance of the K1 capsule O-acetylation for the bacterium were largely unknown at the start of the thesis. A strain collection comprising 183 E. coli K1 strains was established. The E. coli K1 isolates derived from stool samples of healthy donors, human urinary tract infections, human invasive diseases like newborn meningitis and bacteremia, and from avian colisepticemia. All isolates were typed by multilocus sequence typing (MLST). Thirty-nine sequence types (ST) and five sequence type complexes (STC) were identified. The major share of the strains belonged to the STC95 (80 strains, 44%). 103 of 183 E. coli K1 strains were neuO-positive (56%). The gene was found in 78 (98%) STC95 isolates, but only in 25 (24%) of 103 non-STC95 isolates. Therefore, there was an association of neuO with the STC95. With the help of DNA sequencing of internal fragments of CUS-3, distinct CUS-3 genotypes were assigned. There was a segregation of CUS-3 genotypes according to STs, suggesting coevolution of the prophage CUS-3 and its host. Some human and avian isolates were indistinguishable with respect to MLST, CUS-3 genotyping and the presence of genetic markers associated with extraintestinal pathogenic E. coli, which was compatible with the hypothesis of zoonotic transmission of these strains. Functional analyses performed in this study neither revealed an impact of NeuO-mediated K1 capsule O-acetylation on the ability of the bacteria to adhere to or invade into human brain microvascular endothelial cells, nor on the in vivo virulence of the bacteria in a chicken infection model. K1 capsule O-acetylation decreased in vivo chicken gut colonization and in vitro biofilm formation, while increasing E. coli K1 desiccation resistance. This study provides evidence that phase variable neuO expression and the subsequent O-acetylation of the E. coli K1 capsule serves as an efficient tool for the adaptation to changing environments. KW - Escherichia coli KW - Kapsel KW - Biofilm KW - Phylogenie KW - Virulenzfaktor KW - Acetylierung KW - Genexpression KW - O-Acetylierung KW - Multilokus-Sequenztypisierung KW - O-acetylation KW - multilocus sequence typing Y1 - 2009 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-47880 ER - TY - THES A1 - Brandes, Nicolas T1 - Oxidative Thiol Modifications in Pro- and Eukaryotic Organisms T1 - Oxidative Thiol Modifikationen in Pro- und Eukaryotischen Organismen N2 - Cystein spielt eine wichtige Rolle in der Biochemie vieler Proteine. Aufgrund der Redox-Eigenschaften und der hohen Reaktivität der freien Thiol-Gruppe sowie dessen Fähigkeit Metallionen zu koordinieren, ist Cystein oft Bestandteil von katalytischen Zentren vieler Enzyme. Zudem lassen sich Cysteine durch reaktive Sauerstoff- und Stickstoffspezies leicht reversibel oxidativ modifizieren. In den letzten Jahren wurde gezeigt, dass Proteine redox-bedingte Thiol-Modifikationen nutzen, um Veränderungen ihrer Aktivität zu steuern. Diese redox-regulierten Proteine spielen eine zentrale Rolle in vielen physiologischen Prozessen. Das erste Ziel meiner Arbeit war die Identifizierung von Stickstoffmonoxid (NO)-sensitiven Proteinen in E. coli. Die redox-bedingten Funktionsänderungen solcher Proteine erklären möglicherweise die veränderte Physiologie von E. coli Zellen, die unter NO-Stress leiden. Um E. coli Proteine zu identifizieren, die unter Einwirkung von NO-Stress reversibel Thiol-modifiziert werden, wandte ich eine Kombination aus differentiellem Thiol-Trapping und 2D Gel-Elektrophorese an. Es wurden zehn Proteinen identifiziert, welche NO-sensitive Thiol-Gruppen enthalten. Genetische Studien ergaben, dass Modifikationen an AceF & IlvC mitverantwortlich sind für die NO-induzierte Wachstumshemmung. Bemerkenswert ist es, dass die Mehrheit der identifizierten Proteine speziell nur gegen reaktive Stickstoffspezies empfindlich ist, welches an einem der identifizierten Stickstoffmonoxid-sensitiven Proteinen, der kleinen Untereinheit von Glutamate synthase, getestet wurde. In vivo und in vitro Aktivitätsstudien zeigten, dass es zu einer schnellen Inaktivierung von Glutamate synthase nach NO-Behandlung kommt, das Protein aber resistent gegenüber anderen Oxidationsmittel ist. Diese Resultate implizieren, dass reaktive Sauerstoff- und Stickstoffspezies unterschiedliche physiologische Vorgänge in Bakterien beeinflussen. Das zweite Ziel meiner Arbeit war es, redox-sensitive Proteine in S. cerevisiae zu identifizieren und deren Redox-Zustand als in vivo Read-Out zu verwenden, um die Rolle von oxidativen Stress während des Alterungsprozess eukaryotischer Zellen zu analysieren. Zunächst bestimmte ich in Hefezellen mit Hilfe von OxICAT, einer hochsensiblen quantitativen Methode, die Thiol-Trapping mit Massenspektrometrie verbindet, den exakten in vivo Thiol-Status von fast 300 Proteinen. Diese Proteine lassen sich in vier Gruppen einteilen: 1) Proteine, deren Cysteinreste resistent gegen Oxidation sind; 2) Proteine, in denen Cysteinmodifikationen strukturelle Aufgaben übernehmen; 3) Proteine mit oxidationsempfindlichen Cysteinen, die bereits eine gewisse Oxidation in exponentiell wachsenden Hefezellen aufweisen; 4) Proteine, die reduziert sind, aber redox-sensitive Cysteinreste enthalten, die die Funktion der Proteine bei Vorhandensein von oxidativen Stress beeinflussen. Die Sensitivität dieser Proteine gegenüber oxidativen Stress wurde durch Exposition subletaler Konzentrationen von H2O2 oder Superoxid auf Hefezellen nachgewiesen. Es wurde gezeigt, dass die wichtigsten zellulären Angriffspunkte von H2O2- und Superoxid-bedingtem Stress Proteine sind, die an Vorgängen der Translation, Glykolyse, des Citratzyklus und der Aminosäure-Biosynthese beteiligt sind. Diese Zielproteine zeigen, dass Zellen für die Bekämpfung von oxidativen Stress Metabolite schnell in Richtung des Pentosephosphatweges umleiten, um die Produktion des Reduktionsmittels NADPH sicherzustellen. Die hier präsentierten Ergebnisse belegen, dass die quantitative Bestimmung des Oxidationsstatus von Proteinen eine wertvolle Methode ist, um redox-sensitive Cysteinreste zu identifizieren. Die OxICAT Technologie wurde dann verwendet, um das genaue Ausmaß und die Entstehung von oxidativen Stress in chronologisch alternden S. cerevisiae Zellen zu bestimmen. Für diese Bestimmung wurde der Oxidationsstatus von Proteinen in alternden Hefezellen als physiologischer Read-Out verwendet. Ich zeigte, dass die zelluläre Redox-Homöostase in chronologisch alternden Hefezellen global zusammenbricht, wobei es sich dabei um einen Prozess handelt, der dem Zelltod vorausgeht. Der Beginn dieses Zusammenbruchs scheint mit der Lebensdauer der Hefezellen zu korrelieren, da Kalorienrestriktion die Lebensdauer der Hefezellen erhöht und den Zusammenbruch des Redox-Gleichgewichts verzögert. Die Oxidation einer kleinen Anzahl an Proteinen (z.B. Thioredoxin reductase) geht dem Redox-Zusammenbruch deutlich voraus, was maßgeblich zum Verlust der Redox-Homöostase beitragen könnte. Diese Studien an alternden Hefezellen erweitern unser Verständnis, wie sich Veränderungen in der Redox-Homöostase auf die Lebensdauer von Hefezellen auswirken. Zudem bestätigen die hier präsentierten Ergebnisse die Bedeutung von oxidativen Thiol-Modifikationen als eine der wichtigsten posttranslationalen Proteinmodifikationen in pro-und eukaryotischen Organismen N2 - Cysteines play important roles in the biochemistry of many proteins. The high reactivity, redox properties, and ability of the free thiol group to coordinate metal ions designate cysteines as the amino acids of choice to form key catalytic components of many enzymes. Also, cysteines readily react with reactive oxygen and nitrogen species to form reversible oxidative thiol modifications. Over the last few years, an increasing number of proteins have been identified that use redox-mediated thiol modifications to modulate their function, activity, or localization. These redox-regulated proteins are central players in numerous important cellular processes. First aim of this study was to discover nitric oxide (NO) sensitive proteins in E. coli, whose redox-mediated functional changes might explain the physiological alterations observed in E. coli cells suffering from NO-stress. To identify E. coli proteins that undergo reversible thiol modifications upon NO-treatment in vivo, I applied a differential thiol trapping technique combined with two-dimensional gel analysis. 10 proteins were found to contain thiol groups sensitive to NO-treatment. Subsequent genetic studies revealed that the oxidative modifications of AceF & IlvC are, in part, responsible for the observed NO-induced growth inhibition. Noteworthy, the majority of identified protein targets turned out to be specifically sensitive towards reactive nitrogen species. This oxidant specificity was tested on one NO-sensitive protein, the small subunit of glutamate synthase. In vivo and in vitro activity studies demonstrated that glutamate synthase rapidly inactivates upon nitric oxide treatment but is resistant towards other oxidative stressors. These results imply that reactive oxygen and nitrogen species affect distinct physiological processes in bacteria. The second aim of my study was to identify redox-sensitive proteins in S. cerevisiae and to use their redox state as in vivo read-out to assess the role of oxidative stress during the eukaryotic aging process. I first determined the precise in vivo thiol status of almost 300 yeast proteins located in the cytosol and sub-cellular compartments of yeast cells using a highly quantitative mass spectrometry based thiol trapping technique, called OxICAT. The identified proteins can be clustered in four groups: 1) proteins, whose cysteine residues are oxidation resistant; 2) proteins with structurally or functionally important cysteine modifications 3) proteins with highly oxidation-sensitive active site cysteines, which are partially oxidized in exponentially growing yeast cells due to their exquisite sensitivity towards low amounts of ROS; 4) proteins that are reduced in exponentially growing cells but harbor redox-sensitive cysteine(s) that affect the catalytic function of the protein during oxidative stress. These oxidative stress sensitive proteins were identified by exposure of yeast cells to sublethal concentrations of H2O2 or superoxide. It was shown that the major targets of peroxide- and superoxide-mediated stress in the cell are proteins involved in translation, glycolysis, TCA cycle and amino acid biosynthesis. These targets indicate that cells rapidly redirect the metabolic flux and energy towards the pentose phosphate pathway in an attempt to ensure the production of the reducing equivalent NADPH to counterattack oxidative stress. These results reveal that the quantitative assessment of a protein’s oxidation state is a valuable tool to identify catalytically active and redox-sensitive cysteine residues. The OxICAT technology was then used to precisely determine extent and onset of oxidative stress in chronologically aging S. cerevisiae cells by utilizing the redox status of proteins as physiological read-out. I found that chronological aging yeast cells undergo a global collapse of the cellular redox homeostasis, which precedes cell death. The onset of this collapse appears to correlate with the yeast life span, as caloric restriction increases the life span and delays the redox collapse. These results suggest that maintenance of the redox balance might contribute to the life expanding benefits of regulating the caloric intake of yeast. Clustering analysis of all oxidatively modified proteins in chronological aging yeast revealed a subset of proteins whose oxidative thiol modifications significantly precede the general redox collapse. Oxidation of these early target proteins, which most likely results in a loss of their activity, might contribute to or even cause the observed loss of redox homeostasis (i.e., thioredoxin reductase) in chronologically aging yeast. These studies in aging yeast expand our understanding how changes in redox homeostasis affect the life span of yeast cells and confirm the importance of oxidative thiol modifications as key posttranslational modifications in pro- and eukaryotic organisms. KW - Oxidativer Stress KW - Cystein KW - Saccharomyces cerevisiae KW - Escherichia coli KW - Wasserstoffperoxid KW - Hyperoxide KW - Sauerstoffradikal KW - Thiolgruppe KW - Altern KW - Oxidation KW - Biologische Oxidation KW - Oxidative Thiol Modifikationen KW - Reaktive Sauerstoffspezies KW - Chronologisches Altern KW - Reversibel KW - Posttranslational KW - oxidative thiol modification KW - chronological aging KW - reactive oxygen species KW - Saccharomyces cerevisiae KW - thioredoxin reductase Y1 - 2010 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-46542 ER - TY - JOUR A1 - Schmoll, T. A1 - Hacker, Jörg A1 - Goebel, W. T1 - Nucleotide sequence of the sfaA gene coding for the S fimbrial protein subunit of Escherichia coli N2 - The sfaA gene of the uropathogenic Escherichia coli 06 strain 536, which is responsible for the determination of the S fimbrial protein subunit, was sequenced. The structural gene codes for a polypeptide of 180 amino acids including a 24-residue N-terminal signal sequence. A size of 15.95 kDa was calculated for the processed SfaA protein. The nucleotide and deduced amino acid sequences show significant homology to those of the F1C fimbria and, to a lesser extent, of the mannose- sensitive hemagglutinating fimbria (FimA, PilA). Only week homology toP fimbriae subunits (F72 , Pap) was found. KW - Infektionsbiologie KW - Escherichia coli KW - Fimbria KW - (Nucleotide sequence KW - sfaA gene) Y1 - 1987 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-59480 ER - TY - JOUR A1 - Van Die, I. A1 - Kramer, C. A1 - Hacker, Jörg A1 - Bergmans, H. A1 - Jongen, W. A1 - Hoekstra, W. T1 - Nucleotide sequence of the genes coding for minor fimbrial subunits of the F1C fimbriae of Escherichia coli N2 - F 1 C fimbriae allow uropathogenic Escherichia coli to adhere to specific epithelial surfaces. This adhesive property is probably due to the presence of minor fimbrial components in F1C fimbriae. The foe gene cluster encoding F1C fimbriae has been cloned, as described previously. Here we present the nucleotide sequence (2081 bp) coding for the F 1 C minor fimbria I subunits. The structural genes code for polypeptides of 175 (FocF), 166 (FocG), and 300 (FocH) amino acids. The deduced amino acids of the F 1 C minor subunits were compared with the reported sequences of the minor subunits of other types of fimbriae. The data show that the Foc minor subunits are highly homologous to the corresponding Sfa proteins, whereas homology to the minor subunits of type 1 and P fimbriae is much lower. KW - Pilus KW - Escherichia coli KW - Adherence KW - Urinary tract KW - Foc protein KW - Minor subunits KW - Sequencing KW - Homology Y1 - 1991 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-40353 ER - TY - THES A1 - Maibaum, Maria T1 - Molekulargenetische Untersuchungen zur Persistenz und Genomvariabilität von Escherichia-coli-Isolaten von Patientinnen mit chronisch rezidivierenden Harnwegsinfektionen T1 - Molecular genetic investigations of persistence and gene variability of Escherichia coli isolates from patients with chronic recurrent urinary tract infections N2 - Harnwegsinfektionen gehören zu den häufigsten Infektionskrankheiten des Menschen und werden überwiegend durch uropathogene Escherichia coli (UPEC) ausgelöst. Die genaue Erforschung der Krankheitserreger durch molekularbiologische Verfahren könnte zur Entwicklung neuer diagnostischer Methoden sowie zu besseren Präventions- und Therapiestrategien führen. In der vorliegenden Studie wurden 166 Stuhl- und 86 Urinisolate, die von Patientinnen mit chronisch rezidivierenden Harnwegsinfektionen gewonnen wurden, auf das Vorhandensein der Virulenzfaktoren alpha-Hämolysin, P-, S- und Typ-1-Fimbrien sowie den zytotoxisch-nekrotisierenden Faktor 1 sowohl geno- als auch phänotypisch untersucht. Weiterhin wurde mit Hilfe der Rep-PCR und der Pulsfeldgelelektrophorese ein Identitäts-Screening durchgeführt, so daß sämtliche E. coli-Isolate zu 46 Stuhl- und 16 Urinklonen zusammengefaßt werden konnten. Alle untersuchten Gene fanden sich bei den Urinklonen häufiger als bei den Stuhlklonen, dabei war das Typ-1-Fimbrien-Gencluster jeweils am häufigsten vorhanden. Im Gegensatz zu den Stuhlstämmen exprimierten alle hly positiven Urinstämme dieses Toxin auch, die Fimbrienproduktion überwog dagegen bei den Stuhlisolaten. Bezüglich der Klinik korrelierte die Pathogenität der Urinklone mit der Aktivitätsstufe, bei den Stuhlklonen konnte dieser Zusammenhang nicht nachgewiesen werden. Bedingt durch den chronischen Krankheitsverlauf der Patientinnen wiesen die E. coli-Isolate dieser Studie ein geringeres pathogenes Potential auf als vergleichbare Isolate akuter Infektionsereignisse. Es konnten keine Deletionen von Pathogenitätsinseln beobachtet werden. Auffallend war, daß unter der Langzeitmetaphylaxe mit AcimethinR sämtliche untersuchten Pathogenitätsfaktoren seltener auftraten. Bei der Beobachtung der einzelnen Patientinnen über einen längeren Zeitraum hinweg (Januar bis Oktober 1998) konnten mehrfach Persistenzen verschiedener Klone von bis zu 9 Monaten nachgewiesen werden. N2 - Urinary tract infections belong to the most common human infectious diseases and are mostly caused by uropathogenic Escherichia coli (UPEC). In the following study 166 stool- and 86 urine strains were isolated from 11 patients suffering from chronic urinary tract infections and as well genetically as phenotypically tested on the possession of hemolysin, P-, S- and type-1-fimbriae and cytotoxic necrotizing factor type 1. Besides they were analyzed by so called Rep-polymerase chain reaction and pulse field gene electrophoresis. With this identity-screening all strains could be divided into 46 stool- and 16 urine clones. All investigated gene clusters existed more often on the urine as on the stool clones. The type-1-fimbriae gene cluster was always the most frequent virulence factor. More toxic UPEC isolates correlated with clinical gravity of disease, whereas virulence of stool clones had no connection with disease activity. Due to chronic progress of disease these E. coli strains possessed less virulence factors than comparable isolates from acute infection phases. There was no proof of deletions of pathogenicity islands. All clones isolated under prophylaxis with AcimethinR carried less pathogen factors than strains without therapy. Persistence of several clones could be observed up to 9 months. KW - Harnwegsinfektion KW - Escherichia coli KW - Genomvaribilität KW - urinary tract infection KW - Escherichia coli KW - gene variability Y1 - 2002 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-4581 ER - TY - THES A1 - Hoffmann-Wolz, Alexander T1 - Molekularbiologische Untersuchungen von Escherichia-coli-Stuhl- und Urin-Isolaten von Patientinnen mit chronisch-rezidivierenden Harnwegsinfektionen hinsichtlich ihrer Persistenz und Genomstruktur N2 - Harnwegsinfektionen (HWI) gehören zu den häufigsten bakteriell bedingten Erkrankungen; vor allem Frauen sind sehr häufig betroffen. Harnwegsinfektionen kommt große medizinische und volkswirtschaftliche Bedeutung zu. Bei akuten unkomplizierten Infekten ist allein Escherichia coli in über 70 % der Fälle die Ursache. Auch bei komplizierten chronischen Infektionen spielt Escherichia coli in über 40 % aller Fälle eine große Rolle. E. coli Stämme, die die Nieren und ableitenden Harnwege inklusive Harnblase infizieren, werden als uropathogene E. coli (UPEC) bezeichnet. Sie unterscheiden sich von anderen, apathogenen E. coli Stämmen dadurch, daß sie bestimmte Virulenzfaktoren (VF) und Fitnessfaktoren besitzen, die ihnen besondere Virulenz verleihen. Solche Virulenzfaktoren sind vor allem Kapseln, Adhäsine, Toxine und Eisenaufnahmesysteme. In dieser Arbeit wurden Stuhl- und Urinproben von acht Patientinnen untersucht, die in der nephrologischen Abteilung der Universitätsklinik Jena betreut wurden und alle an chronisch rezidivierenden Harnwegsinfektionen leiden. Die gewonnenen Isolate wurden mittels Multiplex-PCR auf Virulenzfaktoren getestet, die für UPEC typisch sind. Des Weiteren wurden mit Hilfe der „Repetitive Extragenic Palindromic“ (Rep)-PCR und den Ergebnissen aus der Multiplex-PCR-Analyse Klone definiert. Ausgewählte Isolate wurden mittels Pulsfeldgelelektrophorese (PFGE) untersucht. Die Rep-PCR- und PFGE-Ergebnisse aus vorangegangenen Arbeiten (L. Brauchle, 2002 und M. Maibaum, 2003) wurden in diese Arbeit mit integriert und nomenklatorisch angeglichen. Die 167 Stuhl- und 186 Urinisolate dieser Arbeit konnten 81 Stuhl- und 64 Urinklonen zugeordnet werden. In der vorliegenden Studie scheinen die Häufigkeiten UPEC-typischer Virulenzfaktoren nach längerer chronischer Harnwegsinfektion wieder etwas anzusteigen. Insbesondere aber nahmen die Häufigkeiten der Virulenzfaktoren innerhalb der Stuhlstämme zu und entsprachen oftmals nahezu den Häufigkeiten bei Urinstämmen. Kapselgene, die bei Urinstämmen deutlich häufiger gefunden wurden, scheinen bei Chronizität eine Rolle zu spielen. Auch innerhalb der Urinklone häufiger zu finden waren die für Hämolysin, P-Fimbrien, S- bzw. F1C-Fimbrien codierenden Gencluster. Als Erregerreservoir scheint auch bei chronischen Harnwegsinfektionen der Darm festzustehen. Im Gesamtstudienzeitraum von 38 Monaten (1997-2000) koexistierten 18 Stämme in Stuhl und Urin gleichzeitig. Zehn dieser Koexistenzen wurden nochmals zu anderen Zeitpunkten gefunden (Persistenzen). Über den Vergleich der PFGE-Muster von Stuhl- und Urinklonen konnten bei Probandin Pat. 2 (HF) Klone mit dem PFGE-Muster IV und XV identifiziert werden, deren Bandenmuster sich so ähnlich sind (nur ein einziger Bandenshift), daß hier vermutlich eine DNA-Umlagerung stattgefunden hat. Innerhalb von 51 Untersuchungsterminen konnte lediglich vier Mal eine akute Exazerbation erfaßt werden. Tendenziell läßt sich über den gesamten Studienzeitraum ein Rückgang an erneuten Ausbrüchen bei ähnlicher Verteilung des Virulenzfaktorspektrums in den gefundenen Stuhl- und Urinstämmen beobachten. Eine prophylaktische Gabe von L-Methionin (Acimethin®) verminderte die Häufigkeit der untersuchten Virulenzfaktoren innerhalb der Stuhlstämme, kann aber bei chronischen Harnwegsinfektionen eine Exazerbation nicht sicher verhindern, möglicherweise jedoch deren Anzahl verringern. KW - Escherichia coli KW - Harnwegsinfektionen KW - Pathogenitätsfaktoren Y1 - 2007 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-27338 ER - TY - THES A1 - Oswald, Sibylle T1 - Molekularbiologische Untersuchungen des probiotischen Escherichia coli Stammes DSM 6601 und Entwicklung der stammeigenen Plasmide als Klonierungsvektoren T1 - Molecular investigations of the probiotic Escherichia coli strain DSM 6601 and development of the indigenous plasmids as cloning vectors N2 - Der apathogene E. coli Stamm DSM 6601 (E. coli Nissle 1917) kann als Modellorganismus für die Verwendung eines kommensalen Gram-negativen Bakterienstammes als Probiotikum angesehen werden. Dieser E. coli Stamm wurde intensiv erforscht und seine Eigenschaften sind daher gut charakterisiert. Der probiotische Charakter dieses Bakterienstammes ist auf gute Kolonisierungseigenschaften des menschlichen Darms, immunmodulatorische Effekte und antagonistische Wirkungen zurückzuführen. Der E. coli Stamm DSM 6601 wird seit einigen Jahrzehnten zur Behandlung verschiedener gastrointestinaler Erkrankungen eingesetzt und seine therapeutische Wirksamkeit ist wissenschaftlich bewiesen. Daher eignet sich dieser Stamm als Modellstamm für die Entwicklung eines bakteriellen Lebendvektors, der für mukosale Immunisierungen oder die zielgerichtete Lieferung von therapeutischen Molekülen in den Darm eingesetzt werden könnte. Ein Ziel dieser Arbeit war die Charakterisierung der kryptischen Plasmide pMUT1 und pMUT2 des probiotischen E. coli Stammes DSM 6601 durch Analyse der DNA-Sequenz. Die Analyse ergab, dass das Plasmid pMUT1 ein Replikationssystem vom ColE1-Typ, ein Mobilisierungssystem sowie eine Stabilitätsregion enthält, während das Plasmid pMUT2 ein ColE2-ähnliches Replikationssystem und ein anderes Mobilisierungssystem besitzt. In beiden Plasmiden konnten keine weiteren offenen Leserahmen mit bekannter Funktion identifiziert werden. Des Weiteren wurde ein spezifisches PCR-Nachweissystem für den E. coli Stamm DSM 6601 etabliert, das auf einer Methode zur direkten DNA-Isolierung aus Stuhlproben und einem optimierten PCR-Protokoll für auf den kryptischen Plasmiden basierende Primerkombinationen beruht. Dadurch konnte eine Sensitivität von 10(3)-10(4) Bakterien/0,1 g Stuhl erreicht werden, die vergleichbar mit den Nachweisgrenzen anderer beschriebener PCR-Nachweissysteme ist. Durch Analysen von Patientenstuhlproben wurde die Spezifität und der diagnostische Nutzen dieses PCR-Nachweissystems bestätigt. Darüber hinaus wurde eine plasmidfreie Variante des E. coli Stammes DSM 6601 hergestellt. Durch funktionelle Untersuchungen dieses Stammes konnten keine Unterschiede im Vergleich zu dem Wildtyp festgestellt werden, wodurch eine mögliche Funktion der beiden kryptischen Plasmide weiterhin unklar bleibt. Diese plasmidfreie Variante kann als Lebendvektor für rekombinante Plasmide auf Basis der Plasmide pMUT1 und pMUT2 verwendet werden. Ein weiteres Ziel dieser Arbeit war die Entwicklung von stabilen Klonierungsvektoren für den probiotischen E. coli Stamm DSM 6601. Durch Integration von Antibiotika-Resistenzkassetten in die Plasmide pMUT1 und pMUT2 wurden Klonierungsvektoren konstruiert, die auch nach Insertion weiterer DNA-Fragmente ohne Antibiotika-Selektionsdruck stabil in diesem Stamm beibehalten werden. Zusätzlich wurde durch die stabile Expression von fluoreszierenden Proteinen ein visuelles Nachweissystem etabliert, das bei in vivo Experimenten verwendet werden kann. Dadurch wird die Möglichkeit geboten, Erkenntnisse über Kolonisierungseigenschaften sowie Interaktionen des E. coli Stammes DSM 6601 mit endogenen Mikroorganismen und Zellen des Darmimmunsystems zu erlangen, was zur Aufklärung der Wirkungsweise dieses Stammes beitragen könnte. Im Hinblick auf die Entwicklung eines Lebendvakzins auf der Basis des probiotischen E. coli Stammes DSM 6601 wurden Adhäsine von humanpathogenen enterohämorrhagischen E. coli und von tierpathogenen enterotoxischen E. coli in diesem Stamm exprimiert. Bei ersten Immunisierungsversuchen in Mäusen konnte jedoch keine Induktion einer spezifischen Immunantwort gegen diese Adhäsine nachgewiesen werden. Weiterhin wurde die inhibitorische Wirkung des E. coli Stammes DSM 6601 auf die Invasivität von Salmonellen in vitro und in vivo untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass Typ 1- und F1C-Fimbrien keine Rolle bei dem inhibitorischen Effekt in vitro spielen und dass durch diesen E. coli Stamm in konventionellen Mäusen keine inhibitorischen Wirkungen nachzuweisen sind. Die Ergebnisse dieser Arbeit bilden durch die Entwicklung von stabilen Klonierungsvektoren und die Etablierung von Nachweissystemen für den probiotischen E. coli Stamm DSM 6601 die Grundlage für den Einsatz dieses Stammes als Lebendvektor und für in vivo Untersuchungen, die zur Aufklärung der Wirkungsmechanismen dieses Stammes beitragen könnten. N2 - The nonpathogenic E. coli strain DSM 6601 (E. coli Nissle 1917) can be considered as model organism for the employment of a commensal Gram-negative bacterial strain as a probiotic. This E. coli strain has been intensively investigated and therefore its properties are well characterized. The probiotic character of this strain is due to excellent colonization properties of the human gut, immunomodulatory effects and antagonistic activities. The E. coli strain DSM 6601 has been used for decades for the treatment of various gastrointestinal diseases and its therapeutic efficacy is scientifically proved. Therefore, this strain is suited as a model strain for the development of a bacterial live vector, which might be used for mucosal immunization or localized delivery of therapeutic molecules into the intestine. One major aim of this work was the characterization of the cryptic plasmids pMUT1 and pMUT2 of probiotic E. coli strain DSM 6601 by DNA sequence analysis. The analysis showed that plasmid pMUT1 carries a replication system of ColE1-type, a mobilization system as well as a stabilization region, whereas plasmid pMUT2 contains a ColE2-like replication system and another mobilization system. Further open reading frames with known function were not identified in both plasmids. Furthermore, a specific PCR detection system for E. coli strain DSM 6601 was established, which uses a method for direct isolation of DNA from faecal samples and an optimized PCR protocol for primer combinations based on the cryptic plasmids. Thereby, a sensitivity of 10(3)-10(4) bacteria/0,1 g faeces was achieved that is comparable with detection limits of other described PCR detection systems. The specifity and diagnostic utility of this PCR detection system was confirmed by analysis of faecal samples from patients. In addition, a plasmid-free variant of E. coli strain DSM 6601 was constructed. Functional analyses of this strain detected no differences compared to the wildtype, whereby the possible function of both cryptic plasmids still remains unclear. This plasmid-free variant can be used as live vector for recombinant plasmids based on the plasmids pMUT1 and pMUT2. Another aim of this work was the development of stable cloning vectors for the probiotic E. coli strain DSM 6601. Cloning vectors were constructed by integration of antibiotic resistance cassettes in the plasmids pMUT1 and pMUT2, which are still stably maintained following insertion of additional DNA fragments without selection pressure by antibiotics. Furthermore, a visual detection system was established by the stable expression of fluorescent proteins that can be used in in vivo experiments. This offers the opportunity to gain knowledge of colonization properties as well as interactions of E. coli strain DSM 6601 with endogenous microorganisms and cells of the gut’s immune system, which might contribute to explain the mode of action of this strain. With regard to the development of a live vaccine based on the probiotic E. coli strain DSM 6601, adhesins of human pathogenic enterohaemorrhagic E. coli and animal pathogenic enterotoxigenic E. coli were expressed in this strain. Induction of specific immune responses to these adhesins were not demonstrated by first immunization experiments in mice. Moreover, the inhibitory effect of the E. coli strain DSM 6601 on Salmonella invasion was investigated in vivo and in vitro. It was demonstrated that type 1 and F1C fimbriae have no influence on the inhibitory effect in vitro and that no inhibitory effects could be established in conventional mice by this E. coli strain. By the development of stable cloning vectors and the establishment of detection systems for the E. coli strain DSM 6601, the results of this work provide the basis for the employment of this strain as live vector and for in vivo investigations, which might contribute to explain this strain’s mode of action. KW - Escherichia coli KW - Probiotikum KW - Molekularbiologie KW - Plasmidcharakterisierung KW - Klonierungsvektoren KW - PCR-Nachweissystem KW - bakterieller Lebendvektor KW - plasmid characterization KW - cloning vectors KW - PCR detection system KW - bacterial live vector Y1 - 2006 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-23935 ER - TY - JOUR A1 - Hacker, Jörg A1 - Ott, M. A1 - Schmidt, G. A1 - Hull, R. A1 - Goebel, W. T1 - Molecular cloning of the F8 fimbrial antigen from Escherichia coli N2 - The genetic determinant coding for the Pspecific F8 fimbriae was cloned from · the chromosome of the Escherichia coli wild-type strain 2980 (018: K5: H5: FlC, F8). The F8 determinant was further subcloned into the Pstl site of pBR322 and a restriction map was established. In a Southern hybridization experiment identity between the chromosomally encoded F8 determinant of 2980 and its cloned Counterpart was demonstrated. The cloned F8 fimbriäe and those of the wild type strain consist of a protein subunit of nearly 20 kDa. F8 fimbriated strains were agglutinated by an F8 polyclonal antiserum, caused mannose-resistant hemagglutination and attached to human uroepi thellal cells. The cloned F8 determinant was weil expressed in a variety of host strains. KW - Infektionsbiologie KW - Escherichia coli KW - antigen KW - F8 fimbriae KW - gene cloning Y1 - 1986 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-59391 ER - TY - JOUR A1 - Szalay, Aladar A. A1 - Hill, Philip J. A1 - Stritzker, Jochen A1 - Scadeng, Miriam A1 - Geissinger, Ulrike A1 - Haddad, Daniel A1 - Basse-Lüsebrink, Thomas C. A1 - Gbureck, Uwe A1 - Jakob, Peter T1 - Magnetic Resonance Imaging of Tumors Colonized with Bacterial Ferritin-Expressing Escherichia coli N2 - Background: Recent studies have shown that human ferritin can be used as a reporter of gene expression for magnetic resonance imaging (MRI). Bacteria also encode three classes of ferritin-type molecules with iron accumulation properties. Methods and Findings: Here, we investigated whether these bacterial ferritins can also be used as MRI reporter genes and which of the bacterial ferritins is the most suitable reporter. Bacterial ferritins were overexpressed in probiotic E. coli Nissle 1917. Cultures of these bacteria were analyzed and those generating highest MRI contrast were further investigated in tumor bearing mice. Among members of three classes of bacterial ferritin tested, bacterioferritin showed the most promise as a reporter gene. Although all three proteins accumulated similar amounts of iron when overexpressed individually, bacterioferritin showed the highest contrast change. By site-directed mutagenesis we also show that the heme iron, a unique part of the bacterioferritin molecule, is not critical for MRI contrast change. Tumor-specific induction of bacterioferritin-expression in colonized tumors resulted in contrast changes within the bacteria-colonized tumors. Conclusions: Our data suggest that colonization and gene expression by live vectors expressing bacterioferritin can be monitored by MRI due to contrast changes KW - Escherichia coli Y1 - 2011 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-75789 ER - TY - JOUR A1 - Sebald, Walter A1 - Arends, Hermann A1 - McCarthy, John E. G. T1 - Isolation and manipulation of genes coding for energy-transducing enzymes from Neurospora crassa and Escherichia coli N2 - No abstract available. KW - Escherichia coli KW - Neurospora crassa Y1 - 1984 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-86768 ER - TY - JOUR A1 - Masota, Nelson E. A1 - Ohlsen, Knut A1 - Schollmayer, Curd A1 - Meinel, Lorenz A1 - Holzgrabe, Ulrike T1 - Isolation and characterization of galloylglucoses effective against multidrug-resistant strains of Escherichia coli and Klebsiella pneumoniae JF - Molecules N2 - The search for new antibiotics against multidrug-resistant (MDR), Gram-negative bacteria is crucial with respect to filling the antibiotics development pipeline, which is subject to a critical shortage of novel molecules. Screening of natural products is a promising approach for identifying antimicrobial compounds hosting a higher degree of novelty. Here, we report the isolation and characterization of four galloylglucoses active against different MDR strains of Escherichia coli and Klebsiella pneumoniae. A crude acetone extract was prepared from Paeonia officinalis Linnaeus leaves, and bioautography-guided isolation of active compounds from the extract was performed by liquid–liquid extraction, as well as open column, flash, and preparative chromatographic methods. Isolated active compounds were characterized and elucidated by a combination of spectroscopic and spectrometric techniques. In vitro antimicrobial susceptibility testing was carried out on E. coli and K. pneumoniae using 2 reference strains and 13 strains hosting a wide range of MDR phenotypes. Furthermore, in vivo antibacterial activities were assessed using Galleria mellonella larvae, and compounds 1,2,3,4,6-penta-O-galloyl-β-d-glucose, 3-O-digalloyl-1,2,4,6-tetra-O-galloyl-β-d-glucose, 6-O-digalloyl-1,2,3,4-tetra-O-galloyl-β-d-glucose, and 3,6-bis-O-digalloyl-1,2,4-tri-O-galloyl-β-d-glucose were isolated and characterized. They showed minimum inhibitory concentration (MIC) values in the range of 2–256 µg/mL across tested bacterial strains. These findings have added to the number of known galloylglucoses from P. officinalis and highlight their potential against MDR Gram-negative bacteria. KW - antimicrobial resistance KW - Enterobacteriaceae KW - Paeonia KW - gallotannins KW - isolation KW - structural elucidation KW - Escherichia coli KW - Klebsiella pneumoniae Y1 - 2022 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-286179 SN - 1420-3049 VL - 27 IS - 15 ER - TY - JOUR A1 - Hacker, Jörg A1 - Ulmer, E. A1 - Fasske, E. A1 - Schmidt, G. T1 - Isolation and characterization of coliphage Omega18A specific for Escherichia coli O18ac strains N2 - The bactedophage Q18A, specific for Escherichia coli 018ac srrains, was isolated frorn sewage. The results of host range and conjugation experiments showed that the sensitivity of bacteria to the phage is associated with rhe presence of 018ac antigens. With sorne of rhe 018 strains rhe phage Q18A produces clear Iysis on bacterial lawns only when applied at a high multiplicity and moreover the phage does not multiply. With rhe help of the phage Ql8A, E. coli 0 18ac strains could be divided inro rwo serologically clistinct subgroups called 018A and 018A1• E. coli strains belanging to the sugroup 0 ISAare sensitive to phage Q t8A wheteas bacteria of subgroup A1 are resistanr. N2 - Der Bakteriophage Q18A, der spezifisch Escherichia coli 018ac Bakterien lysierr, wurde aus Abwasser isoliert. Die Untersuchungen des Wirtsbereichs und Konjugationsversuche zeigten, daß die Sensitivität der Bakterien gegenüber dem Phagen mit dem Vorhandensein des 0 '18ac Antigens assoziiert ist. Bei eir1igen 0 18 Stämmen wird nur bei Anwendung hoher Phagenkonzentrationen eine klare Lysis auf dem Bakterienrasen erzeugt. Darüber hinaus läßt sich der Phage auf diesen Stämmen nicht vermehren. Mit Hilfe des Phagen Q l8A konnten E, wli 0 18ac Stämme in zwei serologische Subgruppen unteneilt werden, die als 0 lHA und 0 l8A 1 bezeichnet werden. E. coli Bakterien der Subgruppe 0 ISA sind gegenüber dem Phagen Ql8A sensitiv und diejenigen der Subgruppe 0 18A 1 sind resistent. KW - Escherichia coli Y1 - 1987 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-73001 ER - TY - THES A1 - Denker, Katrin T1 - Isolation and characterization of channel-forming proteins in the outer membrane of E. coli and Borrelia species T1 - Isolierung und Charakterisierung porenformender Proteine in der Aussenmembran von E. coli und Borrelien N2 - In this study pore forming proteins of the gram-negative bacteria B. burgdorferi, B. duttonii and E.coli were investigated. Therefore the study is subdivided into three parts. In the first part outer membrane preparation of three relapsing fever Borrelia were investigated. In the second part the putative TolC homologue BB0124 of B. burgdorferi, the Lyme borreliosis agent, was studied. In the last part the influence of point mutants within the greasy slide of the maltose specific porin (LamB) of E. coli were shown. In the first part of this study outer membrane preparations of three Borrelia relapsing fever strains have been studied for pore-forming activity in the black lipid bilayer assay. Histograms of conductance fluctuations were obtained from single-channel experiments with outer membrane preparations of B. hermsii, B. recurentis and B. duttonii. All strains had a different conductance fluctuation pattern with a broad range of single-channel conductance values varying from 0.5 nS – 11 nS. Common for all three strains was a high pore-forming activity at around 0.5 nS. Furthermore the proteins of the outer membrane of B. duttonii were separated by chromatographic methods. Some eluate fractions contained a channel-forming protein, which was forming stable channels with a single-channel conductance of 80 pS in 1 M KCl. Characterization of this channel showed that it is slightly anionic selective and voltage independent. The small single-channel conductance suggests that it is a specific pore. However, a substrate specificity could not be determined. In the second part, for the B. burgdorferi HB19 and p66 knock out strain HB19/K02, their outer membrane preparations were characterized in the black lipid bilayer assay. Comparing the histograms of single-channel conductions fluctuations of both strains showed no single-channel activity at 11.5 nS for the p66 knock out strain. This verifies earlier studies that P66 is a pore-forming protein in B. burgdorferi. Furthermore, one fraction obtained by anion exchange chromatography of the p66 knock out outer membrane protein preparation showed a uniform channel-forming activity with a single channel conductance of 300 pS. The electrophysically characterization of the 300 pS channel showed that it is not ionselective or voltage dependent. By mass spectrometry using peptide mass finger prints, BB0142 could be identified as the sole channel forming candidate in the active fraction. A BLAST search and a conserved domain search showed that BB0142 is a putative TolC homologue in B. burgdorferi. Furthermore the location of the bb0142 gene within the chromosome is in an operon encoding a multidrug efflux pump. In this study the expression of an outer membrane component of a putative drug efflux system of B. burgdorferi was shown for the first time. In the third part functional studies of the maltooligosaccharide-specific LamB channel were performed. The 3D-structure of LamB suggests that a number of aromatic residues (Y6, Y41, W74, F229, W358 and W420) within the channel lumen is involved in carbohydrate and ion transport. All aromatic residues were replaced by alanine (A) scanning mutagenesis. Furthermore, LamB mutants were created in which one, two, three, four and five aromatic residues were replaced to study their effects on ion and maltopentaose transport through LamB. The purified mutant proteins were reconstituted into lipid bilayer membranes and the single-channel conductance was studied. The results suggest that all aromatic residues provide some steric hindrance for ion transport through LamB. Highest impact is provided by Y6 and Y41, which are localized opposite to Y118, which forms the central constriction of the LamB channel. Stability constants for binding of maltopentaose to the mutant channels were measured using titration experiments with the carbohydrate. The mutation of one or several aromatic amino acids led to a substantial decrease of the stability constant of binding. The highest effect was observed when all aromatic amino acids were replaced by alanine because no binding of maltopentaose could be detected in this case. However, binding was again possible when Y118 was replaced by tryptophane (W). The carbohydrate-induced block of the channel function could also be used for the study of current noise through the different mutant LamB-channels. The analysis of the power density spectra of some of the mutants allowed the evaluation of the on- and off-rate constants (k1 and k-1) of carbohydrate binding to the binding-site inside the channels. The results suggest that both on- and off-rate constants were affected by the mutations. For most mutants k1 decreased and k-1 increased. N2 - In dieser Studie wurden porenformende Proteine der gram-negativen Bakterien B. burgdorferi, B. duttonii und E. coli untersucht. Daher wurde die Arbeit in drei Teile untergliedert. Im ersten Teil wurden zuerst die Außenmembranpräparationen von drei Rückfallfieber auslösenden Borrelien Stämmen untersucht. Der zweite Teil der Arbeit behandelt das TolC homologe Protein BB0142 des Erreger der Lyme Borreliose, B. burgdorferi. Im letzten Teil wurde der Einfluss von Punktmutationen innerhalb der „greasy slide“ auf die zuckerspezifische Pore (LamB) von E. coli untersucht. Die Außenmembranpräparationen der drei Rückfallfieber Borrelien wurden auf porenformende Aktivität im Black Lipid Bilayer untersucht. Leitfähigkeitshistograme wurden nach Einzelkanalmessungen der Außenmembranepräparation von B. hermsii, B. recurrentis und B. duttonii erstellt. Alle Stämme zeigten ein anderes Leitfähigkeitsfluktuationsmuster, wobei die Werte der Einzelleitfähigkeit von 0,5 nS bis 11 nS variierten. Auffällig war das alle drei Stämme eine hohe Aktivität um 0,5 nS gemeinsan hatten. Darauffolgend wurden die Proteine der Außenmembran von B. duttonii durch verschiedene chromatographische Methoden aufgetrennt. Einige Eluatfraktionen enthielten ein kanalformendes Protein, das stabile Kanäle mit einer Einzelleitfähigkeit von 80 pS in 1 M KCl formt. Die Bestimmung der Kanaleigenschaften zeigte, dass er leicht anionenselektive und spannungsunabhängig ist. Die geringe Einzelleitfähigkeit suggeriert, dass der Kanal zudem eine spezifische Pore sein könnte. Bisher konnte aber keine Substratespezifität festgestellt werden. Im zweiten Abschnitt erfolgte die Untersuchung von Außenmembranpräparationen von B. burgdorferi HB19 und dem p66 knock-out Stamm HB19/K02 mit Hilfe des Black Lipid Bilayers. Im Vergleich der beiden erhalten Einzelleitfähigkeitshistogramme konnte gezeigt werden, dass die Einzelleitfähigkeit von 11,5 nS nicht mehr im p66 knock out Stamm vorkam. Dies belegt frühere Studien, dass P66 ein poreformendes Protein von B. burgdorferi ist. Durch Anionenaustauscher-Chromatographie der Außenmembranpräparation des p66 knock out Stammes wurde zudem eine Proteinfraktion mit einer einheitlichen porenformenden Aktivität von 300 pS in 1 M KCl erhalten. Die elektrophysikalische Charakterisierung der 300 pS Pore zeigte, dass der Kanal nicht ionenselektiv oder spannungsabhängig ist. Mit Hilfe von Massenspektrometrie und Peptidemassenbestimmung, konnte BB0142 als einziger möglicher kanalformender Kandidat identifiziert werde. Eine BLAST Suche sowie eine „conserved domain“ Suche zeigten, dass BB0142 ein putatives TolC homologes Protein von B. burgdorferi ist. Darüber hinaus ist das bb0142 Gen in einem Operon lokalisiert, das eine putative Efflux Pumpe codiert. In der vorliegenden Arbeit konnte das erste Mal gezeigt weden, dass in B. burgdorferi die Außenmembrankomponente einer Efflux Pumpe expremiert wird. Im dritten Teil wurden Funktionsstudien an dem zuckerspezifischen Kanal LamB durchgeführt. Die 3D Struktur zeigte, dass einige aromatische Aminosäuren (Y6, Y41, W74, F229, W358 und W420) innerhalb des Kanallumen in den Kohlenhydrat- und Ionentransport involviert sind. Alle aromatischen Reste wurden bei Punktmutation durch Alanin ersetzt. Zudem wurden LamB Mutanten erzeugt in denen ein, zwei, drei, vier oder fünf aromatische Reste durch Alanin ersetzt. Die aufgereinigten LamB Mutanten wurden im Black Lipid Bilayer untersucht und ihre Einzelleitfähigkeit bestimmt. Die Ergebnisse zeigen, dass alle aromatischen Reste eine gewisse sterische Hinderung beim Ionentransport durch LamB bewirken. Den größten Einfluss haben die Reste Y6 und Y41, die gegenüber dem Rest Y188 liegen, der die zentrale Verengung des LamB Kanal darstellt. Stabilitätskonstanten der Zuckerbindung in den Mutanten wurde durch Titrationsexperimente mit Maltopentaose und -heptaose bestimmt. Mutation an einem oder mehreren aromatischen Resten führt zu einer deutlichen Abnahme der Bindungsstabilitätskonstanten. Den stärksten Effekt zeigte die Mutante, in der alle aromatischen Reste durch Alanin ersetzt wurden. Es konnte dort keine Zuckerbindung mehr festgestellt werden. Die Bindung wurde wieder hergestellt nachdem Y118 durch ein Tryptophan ersetzt wurde. Durch das zuckerinduzierte Öffnen und Schließen des Kanals ergiebt sich ein Stromrauschen. Die Analyse des Rausch Spektrum von einigen Mutanten erlaubte die Bestimmung der Dissoziations- (k-1) und der Assoziationskonstaten (k1) der Zuckerbindung an der Bindestelle innerhalb des Kanals. Die Ergebnisse zeigten, dass die Geschwindigkeitskonstanten durch die Mutationen beeinflusst wurden. Für die meisten Mutanten sank der k1 Wert während der k-1 Wert anstieg. KW - Escherichia coli KW - Kanalbildner KW - Zellwand KW - Borrelia KW - Borrelia burgdorferi KW - BB0142 KW - porenformende Proteine KW - Maltoporin KW - black lipid bilayer KW - Borrelia burgdorferi KW - BB0142 KW - channel forming proteins KW - Maltoporin KW - black lipid bilayer Y1 - 2006 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-16955 ER - TY - THES A1 - Rund, Stefan A. T1 - Interferenz des probiotischen Escherichia coli Stammes Nissle 1917 mit Adhäsion, Replikation und Shiga Toxin Produktion von EHEC Stämmen in vitro T1 - Interference of the probiotic Escherichia coli strain Nissle 1917 with adhesion, replication and Shiga toxin production of EHEC strains in vitro N2 - E. coli Nissle 1917 (EcN) zählt durch seine fast hundertjährige Nutzung als Arzneimittel und aufgrund der weitreichenden Forschung während der letzten Jahrzehnte mittlerweile zu einem der am besten untersuchten Probiotika. EcN wird als Medikament zur Remissionserhaltung von Patienten mit Kolitis, bei chronischer Verstopfung und bei Durchfall von Kleinkindern eingesetzt. Der enteroaggregative – hämorrhagische - E. coli (EAHEC) mit dem Serotyp O104:H4 war 2011 in Deutschland für den bisher größten EHEC-Ausbruch seit Beginn der Aufzeichnungen verantwortlich. Es fehlt bis zum heutigen Tage immer noch an effektiven Möglichkeiten einer Infektionsprophylaxe oder einer Behandlung der Erkrankung. Ein alternatives Therapeutikum wird daher dringend benötigt. In dieser Arbeit wurden die antagonistischen Effekte von EcN auf pathogene E. coli Stämme wie dem EHEC Stamm EDL933 oder klinischen EAHEC O104:H4 Isolaten untersucht. Es wurden die Auswirkungen von EcN auf die Adhäsion an humane Epithelzellen, das Wachstum und die Shiga Toxin Produktion der pathogenen Stämme untersucht. Zusätzlich wurde die Resistenz von EcN gegenüber Shiga Toxin Phagen nachgewiesen. Zunächst wurde die Adhäsionseffizienz der verschiedenen E. coli Stämme bestimmt. Der am schlechtesten an die humanen Epithelzelllinien Caco-2 und LS-174T adhärierende Stamm war EcN. Dies ist insofern überraschend, da von Probiotika erwartet wird, besser als Pathogene an Epithelzellen zu adhärieren. Dem ungeachtet konnte jedoch gezeigt werden, dass EcN die Adhäsion von zwei EAHEC O104:H4 Isolaten, des nahe verwandten enteroaggregativen E. coli (EAEC) Stammes 55989 und des enterohämorrhagischen (EHEC) E. coli Stammes O157:H7 EDL933 an beide Zelllinen hemmt. Die von EcN produzierten Mikrozine M und H47 konnten hier für einen Teil des beobachteten anti-adhäsiven Effektes von EcN auf die pathogenen E. coli Stämme verantwortlich gemacht werden. Die Mikrozine wurden hier als einzige Substanz, die das Wachstum der pathogenen E. coli Stämme beeinflusst, identifiziert. Einer der wichtigsten Virulenzfaktoren von EAHEC und EHEC Stämmen ist das Shiga Toxin. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass EcN die Shiga Toxin Produktion der am häufigsten auftretenden EHEC Stämme (´Big Five´: O157:H7, O26:H11, O103:H2, O111:H-, O145:H25) und der klinischen Isolate von EAHEC O104:H4 im Zellkulturmedium DMEM hemmt. Auffällig war, dass die Stx1 Produktion von EHEC O103:H2 und O111:H- nicht nur von EcN, sondern auch von E. coli K-12 Stamm MG1655, gehemmt wurde, im Gegensatz zur EcN-spezifischen Blockierung der Stx2-Produktion in den Serotypen O104:H4, O26:H11, O145:H25. Die Reduktion der Stx-Produktion in EAHEC O104:H4 TY3730 und TY3456, sowie EHEC O26:H11 war zum Teil von der Mikrozinproduktion abhängig. Diese hatte jedoch keinen Einfluss auf die Stx-Produktion in EHEC O157:H7 EDL933 und EHEC O145:H25. Bei Verwendung von LB-Medium zeigte sich im Gegensatz zum DMEM-Medium keine Mikrozin-Abhängigkeit der Toxinproduktion bei den EAHEC Isolaten TY3730 und TY3456. Die Toxinproduktion von EHEC EDL933 wurde ebenfalls nicht durch die Deletion der Mikrozin-Gene in EcN beeinflusst. Studien der Toxinproduktion in SCEM-Medium zeigten ebenfalls eine EcN-Dosisabhängige Reduktion der Stx-Produktion in Co-Kultur. Um den Mechanismus der Hemmung der Stx-Produktion zu untersuchen, wurden Versuche mit der EcN-Mutante EcN::luxS durchgeführt. Diese Deletion des AI-2 ´Quorum sensing´ Moleküls in EcN hatte allerdings keinen Einfluss auf die Hemmung der Stx-Produktion. Der Einsatz von Acetat führte, im Gegensatz zu publizierten Ergebnissen, nicht zu einer Reduktion der Stx-Produktion. Auch eine Beeinflussung der Lyse der EHEC-Bakterien, oder der Verminderung der Sekretion von Shiga Toxin durch EcN, konnte widerlegt werden. Zur Untersuchung der Stx-Expression wurde ein Assay mit einem biolumineszenten C-P (Chromosom-Plasmid) Reporter System etabliert. Damit konnte die Shiga Toxin Expression im Stammhintergrund EHEC EDL933 in Echtzeit untersucht werden. Hier wurde wiederum eine Reduktion der Shiga Toxin Expression in Co-Kultur mit EcN erfolgreich nachgewiesen. In weiteren Versuchen konnte gezeigt werden, dass EcN nicht nur die Shiga Toxin Produktion von nicht-induzierten EAHEC Bakterien, sondern auch in mit Mitomycin C induzierten Bakterien hemmt. Als wichtiger Sicherheitsaspekt einer Behandlung mit EcN wurde die Resistenz von EcN gegenüber Shiga Toxin Phagen untersucht. Die Infektion der Bakterien wurde hierbei mit stx-spezifischer PCR, Phagen-Plaque-Assay, Stx-ELISA und K+-Efflux Assay untersucht. Es konnte durch diese verschiedenen Methoden erfolgreich gezeigt werden, dass EcN nicht durch Shiga Toxin Phagen infiziert wird. Als möglicher Resistenzmechanismus kommt hier eine Mutation vom Phagenrezeptor LamB in Frage, was jedoch noch bestätigt werden muss. Zusammenfassend wurden in dieser Arbeit wichtige antagonistische Effekte von EcN auf pathogene E. coli Stämme untersucht, die als Grundlage von neuen und dringend benötigten Behandlungen von EHEC-Infektionen dienen können. N2 - Due to extensive studies in the last decades and its centennial application as a pharmaceutical, E. coli Nissle 1917 (EcN) is among the best characterized probiotics. EcN is used as remedy for remission maintenance of ulcerative colitis, chronic obstipation and diarrhea in children. The enteroaggregative – haemorrhagic - E. coli (EAHEC) strain O104:H4 was responisible for one of the biggest outbreaks of EHEC recorded so far, that took place in Germany in 2011. Currently, there is no effective prophylaxis or treatment available for EHEC infections in humans. Therefore, alternative therapeutics are desperately needed. The antagonistic effects of EcN on pathogenic E. coli strains like the EHEC O157:H7 strain EDL933 or clinical isolates of EAHEC O104:H4 were investigated in this study. The influence of EcN on adhesion to human epithelial cell lines, the growth and the Shiga toxin production of pathogenic strains were analysed. Furthermore, the resistence of EcN against Shiga toxin phages was proven. Initially, the adhesion efficiency of EcN and pathogenic E. coli strains were determined in monocultures. EcN showed the lowest number of adhering bacteria to Caco-2 and LS-174T cells. This was insofar surprising, since probiotics are expected to adhere more efficiently to epithelial cells than pathogens. Regardless of this fact, it could be shown that EcN is inhibiting the adhesion of two EAHEC O104:H4 isolates, the closely related EAEC strain 55989 and the EHEC O157:H7 strain EDL933 to both cell lines. The microzins M and H47, which are produced by EcN, can be held responsible for a fraction of the observed anti-adhesive effect of EcN. The Microzins were also identified as the only substance that was influencing the growth of the pathogenic E. coli strains. One of the most important virulence factors of EHEC and EAHEC strains is Shiga toxin. In this study could be shown, that EcN is inhibiting the Shiga toxin production of the most common EHEC strains (big five: O157:H7, O26:H11, O103:H2, O111:H-, O145:H25) and two clinical isolates of EAHEC O104:H4 in the cell culture medium DMEM. Interesingly, the Shiga toxin 1 production of EHEC O103:H2 and O111:H- was not only reduced by EcN, but also the E. coli K-12 strain MG1655. In contrast, the Stx2 production of the serotypes O104:H4, O26:H11, O145:H25 was only blocked by EcN. The reduction of the Shiga toxin production in EAHEC O104:H4 TY3730 und TY3456, as well as EHEC O26:H11 was partly dependent on the microcin production of EcN. No influence of microzins on the Stx production of EHEC O157:H7 EDL933 and EHEC O145:H25 was detected. When using LB-medium instead of DMEM-medium, no influence of microzin on the Shiga toxin production of neither EAHEC TY3730 and TY3456, nor EHEC EDL933 could be shown. Experiments with SCEM-medium also resulted in an EcN-dose-dependent inhibition of Shiga toxin production of pathogenic E. coli strains in co-culture with EcN. In order to investigate the mechanism responsible for the observed effects, the EcN mutant EcN::luxS was used in co-culture experiments. However, the deletion of the quorum sensing molecule AI-2 in EcN::luxS had no influence on the Stx production. Using acetate in the experiments did not, in contrast to published results, lead to a reduction of Shiga toxin production. In addition, an influence of EcN on lysis of EHEC strains or the secretion of Shiga toxin could be ruled out. To study the Shiga toxin expression an assay with a bioluminescent C-P (chromosome-plasmid) reporter system was successfully established. Here, Shiga toxin expression could be monitored in real time with the strain background EHEC EDL933. Moreover, a reduction of Shiga toxin expression in co-culture with EcN could be detected. In further experiments could be shown, that EcN is not only reducing the Shiga toxin production in uninduced bacteria, but also in the Mitomycin C induced EAHEC O104:H4 strain TY3730. An important safety issue, in order to use EcN as a pharmaceutical against EHEC strains, is the resistance of EcN against Shiga toxin phages. The infection of bacteria was here investigated with phage plaque assay, stx-PCR, Stx-ELISA and K+-efflux assay. With these different methods could be successfully shown, that EcN is not infected by the tested Shiga toxin phages. A mutation in the phage receptor LamB could be a possible, but still unconfirmed, phage resistance mechanism of EcN. In summary, this study showed important antagonistic effects of EcN against pathogenic E. coli strains, which could be the foundation of new and desperately needed treatment options of EHEC infections. KW - EHEC KW - Probiotikum KW - Escherichia coli KW - E. coli Nissle Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-104837 ER - TY - JOUR A1 - El Mouali, Youssef A1 - Gerovac, Milan A1 - Mineikaitė, Raminta A1 - Vogel, Jörg T1 - In vivo targets of Salmonella FinO include a FinP-like small RNA controlling copy number of a cohabitating plasmid JF - Nucleic Acids Research N2 - FinO-domain proteins represent an emerging family of RNA-binding proteins (RBPs) with diverse roles in bacterial post-transcriptional control and physiology. They exhibit an intriguing targeting spectrum, ranging from an assumed single RNA pair (FinP/traJ) for the plasmid-encoded FinO protein, to transcriptome-wide activity as documented for chromosomally encoded ProQ proteins. Thus, the shared FinO domain might bear an unusual plasticity enabling it to act either selectively or promiscuously on the same cellular RNA pool. One caveat to this model is that the full suite of in vivo targets of the assumedly highly selective FinO protein is unknown. Here, we have extensively profiled cellular transcripts associated with the virulence plasmid-encoded FinO in Salmonella enterica. While our analysis confirms the FinP sRNA of plasmid pSLT as the primary FinO target, we identify a second major ligand: the RepX sRNA of the unrelated antibiotic resistance plasmid pRSF1010. FinP and RepX are strikingly similar in length and structure, but not in primary sequence, and so may provide clues to understanding the high selectivity of FinO-RNA interactions. Moreover, we observe that the FinO RBP encoded on the Salmonella virulence plasmid controls the replication of a cohabitating antibiotic resistance plasmid, suggesting cross-regulation of plasmids on the RNA level. KW - antisense RNA KW - Escherichia coli KW - chromosomal genes KW - protein KW - chaperone KW - virulence KW - family KW - HFQ KW - specificity KW - inhibition Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-261072 VL - 49 IS - 9 ER - TY - THES A1 - Leimbach, Andreas T1 - Genomics of pathogenic and commensal \(Escherichia\) \(coli\) T1 - Genomik pathogener und kommensaler \(Escherichia\) \(coli\) N2 - High-throughput sequencing (HTS) has revolutionized bacterial genomics. Its unparalleled sensitivity has opened the door to analyzing bacterial evolution and population genomics, dispersion of mobile genetic elements (MGEs), and within-host adaptation of pathogens, such as Escherichia coli. One of the defining characteristics of intestinal pathogenic E. coli (IPEC) pathotypes is a specific repertoire of virulence factors (VFs). Many of these IPEC VFs are used as typing markers in public health laboratories to monitor outbreaks and guide treatment options. Instead, extraintestinal pathogenic E. coli (ExPEC) isolates are genotypically diverse and harbor a varied set of VFs -- the majority of which also function as fitness factors (FFs) for gastrointestinal colonization. The aim of this thesis was the genomic characterization of pathogenic and commensal E. coli with respect to their virulence- and antibiotic resistance-associated gene content as well as phylogenetic background. In order to conduct the comparative analyses, I created a database of E. coli VFs, ecoli_VF_collection, with a focus on ExPEC virulence-associated proteins (Leimbach, 2016b). Furthermore, I wrote a suite of scripts and pipelines, bac-genomics-scripts, that are useful for bacterial genomics (Leimbach, 2016a). This compilation includes tools for assembly and annotation as well as comparative genomics analyses, like multi-locus sequence typing (MLST), assignment of Clusters of Orthologous Groups (COG) categories, searching for protein homologs, detection of genomic regions of difference (RODs), and calculating pan-genome-wide association statistics. Using these tools we were able to determine the prevalence of 18 autotransporters (ATs) in a large, phylogenetically heterogeneous strain panel and demonstrate that many AT proteins are not associated with E. coli pathotypes. According to multivariate analyses and statistics the distribution of AT variants is instead significantly dependent on phylogenetic lineages. As a consequence, ATs are not suitable to serve as pathotype markers (Zude et al., 2014). During the German Shiga toxin-producing E. coli (STEC) outbreak in 2011, the largest to date, we were one of the teams capable of analyzing the genomic features of two isolates. Based on MLST and detection of orthologous proteins to known E. coli reference genomes the close phylogenetic relationship and overall genome similarity to enteroaggregative E. coli (EAEC) 55989 was revealed. In particular, we identified VFs of both STEC and EAEC pathotypes, most importantly the prophage-encoded Shiga toxin (Stx) and the pAA-type plasmid harboring aggregative adherence fimbriae. As a result, we could show that the epidemic was caused by an unusual hybrid pathotype of the O104:H4 serotype. Moreover, we detected the basis of the antibiotic multi-resistant phenotype on an extended-spectrum beta-lactamase (ESBL) plasmid through comparisons to reference plasmids. With this information we proposed an evolutionary horizontal gene transfer (HGT) model for the possible emergence of the pathogen (Brzuszkiewicz et al., 2011). Similarly to ExPEC, E. coli isolates of bovine mastitis are genotypically and phenotypically highly diverse and many studies struggled to determine a positive association of putative VFs. Instead the general E. coli pathogen-associated molecular pattern (PAMP), lipopolysaccharide (LPS), is implicated as a deciding factor for intramammary inflammation. Nevertheless, a mammary pathogenic E. coli (MPEC) pathotype was proposed presumably encompassing strains more adapted to elicit bovine mastitis with virulence traits differentiating them from commensals. We sequenced eight E. coli isolates from udder serous exudate and six fecal commensals (Leimbach et al., 2016). Two mastitis isolate genomes were closed to a finished-grade quality (Leimbach et al., 2015). The genomic sequence of mastitis-associated E. coli (MAEC) strain 1303 was used to elucidate the biosynthesis gene cluster of its O70 LPS O-antigen. We analyzed the phylogenetic genealogy of our strain panel plus eleven bovine-associated E. coli reference strains and found that commensal or MAEC could not be unambiguously allocated to specific phylogroups within a core genome tree of reference E. coli. A thorough gene content analysis could not identify functional convergence of either commensal or MAEC, instead both have only very few gene families enriched in either pathotype. Most importantly, gene content and ecoli_VF_collection analyses showed that no virulence determinants are significantly associated with MAEC in comparison to bovine fecal commensals, disproving the MPEC hypothesis. The genetic repertoire of bovine-associated E. coli, again, is dominated by phylogenetic background. This is also mostly the case for large virulence-associated E. coli gene cluster previously associated with mastitis. Correspondingly, MAEC are facultative and opportunistic pathogens recruited from the bovine commensal gastrointestinal microbiota (Leimbach et al., 2017). Thus, E. coli mastitis should be prevented rather than treated, as antibiotics and vaccines have not proven effective. Although traditional E. coli pathotypes serve a purpose for diagnostics and treatment, it is clear that the current typing system is an oversimplification of E. coli's genomic plasticity. Whole genome sequencing (WGS) revealed many nuances of pathogenic E. coli, including emerging hybrid or heteropathogenic pathotypes. Diagnostic and public health microbiology need to embrace the future by implementing HTS techniques to target patient care and infection control more efficiently. N2 - Eines der definierenden Charakteristika intestinal pathogener E. coli (IPEC) Pathotypen ist ein spezifisches Repertoire an Virulenzfaktoren (VFs). Viele dieser IPEC VFs werden als Typisierungsmarker benutzt. Stattdessen sind Isolate extraintestinal pathogener E. coli (ExPEC) genotypisch vielfältig und beherbergen verschiedenartige VF Sets, welche in der Mehrheit auch als Fitnessfaktoren (FFs) für die gastrointestinale Kolonialisierung fungieren. Das Ziel dieser Dissertation war die genomische Charakterisierung pathogener und kommensaler E. coli in Bezug auf ihren Virulenz- und Antibiotikaresistenz-assoziierten Gengehalt sowie ihre phylogenetische Abstammung. Als Voraussetzung für die vergleichenden Analysen erstellte ich eine E. coli VF-Datenbank, ecoli_VF_collection, mit Fokus auf Virulenz-assoziierte Proteine von ExPEC (Leimbach, 2016b). Darüber hinaus programmierte ich mehrere Skripte und Pipelines zur Anwendung in der bakteriellen Genomik, bac-genomics-scripts (Leimbach, 2016a). Diese Sammlung beinhaltet Tools zur Unterstützung von Assemblierung und Annotation sowie komparativer Genomanalysen, wie Multilokus-Sequenztypisierung (MLST), Zuweisung von Clusters of Orthologous Groups (COG) Kategorien, Suche nach homologen Proteinen, Identifizierung von genomisch unterschiedlichen Regionen (RODs) und Berechnung Pan-genomweiter Assoziationsstatistiken. Mithilfe dieser Tools konnten wir die Prävalenz von 18 Autotransportern (ATs) in einer großen, phylogenetisch heterogenen Stammsammlung bestimmen und nachweisen, dass viele AT-Proteine nicht mit E. coli Pathotypen assoziiert sind. Multivariate Analysen und Statistik legten offen, dass die Verteilung von AT-Varianten vielmehr signifikant von phylogenetischen Abstammungslinien abhängt. Deshalb sind ATs nicht als Marker für Pathotypen geeignet (Zude et al., 2014). Während des bislang größten Ausbruchs von Shiga-Toxin-produzierenden E. coli (STEC) im Jahre 2011 in Deutschland waren wir eines der Teams, welches die genomischen Eigenschaften zweier Isolate analysieren konnte. Basierend auf MLST und Detektion orthologer Proteine zu bekannten E. coli Referenzgenomen konnte ihre enge phylogenetische Verwandschaft und Ähnlichkeit des gesamten Genoms zum enteroaggregativen E. coli (EAEC) 55989 aufgedeckt werden. Im Detail identifizierten wir VFs von STEC und EAEC Pathotypen, vor allem das Prophagen-kodierte Shiga-Toxin (Stx) und ein Plasmid des pAA-Typs kodierend für aggregative Adhärenz-Fimbrien. Die Epidemie wurde demnach durch einen ungewöhnlichen Hybrid-Pathotyp vom O104:H4 Serotyp verursacht. Zusätzlich identifizierten wir die Grundlage für den multiresistenten Phänotyp dieser Ausbruchsstämme auf einem Extended-Spektrum-beta-Laktamase (ESBL) Plasmid über Vergleiche mit Referenzplasmiden. Mit diesen Informationen konnten wir ein horizontales Gentransfer-Modell (HGT) zum Auftreten dieses Pathogenen vorschlagen (Brzuszkiewicz et al., 2011). Ähnlich zu ExPEC sind E. coli Isolate boviner Mastitiden genotypisch und phänotypisch sehr divers, und viele Studien scheiterten am Versuch eine positive Assoziation vermeintlicher VFs nachzuweisen. Stattdessen gilt Lipopolysaccharid (LPS) als entscheidender Faktor zur intramammären Entzündung. Gleichwohl wurde ein mammärer pathogener E. coli (MPEC) Pathotyp vorgeschlagen, der mutmaßlich Stämme umfasst, welche eher geeignet sind eine bovine Mastitis auszulösen und über Virulenz-Merkmale von Kommensalen abgegrenzt werden können. Wir sequenzierten acht E. coli Isolate aus serösem Eutersekret und sechs fäkale Kommensale (Leimbach et al., 2016). Bei zwei Mastitisisolaten wurden die Genome vollständig geschlossen (Leimbach et al., 2015). Anhand der genomischen Sequenz des Mastitis-assoziierten E. coli (MAEC) Stamms 1303 wurde das Gencluster zur Biosynthese seines O70 LPS O-Antigens aufgeklärt. Wir analysierten die phylogenetische Abstammung unserer Stammsammlung plus elf bovin-assoziierter E. coli Referenzstämme, aber konnten weder MAEC noch Kommensale bestimmten Phylogruppen innerhalb eines Core-Genom Stammbaums aus Referenz-E. coli eindeutig zuordnen. Eine ausführliche Gengehalt-Analyse konnte keine funktionelle Konvergenz innerhalb von Kommensalen oder MAEC identifizieren. Stattdessen besitzen beide nur sehr wenige Genfamilien, die bevorzugt in einer der beiden Pathotypen vorkommen. Weder eine Gengehalt- noch eine ecoli_VF_collection-Analyse konnte zeigen, dass eine signifikante Assoziation von bestimmten Virulenzfaktoren mit MAEC, im Vergleich zu bovinen fäkalen Kommensalen, besteht. Damit wurde die MPEC Hypothese widerlegt. Auch das genetische Repertoire von Rinder-assoziierten E. coli wird durch die phylogenetische Abstammung bestimmt. Dies ist überwiegend auch bei großen Virulenz-assoziierten Genclustern der Fall, die bisher mit Mastitis in Verbindung gebracht wurden. Dementsprechend sind MAEC fakultative und opportunistische Pathogene, die ihren Ursprung als Kommensale in der bovinen gastrointestinalen Mikrobiota haben (Leimbach et al., 2017). Obwohl traditionelle E. coli Pathotypen in der Diagnostik und Behandlung einen Zweck erfüllen, ist es offensichtlich, dass das derzeitige Typisierungs-System die genomische Plastizität von E. coli zu sehr vereinfacht. Die Gesamtgenom-Sequenzierung (WGS) deckte viele Nuancen pathogener E. coli auf, einschließlich entstehender hybrider oder heteropathogener Pathotypen. Diagnostische und medizinische Mikrobiologie müssen einen Schritt in Richtung Zukunft gehen und HTS-Technologien anwenden, um Patientenversorgung und Infektionskontrolle effizienter zu unterstützen. KW - Escherichia coli KW - Autotransporter KW - STEC KW - Bovine Mastitis KW - high-throughput sequencing KW - virulence factors KW - pathotypes KW - phylogeny KW - ecoli_VF_collection KW - bac-genomics-scripts KW - autotransporter KW - entero-aggregative-haemorrhagic Escherichia coli (EAHEC) KW - mastitis-associated Escherichia coli (MAEC) Y1 - 2017 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-154539 ER - TY - JOUR A1 - Hacker, Jörg A1 - Ott, Manfred A1 - Blum, Gabriele A1 - Marre, Reinhard A1 - Heesemann, Jürgen A1 - Tschäpe, Helmut A1 - Goebel, Werner T1 - Genetics of Escherichia coli uropathogenicity: Analysis of the O6:K15:H31 isolate 536 N2 - E. coli strain 536 (06: K15: H31) isolated from a case of acute pyelonephritis, expresses S-fimbrial adhesins, P-related fimbriae, common type I fimbriae, and hemolysins. The respective chromosomally encoded determinants were cloned by constructing a genomic library of this strain. Furthermore, the strain produces the iron uptake substance, enterocheline, damages HeLa cells, and behaves in a serum-resistant mode. Genetic analysis of spontaneously arising non-hemolytic variants revealed that some of the virulence genes were physically linked to large unstable DNA regions, termed "pathogenicity islands", which were mapped in the respective positions on the E. coli K-12linkage map. By comparing the wild type strain and mutants in in vitro and in vivo assays, virulence features have been evaluated. In addition, a regulatory cross talk between adhesin determinants was found for the wild-type isolate. This particular mode of virulence regulation is missing in the mutant strain. KW - Escherichia coli KW - Genetik Y1 - 1992 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-71578 ER - TY - THES A1 - Reidl, Sebastian T1 - Funktionale Charakterisierung an der Biofilmbildung beteiligter Faktoren pathogener und kommensaler Escherichia coli T1 - Functional characterization of biofilm-associated traits of pathogenic and commensal Escherichia coli N2 - Multizelluläre Gemeinschaften in Form bakterieller Biofilme stellen aus medizinischer Sicht ein großes klinisches Problem dar. Häufig lassen sich chronische oder rezidivierende Erkrankungen aber auch nosokomiale Infektionen auf die multizelluläre Lebensweise von humanpathogenen Erregern zurückführen. Sowohl fakultativ als auch obligat pathogene Escherichia coli-Stämme besitzen eine Vielzahl unterschiedlicher Faktoren, die die Biofilmbildung beeinflussen. Daran beteiligt sind unter anderem Flagellen, extrazelluläre polymere Substanzen, Adhäsine oder Oberflächen-assoziierte Proteine wie Autotransporter. Gegenstand der vorliegenden Arbeit ist die funktionale Charakterisierung des Proteins Antigen 43 (Ag43). Aufgrund seiner Autoaggregation-vermittelnden Eigenschaft trägt Ag43 ebenfalls zur Mikrokoloniebildung und Biofilmreifung bei. Antigen 43 ist ein Autotransporterprotein, welches innerhalb der Bakterienspezies Escherichia coli weit verbreitet ist. Interessanterweise besitzen viele E. coli-Isolate gleich mehrere identische oder ähnliche Kopien von agn43, die in der Regel von variablen Genombereichen (genomische Inseln, Plasmide) kodiert werden. Am Beispiel der Antigen 43-Varianten des uropathogenen Escherichia coli (UPEC)-Stammes 536 (O6:K15:H31), des kommensalen E. coli Isolats Nissle 1917 (O6:K5:H1) sowie des E. coli K-12-Laborstammes MG1655 (OR:H48:K-) ist die Bedeutung des Autotransporterproteins im Rahmen dieser Arbeit näher untersucht worden. Hierfür wurden die verschiedenen agn43-Allele in ein geeignetes Vektorsystem kloniert und im Adhäsin-freien Escherichia coli K-12-Stamm MG1655 ΔfimΔflu exprimiert. Da Antigen 43 in Wildtypstämmen posttranslational glykosyliert vorliegt, sind die Experimente zusätzlich unter Einfluß der heterologen, AIDA I-spezifischen Heptosyltransferase Aah (‘Autotransporter Adhesin Heptosyltransferase’) durchgeführt worden. Anhand von Bindungsstudien (intermolekulare Autoaggregation, Zelladhäsionstests) wurde gezeigt, daß sich einzelne Ag43-Varianten teilweise in ihren Eigenschaften unterscheiden. Im direkten Vergleich mit AIDA-I (‘Adhesin Involved in Diffuse Adherence’) enteropathogener Escherichia coli (EPEC) konnte für Ag43 nur eine Funktion als schwaches Adhäsin nachgewiesen werden. Die heterologe O-Glykosylierung beeinflußte die Funktionalität des Antigen 43 in unterschiedlichem Ausmaß. Je nach Autotransporter-Variante führte die Heptosylierung entweder zu signifikant reduzierten Affinitäten, oder sie hatte keinen Effekt auf die Bindungskapazität des Ag43. Antigen 43 weist zudem strukturelle Homologien zu vergleichbaren Domänen anderer Autotransporter auf. Für viele dieser Proteine konnte bereits eine adhäsive oder invasive Funktion nachgewiesen werden. Eine mögliche Interaktion von Ag43 mit eukaryontischen Rezeptoren ist hingegen noch nicht bzw. nur unvollständig untersucht worden. In Overlay assays und ELISAs wurde für Antigen 43 hier erstmals die spezifische Bindung an die extrazellulären Matrixkomponenten Kollagen und Laminin gezeigt. Zusammenfassend deuten die Ergebnisse dieser Arbeit darauf hin, daß das Escherichia coli spezifische Autotransporterprotein Antigen 43 nicht nur an der bakteriellen Biofilmbildung, sondern auch an der Besiedlung epithelialer Gewebe beteiligt sein kann. Seine Expression verschafft Bakterien einen Kolonisationsvorteil, der mit erhöhter Fitneß einhergeht. Die Aah-vermittelte O-Glykosylierung scheint für die Funktionalität von Ag43 nicht zwingend erforderlich zu sein. Des weiteren ist im Rahmen der vorliegenden Arbeit ein Testsystem entwickelt worden, das auf der Basis von Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierungen (FISH) die Differenzierung von verschiedenen (uro-)pathogenen Mikroorganismen ermöglicht. Das etablierte Protokoll eignet sich nicht nur für die diagnostische Erregeridentifizierung, sondern auch in Abhängigkeit des Probenmaterials zur Untersuchung von (Multispezies-)Biofilmen. N2 - Bacteria living in multicellular communities, i.e. biofilms, have evolved into a major health problem. Most chronic or recurrent diseases including nosocomial infections can be traced back to the multicellular lifestyle of pathogenic agents. Both facultative and obligate pathogenic strains of Escherichia coli express a multitude of diverse factors contributing to biofilm formation like flagella, extracellular polymeric substances, adhesins, or surface-exposed proteins, e.g. autotransporters. This work presents the functional characterization of the surface-associated protein antigen 43 (Ag43). Due to its autoaggregating phenotype, Ag43 is also involved in the formation of microcolonies and biofilms. Antigen 43 represents an autotransporter protein frequently expressed by all Escherichia coli pathotypes. Interestingly, many E. coli isolates encode multiple identical or orthologous copies of agn43 which are usually associated with mobile genetic elements (genomic islands, plasmids). Here, the antigen 43 variants of uropathogenic Escherichia coli (UPEC) strain 536 (O6:K15:H31), commensal isolate E. coli Nissle 1917 (O6:K5:H1), and E. coli K-12 strain MG1655 (OR:H48:K-) have been analyzed. For this purpose, the different agn43-alleles were cloned into a capable vector system and subsequently expressed in Escherichia coli K-12 strain MG1655 ΔfimΔflu lacking the genes encoding type 1-fimbrial adhesins (fim) and antigen 43 (flu). Due to the occurrence of posttranslational glycosylation of Ag43 in wild type strains, experiments were additionally carried out upon co-expression of the heterologous AIDA-I-specific heptosyl transferase Aah (Autotransporter Adhesin Heptosyltransferase). On the basis of binding studies (intermolecular autoaggregation, adhesion to eukaryotic cells) individual properties could be detected for each Ag43-variant. However, compared to AIDA-I (Adhesin Involved in Diffuse Adherence) of enteropathogenic Escherichia coli (EPEC) strains, antigen 43 was shown to act as a weak adhesin. Additionally, O-glycosylation partly influenced protein functions. Depending on the variant tested, posttranslational modification by Aah either resulted in significantly reduced affinities or had no effect on the binding capacity of Ag43. Furthermore, antigen 43 exhibits structural homologies compared to certain domains of related autotransporters. For many of these proteins, an adhesion- or invasion-mediating function could be demonstrated. To date, the interaction of Ag43 with a putative eukaryotic receptor has not been determined, yet. Here, it is shown for the first time that antigen 43 specifically binds to components of the extracellular matrix. Overlay assays and ELISAs identified collagen and laminin as epithelial receptors for Ag43. Taken together, the results obtained in this study confirm the functional role of antigen 43 in biofilm formation as well as its effect during bacterial colonization of epithelial tissues. Expression of the Escherichia coli-specific autotransporter protein is directly correlated to the improved fitness of bacteria infecting the human host. Aah-mediated O-glycosylation seems not to be strictly required for the function of Ag43. The second aim of this work was the design and development of a test system which can be used for the differentiation of (uro-)pathogenic microorganisms in biofilms. For this purpose, the FISH (Fluorescence-in-situ-Hybridization)-technique has been optimized for diagnostic applications. Depending on the specimen, the protocol can also be adapted to the analysis of (multispecies) biofilms. KW - Escherichia coli KW - Biofilm KW - Adhäsine KW - Glykosylierung KW - Extrazelluläre Matrix KW - Kollagen KW - Laminin KW - Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung KW - Katheter KW - Autotransporterprotein KW - Fitneßfaktor KW - autotransporter protein KW - fitness factor Y1 - 2009 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-35684 ER - TY - THES A1 - Bauchart, Philippe Michel Paul T1 - Evaluation of the Zoonotic Risk of Escherichia coli Strains involved in Extraintestinal Infections of Humans and Animals. Characterization of New Virulences Factors in ExPEC T1 - Evaluierung des Zoonotischen Risikos von Escherichia coli Stämmen assoziiert mit Extraintestinalen Infektionen bei Menschen und Tieren. Charakterisierung Neuer Virulenzfaktoren von ExPEC N2 - Avian pathogenic Escherichia coli (APEC) represent a subset of the so-called extraintestinal pathogenic Escherichia coli (ExPEC) pathotype that can cause various extraintestinal infections in humans and animals. APEC are the causative agent of localized colibacillosis or systemic infection in poultry. In this latter case, the syndrome starts as an infection of the upper respiratory tract and develops into a systemic infection. Generally, ExPEC are characterized by a broad variety of virulence-associated factors that may contribute to pathogenesis. Major virulence factors, however, that clearly define this pathotype, have not been identified. Instead, virulence-associated genes of ExPEC and thus also of APEC could be used in a mix-and-match-fashion. Both pathotypes could not be clearly distinguished by molecular epidemiology, and this suggested a hypothetical zoonotic risk caused by APEC. Accordingly, the main scientific question of this study was to characterize common traits as well as differences of APEC and human ExPEC variants that could either support the possible zoonotic risk posed by these pathogenic E. coli strains or indicate factors involved in host specificity. Comparative genomic analysis of selected APEC and human ExPEC isolates of the same serotype indicated that these variants could not be clearly distinguished on the basis of (i) general phenotypes, (ii) phylogeny, (iii) the presence of typical ExPEC virulence genes, and (iv) the presence of pathoadaptive mutations. Allelic variations in genes coding for adhesins such as MatB and CsgA or their regulators MatA and CsgD have been observed, but further studies are required to analyze their impact on pathogenicity. On this background, the second part of this thesis focused on the analysis of differences between human ExPEC and APEC isolates at the gene expression level. The analysis of gene expression of APEC and human ExPEC under growth conditions that mimick their hosts should answer the question whether these bacterial variants may express factors required for their host-specificity. The transcriptomes of APEC strain BEN374 and human ExPEC isolate IHE3034 were compared to decipher whether there was a specific or common behavior of APEC and human ExPEC, in response to the different body temperatures of man (37°C) or poultry (41°C). Only a few genes were induced at 41 °C in each strain relative to growth at 37 °C. The group of down-regulated genes in both strains was markedly bigger and mainly included motility and chemotaxis genes. The results obtained from the transcriptome, genomic as well as phenotypic comparison of human ExPEC and APEC, supports the idea of a potential zoonotic risk of APEC and certain human ExPEC variants. In the third part of the thesis, the focus was set on the characterization of Mat fimbriae, and their potential role during ExPEC infection. Comparison of the mat gene cluster in K-12 strain MG1655 and O18:K1 isolate IHE3034 led to the discovery of differences in (i) DNA sequence, (ii) the presence of transcriptional start and transcription factor binding sites as well as (iii) the structure of the matA upstream region that account for the different regulation of Mat fimbriae expression in these strains. A negative role of the H-NS protein on Mat fimbriae expression was also proven at 20 °C and 37 °C by real-time PCR. A major role of this fimbrial adhesin was demonstrated for biofilm formation, but a significant role of Mat fimbriae for APEC in vivo virulence could not yet be determined. Interestingly, the absence of either a functional matA gene or that of the structural genes matBCDEF independently resulted in upregulation of motility in E. coli strains MG1655 and IHE3034 by a so far unknown mechanism. In conclusion, the results of this thesis indicate a considerable overlap between human and animal ExPEC strains in terms of genome content and phenotypes. It becomes more and more apparent that the presence of a common set of virulence-associated genes among ExPEC strains as well as similar virulence gene expression patterns and phylogenetic backgrounds indicate a significant zoonotic risk of avian-derived E. coli isolates. In addition, new virulence factors identified in human ExPEC may also play a role in the pathogenesis of avian ExPEC. N2 - Vogelpathogene Escherichia coli (APEC) sind eine Untergruppe der sogenannten extraintestinal pathogenen Escherichia coli (ExPEC), welche Infektionen außerhalb des Verdauungstraktes beim Menschen und vielen Tieren verursachen können. ExPEC sind durch eine Vielzahl Virulenz-assoziierter Faktoren charakterisiert, die zur Pathogenese beitragen können. Haupt-Virulenzfaktoren, die eine eindeutige Zuordnung zu diesem Pathotyp erlauben, wurden jedoch noch nicht identifiziert. Die Virulenz bei ExPEC und somit auch bei APEC scheint auf der kombinierten Expression von Virulenzfaktoren zu beruhen. Beide Pathotypen können daher nicht eindeutig aufgrund des Genomgehaltes sowie molekularer Epidemiologie voneinander unterschieden werden. In der vorliegenden Arbeit sollten Gemeinsamkeiten sowie Unterschiede bei ausgewählten APEC- und humanen ExPEC-Isolaten des gleichen Serotyps untersucht werden, um nähere Hinweise auf ein Zoonoserisiko zu erhalten oder um Faktoren zu charakterisieren, die zur Wirtsspezifität beitragen können. Vergleichende Analysen des Genomgehaltes zeigten, dass diese Varianten nicht aufgrund (i) genereller Phänotypen, (ii) ihrer Phylogenie, (iii) der Anwesenheit typischer Virulenz-assoziierter Gene sowie (iv) pathoadaptiver Mutationen voneinander unterschieden werden können. Interessanterweise wurden bei manchen Isolaten Allelvariationen in Genen beobachtet, die für Adhäsine wie MatB und CsgA sowie für ihre Regulatoren (MatA und CsgD) kodieren. Ihre mögliche Bedeutung für die Virulenz muß jedoch weiter analysiert werden. Im zweiten Abschnitt dieser Arbeit wurde untersucht, ob sich eng verwandte Vogel- und humane ExPEC-Isolate hinsichtlich ihrer Genexpression unterscheiden. Um zu untersuchen, ob die Körpertemperatur des Menschen (37 °C) oder von Geflügel (41 °C) einen unterschiedlichen Einfluß auf die bakterielle Genexpression hat und somit zur Wirtsspezifität beitragen kann, wurden die Transkriptome des APEC-Stammes BEN374 und des humanen ExPEC-Stammes IHE3034 nach Anzucht in vitro bei 37 °C bzw. 41 °C miteinander verglichen. Wachstum bei 41 °C führte nur bei wenigen Genen zu einer Induktion der Genexpression, wohingegen die Anzahl der reprimierten Gene bei dieser Temperatur in beiden Stämmen deutlich höher war und vor allem auf eine reduzierte Beweglichkeit und Chemotaxis hindeutete. Die Ergebnisse von vergleichender Genomik, Transkriptomik und Phänotypisierung humaner ExPEC- und APEC-Stämme unterstützen somit die Annahme, dass es ein Zoonoserisiko zwischen manchen APEC- und humanen ExPEC-Isolaten gibt. Im dritten Teil dieser Arbeit stand die Charakterisierung der Mat Fimbrien- Expression in E. coli sowie ihre Rolle bei der Infektion im Mittelpunkt. Der Vergleich der kodierenden matABCDEF Determinanten im E. coli K-12 Stamm MG1655 und im humanen ExPEC O18:K1 Isolat IHE3034 zeigte Unterschiede in (i) der jeweiligen Nukleotidsequenz, (ii) der Anwesenheit von Transkriptionsstartpunkten und Transkriptionsfaktor-Bindungsstellen sowie (iii) der Struktur der „Upstream“-Region des Genclusters auf, die zur unterschiedlichen Fimbrienexpression in beiden Stämmen beitragen können. Eine Repression der Mat Fimbrienexpression durch das H-NS Protein wurde nachgewiesen. Zudem wurde gezeigt, dass Mat Fimbrien signifikant zur Biofilmbildung beitragen, wohingegen ein Beitrag zur in vivo-Virulenz nicht festgestellt wurde. Interessanterweise beeinflusste der MatA Regulator, aber auch die Mat Fimbrien- Strukturgene, die Flagellenexpression: die Abwesenheit von matA bzw. von matBCDEF führte in beiden E. coli Stämmen zu einer Induktion der Flagellenexpression und Motilität. Der zugrundeliegende Mechanismus ist noch unbekannt. Zusammenfassend zeigen die Ergebnisse dieser Arbeit, dass es eine beträchtliche Überlappung des Genomgehaltes und der Phänotypen bei ExPEC-Stämmen, die von Menschen oder Tieren isoliert wurden, gibt. Das Vorhandensein eines gemeinsamen Virulenzgenpools, ihre Phylogenie und ähnliche Genexpressionsprofile legen nahe, dass ein Zoonoserisiko von APEC-Isolaten ausgehen kann. Die Identifizierung bislang unbekannter Virulenzfaktoren humaner ExPEC-Stämme kann sich daher auch auf das Verständnis der Pathogenese von APEC-Isolaten auswirken. Die Ergebnisse dieser Arbeit belegen auch, wie am Beispiel der Mat Fimbrien gezeigt, dass unterschiedliche E. coli-Phänotypen nicht nur auf einen unterschiedlichen Genomgehalt, sondern auch auf die unterschiedliche Regulation konservierter Determinanten zurückgeführt werden kann. KW - Escherichia coli KW - Virulenzfaktor KW - Zoonotisches Risiko KW - APEC KW - ExPEC KW - Mat Fimbrien KW - Biofilm KW - zoonotic risk KW - APEC KW - ExPEC KW - Mat fimbriae Y1 - 2010 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-48848 ER - TY - JOUR A1 - Parkkinen, Jaakko A1 - Hacker, Jörg A1 - Korhonen, Timo K. T1 - Enhancement of tissue plasminogen activator-catalyzed plasminogen activation by Escherichia coli S fimbriae associated with neonatal septicaemia and meningitis. N2 - The effect of Escherichia coli strains isolated from blood and cerebrospinal fluid of septic infants on plasminogen activation was studied. These strains typically carry a filamentous surface protein, S fimbria, that has formerly been shown to bind to endothelial cells and interact with plasminogen. The bacteria effectively promoted plasminogen activation by tissue plasminogen activator (t-PA) which was inhibited by e-aminocaproic acid. A recombinant strain expressing S fimbriae accelerated t-PAcatalyzed plasminogen activation to a similar extent as did the wild-type strains whereas the nonfimbriate recipient strain had no effect. After incubation with t-PA and plasminogen, the S-fimbriate strain displayed bacterium-bound plasmin activity whereas the nonfimbriate strain did not. Bacterium-associated plasmin generation was also observed with a strain expressing mutagenized S fimbriae that Iack the cell-binding subunit SfaS but not with a strain lacking the major subunit SfaA. Both t-PA and plasminogen bound to purified S fimbriae in a lysine-dependent manner and purified S fimbriae accelerated t-PA-catalyzed plasminogen activation. The results indicate that E. coli S fimbriae form a complex with t-PA and plasminogen which enhances the rate of plasminogen activation and generates bacterium-bound plasmin. This may promote bacterial invasion and persistence in tissues and contribute to the systemic activation of fibrinolysis in septicaemia. KW - Escherichia coli Y1 - 1991 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-71566 ER - TY - JOUR A1 - Kurotschka, Peter Konstantin A1 - Fulgenzio, Chiara A1 - Da Cas, Roberto A1 - Traversa, Giuseppe A1 - Ferrante, Gianluigi A1 - Massidda, Orietta A1 - Gágyor, Ildikó A1 - Aschbacher, Richard A1 - Moser, Verena A1 - Pagani, Elisabetta A1 - Spila Alegiani, Stefania A1 - Massari, Marco T1 - Effect of fluoroquinolone use in primary care on the development and gradual decay of Escherichia coli resistance to fluoroquinolones: a matched case-control study JF - Antibiotics N2 - The reversibility of bacterial resistance to antibiotics is poorly understood. Therefore, the aim of this study was to determine, over a period of five years, the effect of fluoroquinolone (FQ) use in primary care on the development and gradual decay of Escherichia coli resistance to FQ. In this matched case–control study, we linked three sources of secondary data of the Health Service of the Autonomous Province of Bolzano, Italy. Cases were all those with an FQ-resistant E. coli (QREC)-positive culture from any site during a 2016 hospital stay. Data were analyzed using conditional logistic regression. A total of 409 cases were matched to 993 controls (FQ-sensitive E. coli) by the date of the first isolate. Patients taking one or more courses of FQ were at higher risk of QREC colonization/infection. The risk was highest during the first year after FQ was taken (OR 2.67, 95%CI 1.92–3.70, p < 0.0001), decreased during the second year (OR 1.54, 95%CI 1.09–2.17, p = 0.015) and became undetectable afterwards (OR 1.09, 95%CI 0.80–1.48, p = 0.997). In the first year, the risk of resistance was highest after greater cumulative exposure to FQs. Moreover, older age, male sex, longer hospital stays, chronic obstructive pulmonary disease (COPD) and diabetes mellitus were independent risk factors for QREC colonization/infection. A single FQ course significantly increases the risk of QREC colonization/infection for no less than two years. This risk is higher in cases of multiple courses, longer hospital stays, COPD and diabetes; in males; and in older patients. These findings may inform public campaigns and courses directed to prescribers to promote rational antibiotic use. KW - drug resistance KW - bacterial KW - antimicrobial resistance KW - anti-bacterial agents KW - primary care KW - quinolones KW - fluoroquinolones KW - information storage and retrieval KW - Escherichia coli Y1 - 2022 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-278771 SN - 2079-6382 VL - 11 IS - 6 ER - TY - THES A1 - Hör, Jens T1 - Discovery of RNA/protein complexes by Grad-seq T1 - Ermittlung von RNA/Protein-Komplexen mittels Grad-seq N2 - Complex formation between macromolecules constitutes the foundation of most cellular processes. Most known complexes are made up of two or more proteins interacting in order to build a functional entity and therefore enabling activities which the single proteins could otherwise not fulfill. With the increasing knowledge about noncoding RNAs (ncRNAs) it has become evident that, similar to proteins, many of them also need to form a complex to be functional. This functionalization is usually executed by specific or global RNA-binding proteins (RBPs) that are specialized binders of a certain class of ncRNAs. For instance, the enterobacterial global RBPs Hfq and ProQ together bind >80 % of the known small regulatory RNAs (sRNAs), a class of ncRNAs involved in post-transcriptional regulation of gene expression. However, identification of RNA-protein interactions so far was performed individually by employing low-throughput biochemical methods and thereby hindered the discovery of such interactions, especially in less studied organisms such as Gram-positive bacteria. Using gradient profiling by sequencing (Grad-seq), the present thesis aimed to establish high-throughput, global RNA/protein complexome resources for Escherichia coli and Streptococcus pneumoniae in order to provide a new way to investigate RNA-protein as well as protein-protein interactions in these two important model organisms. In E. coli, Grad-seq revealed the sedimentation profiles of 4,095 (∼85 % of total) transcripts and 2,145 (∼49 % of total) proteins and with that reproduced its major ribonucleoprotein particles. Detailed analysis of the in-gradient distribution of the RNA and protein content uncovered two functionally unknown molecules—the ncRNA RyeG and the small protein YggL—to be ribosomeassociated. Characterization of RyeG revealed it to encode for a 48 aa long, toxic protein that drastically increases lag times when overexpressed. YggL was shown to be bound by the 50S subunit of the 70S ribosome, possibly indicating involvement of YggL in ribosome biogenesis or translation of specific mRNAs. S. pneumoniae Grad-seq detected 2,240 (∼88 % of total) transcripts and 1,301 (∼62 % of total) proteins, whose gradient migration patterns were successfully reconstructed, and thereby represents the first RNA/protein complexome resource of a Gram-positive organism. The dataset readily verified many conserved major complexes for the first time in S. pneumoniae and led to the discovery of a specific interaction between the 3’!5’ exonuclease Cbf1 and the competence-regulating ciadependent sRNAs (csRNAs). Unexpectedly, trimming of the csRNAs by Cbf1 stabilized the former, thereby promoting their inhibitory function. cbf1 was further shown to be part of the late competence genes and as such to act as a negative regulator of competence. N2 - Makromoleküle, die Komplexe bilden, sind die Grundlage der meisten zellulären Prozesse. Die meisten bekannten Komplexe bestehen aus zwei oder mehr Proteinen, die interagieren, um eine funktionelle Einheit zu bilden. Diese Interaktionen ermöglichen Funktionen, die die einzelnen Proteine nicht erfüllen könnten. Wachsende wissenschaftliche Erkenntnisse über nichtkodierende RNAs (ncRNAs) haben gezeigt, dass, analog zu Proteinen, auch viele ncRNAs Komplexe bilden müssen, um ihre Funktionen ausüben zu können. Diese Funktionalisierung wird normalerweise von spezifischen oder globalen RNA-bindenden Proteinen (RBPs), die auf eine bestimmte Klasse an ncRNAs spezialisiert sind, durchgeführt. So binden beispielsweise die in Enterobakterien verbreiteten globalen RBPs Hfq und ProQ zusammen >80 % der bekannten kleinen regulatorischen RNAs (sRNAs)—eine Klasse der ncRNAs, die in die posttranskriptionelle Genexpressionsregulation involviert ist. RNA-Protein-Interaktionen wurden bisher anhand einzelner Moleküle und mithilfe von biochemischen Methoden mit niedrigem Durchsatz identifiziert, was die Entdeckung solcher Interaktionen erschwert hat. Dies gilt insbesondere für Organismen, die seltener Gegenstand der Forschung sind, wie beispielsweise grampositive Bakterien. Das Ziel dieser Doktorarbeit war es, mittels gradient profiling by sequencing (Grad-seq) globale Hochdurchsatzkomplexomdatensätze der RNA-ProteinInteraktionen in Escherichia coli und Streptococcus pneumoniae zu generieren. Diese Datensätze ermöglichen es auf eine neue Art und Weise RNA-Protein- und ProteinProtein-Interaktionen in diesen wichtigen Modellorganismen zu untersuchen. Die E. coli Grad-seq-Daten beinhalten die Sedimentationsprofile von 4095 Transkripten (∼85 % des Transkriptoms) und 2145 Proteinen (∼49 % des Proteoms), mit denen die wichtigsten Ribonukleoproteine reproduziert werden konnten. Die detaillierte Analyse der Verteilung von RNAs und Proteinen im Gradienten zeigte, dass zwei Moleküle, deren Funktionen bisher unbekannt waren—die ncRNA RyeG und das kleine Protein YggL—ribosomenassoziiert sind. Durch weitere Charakterisierung konnte gezeigt werden, dass RyeG für ein toxisches Protein mit einer Länge von 48 Aminosäuren kodiert, das bei Überexpression die Latenzphase drastisch verlängert. Für YggL konnte eine Interaktion mit der 50S Untereinheit von 70S Ribosomen nachgewiesen werden, was auf eine potenzielle Funktion in der Biogenese von Ribosomen oder bei der Translation bestimmter mRNAs hindeutet. Die S. pneumoniae Grad-seq Daten beinhalten 2240 Transkripte (∼88 % des Transkriptoms) und 1301 Proteine (∼62 % des Proteoms), deren Migrationsprofile im Gradienten erfolgreich rekonstruiert werden konnten. Dieser RNA/ProteinKomplexomdatensatz eines grampositiven Organismus ermöglichte erstmalig die Verifizierung der wichtigsten konservierten Komplexe von S. pneumoniae. Weiterhin konnte eine spezifische Interaktion der 3’!5’-Exonuklease Cbf1 mit den ciadependent sRNAs (csRNAs), die an der Regulation von Kompetenz beteiligt sind, nachgewiesen werden. Überraschenderweise stabilisiert das von Cbf1 durchgeführte Kürzen der csRNAs die selbigen, was deren inhibitorische Funktion unterstützt. Darüber hinaus konnte gezeigt werden, dass cbf1 eines der späten Kompetenzgene ist und als solches als negativer Regulator der Kompetenz agiert. KW - Multiproteinkomplex KW - RNS-Bindungsproteine KW - RNS KW - Escherichia coli KW - Streptococcus pneumoniae KW - Complexome KW - RNA-binding protein KW - RNA KW - Escherichia coli KW - Streptococcus pneumoniae KW - Grad-seq KW - Bacteria Y1 - 2020 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-211811 ER - TY - THES A1 - Seo, Ean Jeong T1 - Construction of recombinant E. coli Nissle 1917 (EcN) strains for the expression and secretion of defensins T1 - Konstruktion von rekombinanten E. coli Nissle 1917 (EcN) Stämmen, die Defensine exprimieren bzw. sekretieren N2 - Der probiotische Escherichia coli Stamm Nissle 1917 (EcN) ist eines der wenigen Probiotika, die als aktive Komponente eines Medikaments in mehreren Ländern zugelassen sind. Am besten ist die Wirksamkeit des EcN für die Remissionserhaltung von an Colitis Ulcerosa leidenden Patienten dokumentiert. Diese Fähigkeit ist vermutlich darauf zurückzuführen, dass EcN in der Lage ist die Produktion des humanen beta-Defensins 2 (HBD2) mittels seiner Flagelle zu Induzieren. In dieser Studie wurden rekombinante EcN Stämme konstruiert, die ein Defensin zu produzieren vermögen. Zu diesem Zweck wurden Kodon-optimierte Defensingene in Expressionsplasmidvektoren kloniert, die entweder die Proform mit der Signalsequenz oder die reife Defensinform des humanen -Defensins 5 (HD5) oder des humanen -Defensins 2 (HBD2) unter der Kontrolle des T7-Promotors kodieren. Die Synthese dieser Defensine wurde mittels Western-Blot nach der Induktion der Expression und der Lyse der rekombinanten EcN Stämme demonstriert. Das rekombinante reife HBD2 mit einem N-terminalen His-Tag konnte mittels Ni-Säulen-Chromatographie aufgereinigt werden. Das so gewonnene HBD2 zeigte antimikrobielle Aktivität gegen E. coli, Salmonella enterica Serovar Typhimurium und Listeria monocytogenes. In einem zweiten Ansatz wurde der Teil des HBD2-Gens mit dem yebF-Gen fusioniert, der das reife HBD2 kodiert. Das resultierende Fusionsprotein YebFMHBD2 wurde von dem entsprechenden EcN Stamm nach Induktion der Expression sekretiert. Die Präsenz von YebFMHBD2 im Medium war nicht das Ergebnis von Zellyse wie Western-Blots spezifisch für die -Galaktosidase und das Maltose-Bindeprotein mit dem Kulturüberstand zeigten. Dieser Kulturüberstand inhibierte das Wachstum von E. coli, Salmonella enterica Serovar Typhimurium und Listeria monocytogenes nach Dialyse und Aufkonzentration sowohl in Agardiffusionsassays als auch in Flüssigcokultur. Damit konnte gezeigt werden, dass EcN ein für die Produktion von bestimmten humanen Defensinen geeignetes Probiotikum darstellt. EcN ist bei der Behandlung von Morbus Crohn Patienten nicht aktiv. Dies ist vermutlich in der genetisch bedingten Unfähigkeit zur ausreichenden Defensinproduktion solcher Individuen begründet. Als ein erster Schritt in der Entwicklung von alternativen Ansätzen zur Behandlung Morbus Crohn Patienten wurden in dieser Arbeit EcN Stämme konstruiert, die in der Lage sind HD5 oder HBD2 zu produzieren. N2 - The probiotic Escherichia coli strain Nissle 1917 (EcN) is one of the few probiotics licensed as a medication in several countries. Best documented is its effectiveness in keeping patients suffering from ulcerative colitis (UC) in remission. This might be due to its ability to induce the production of human beta defensin 2 (HBD2) in a flagellin-dependent way in intestinal epithelial cells. In contrast to ulcerative colitis, for Crohn´s disease (CD) convincing evidence is lacking that EcN might be clinically effective, most likely due to the genetically based inability of sufficient defensin production in CD patients. As a first step in the development of an alternative approach for the treatment of CD patients, EcN strains were constructed which were able to produce human alpha-defensin 5 (HD5) or beta-defensin 2 (HBD2). For that purpose codon-optimized defensin genes encoding either the proform with the signal sequence or the mature form of human alpha defensin 5 (HD5) or the gene encoding HBD2 with or without the signal sequence were cloned in an expression vector plasmid under the control of the T7 promoter. Synthesis of the encoded defensins was shown by Western blots after induction of expression and lysis of the recombinant EcN strains. Recombinant mature HBD2 with an N-terminal His-tag could be purified by Ni-column chromatography and showed antimicrobial activity against E. coli, Salmonella enterica serovar Typhimurium and Listeria monocytogenes. In a second approach, that part of the HBD2-gene which encodes mature HBD2 was fused with yebF gene. The resulting fusion protein YebFMHBD2 was secreted from the encoding EcN mutant strain after induction of expression. Presence of YebFMHBD2 in the medium was not the result of leakage from the bacterial cells, as demonstrated in the spent culture supernatant by Western blots specific for ß-galactosidase and maltose-binding protein. The dialyzed and concentrated culture supernatant inhibited the growth of E. coli, Salmonella enterica serovar Typhimurium and Listeria monocytogenes in radial diffusion assays as well as in liquid coculture. This demonstrates EcN to be a suitable probiotic E. coli strain for the production of certain defensins. KW - Escherichia coli KW - Probiotikum KW - Rekombinante DNS KW - Genexpression KW - Defensine KW - Probiotic KW - Recombinant defensins KW - E. coli Nissle 1917 KW - HBD2 KW - HD5 KW - Antimicrobial activity KW - Secretion Y1 - 2012 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-72005 ER - TY - JOUR A1 - Schmoll, T. A1 - Morschhäuser, J. A1 - Ott, M. A1 - Ludwig, B. A1 - Van Die, I. A1 - Hacker, Jörg T1 - Complete genetic organization and functional aspects of the Escherichia coli S fimbrial adhesin determinant: nucleotide sequence of the genes sfaB, C, D, E, F. N2 - The S fimbrial adhesin (sfa) determinant of E. co/i comprises nine genes situated on a stretch of 7.9 kilobases (kb) DNA. Here the nucleotide sequence of the genes sfa B and sfaC situated proximal to the main structural gene sfaA is described. Sfa-LacZ fusions show that the two genes are transcribed in opposite directions. The isolation of mutants in the proximal region of the sfa gene cluster, the construction of sfa-phoA gene fusions and subsequent transcomplementation sturlies indicated that the genes sfaB and sfaC play a role in regulation of the sfa determinant. ln addition the nucleotide sequence of the genes sfa D, sfa E and sfa F situated between the genes sfaA and sfaG responsible for S subunit proteins, were determined. lt is suggested that these genes are involved in transport and assembly of fimbrial subunits. Thus the entire genetic organization of the sfa determinant is presented and compared with the gene clusters coding for P fimbriae (pap), F1 C fimbriae (foc) and type I fimbriae ( fim). The evolutionary relationship of fimbrial adhesin determinants is discussed. KW - Infektionsbiologie KW - Escherichia coli KW - S fimbrial adhesin (Sfa) KW - genetic organization KW - gene regulation KW - nucleotide sequence Y1 - 1990 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-59661 ER - TY - JOUR A1 - Krallmann-Wenzel, U. A1 - Ott, M. A1 - Hacker, Jörg A1 - Schmidt, G T1 - Chromosomal mapping of genes encoding mannose-sensitive (type I) and mannose-resistant F8(P) fimbriae of Escherichia coli O18:K5:H5 N2 - DNA hybridization experiments demonstrated that the gene clusters encoding the F8 fimbriae (fei) as well as the type I fimbriae (pi/) exist in a single copy on the chromosome of E. coli 018:K5 strain 2980. In conjugation experiments with appropriate donors, the chromosomal site of these gene clusters was determined. The pil genes were mapped close to the gene clusters thr and Jeu controlling the biosynthesis of threonine and leucine, respectively. The fei genes were found to be located close to the galactose operon (gal) between the position 17 and 21 of the E. coli chromosomallinkage map. KW - Infektionsbiologie KW - Escherichia coli KW - F1 KW - F8 fimbriae KW - Gene cloning KW - Gene mapping Y1 - 1989 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-59545 ER - TY - THES A1 - Zude, Ingmar T1 - Characterization of virulence-associated traits of Escherichia coli bovine mastitis isolates T1 - Charakterisierung Virulenz-assozierter Eigenschaften von Escherichia coli Isolaten boviner Mastitis N2 - Bacterial mastitis is caused by invasion of the udder, bacterial multiplication and induction of inflammatory responses in the bovine mammary gland. Disease severity and the cause of disease are influenced by environmental factors, the cow’s immune response as well as bacterial traits. Escherichia coli (E. coli) is one of the main causes of acute bovine mastitis, but although pathogenic E. coli strains can be classified into different pathotypes, E. coli causing mastitis cannot unambiguously be distinguished from commensal E. coli nor has a common set of virulence factors been described for mastitis isolates. This project focussed on the characterization of virulence- associated traits of E. coli mastitis isolates in comprehensive analyses under conditions either mimicking initial pathogenesis or conditions that E. coli mastitis isolates should encounter while entering the udder. Virulence-associated traits as well as fitness traits of selected bovine mastitis or faecal E. coli strains were identified and analyzed in comparative phenotypic assays. Raw milk whey was introduced to test bacterial fitness in native mammary secretion known to confer antimicrobial effects. Accordingly, E. coli isolates from bovine faeces represented a heterogeneous group of which some isolates showed reduced ability to survive in milk whey whereas others phenotypically resembled mastitis isolates that represented a homogeneous group in that they showed similar survival and growth characteristics in milk whey. In contrast, mastitis isolates did not exhibit such a uniform phenotype when challenged with iron shortage, lactose as sole carbon source and lingual antimicrobial peptide (LAP) as a main defensin of milk. Reduced bacterial fitness could be related to LAP suggesting that bacterial adaptation to an intramammary lifestyle requires resistance to host defensins present in mammary secretions, at least LAP. E. coli strain 1303 and ECC-1470 lack particular virulence genes associated to mastitis isolates. To find out whether differences in gene expression may contribute to the ability of E. coli variants to cause mastitis, the transcriptome of E. coli model mastitis isolates 1303 and ECC-1470 were analyzed to identify candidate genes involved in bacterium-host interaction, fitness or even pathogenicity during bovine mastitis. DNA microarray analysis was employed to assess the transcriptional response of E. coli 1303 and ECC-1470 upon cocultivation with MAC-T immortalized bovine mammary gland epithelial cells to identify candidate genes involved in bacterium-host interaction. Additionally, the cell adhesion and invasion ability of E. coli strain 1303 and ECC-1470 was investigated. The transcriptonal response to the presence of host cells rather suggested competition for nutrients and oxygen between E. coli and MAC-T cells than marked signs of adhesion and invasion. Accordingly, mostly fitness traits that may also contribute to efficient colonization of the E. coli primary habitat, the gut, have been utilized by the mastitis isolates under these conditions. In this study, RNA-Seq was employed to assess the bacterial transcriptional response to milk whey. According to our transcriptome data, the lack of positively deregulated and also of true virulence-associated determinants in both of the mastitis isolates indicated that E. coli might have adapted by other means to the udder (or at least mammary secretion) as an inflammatory site. We identified traits that promote bacterial growth and survival in milk whey. The ability to utilize citrate promotes fitness and survival of E. coli that are thriving in mammary secretions. According to our results, lactoferrin has only weak impact on E. coli in mammary secretions. At the same time bacterial determinants involved in iron assimilation were negatively regulated, suggesting that, at least during the first hours, iron assimilation is not a challenge to E. coli colonizing the mammary gland. It has been hypothesized that cellular iron stores cause temporary independency to extracellular accessible iron. According to our transcriptome data, this hypothesis was supported and places iron uptake systems beyond the speculative importance that has been suggested before, at least during early phases of infection. It has also been shown that the ability to resist extracytoplasmic stress, by oxidative conditions as well as host defensins, is of substantial importance for bacterial survival in mammary secretions. In summary, the presented thesis addresses important aspects of host-pathogen interaction and bacterial conversion to hostile conditions during colonization of the mastitis inflammatory site, the mammary gland. N2 - Bei der bakteriellen Mastitis handelt es sich um eine Infektion der bovinen Milchdrüse, ausgelöst durch Eintritt und Wachstum der Bakterien im Euter der Kuh. Krankheitsverlauf und Ursache werden beeinflusst durch Umweltfaktoren, das Immunsystem des Wirtes und die Eigenschaften des bakteriellen Erregers. Die Spezies Escherichia coli (E. coli) ist einer der häufigsten Erreger der akuten bovinen Mastitis. Generell können pathogene E. coli -Stämme entsprechend ihres Infektionsortes in verschiedene Pathotypen klassifiziert werden, die durch eine individuelle Kombination verschiedener Virulenzfaktoren gekennzeichnet sind. Eine eindeutige Unterscheidung von E. coli –Mastitiserregern und kommensalen E. coli -Stämmen ist bisher nicht beschrieben. Diese Studie befasst sich mit der Charakterisierung virulenz-assozierter Eigenschaften von E. coli –Isolaten der bovinen Mastitis. Dazu wurden Untersuchungen unter Bedingungen durchgeführt, die denen während der Anfangsphase der Mastitis entsprechen. Die Virulenz und Fitness-assoziierten Eigenschaften ausgewählter E. coli Mastitis- und Fäkalisolate wurden in vergleichenden phenotypischen Assays identifiziert und analysiert. Zur Untersuchung der bakteriellen Fitness in Milchdrüsensekreten wurde native Molke mit antimikrobiellen Eigenschaften von Rohmilch genutzt. Dabei stellte sich heraus dass E. coli Fäkalisolate eine heterogene Gruppe bilden. Innerhalb dieser Gruppe wiesen einige Isolate eine verminderte Überlebensrate auf. Andere Fäkalisolate zeigten eine höhere Überlebensrate, ähnlich der Überlebensrate von Mastitiserregern. Im Gegensatz zum ihrem grundsätzlich guten Überleben in Molke zeigten Mastitisisolate keine einheitlichen phänotypischen Merkmale bei Wachstum mit 1) Lactose als einziger Kohlenstoffquelle, 2) Eisenlimitierung, oder 3) unter Einfluss von lingualem antimikrobiellem Peptid (LAP), einem bedeutenden Defensin der Wirtsantwort im Euter. Die verminderte Fähigkeit in Milchdrüsensekreten zu überleben korrelierte mit der konzentrationsabhängigen Überlebensfähigkeit in Gegenwart von LAP. Dies lässt vermuten dass eine Anpassung der Bakterien an die Lebensbedingungen in der bovinen Milchdrüse der Resistenz gegenüber Defensinen (u.a. LAP) bedarf. Den Mastitis-isolaten E. coli 1303 und ECC 1470 fehlen diverse Virulenzgene die bereits mit Mastitis assoziiert werden konnten. Um zu bestimmen ob Unterschiede in der Genexpression beider E. coli Isolate dazu beitragen Mastitis auszulösen, wurden Transkriptomanalysen durchgeführt. Dabei sollten vor allem Kandidatengene bestimmt werden, die an der Wirt-Pathogen-Interaktion beteiligt sind oder zur bakteriellen Fitness oder Virulenz der Erreger beitragen. Auf der Basis von DNA Microarrays wurde die Genexpression von E. coli 1303 und ECC 1470 in Gegenwart von immortalisierten Zellen des bovinen Milchdrüsenepithels (MAC-T) bestimmt. Zusätzlich wurde die Fähigkeit zur Zelladhäsion und Internalisierung beider Isolate untersucht. Die bakterielle Transkriptionsantwort in Gegenwart der Wirtszellen ergab, dass Erreger und Wirtszellen eher um den Bedarf an Nährstoffen und Sauerstoff konkurrierten, anstatt deutliche Anzeichen der Zelladhäsion oder Invasion zu zeigen. Beide Isolate nutzten vornehmlich Fitnesseigenschaften, die auch bei der Besiedlung des Darms als dem primären Habitat von E. coli verwendet werden. In dieser Studie wurde außerdem die Genexpression von E. coli 1303 und ECC 1470 in Reaktion auf Molke aus Rohmilch mittels Gesamt-Transkriptom-Sequenzierung (RNA Seq) untersucht. Die Transkriptomanalyse ergab keine wirklich deregulierten virulenz-assozierten Gene in einer der beiden E. coli Mastitis Isolate. Ferner konnten Eigenschaften identifiziert werden, die zum Wachstum und Überleben in nativer Molke beitragen. Die Fähigkeit, Citrat zu verwerten, begünstigt das erfolgreiche Überleben in Milchdrüsensekten und stellt einen wichtigen Fitnessfaktor dar. Unsere Transkriptomdaten bestätigen dass Lactoferrin nur geringen Einfluss auf das Wachstum, von E. coli in Milchdrüsensekreten, hat. Die Expression bakterieller Determinanten, die an der Aufnahme von Eisen beteiligt sind, wurde herunterreguliert. Dies lässt darauf schließen dass Eisenaufnahme in den ersten Stunden der Kolonisierung durch die Erreger keine essentielle Fitnesseigenschaft darstellt. Vermutlich reicht die intrazelluläre Menge an Eisen aus, um eine zeitweise Unabhängigkeit von extrazellular verfügbarem Eisen zu ermöglichen. Diese These konnte durch unsere Transkriptomdaten gestützt werden und stellt eine wichtige Entdeckung in Bezug auf die Verfügbarkeit von Eisen während der Kolonisierung der Milchdrüse dar. Unsere Daten zeigen, dass die Resistenz gegenüber extrazellulärem Stress durch oxidative Bedingungen und Defensine des Wirtes von großer Bedeutung für das bakterielle Überleben in Milchdrüsensekreten ist. Die vorliegende Thesis befasst sich mit wichtigen Aspekten der Wirt-Pathogen-Interaktion und der Anpassung an die antimikrobiellen Bedingungen während der Kolonisierung der Milchdrüse als Ort der Infektion. KW - Escherichia coli KW - mastitis KW - infection KW - virulence KW - transcriptome analysis KW - Kuh KW - Brustdrüsenentzündung KW - Virulenz Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-100934 ER - TY - JOUR A1 - Hacker, Jörg A1 - Schrettenbrunner, A. A1 - Schröter, G. A1 - Schmidt, G. A1 - Düvel, H. A1 - Goebel, W. T1 - Characterization of Escherichia coli wild-type strains by means of agglutination with antisera raised against cloned P-, S- and MS-fimbriae antigens, hemagglutination, serotyping and hemolysin-production N2 - E. coli stcains isolated from patients with urinary tcact infecrions (UTn very often possess mannose"sensitive (MS) and mannose-resistant (MR) adherence facmrs (fimbriae). According to their receptor specificity the mannose-resistant adhesins can be divided inm several types, P, S, M and X. We have cloned rhe determinants of rhree groups of UTI E. coli adhesins, MS, p and S, and prepared specific aorisera against the fimbriae antigens. 189 hernagglutination (HA+) -positive stcains, 96 fecal isolates and 93 strains isoJated from UTI . have been tesred with rhese specific antisera and further characterized by receptor specific : HA, HA parteras and further of rhe "common 0 serogroups" 01, 02, 04, 06, 07, 08, 018, ' 025, 075, most prevalenr in UTI, and hemolysin production. · 68 (73 %) of the UTI srrains a.nd 50 (52%) of the fecal isolates showed P-receptor specificiry; 16 (17%) of the uropathogenic bacteria and 33 (34%) of the fecal strains exhibited S, M or X-fimbriae antigens. 24% of rhe P-hemagglutinating (P+) strains reacted wirb P (F8)-specific antiserum. In contrast, more than three quaner of the s+-srrains were agglutinated by S-specific antiserum. HA-pattern VJ and 018 amigen were found to be associared with P-fimbriae strains, wbereas HA-pattern V and VII and the 0 anrigens 02 (M-type), 06 and 018 (5-type) occurred most frequently in p- -strains. A high percentage of P-fimbriated strains showed mannose-sensitive hemagglurination and hemolysin production. N2 - E. co/i-Stämme, die von Patienten mit Urogenitaltraktinfektionen (UTI) isoliert werden, weisen oftmals Mannose-sensitive (MS) und Mannose-resistente (MR) Adhärenzfaktoren (Fimbrien) auf. Entsprechend ihrer Rezeptorspezifität können die MR-Adhäsine in verschiedene Gruppen, P, S, M und X unterteilt werden. Vor kurzem haben wir die Determinanten von drei Gruppen der UTI E. coli-Adhäsine, MS, P und S, kloniert und spezifische Antiseren gegen diese Fimbrienantigene hergestellt. 189 Hämagglutinations (HA +)-positive Stämme,. 96 Isolate aus Stuhlproben und 93 Stämme von Patienten mit UTl, wurden mit diesen Fimbrienantigen-spezifischen Antiseren getestet. Sie wurden weiterhin bezüglich ihrer rezeptorspezifischen HA, ihres HA-Musters, dem Vorkommen der 0-Serogruppen 01, 02, 04, 06, 07, 08, 018, 025, 075 ("common 0-serogroups"), die bei Harnwegsisolaten vorherrschen, und der Hämolysinbildung charakterisiert. 68 (73 %) der UTl-Stämme und 50 (52%) der fäkalen lsolate zeigten P-Rezeptorspezifität; 16 ( 17%) uropathogene Stämme und 33 (34%) Stämme aus Stuhlproben prägten S, M oder X-Fimbrienantigene aus. 24% der P-hämagglutinierenden (P+) Stämme reagierten mit P (F8)-spezifischem Antiserum. lm Gegensatz dazu reagierten mehr als drei Viertel der s+ -Stämme mit dem S-spezifischen Antiserum. Das HA-Muster Vl und 018- Antigen wurden meistenteils bei p+ -Stämmen gefunden; die HA-Muster V und Vll und die 0-Antigene 02 (M-Typ), 06 und 018 (S-Typ) wurden vorzugsweise bei p--Stämmen nachgewiesen. Ein hoher Prozentsatz von P-fimbrierten Stämmen zeigte Mannose-sensitive Hämagglutination und Hämolysinbildung. KW - Escherichia coli Y1 - 1986 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-72992 ER - TY - THES A1 - Salvador, Ellaine Riciel P. T1 - Characterization of Asymptomatic Bacteriuria (ABU) Escherichia coli Isolates: virulence traits and host-pathogen interactions T1 - Charakterisierung der Virulenzeigenschaften und Wirt-Pathogen-Interaktionen von asymptomatischer Bakteriurie (ABU) Escherichia coli Isolaten N2 - Urinary tract infection (UTI) is one of the most serious health problems worldwide. It accounts for a million hospital visits annually in the United States. Among the many uropathogenic bacteria, uropathogenic Escherichia coli (UPEC) is the most common causative agent of UTI. However, not all E. coli that inhabit the urinary tract can cause UTI. Some of them thrive for long periods of time in the urinary bladder without causing overt symptoms of infection. This carrier state is called asymptomatic bacteriuria (ABU). E. coli ABU isolates can live in the host without inducing host response due to deletions, insertions and point mutations in the genome leading to the attenuation of virulence genes. They therefore behave in the same way as commensals. Since bacteria that inhabit the urinary tract are said to originate from the lower intestinal tract and ABU behave in a similar way as commensals, this study compared various phenotypic and genotypic characteristics of ABU and commensal E. coli fecal isolates. The two groups did not show a strict clustering with regards to phylogenetic lineage since there appears to be overlaps in their distribution in some clonal complexes. In addition, it was observed that the UPEC virulence genes were more frequently inactivated in ABU than in fecal isolates. Hence, ABU tend to have less functional virulence traits compared to the fecal isolates. The ABU model organism E. coli 83972 which is known not only for its commensal behavior in the urinary bladder but its ability to outcompete other bacteria in the urinary tract is currently being used as prophylactic treatment in patients who have recurrent episodes of UTI at the University Hospital in Lund, Sweden. The pilot studies showed that upon deliberate long-term colonization of the patients with E. coli 83972, they become protected from symptomatic UTI. In this study, the phenotypic and genotypic characteristics of eight re-isolates taken from initially asymptomatically colonized patients enrolled in the deliberate colonization study who reported an episode of symptoms during the colonization period were investigated. Two out of the eight re-isolates were proven to be a result of super infection by another uropathogen. Six re-isolates, on the other hand, were E. coli 83972. The urine re-isolates confirmed to be E. coli 83972 were phenotypically heterogeneous in that they varied in colony size as well as in swarming motility. Four of these re-isolates were morphologically homogenous and similar to the parent isolate E. coli 83972 whereas one of them appeared phenotypically heterogenous as a mixture of smaller and normal-sized colonies. Still another re-isolate phenotypically resembled small colony variants. Meanwhile, three of the six re-isolates did not differ from the parent isolate with regards to motility. On the other hand, three exhibited a markedly increased motility compared to the parent isolate. Transcriptome analysis demonstrated the upregulation of a cascade of genes involved in flagellar expression and biosynthesis in one of the three motile re-isolates. However, upon further investigation, it was found out that the expression of flagella had no effect on bacterial adhesion to host cells in vitro as well as to the induction of host inflammatory markers. Thus, this implies that the increased motility in the re-isolates is used by the bacteria as a fitness factor for its benefit and not as a virulence factor. In addition, among the various deregulated genes, it was observed that gene regulation tends to be host-specific in that there is no common pattern as to which genes are deregulated in the re-isolates. Taken together, results of this study therefore suggest that the use of E. coli 83972 for prophylactic treatment of symptomatic UTI remains to be very promising. N2 - Harnwegsinfektionen (HWI) sind weltweit ein ernstes Gesundheitsproblem, auf welches allein in den USA jährlich ca. eine Million Krankenhausbesuche entfallen. Innerhalb der Gruppe uropathogener Bakterien stellen die uropathogenen Escherichia coli (UPEC) die wichtigsten Verursacher akuter Harnwegserkrankungen dar. Interessanterweise führen nicht alle E. coli Varianten, die den Harnweg besiedeln, zwangsläufig zu HWI. Einige von ihnen sind in der Lage, die Harnblase über einen langen Zeitraum zu kolonisieren ohne Symptome einer HWI auszulösen. Dieses Phänomen wird als asymptomatische Bakteriurie (ABU) bezeichnet. Die Eigenschaft von E. coli ABU-Isolaten innerhalb des Wirtsorganismus leben zu können, ohne eine deutliche Wirtsabwehrreaktion hervorzurufen, ist unter anderem bedingt durch Deletionen, Insertionen und Punktmutationen im bakteriellen Genom und der daraus resultierenden Inaktivierung einiger Virulenzgene. Ihre Lebensweise ist daher mit der kommensaler Organismen vergleichbar. Da die den Harnweg besiedelnden Bakterien mit hoher Wahrscheinlichkeit ihren Ursprung im unteren Darmtrakt haben und sich die ABU-Isolate ähnlich der Kommensalen verhalten, wurden in dieser Arbeit zahlreiche phäno- und genotypische Charakteristika von ABU-Isolaten mit denen kommensaler E. coli-Fäkalisolate verglichen. Für diese beiden Gruppen konnte hinsichtlich ihrer phylogenetischen Abstammung keine strikte Clusterbildung festgestellt werden, da ihre Verteilung in einigen klonalen Komplexen Überlappungen aufwies. Es zeigte sich jedoch, dass die UPEC-Virulenzgene in den ABU-Isolaten häufiger inaktiviert vorlagen als in den Fäkalisolaten. Demzufolge scheinen die ABU-Isolate weniger funktionale Virulenzeigenschaften zu besitzen als die Fäkalisolate. Der Modell-ABU Stamm E. coli 83972 ist sowohl für sein kommensales Verhalten in der menschlichen Blase bekannt, als auch für seine Fähigkeit, andere Bakterien aus dem Harntrakt zu verdrängen. Er wird gegenwärtig am Universitätsklinikum in Lund (Schweden) als prophylaktisches Therapeutikum bei der Behandlung von Patienten mit rezidivierenden HWI eingesetzt. In Pilotstudien konnte gezeigt werden, dass eine vorsätzliche Langzeit-Kolonisierung von Patienten mit E. coli 83972 zum Schutz vor symptomatischen HWI führt. In der vorliegenden Arbeit wurden die phäno- und genotypischen Charakteristika von acht Patienten-Reisolaten dieser Langzeitstudie untersucht. Die Reisolate wurden aus zunächst asymptomatisch kolonisierten Patienten isoliert, die allerdings im Verlauf der Langzeit-Kolonisierung über eine Reihe von Symptomen klagten. Zwei dieser acht Reisolate waren nachweislich das Resultat einer Superinfektion mit einem anderen uropathogenen Bakterium. Die restlichen sechs Reisolate konnten jedoch als E. coli 83972 identifiziert werden. Für diese sechs Reisolate war eine phänotypische Heterogenität zu beobachten, die sich zum einen in variierender Koloniegröße, zum anderen in unterschiedlichem Schwärmverhalten zeigte: Vier der Reisolate entsprachen morphologisch dem Ausgangsstamm E. coli 83972, wohingegen ein Reisolat phänotypisch abweichend als Mischung von kleineren und normal-großen Kolonien in Erscheinung trat. Ein weiteres Reisolat ähnelte phänotypisch sogenannten „Small Colony Variants“. Das Schwärmverhalten betreffend unterschieden sich indessen drei der sechs Reisolate vom Ausgangsstamm. Sie zeigten im Vergleich eine erhöhte Motilität. In einem dieser drei motilen Reisolate konnte mittels Transkriptomanalyse die hochregulierte Expression einer Reihe von Genen, welche für die Flagellenexpression und -biosynthese verantwortlich sind, aufgezeigt werden. Weiterführende in vitro-Untersuchungen ergaben jedoch, dass diese erhöhte Flagellenexpression weder einen verstärkenden Effekt auf die bakterielle Adhäsion an die Wirtszellen hat, noch in der Wirtszelle die Bildung von Entzündungsmarkern induziert. Dieses Ergebnis impliziert, dass die erhöhte Motilität der Reisolate als Fitnessfaktor und nicht als Virulenzfaktor zu betrachten ist. Ferner führte die genauere Analyse der deregulierten Gene zu der Annahme, dass die Genregulation in den Reisolaten wirtsspezifisch ist, da sich kein übereinstimmendes Muster bezüglich der Deregulation abzeichnete. Unter Berücksichtigung aller Ergebnisse dieser Studie lässt sich abschließend sagen, dass die Verwendung des E. coli Stammes 83972 als prophylaktisches Therapeutikum bei der Behandlung von symptomatischen HWI weiterhin als sehr vielversprechend angesehen werden kann. KW - Escherichia coli KW - Harnwegsinfektion KW - Virulenz KW - Escherichia coli KW - Urinary tract infection KW - asymptomatic bacteriuria Y1 - 2011 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-71283 ER - TY - JOUR A1 - Munoa, F. A1 - Hacker, Jörg A1 - Juarez, A. T1 - Characterization of a chromosomal mutant that blocks hemolysin excretion in Escherichia coli N2 - We analyzed an Escherichia coli strain which harbours a chromosomal mutation that blocks the hemolysin excretion. Compartmentation studies showed that hemolysin accumulates in the cytoplasm and not in the periplasm. The mutation did not affect the SDS-PAGE protein pattern of the outer membrane, although some alterations were apparent in the periplasmic protein pattern. The mutant strain, E. coli Hsb-1 also failed to export a cloned fimbrial adhesin. The mutation maps in the min. 3.5 of the E. coli genetic map. KW - Infektionsbiologie KW - Hemolysin excretion KW - Escherichia coli KW - Mutant Y1 - 1988 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-59534 ER -