TY - THES A1 - Beyer, Ines T1 - Immunhistochemische Analyse der Expression des CFR-1/PAM-1-Rezeptors auf Karzinomen und deren Präkanzerosen T1 - Immunohistochemical analysis of the CFR-1/PAM-1 receptor expression on carcinomas and precancerous lesions N2 - Die humane Hybridomatechnologie ist ein guter Ansatz um tumorspezifische humane monoklonale Antikörper zu gewinnen. Der humane monoklonale IgM-Antikörper PAM-1 wurde aus einem Patienten mit Magenkarzinom mit Hilfe der humanen Hybridomatechnik isoliert und bindet an eine neue, post-transkriptionell modifizierte Variante des CFR-1 Rezeptors. Dieser Rezeptor ist auf fast allen Karzinomen unabhängig von Lokalisation und Art exprimiert, aber nicht auf gesundem Gewebe. CFR-1/ PAM-1 ist auch auf Präkanzerosen nachgewiesen worden: Helicobacter pylori-assoziierte Gastritis, Dysplasie des Magens, Colitis ulcerosa assozierte Dysplasie und Kolonadenome, Barrettmetaplasie, -dysplasie des Ösophagus, Plattenepitheldysplasie der Lunge und cervicale intraepitheliale Neoplasie I-III. Das auf präkanzerös veränderte und maligne entartetet Zellen beschränkte Expressionsmuster des CFR-1/PAM-1 Rezeptors bietet interessante Angriffspunkte für weitere Forschungen. N2 - Precancerous epithelial lesions are sites of uncontrolled cellular proliferation, generated by irreversible genetic changes. Not all of these lesions progress to invasive cancer, some may even regress, but early detection of abnormal cells can be crucial for survival of the patient. Diagnosis is mainly performed by using morphological parameters. Proliferation markers can facilitate the analysis, if they show a consistent expression and distinguish between healthy and malignant cells. The fully human monoclonal IgM antibody PAM-1 was isolated from a patient with stomach carcinoma and binds to a new variant of CFR-1 (cysteine-rich fibroblast growth factor receptor 1). This CFR-1/PAM-1 receptor is expressed on nearly all epithelial cancers of every type and origin, but not on healthy tissue. It is also present on precursor lesions found in: Helicobacter pylori-induced gastritis, intestinal metaplasia and dysplasia of the stomach, ulcerative colitis-related dysplasia and adenomas of the colon, Barrett metaplasia and dysplasia of the esophagus, squamous cell metaplasia and dysplasia of the lung and cervical intraepithelial neoplasia. The unique, growth-dependent, expression of this new CFR-1 isoform makes the PAM-1 antibody an ideal diagnostic tool for the detection of precancerous and cancerous lesions. KW - monoklonale Antikörper KW - Präkanzerosen KW - natürliche Immunität KW - Rezeptor-Expression KW - monoclonal antibody KW - precancerous lesions KW - natural immunity KW - receptor expression Y1 - 2004 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-13463 ER - TY - THES A1 - Weinand, Hanne T1 - Herstellung eines monoklonalen Antikörpers gegen die Endonuklease NmeDI zur Typisierung von Neisseria meningitidis T1 - Development of monoclonal antibodies directed against the endonuclease NmeDI for typing of Neisseria meningitidis N2 - Neisseria meningitidis ist eine der führenden Ursachen von Morbidität und Mortalität sowohl bei Kindern als auch bei Erwachsenen. Die Typisierung ist die Grundlage für die epidemiologische Überwachung der Erkrankung durch Meningokokken. Die Endonuklease NmeDI ist spezifisch für die klonalen Linien des ST-8 und ST-11 Komplex Meninkokken, die mit Erkrankungen der Serogruppe C assoziiert sind. Deshalb wurde für die rasche Identifizierung von Stämmen dieser Linien ein monoklonaler Antikörper entwickelt. Der Antikörper erkennt spezifisch die ST-8 und ST-11 Komplex Meningokokken in Western-Blot und Dot-Blot. Er wird mitlerweile routinemäßig im Nationalen Referenzzentrum für Meningokokken zur Identifizierung der Linien ohne zusätzliche Anwendung der Multilokus Sequenz Typisierung (MLST) eingesetzt. N2 - Neisseria meningitidis is a leading cause of morbidity and mortality in children and adolescents. Typing is essential for epidemiological surveillance of meningococcal disease. The endonuclease NmeDI is specific to the clonal lineages ST-8 and ST-11 complex associated with serogroup C disease. Therefore, a monoclonal antibody was developed for rapid identification of strains belonging to these lineages. The antibody specifically recognized ST-8 and ST-11 complex meningococci in Western blots and dot blots. It is now routinely used at the German National reference centre for meningococci for presumptive identification of the lineages without multilocus sequence typing. KW - Herzmuskel KW - Durchblutungsmessung KW - NMR-Tomographie KW - Neisseria meningitidis KW - monoklonale Antikörper KW - NmeDI KW - Typisierung KW - Neisseria meningitidis KW - monoclonal antibodies KW - NmeDI KW - typing Y1 - 2005 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-12878 ER - TY - THES A1 - Geis, Tanja T1 - Molekularbiologische und immunologische Untersuchungen zu klinisch relevanten immunodominanten Antigenen von Methicillin-resistenten Staphylococcus aureus-Bakterien (MRSA) für eine Antikörpertherapie T1 - Molecular and immunological characterization of immunodominant antigens of MRSA N2 - Zusammenfassung: Staphylococcus aureus ist einer der häufigsten Erreger von nosokomialen Infektionen. Die grampositiven in Haufen angeordneten kokkoiden Bakterien verursachen neben harmlosen lokal-oberflächlichen Hautinfektionen auch gefürchtete lebensbedrohliche Systeminfektionen. Ein großes Problem in der Therapie von S. aureus-Infektionen stellen die zunehmenden Multiresistenzen dieses Erregers dar. Die Entwicklung neuer Antibiotika reicht hierbei auf Dauer oft nicht aus, da immer wieder neue Resistenzen der Bakterien zu erwarten sind. Es besteht daher dringender Bedarf an der Entwicklung alternativer Therapieformen im Kampf gegen multiresistente Problemkeime wie S. aureus. Eine Möglichkeit besteht in der Immuntherapie, zum Beispiel durch Gewinnung von monoklonalen Antikörpern gegen geeignete Targetstrukturen von S. aureus. In den beiden immundominanten Antigenen IsaA und IsaB scheinen solche geeigneten Angriffsstrukturen gefunden zu sein. In dieser Arbeit wurde eine IsaB-Mutante hergestellt und nachfolgend phänotypisch charakterisiert. Diese Arbeiten bilden die Grundlage für die Aufklärung der Funktion von IsaB. Weiterhin sollte ein humaner monoklonaler Antikörper gegen IsaA generiert werden. Zur Testung der Antigenspezifität war es notwendig einen anti-IsaA-spezifischen ELISA zu entwickeln. Durch die Fusion der Hybridomzelllinie HAB mit B-Lymphozyten aus lymphatischem Gewebe septikämischer Patienten sollten Fusionszellen gewonnen werden, die spezifische anti-IsaA-Antikörper produzieren. Durch den Einsatz einer humanen Hybridomzelllinie sollten Kreuzspezies-Reaktionen, wie sie bei murinen therapeutischen Antikörpern beobachtet wurden, ausgeschaltet werden. Es wurden mehrere Fusionen mit lymphatischem Material (Lymphknoten, Blut-B-Lymphozyten) durchgeführt. Eine spezifische Antikörperproduktion blieb hierbei jedoch aus. Ein anti-IsaA-spezifischer ELISA konnte auf der Grundlage polyklonaler anti-IsaA-Antikörper aus immunisierten Kaninchen erfolgreich etabliert werden. Der ELISA zeigte die höchste Spezifität bei einer Antigenbeschichtung von 2 µg/ml IsaA und einer optimalen Primärantikörperkonzentration von 1 : 25600. In einem weiteren Teil der Arbeit sollte die Spezifität des polyklonalen Antikörpers und das Vorkommen von IsaA bei verschiedenen Staphylococcus aureus-Stämmen und anderen Bakterienspezies getestet werden. Dazu wurde mittels Western-Blot die Expression von IsaA untersucht. Ergebnis dieser Untersuchung war, dass IsaA unabhängig von der Herkunft, vom Infektionstyp oder Resistenzeigenschaften von allen S. aureus-Isolaten exprimiert wird. Von den anderen untersuchten Bakteriespezies zeigte der IsaA-spezifische polyklonale Antikörper auch eine Reaktion gegen S. haemolyticus, S. hominis, S. lugdunensis, S. warnerii und S. cohnii. Ob diese Staphylokokkenarten ein IsaA-homologes Protein mit konservierten Domänen exprimieren, das mit dem Antiserum kreuzreagiert, müssen zukünftige Untersuchungen zeigen. Die Herstellung der IsaB-Mutante erfolgte durch Konstruktion eines Inaktivierungsplasmides (pTG1), in dem eine Erythromycinkassette zwischen ein „upstream“- und „downstream“-Fragment kloniert wurde. Als Grundlage diente der temperatursensitive „shuttle“-Vektor pBT2, der bei erhöhter Temperatur in S. aureus nicht weiter replizieren kann und dadurch homologe Fragmente auf dem Vektor mit genomischen Abschnitten rekombinieren. Die erfolgreicher Herstellung der isaB-Mutante wurde im Southern-Blot überprüft. Die Mutante wurde verschiedenen vergleichenden Experimenten mit dem Wildtyp unterzogen, um Informationen über die mögliche Funktion des Targetproteins IsaB im Hinblick auf Wachstum und Virulenz für S. aureus zu gewinnen. Die Wachstumsexperimente ergaben einen deutlichen Unterschied im Wachstumsverhalten der Mutante im Vergleich zum Wildtyp. Da die Mutante deutlich schneller wuchs als der Wildtyp scheint IsaB wichtig für das Wachstum von S. aureus zu sein. In vitro-Experimente zur Testung von möglichen in vivo-Umwelteinflüssen bzw. Stressfaktoren auf das Wachsum der Stämme erfolgten mittels Zusetzung von Glucose und NaCl. Hier zeigte sich ein deutlicher Wachstumsvorteil des Wildtyps gegenüber der isaB-Mutante, so dass unter extremen Umweltbedingungen IsaB S. aureus ein besseres Wachsen ermöglicht. In weiteren Experimenten wurden das Hämolyse- und Proteolyseverhalten der Mutante im Vergleich zum Wildtyp untersucht. IsaB scheint Einfluss auf die Expression von Hämolysinen und Proteasen zu haben, die wichtige Virulenzfaktoren von S. aureus sind. Die Untersuchungen zur Bestimmung der minimalen Hemmkonzentration (MHK) von Wildtyp und Mutante ergaben ebenfalls Unterschiede für verschiedene Antibiotika, so dass IsaB Einfluss auf die Antibiotikaempfindlichkeit zu nehmen scheint. Die in dieser Arbeit erzielten Ergebnisse verdeutlichen die prinzipielle Eignung von IsaB als Targetprotein für eine Antikörpertherapie bei lebensbedrohlichen S. aureus-Infektionen. N2 - Summary: Staphylococcus aureus is one of the most frequent causes of nosocomial infections. The spectrum of diseases ranges from self limiting local infections of the skin to feared life-threatening systemic infections. The increasing rate of multi-resistant S. aureus strains represents a serious problem in the therapy of infections due to S. aureus. In addition to the development of new antibiotics, it is very important to develop alternative forms of therapy in the fight against multi-resistant bacteria, such as S. aureus. As an alternative, immuno-therapeutical methods can be developed, for example the use of monoclonal antibodies against target elements of S. aureus. A prerequisite for the development of therapeutical antibodies is the identification of immuno-dominant antigens which should preferentially be located on the cell surface of the pathogen or being secreted proteins. Recently, two immunodominant antigens named IsaA and IsaB have been identified which seem to be suitable structures for an antibody-based immuno-therapeutical approach. To learn more about the function of the immunodominant antigens and to evaluate the role in diseases caused by S. aureus in this work an isaB-mutant was constructed and phenotypically characterized. Moreover, a human monoclonal antibody against IsaA should be generated. For testing the specificity of monoclonal antibodies, it was necessary to develop an anti-IsaA-specific ELISA. By fusion of the human heteromyeloma cell line HAB-1 with B-lymphocytes from lymphatic material of patients with sepsis anti-IsaA producing hybridoma clones should be generated and later on tested in different models. By application of the human heteromyeloma cell line cross-reactions of species, as they were observed with murine antibodies, can be circumvented. In this work, several fusions of different lymphatic material were accomplished. However, specific anti-IsaA producing antibodies could not be generated. Furthermore, an anti-IsaA-specific ELISA could successfully be established on the basis of polyclonal anti-IsaA-antibodies from immunized rabbits. The ELISA showed the highest specificity at an antigen-coating of 2 µg/ml of IsaA and an optimal primary antibody concentration of 1:25600. To evaluate the expression of IsaA protein within the species S. aureus and to test the specificity of the antibody Western blot experiments were performed using different S. aureus strains, strains from other staphylococcal species and also non-staphylococcal isolates. These experiments reveal that IsaA is specifically expressed by all S. aureus strains tested, independently of the origin of the strains and regardless the type of infection the strains have caused or the type of resistance they do express. The isaB-mutant was created via constructing an inactivating plasmid (pTG1), in which the erythromycin resistance cassette ermB was cloned between an upstream and downstream fragment of isaB in the temperature-sensitive shuttle-vector pBT2, which cannot replicate in S. aureus at higher temperatures (42°C) facilitating homologous recombination with homologous sequences in the genome. The successful construction of the isaB-mutant was proven by Southern blot hybridization. Moreover, the mutant was submitted to different comparative experiments with the wildtype, in order to get information about the possible function of the target protein IsaB. Growth experiments have clearly demonstrated a faster growth behaviour of the isaB-mutant cells compared to the wildtype. However, in the presence of high salt and glucose concentrations the wildtype grew much faster suggesting a role of IsaB in growth under extreme environmental conditions. The results of this work clearly support the idea of using IsaB as a target protein for immuno-therapy against life-threatening infections due to S. aureus. KW - MRSA KW - monoklonale Antikörper KW - immunodominante Antigene KW - ELISA KW - Immuntherapie KW - MRSA KW - monoclonal antibodies KW - immunodominant antigens KW - ELISA KW - immuntherapy Y1 - 2005 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-18108 ER - TY - THES A1 - Bittner, Thomas T1 - Immunhistologische Charakterisierung immunkompetenter Zellen in Plattenepithelkarzinomen des oberen Aerodigestivtraktes T1 - Immunohistochemical characterisation of immunocompetent cells in squamous cell carcinomas of the upper aerodigestive tract N2 - Ziel der vorliegenden Studie war es, die Beziehung zwischen Expression der Basalmembran und der damit einhergehen Veränderung des Immunzelleninfiltrates zu untersuchen. Eine Reihe von 23 Plattenepithelkarzinomen des Larynx und Hypopharynx wurden lichtmikroskopisch untersucht. Hierzu wurde eine immunhistochemischen Färbung verwendet mit monoklonalen Antikörpern gegen folgende Membranantigene: CD 1a, CD 4, CD 8, Pan B, CD 14, ICAM 1, LFA, HLA-DR, Kollagen 4. Die immunhistochemische Analyse wurde bezogen auf den Differenzierungsgrad des Tumors, definiert durch die Ausprägung der Basalmembran. Epithel und Stroma wurden getrennt ausgezählt. Der Verlust der Basalmembran wurde von einer Veränderung in der Zusammensetzung des Immunzelleninfiltrates begleitet: HLA-DR und LFA nahm in beiden Kompartimenten ab. Pan B und CD 14 zeigten eine Parallelität im Färbeverhalten. Pan B zeigte die stärkste Färbung in Plattenepithelkarzinomen mit annähernd ununterbrochener Basalmembran. CD 8 zeigte die stärksteFärbung in Plattenepithelkarzinomen mit lückenhafter, aber noch vorhandener Basalmembran. Die CD 8 positiven Zellen zeigten stellenweise engen Kontakt zur Basalmembran, stellenweise keimzentrumsähnliche Anordnungen. Wir schlussfolgern, dass bei gut differenzierten Tumoren das B-Zell System, bei mäßig differenzierten das T-Zell System eine gewisse Rolle spielt. Der Übergangszone Tumor-Stroma scheint eine besondere immunologische Bedeutung zu zukommen. N2 - The objective of the present study was to evaluate the relationship between the expression of the basement Membrane (BM) in SCC and the relative proportions of selective immune cell populations. A series of 23 SCC of the Larynx and the Hypopharynx was assessed by light microscopy and using immunohistochemical staining with monoclonal antibodies directed against the following cell surface antigens: CD 1a, CD 4, CD 8, Pan B, CD 14, ICAM 1, LFA, HLA-DR, Collagen 4. Immunhistochemical analysis of the tumor infiltrating cells was performed and correlated with the transformation level as defined by the grade of expression of BM. The loss of BM was accompanied by a change in immune infiltrate: HLA-DR and LFA decreased in both compartiments. The B cells stained in parallel with CD 14 positive cells. Pan B showed the highest levels in SCC with a nearly continous BM. CD 8 peaked in tumors with a leaky but still present BM. The CD 8 cells showed sometimes tight junction to the BM, sometimes formations similar to germinal centers. We conclude that in well differentiated SCC the B cell system plays a certain role, in middle differentiated the T cell system. The epithelio-stromal junction zone seems to play an important immunologic role. KW - Plattenepithelkarzinom KW - immunkompetente Zellen KW - monoklonale Antikörper KW - Immunantwort KW - squamous cell carcinoma KW - immunocompetent cells KW - monoclonal antibodies KW - immune response Y1 - 2005 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-12087 ER - TY - THES A1 - Langenhan, Ronny T1 - Identifizierung immunodominanter antigener Strukturen von Methicillin-resistenten Staphylococcus aureus (MRSA) mit Hilfe einer Expressionsgenbank T1 - Identification immunodominant and antigenic structures of methicillin resistant Staphylococcus aureus (MRSA) with an expression library N2 - Infektionen durch MRSA können aufgrund der zunehmenden Therapieresistenz der Erreger ernsthafte Verläufe zeigen. Daher ist die Entwicklung alternativer Behandlungsstrategien ein Ziel der aktuellen Infektionsforschung. Ein vielversprechender Ansatz liegt in der Verwendung pathogenspezifischer, monoklonaler Antikörper gegen immunodominante Antigene der Erreger. Durch die Fortschritte in der Genomforschung der vergangenen Jahre ist nun die Analyse der Gesamtheit der Pathogenitätsfaktoren eines bakteriellen Erregers möglich. Durch eine funktionelle Genomanalyse mit Hilfe immunologischer Detektionssysteme können antigene Bakterienzellstrukturen identifiziert werden. Daraus abgeleitete Targetstrukturen sollen die Grundlage bilden für die Entwicklung spezifischer humaner Antikörper, die in alternativen Therapieansätzen zusätzlich zur antimikrobiellen Chemotherapie zukünftig an Bedeutung gewinnen werden. In der vorliegenden Arbeit wurde eine Expressionsgenbank eines MRSA-Stammes hergestellt und mittels Patientenseren nach immunodominanten Antigenen gesucht. Die aus einem Partialverdau der genomischen DNA gewonnenen Fragmente wurden in einen Expressionsvektor kloniert. Die so hergestellte Genbank des ausgewählten MRSA-Stammes A 134 umfasst ca. 10000 Klone. Ein vergleichendes Screening der Genbank erfolgte mit dem Serum eines Patienten mit einer MRSA-Sepsis und mit dem Serum einer negativen Kontrollperson. Die DNA-Inserts der immunoreaktiven Klone wurden sequenziert und durch Datenbankvergleiche identifiziert. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen deutlich, dass der gewählte Ansatz geeignet ist, um immunodominante Antigene, die während einer Sepsis exprimiert werden, zu identifizieren. Die in der vorliegenden Arbeit gefundenen putativen immunodominanten Antigenstrukturen umfassen ein Holin, die Amidase LytA, Faktoren des isd-Genclusters, der für die Cadmiumresistenz wichtige Transporter CadA, unbekannte Proteine der Staphylokokken-Pathogenitätsinsel SaPI3 und Protein A. Interessanterweise wurden durch den methodischen Ansatz vorwiegend Proteine auf mobilen genetischen Elementen identifiziert. Diese Ergebnisse legen nahe, dass während einer S. aureus-Infektion nicht nur Gene für das Wachstum der Zellen und Virulenzfaktoren wie Toxine und Adhäsine, sondern auch mobile Elemente exprimiert werden. Die Bedeutung dieser Prozesse für das Infektionsgeschehen ist allerdings bislang unbekannt und zukünftige Untersuchungen müssen zeigen, inwieweit diese Elemente für die Pathogenese von Bedeutung sind. Die in dieser Arbeit identifizierten Antigene müssen auch in zukünftigen Arbeiten durch Subklonierung weiter charakterisiert werden. Eine weitere interessante Beobachtung ist die Identifizierung eines Bakteriophagens, der in das isd-Gencluster inserierte, das für die Aufnahme von Eisen eine Bedeutung besitzt. Inwieweit durch die Insertion des Phagens die Eisenaufnahme in dem klinischen Isolat gestört wird, müssen zukünftige Studien zeigen. Die positive Reaktion des Patientenserums mit dem Protein A ist am wahrscheinlichsten auf die Antiköperbindung am FC-Fragment zurückzuführen. Es ist jedoch auch möglich, dass während der Infektion verstärkt Protein A gebildet wird, das durch die Bindung von Antikörpern am Fc-Teil eine immunsuppressive Wirkung durch die Neutralisierung opsonisierender und Toxin-inaktivierender Antikörper besitzt. Durch die Sequenzierung und Datenbankanalyse der positiven Klone konnte ein erster Überblick über immunodominante Antigene von S. aureus erhalten werden. Da auf den Insertelementen meist mehrere putative Antigene kodiert sind, müssen in zukünftigen Arbeiten die identifizierten Insertelemente subkloniert und damit weiter charakterisiert werden. Dadurch sollte es möglich sein, die immunogenen Strukturen zu erkennen und diese für die Entwicklung monoklonaler Antikörper zu nutzen. N2 - Infections caused by methicillin resistant Staphylococcus aureus (MRSA) are increasingly difficult to threat due to the presence of multiple antibiotic resistance traits. Therfore, the developemet of alternative strategies are urgently demanded to combat severe staphylococcal infections. Immunotherapy has become a promising approach using specific, monoclonal antibodies against defined immunodominant structures (antigens) of the bacterium. The recent progress of genome-based research of bacterial pathogens allows now the global analysis of factors involved in pathogenicity. The identification of such virulence-associated factors might result in the development of specific antibodies against bacterial pathogens which may administered supplementary to antibiotics increasing the success of of a therapy. In this study an expression library of an MRSA strain was constructed. For this purpose, genomic DNA of a MRSA strain was digested with Sau3A and DNA fragments of 3 to 10 kb were ligated into the expression vector ZAP-express. The gene library encompasses approximately 10,000 clones. To detect specific antigenic structures the expression library was screened by using human sera of MRSA septiceamic patients and sera of asymptomatically colonized individuals. Clones which specifically reacted with the patients sera were further analyzed by DNA-sequencing and BLAST analysis. Several staphylococcal antigenic and immunodominant structures were identified including a putative holin and a gene with strong homology to the amidase lytA. Both proteins may phage-derived as they show significant similarity to a range of phage proteins. In addition, genes of the isd-locus reacted with the immunsera. These genes encode proteins which are important for transport of iron into the cell. Furthermore, a cadmium resistance factor (cadA), unknown proteins localized on Staphylococcus aureus pathogenicity island 3 (SaPI3) and protein A showed a positive reaction with the immune sera. Interestingly, almost all proteins identified are associated with mobile genetic elements. The results of the study suggests that proteins encoded on mobile genetic elements are indeed expressed during infection which in turn are recognized by the immune system resulting in the production of specific antibodies. To what extend these antibodies contribute to a successful defence of staphylococcal cells is currently not known and subject of ongoing studies. Moreover, the antigenic and immunodominant structures identified in this study have to subcloned to characterize their immunoreactive potential. The positive reaction of the patient serum with protein A is probably caused by the antibody-binding capacity of the protein to the FC-fragment of antibodies. An alternative theoretical opportunity could be that an acute S. aureus infection causes a massive production of protein A that subsequently consume antibodies due to binding of the FC-Fragment. The sum of these events may cause a dramatic immunsuppressive effect. In conclusion, several putative immunodominant structures have been identified being the basis for further studies to assess whether or not these structures may serve as targets of an antibody-based therapy of infections caused by S. aureus. KW - MRSA KW - monoklonale Antikörper KW - Expressionsgenbank KW - Pathogenitätsinsel KW - Bakteriophagen KW - MRSA KW - monoclonal antibodies KW - expression library KW - pathogenicity island KW - bacteriophage Y1 - 2005 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-13719 ER - TY - THES A1 - Bittner, Thomas T1 - Immunhistologische Analyse Chemokinrezeptor positiver Zellen in der humanen decidua basalis der Frühschwangerschaft T1 - Immunohistochemical Analysis of chemokine receptors bearing cells in human decidua basalis of early pregnancy N2 - Das Ziel dieser Arbeit war, eine qualitative Darstellung des Verteilungsmusters von Chemokinrezeptoren in der Dezidua der Frühschwangerschaft. Ferner sollte eine morphologische Zuordnung positiver Zellen zu den einzelnen Populationen (Cytotrophoblasten CTB, Stromazellen, Leukozyten) stattfinden. Eine Reihe von 15 Deciduageweben aus legaler Abtreibung wurde lichtmikroskopisch untersucht. Hierzu wurde eine immunhistochemischen Färbung verwendet mit monoklonalen Antikörpern gegen folgende Antigene: CCR6, CCR7, CCR9,CXCR2,CXCR3, CXCR4 und Panzytokeratin Die grösste Anzahl von CXCR4 Rezeptoren zeigten Zytotrophoblasten an der Spitze von auswachsenden Zellsäulen der Plazenta und an der Oberfläche der Dezidua. Im Gegensatz dazu waren die CTB an der Basis der Zellsäulen und in den tiefen Schichten der Dezidua deutlich schwächer gefärbt.. Diesem Rezeptor kommt wohl eine entscheidende Rolle bei der Chemotaxis, Zellproliferation und dem infiltrativen Wachstum zu. In den von uns gefärbten Schnitten zeigte keine Population von Trophoblasten positive Anfärbungen für CCR7. Das Färbebild von CCR9 zeigte bei uns unerwartet eine Kernfärbung der invasiven CTB. Es ließ sich eine sehr geringe Rezeptorausstattung der Lymphozyten feststellen.. CXCR 3 und CCR 6 jedoch zeigten in der Mehrzahl der Fälle positive Lymphozyten. Auffallend war, dass diese jedoch deutlich schwächer färbten als die vergleichbaren Zellen in der positiv Kontrolle gefärbte Tonsille. Die Dezidua in der Frühschwangerschaft scheint also durch das Herunterregulieren von Chemokinrezeptoren auf immunkompetenten Zellen ein Raum der Immuntoleranz zu sein. N2 - The objective of the present study was to represent the distribution of chemokine receptors in the deciduas of early pregnancy and attach them morphologically to the different subsets of cell types. A series of 15 deciduas from legal abortion was assessed by light microscopy and using immunohistochemical staining with monoclonal antibodies directed against the following antigens: CCR6, CCR7, CCR9,CXCR2,CXCR3, CXCR4 and cytokeratin. The highest level of CXCR4 receptors showed cytotrophoblasts (CTB) on the top of outgrowing cell columns of the placenta and in the superficial layers of decidual tissue. However CXCR4 was scarcely expressed from CTB at the base of cell columns and in deeper layers of deciduas. CXCR4 receptor seems to play an important role in chemotaxis, proliferation and infiltrative growing. In our samples no subpopulation of CTB showed expression of CCR7 receptors. Invasive CTB showed nuclear staining with CCR9. Lymphocytes were remarkably low endowed with receptors. But CCR6 and CXCR3 stained positive in the majority of lymphocytes. However they showed remarkably lower levels than lymphocytes do in tonsilles. Decidua in early pregnancy seems to be a site of immuntolerance by regulating down chemokine receptors on the surface of immunocompetent cells. KW - Immunhistochemie KW - monoklonale Antikörper KW - Chemokine KW - decidua basalis KW - Chemokinreceptor KW - Immunohistochemistry KW - monoclonal antibody KW - chemokine KW - decidua basalis KW - chemokine recepteo Y1 - 2007 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-22852 ER - TY - THES A1 - Halder, Partho T1 - Identification and characterization of synaptic proteins of Drosophila melanogaster using monoclonal antibodies of the Wuerzburg Hybridoma Library T1 - Identifikation und Charakterisierung von synaptischen Proteinen von Drosophila melanogaster mit Hilfe von monoklonalen Antikörpern der Würzburger Hybridoma-Bibliothek N2 - For a large fraction of the proteins expressed in the human brain only the primary structure is known from the genome project. Proteins conserved in evolution can be studied in genetic models such as Drosophila. In this doctoral thesis monoclonal antibodies (mAbs) from the Wuerzburg Hybridoma library are produced and characterized with the aim to identify the target antigen. The mAb ab52 was found to be an IgM which recognized a cytosolic protein of Mr ~110 kDa on Western blots. The antigen was resolved by two-dimensional gel electrophoresis (2DE) as a single distinct spot. Mass spectrometric analysis of this spot revealed EPS-15 (epidermal growth factor receptor pathway substrate clone 15) to be a strong candidate. Another mAb from the library, aa2, was already found to recognize EPS-15, and comparison of the signal of both mAbs on Western blots of 1D and 2D electrophoretic separations revealed similar patterns, hence indicating that both antigens could represent the same protein. Finally absence of the wild-type signal in homozygous Eps15 mutants in a Western blot with ab52 confirmed the ab52 antigen to be EPS-15. Thus both the mAbs aa2 and ab52 recognize the Drosophila homologue of EPS-15. The mAb aa2, being an IgG, is more suitable for applications like immunoprecipitation (IP). It has already been submitted to the Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB) to be easily available for the entire research community. The mAb na21 was also found to be an IgM. It recognizes a membrane associated antigen of Mr ~10 kDa on Western blots. Due to the membrane associated nature of the protein, it was not possible to resolve it by 2DE and due to the IgM nature of the mAb it was not possible to enrich the antigen by IP. Preliminary attempts to biochemically purify the endogenously expressed protein from the tissue, gave promising results but could not be completed due to lack of time. Thus biochemical purification of the protein seems possible in order to facilitate its identification by mass spectrometry. Several other mAbs were studied for their staining pattern on cryosections and whole mounts of Drosophila brains. However, many of these mAbs stained very few structures in the brain, which indicated that only a very limited amount of protein would be available as starting material. Because these antibodies did not produce signals on Western blots, which made it impossible to enrich the antigens by electrophoretic methods, we did not attempt their purification. However, the specific localization of these proteins makes them highly interesting and calls for their further characterization, as they may play a highly specialized role in the development and/or function of the neural circuits they are present in. The purification and identification of such low expression proteins would need novel methods of enrichment of the stained structures. N2 - Für einen Großteil der Proteine, die im menschlichen Gehirn exprimiert werden, ist lediglich die Primärstruktur aus dem Genomprojekt bekannt. Proteine, die in der Evolution konserviert wurden, können in genetischen Modellsystemen wie Drosophila untersucht werden. In dieser Doktorarbeit werden monoklonale Antikörper (mAk) aus der Würzburger Hybridoma Bibliothek produziert und charakterisiert, mit dem Ziel, die erkannten Proteine zu identifizieren. Der mAk ab52 wurde als IgM typisiert, das auf Western Blots ein zytosolisches Protein von Mr ~110 kDa erkennt. Das Antigen wurde durch zwei-dimensionale Gelelektrophorese (2DE) als einzelner Fleck aufgelöst. Massenspektrometrische Analyse dieses Flecks identifizierte dass EPS-15 (epidermal growth factor receptor pathway substrate clone 15) als viel versprechenden Kandidaten. Da für einen anderen mAk aus der Bibliothek, aa2, bereits bekannt war, dass er EPS-15 erkennt, wurden die Western-Blot-Signale der beiden Antikörper nach 1D und 2D Trennungen von Kopfhomogenat verglichen. Die Ähnlichkeit der beiden Muster deuteten darauf hin, dass beide Antigene dasselbe Protein erkennen. Das Fehlen des Wildtyp-Signals in homozygoten Eps15 Mutanten in einem Western Blot mit mAk ab52 bestätigten schließlich, dass EPS-15 das Antigen zu mAk ab52 darstellt. Demnach erkennen beide mAk, aa2 und ab52, das Drosophila Homolog zu EPS-15. Da mAk aa2 ein IgG ist, dürfte er für Anwendungen wie Immunpräzipitation (IP) besser geeignet sein. Er wurde daher bereits bei der Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB) eingereicht, um ihn der ganzen Forschergemeinde leicht zugänglich zu machen. Der mAk na21 wurde ebenfalls als IgM typisiert. Er erkennt ein Membran assoziiertes Antigen von Mr ~10 kDa auf Western Blots. Aufgrund der Membranassoziierung des Proteins war es nicht möglich, es in 2DE aufzulösen und da es sich um ein IgM handelt, war eine Anreicherung des Antigens mittels IP nicht erfolgreich. Vorversuche zur biochemischen Reinigung des endogenen Proteins aus Gewebe waren Erfolg versprechend, konnten aber aus Zeitmangel nicht abgeschlossen werden. Daher erscheint eine biochemische Reinigung des Proteins für eine Identifikation durch Massenspektrometrie möglich. Eine Reihe weiterer mAk wurden hinsichtlich ihrer Färbemuster auf Gefrierschnitten und in Ganzpräparaten von Drosophila Gehirnen untersucht. Allerdings färbten viele dieser mAk sehr wenige Strukturen im Gehirn, so dass nur eine sehr begrenzte Menge an Protein als Startmaterial verfügbar wäre. Da diese Antikörper keine Signale auf Western Blots produzierten und daher eine Anreicherung des Antigens durch elektrophoretische Methoden ausschlossen, wurde keine Reinigung versucht. Andererseits macht die spezifische Lokalisation dieser Proteine sie hoch interessant für eine weitere Charakterisierung, da sie eine besonders spezialisierte Rolle in der Entwicklung oder für die Funktion von neuralen Schaltkreisen, in denen sie vorkommen, spielen könnten. Die Reinigung und Identifikation solcher Proteine mit niedrigem Expressionsniveau würde neue Methoden der Anreicherung der gefärbten Strukturen erfordern. KW - Taufliege KW - Synapse KW - Proteine KW - Monoklonaler Antikörper KW - synaptische Proteine KW - monoklonale Antikörper KW - Drosophila melanogaster KW - synaptic proteins KW - monoclonal antibodies Y1 - 2011 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-67325 N1 - korrigierte Ausgabe der Arbeit aus dem Jahr 2022 unter: https://doi.org/10.25972/OPUS-27020 ER - TY - THES A1 - Nagl, Patrick Alexander T1 - Chemistry meets Cancer Immunotherapy: Synthesis and Characterization of Hapten-like Compounds for Selective Immunotherapy T1 - Chemie trifft Krebsimmuntherapie: Synthese und Charakterisierung von hapten-artigen Verbindungen für selektive Immuntherapie N2 - Chimeric antigen receptors (CARs) are able to specifically direct T cells to tumor antigens and therapy with anti-CD19 CARs has already cured cancer patients with B-cell lymphomas who have undergone long-term therapy non-successful. Despite this impressive result, the therapy is currently only approved as a last treatment option for blood cancers due to its life-threatening deficiencies. For patient safety and to enable additional application such as the treatment of solid tumors, CAR-T cells must be controllable, e. g. by chemically programmable CARs (cpCARs) regulated by hapten-like compounds. This thesis reports the synthesis and characterization of such hapten-like compounds. In the first step, seven different warheads with two different spacers were bound to biotin in order to find a suitable warhead for programming the cpCAR. In a second step, synthetic routes for the three pharmacophores folate, c(RGD), and an RGD peptidomimetic were developed. The routes allow the modification of the pharmacophores with one of the warheads from the first step. CuAAC was chosen as a bioorthogonal approach to link pharmacophores and warheads. In total, three different pharmacophores were modified with the 1,3-diketone motif of compound 21 leading to 112, 113 and 128. Activation of the T-cell signaling cascade was tested after binding of these hapten-like compounds to the cpCAR in the presence of suitable target structures. For 112, only a slight, non-significant, activation of the T-cell signaling cascade was observed, whereas for 113 and 128, a significant activation of the T-cell signaling cascade was observed. The poor solubility of the folate compounds led to alternative strategies. Folic acid was exchanged by pteroic acid and the bifunctional, linear compounds were enlarged to trifunctional dendrimers. Besides the reported regioisomer in 112, a second one, which was not reported to date, occurred by the cyclization of the linear RGD pentapeptide leading to 113. After the reported synthesis of an RGD peptidomimetic analogous to 128 could not be reproduced, a new synthetic route was developed. It also consists of 17 steps, but reduces the number of linear steps from 13 to 10. Moreover, the developed route contains an asymmetric hydrogenation step and is, compared to the published one, more flexible by the use of the copper-catalyzed azide-alkyne cycloaddition (CuAAC). In addition, an unknown reaction was observed. Instead of the formation of a Schiff base in the reductive amination of 129, an insertion of propargylamine occurred forming 131. The reaction is almost quantitative and in high purity. After requiring no purification, it could be predestined for industrial purposes, such as the synthesis of N-functionalized 1,2-dihydroquinolines or as a building block with various orthogonal functional groups. Besides the sulfonamide 16, the diketone (21, 27, 31) and lactam compounds (39 – 41), experiments on adapter molecules with further warheads were performed. In the synthesis of a proadapter approach, in which the warhead is formed only after the retro-aldol reaction catalyzed by the mAb, 6 of 10 steps were successfully performed. A newly developed synthesis to keto-sulfonyl and keto-sulfoxide compounds could not be completed but was performed on a small scale to the point of keto-sulfonyl and keto-sulfoxide. Furthermore, a universal synthesis route was designed to allow the introduction of the warhead at the end of the synthesis by acylation. Thus, after 5 shared steps, 3 of them in quantitative yield, different warheads may be introduced. Moreover, this also facilitates the purification and the analysis of the compounds by the absence of tautomerism or labile groups. However, the acylation experiments were not successful with either the acid cyanide or the Weinreb amide. In summary, this thesis has proven that the 1,3-diketone motif is a suitable warhead for programming the cpCAR, which was developed by Hudecek et al. (unpublished data). The hapten-like compounds 112, 113 and 128 simultaneously bind to integrin ${\alpha}_v{\beta}_3$ and the cpCAR activating the T-cell signaling cascade. The modular synthesis strategy and the use of the bioorthogonal CuAAC allow straightforward access to these valuable immunotherapeutics but revealed the need for an additional purification step to remove copper ions. N2 - Chimäre Antigen-Rezeptoren (CARs) ermöglichen es T-Zellen spezifisch auf Tumorantigene auszurichten. Die Therapie mit anti-CD19 CARs konnte bereits eindrucksvolle Ergebnisse liefern und austherapierte Krebspatienten mit B-Zell-Lymphomen heilen. Durch zum Teil lebensbedrohliche Nebenwirkungen ist sie aktuell jedoch nur als letzte Therapiemöglichkeit zugelassen. Um Patienten zu schützen und ihr Einsatzgebiet zu erweitern, beispielsweise zur Behandlung von soliden Tumoren, müssen CAR-T-Zellen kontrollierbar sein, z. B. durch chemisch programmierbare CARs (cpCARs), die durch hapten-artigen Verbindungen reguliert werden. Die vorliegende Arbeit beschreibt die Synthese und Charakterisierung von solchen Verbindungen. Dafür wurden im ersten Schritt sieben verschiedene reaktive Gruppen mit zwei unterschiedlichen Spacern an Biotin gebunden, um eine geeignete reaktive Gruppe für die Programmierung des cpCARs zu finden. Im zweiten Schritt wurden Syntheserouten für die drei Pharmakophore Folat, c(RGD) und ein RGD-Peptidomimetikum entwickelt. Die Routen ermöglichen es das jeweilige Pharmakophor mit einer der reaktiven Gruppe aus dem ersten Schritt zu modifizieren. Zur Verbindung von Pharmakophor und reaktiver Gruppe, wurde die CuAAC als bioorthogonaler Ansatz gewählt. Insgesamt wurden im Rahmen dieser Arbeit drei verschiedene Pharmakophore mit dem 1,3-Diketon-Motiv von Verbindung 21 modifiziert. Mit den resultierenden Verbindungen 112, 113 und 128 wurde die Aktivierung der T-Zell-Signalkaskade bei Anwesenheit geeigneter Zielstrukturen untersucht. Bei 112 konnte nur eine leichte, nicht signifikante Aktivierung der T-Zell-Signalkaskade beobachtet werden, während bei 113 und 128 eine deutliche Aktivierung der T-Zell-Signalkaskade beobachtet wurde. Die schlechte Löslichkeit der Folatverbindungen führte zu Versuchen Folsäure gegen Pteroinsäure zu tauschen und die linearen Verbindungen zu trifunktionalen, dendrimeren Verbindungen mit weiteren Triethylenglycol-Ketten zu vergrößern. Neben dem publizierten Regioisomer in 112 trat bei der Zyklisierung des linearen RGD-Pentapeptides ein zweites Regioisomer auf, das zu 113 führte. Nachdem die veröffentlichte Syntheseroute eines RGD-Peptidomimetikums, das analog zu 128 ist, nicht reproduziert werden konnte, wurde eine neue Syntheseroute entwickelt. Sie besteht ebenfalls aus 17 Schritten, die Anzahl der linearen Schritte konnte jedoch von 13 auf 10 reduziert werden. Zusätzlich enthält die entwickelte Route einen asymmetrischen Hydrierungsschritt und ist durch den Einsatz der Kupfer-katalysierten Azid-Alkin-Cycloaddition (CuAAC) flexibler als die bereits publizierte Synthese. Während der Entwicklung der Syntheseroute wurde eine Reaktion beobachtet, die in der Literatur bisher nicht bekannt ist. Anstatt der Bildung eines Imins bei der reduktiven Aminierung von 129 kam es zu einer Insertion von Propargylamin, was zu 131 führte. Die Reaktion verläuft dabei nahezu quantitativ und in hoher Reinheit, so dass keine Aufreinigung notwendig ist. Sie könnte somit prädestiniert für industrielle Zwecke sein, wie zum Beispiel die Synthese von N-funktionalisieren 1,2-Dihydrochinolinen oder als Baustein mit mehreren funktionellen Gruppen, die orthogonal zu einander sind. Zusätzlich zum Sulfonamid 16, den Diketon- (21, 27, 31) und Lactamverbindungen (39 – 41), wurden Versuche zu Adaptermolekülen mit weiteren reaktiven Gruppen durchgeführt. Bei der Synthese eines Proadapter-Ansatzes, bei dem die reaktive Gruppe erst nach der vom mAb katalysierten Retroaldolreaktion entsteht, konnten 6 von 10 Schritten erfolgreich durchgeführt werden. Eine neu entwickelte Synthese von Keto-Sulfonyl- und Keto-Sulfoxid-Verbindungen konnte nicht abgeschlossen, aber im kleinen Maßstab bis zum Keto-Sulfonyl bzw. Keto-Sulfoxid durchgeführt werden. Des Weiteren wurde eine universelle Syntheseroute entworfen, um die Einführung der reaktiven Gruppe am Ende der Synthese durch Acylierung zu ermöglichen. So können nach den ersten 5 gemeinsamen Schritten, 3 davon in quantitativer Ausbeute, verschiedene reaktive Gruppen eingeführt werden. Darüber hinaus wird durch die Abwesenheit von Tautomerie oder labilen Gruppen sowohl die Aufreinigung als auch die Analytik der Verbindungen erleichtert. Die Acylierungsversuche waren jedoch weder mit dem Säurecyanid noch mit dem Weinreb-Amid erfolgreich. Zusammenfassend konnte in dieser Arbeit bewiesen werden, dass das 1,3-Diketon-Motiv eine geeignete reaktive Gruppe zur Programmierung des cpCARs ist, der von Hudecek et al. (bisher unveröffentlicht) entwickelt wurde. Es konnte außerdem gezeigt werden, dass die hapten-artigen Verbindungen gleichzeitig an Integrin ${\alpha}_v{\beta}_3$ und den cpCAR binden und die T-Zell-Signalkaskade aktivieren. Die modulare Synthesestrategie und der Einsatz der bioorthogonalen CuAAC für die Herstellung der Verbindungen ermöglichen einen unkomplizierten Zugang zu diesen wertvollen Immuntherapeutika, offenbarten jedoch die Notwendigkeit für einen zusätzlichen Reinigungsschritt zur Entfernung der Kupferionen. KW - Organische Synthese KW - Synthetische Biologie KW - Click-Chemie KW - Peptidsynthese KW - NMR-Spektroskopie KW - chemically programmable KW - chemisch programmierbar KW - CAR T cells KW - monoclonal antibodies KW - CAR T-Zellen KW - monoklonale Antikörper Y1 - 2022 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-211385 ER - TY - BOOK A1 - Halder, Partho T1 - Identification and characterization of synaptic proteins of Drosophila melanogaster using monoclonal antibodies of the Wuerzburg Hybridoma Library T1 - Identifikation und Charakterisierung von synaptischen Proteinen von Drosophila melanogaster mit Hilfe von monoklonalen Antikörpern der Würzburger Hybridoma-Bibliothek N2 - For a large fraction of the proteins expressed in the human brain only the primary structure is known from the genome project. Proteins conserved in evolution can be studied in genetic models such as Drosophila. In this doctoral thesis monoclonal antibodies (mAbs) from the Wuerzburg Hybridoma library are produced and characterized with the aim to identify the target antigen. The mAb ab52 was found to be an IgM which recognized a cytosolic protein of Mr ~110 kDa on Western blots. The antigen was resolved by two-dimensional gel electrophoresis (2DE) as a single distinct spot. Mass spectrometric analysis of this spot revealed EPS-15 (epidermal growth factor receptor pathway substrate clone 15) to be a strong candidate. Another mAb from the library, aa2, was already found to recognize EPS-15, and comparison of the signal of both mAbs on Western blots of 1D and 2D electrophoretic separations revealed similar patterns, hence indicating that both antigens could represent the same protein. Finally absence of the wild-type signal in homozygous Eps15 mutants in a Western blot with ab52 confirmed the ab52 antigen to be EPS-15. Thus both the mAbs aa2 and ab52 recognize the Drosophila homologue of EPS-15. The mAb aa2, being an IgG, is more suitable for applications like immunoprecipitation (IP). It has already been submitted to the Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB) to be easily available for the entire research community. The mAb na21 was also found to be an IgM. It recognizes a membrane associated antigen of Mr ~10 kDa on Western blots. Due to the membrane associated nature of the protein, it was not possible to resolve it by 2DE and due to the IgM nature of the mAb it was not possible to enrich the antigen by IP. Preliminary attempts to biochemically purify the endogenously expressed protein from the tissue, gave 99 promising results but could not be completed due to lack of time. Thus biochemical purification of the protein seems possible in order to facilitate its identification by mass spectrometry. Several other mAbs were studied for their staining pattern on cryosections and whole mounts of Drosophila brains. However, many of these mAbs stained very few structures in the brain, which indicated that only a very limited amount of protein would be available as starting material. Because these antibodies did not produce signals on Western blots, which made it impossible to enrich the antigens by electrophoretic methods, we did not attempt their purification. However, the specific localization of these proteins makes them highly interesting and calls for their further characterization, as they may play a highly specialized role in the development and/or function of the neural circuits they are present in. The purification and identification of such low expression proteins would need novel methods of enrichment of the stained structures. N2 - Für einen Großteil der Proteine, die im menschlichen Gehirn exprimiert werden, ist lediglich die Primärstruktur aus dem Genomprojekt bekannt. Proteine, die in der Evolution konserviert wurden, können in genetischen Modellsystemen wie Drosophila untersucht werden. In dieser Doktorarbeit werden monoklonale Antikörper (mAk) aus der Würzburger Hybridoma Bibliothek produziert und charakterisiert, mit dem Ziel, die erkannten Proteine zu identifizieren. Der mAk ab52 wurde als IgM typisiert, das auf Western Blots ein zytosolisches Protein von Mr ~110 kDa erkennt. Das Antigen wurde durch zwei-dimensionale Gelelektrophorese (2DE) als einzelner Fleck aufgelöst. Massenspektrometrische Analyse dieses Flecks identifizierte dass EPS-15 (epidermal growth factor receptor pathway substrate clone 15) als viel versprechenden Kandidaten. Da für einen anderen mAk aus der Bibliothek, aa2, bereits bekannt war, dass er EPS-15 erkennt, wurden die Western-Blot-Signale der beiden Antikörper nach 1D und 2D Trennungen von Kopfhomogenat verglichen. Die Ähnlichkeit der beiden Muster deuteten darauf hin, dass beide Antigene dasselbe Protein erkennen. Das Fehlen des Wildtyp-Signals in homozygoten Eps15 Mutanten in einem Western Blot mit mAk ab52 bestätigten schließlich, dass EPS-15 das Antigen zu mAk ab52 darstellt. Demnach erkennen beide mAk, aa2 und ab52, das Drosophila Homolog zu EPS- 15. Da mAk aa2 ein IgG ist, dürfte er für Anwendungen wie Immunpräzipitation (IP) besser geeignet sein. Er wurde daher bereits bei der Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB) eingereicht, um ihn der ganzen Forschergemeinde leicht zugänglich zu machen. Der mAk na21 wurde ebenfalls als IgM typisiert. Er erkennt ein Membran assoziiertes Antigen von Mr ~10 kDa auf Western Blots. Aufgrund der Membranassoziierung des Proteins war es nicht möglich, es in 2DE aufzulösen und 101 da es sich um ein IgM handelt, war eine Anreicherung des Antigens mittels IP nicht erfolgreich. Vorversuche zur biochemischen Reinigung des endogenen Proteins aus Gewebe waren Erfolg versprechend, konnten aber aus Zeitmangel nicht abgeschlossen werden. Daher erscheint eine biochemische Reinigung des Proteins für eine Identifikation durch Massenspektrometrie möglich. Eine Reihe weiterer mAk wurden hinsichtlich ihrer Färbemuster auf Gefrierschnitten und in Ganzpräparaten von Drosophila Gehirnen untersucht. Allerdings färbten viele dieser mAk sehr wenige Strukturen im Gehirn, so dass nur eine sehr begrenzte Menge an Protein als Startmaterial verfügbar wäre. Da diese Antikörper keine Signale auf Western Blots produzierten und daher eine Anreicherung des Antigens durch elektrophoretische Methoden ausschlossen, wurde keine Reinigung versucht. Andererseits macht die spezifische Lokalisation dieser Proteine sie hoch interessant für eine weitere Charakterisierung, da sie eine besonders spezialisierte Rolle in der Entwicklung oder für die Funktion von neuralen Schaltkreisen, in denen sie vorkommen, spielen könnten. Die Reinigung und Identifikation solcher Proteine mit niedrigem Expressionsniveau würde neue Methoden der Anreicherung der gefärbten Strukturen erfordern. KW - synaptic proteins KW - Taufliege KW - Synapse KW - Proteine KW - Monoklonaler Antikörper KW - synaptische Proteine KW - monoklonale Antikörper KW - Drosophila melanogaster KW - monoclonal antibodies Y1 - 2022 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-270205 N1 - ursprüngliche Originalausgabe der Dissertation erschienen am 19.01.2012 unter: https://nbn-resolving.org/urn:nbn:de:bvb:20-opus-67325 ER -