TY - JOUR A1 - Gowda, Madhu A1 - Godder, Kamar A1 - Kmieciak, Maciej A1 - Worschech, Andrea A1 - Ascierto, Maria-Libera A1 - Wang, Ena A1 - Francesco M., Marincola A1 - Manjili, Masoud H. T1 - Distinct signatures of the immune responses in low risk versus high risk neuroblastoma JF - Journal of Translational Medicine N2 - Background: Over 90% of low risk (LR) neuroblastoma patients survive whereas less than 30% of high risk (HR) patients are long term survivors. Age (children younger than 18 months old) is associated with LR disease. Considering that adaptive immune system is well developed in older children, and that T cells were shown to be involved in tumor escape and progression of cancers, we sought to determine whether HR patients may tend to show a signature of adaptive immune responses compared to LR patients who tend to have diminished T-cell responses but an intact innate immune response. Methods: We performed microarray analysis of RNA extracted from the tumor specimens of HR and LR patients. Flow cytometry was performed to determine the cellular constituents in the blood while multiplex cytokine array was used to detect the cytokine profile in patients' sera. A HR tumor cell line, SK-N-SH, was also used for detecting the response to IL-1 beta, a cytokines which is involved in the innate immune responses. Results: Distinct patterns of gene expression were detected in HR and LR patients indicating an active T-cell response and a diminished adaptive immune response, respectively. A diminished adaptive immune response in LR patients was evident by higher levels of IL-10 in the sera. In addition, HR patients had lower levels of circulating myeloid derived suppressor cells (MDSC) compared with a control LR patient. LR patients showed slightly higher levels of cytokines of the innate immune responses. Treatment of the HR tumor line with IL-1b induced expression of cytokines of the innate immune responses. Conclusions: This data suggests that adaptive immune responses may play an important role in the progression of HR disease whereas innate immune responses may be active in LR patients. KW - Neural precursor cells KW - Retinoic acid KW - Ifn-gamma KW - Progenitor cells KW - Breast-cancer KW - T-lymphocytes KW - IN-VIVO KW - Differentiation KW - Pathway KW - Activation KW - Neuroblastoma KW - innate immunity KW - adaptive immunity KW - prognostic biomarkers Y1 - 2011 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-135147 VL - 9 IS - 170 ER - TY - THES A1 - Simann, Meike T1 - Aufklärung der Effekte von Fibroblasten-Wachstumsfaktor 1 und 2 auf die Adipogenese und Osteogenese von primären humanen Knochenmark-Stroma-Zellen T1 - Elucidation of fibroblast growth factor 1 and 2 effects on the adipogenesis and osteogenesis of primary human bone marrow stromal cells N2 - Regulating and reverting the adipo-osteogenic lineage decision of trabecular human bone marrow stromal cells (hBMSCs) represents a promising approach for osteoporosis therapy and prevention. Fibroblast growth factor 1 (FGF1) and its subfamily member FGF2 were scored as lead candidates to exercise control over lineage switching processes (conversion) in favor of osteogenesis previously. However, their impact on differentiation events is controversially discussed in literature. Hence, the present study aimed to investigate the effects of these FGFs on the adipogenic and osteogenic differentiation and conversion of primary hBMSCs. Moreover, involved downstream signaling mechanisms should be elucidated and, finally, the results should be evaluated with regard to the possible therapeutic approach. This study clearly revealed that culture in the presence of FGF1 strongly prevented the adipogenic differentiation of hBMSCs as well as the adipogenic conversion of pre-differentiated osteoblastic cells. Lipid droplet formation was completely inhibited by a concentration of 25 ng/µL. Meanwhile, the expression of genetic markers for adipogenic initiation, peroxisome proliferator-activated receptor gamma 2 (PPARg2) and CCAAT/enhancer binding protein alpha (C/EBPa), as well as subsequent adipocyte maturation, fatty acid binding protein 4 (FABP4) and lipoprotein lipase (LPL), were significantly downregulated. Yet, the genetic markers of osteogenic commitment and differentiation were not upregulated during adipogenic differentiation and conversion under FGF supplementation, not supporting an event of osteogenic lineage switching. Moreover, when examining the effects on the osteogenic differentiation of hBMSCs and the osteogenic conversion of pre-differentiated adipocytic cells, culture in the presence of FGF1 markedly decreased extracellular matrix (ECM) mineralization. Additionally, the gene expression of the osteogenic marker alkaline phosphatase (ALP) was significantly reduced and ALP enzyme activity was decreased. Furthermore, genetic markers of osteogenic commitment, like the master regulator runt-related transcription factor 2 (RUNX2) and bone morphogenetic protein 4 (BMP4), as well as markers of osteogenic differentiation and ECM formation, like collagen 1 A1 (COL1A1) and integrin-binding sialoprotein (IBSP), were downregulated. In contrast, genes known to inhibit ECM mineralization, like ANKH inorganic pyrophosphate transport regulator (ANKH) and osteopontin (OPN), were upregulated. ANKH inhibition revealed that its transcriptional elevation was not crucial for the reduced matrix mineralization, perhaps due to decreased expression of ectonucleotide pyrophosphatase/phosphodiesterase 1 (ENPP1) that likely annulled ANKH upregulation. Like FGF1, also the culture in the presence of FGF2 displayed a marked anti-adipogenic and anti-osteogenic effect. The FGF receptor 1 (FGFR1) was found to be crucial for mediating the described FGF effects in adipogenic and osteogenic differentiation and conversion. Yet, adipogenic conversion displayed a lower involvement of the FGFR1. For adipogenic differentiation and osteogenic differentiation/conversion, downstream signal transduction involved the extracellular signal-regulated kinases 1 and 2 (ERK1/2) and the mitogen-activated protein kinase (MAPK)/ERK kinases 1 and 2 (MEK1/2), probably via the phosphorylation of FGFR docking protein FGFR substrate 2a (FRS2a) and its effector Ras/MAPK. The c-Jun N-terminal kinase (JNK), p38-MAPK, and protein kinase C (PKC) were not crucial for the signal transduction, yet were in part responsible for the rate of adipogenic and/or osteogenic differentiation itself, in line with current literature. Taken together, to the best of our knowledge, our study was the first to describe the strong impact of FGF1 and FGF2 on both the adipogenic and osteogenic differentiation and conversion processes of primary hBMSCs in parallel. It clearly revealed that although both FGFs were not able to promote the differentiation and lineage switching towards the osteogenic fate, they strongly prevented adipogenic differentiation and lineage switching, which seem to be elevated during osteoporosis. Our findings indicate that FGF1 and FGF2 entrapped hBMSCs in a pre-committed state. In conclusion, these agents could be applied to potently prevent unwanted adipogenesis in vitro. Moreover, our results might aid in unraveling a pharmacological control point to eliminate the increased adipogenic differentiation and conversion as potential cause of adipose tissue accumulation and decreased osteoblastogenesis in bone marrow during aging and especially in osteoporosis. N2 - Die Regulation und Umkehr des adipogenen und osteogenen Commitments von trabekulären humanen Knochenmarks-Stroma Zellen (hBMSCs) stellt einen vielversprechenden Ansatz für die Prävention und Therapie der Knochenerkrankung Osteoporose dar. Der Fibroblasten-Wachstumsfaktor 1 (FGF1) und sein Proteinfamilien-Mitglied FGF2 wurden in einer vorhergehenden Studie als Hauptkandidaten bezüglich der Kontrolle einer Konversion (Schicksalsänderung) von hBMSCs in die osteogene Richtung bewertet. Der Effekt von FGF1 und FGF2 auf die Differenzierung von hBMSCs wird jedoch in der Literatur kontrovers diskutiert. Folglich zielte die aktuelle Studie darauf ab, die Effekte dieser Faktoren auf die adipogene und osteogene Differenzierung und Konversion von primären hBMSCs zu untersuchen. Außerdem sollten die nachgeschalteten Signalmechanismen aufgeklärt und die Ergebnisse abschließend bezüglich des angestrebten Therapieansatzes bewertet werden. Die vorliegende Studie zeigte eindeutig, dass die adipogene Differenzierung von hBMSCs sowie die adipogene Konversion von vordifferenzierten osteoblastischen Zellen durch die Kultur in Gegenwart von FGF1 stark inhibiert wurden. Die typische Bildung von intrazellulären Fetttropfen war bei einer Konzentration von 25 ng/µL vollständig inhibiert, während die Genexpression von frühen und späten adipogenen Markern signifikant herunterreguliert war. Die osteogenen Marker waren jedoch während der adipogenen Differenzierung und Konversion unter FGF-Zugabe nicht hochreguliert, was eine etwaige Schicksalsänderung zugunsten der osteogenen Richtung nicht unterstützte. Bei der Untersuchung der osteogenen Differenzierung von hBMSCs und der osteogenen Konversion von vordifferenzierten adipozytischen Zellen bewirkte die Zugabe von FGF1 zum Differenzierungsmedium eine deutliche Verminderung der Mineralisierung der extrazellulären Matrix (ECM). Darüber hinaus war die Genexpression der alkalischen Phosphatase (ALP) signifikant reduziert; außerdem wurde die ALP Enzymaktivität erniedrigt. Sowohl Marker des osteogenen Commitments einschließlich des osteogenen Master-Transkriptionsfaktors RUNX2 (Runt-related transcription factor 2), als auch Marker der weiterführenden osteogenen Differenzierung waren herunterreguliert. Im Kontrast dazu waren Inhibitoren der ECM-Mineralisierung hochreguliert. Die Hochregulation von ANKH (ANKH inorganic pyrophosphate transport regulator) schien hierbei jedoch keine direkte Auswirkung auf die Reduzierung der Mineralisierung zu haben; seine Wirkung wurde wahrscheinlich durch die Herunterregulation von ENPP1 (Ectonucleotide pyrophosphatase/ phosphodiesterase 1) aufgehoben. Wie FGF1 zeigte auch FGF2 eine anti-adipogene und anti-osteogene Wirkung. Der FGF Rezeptor 1 (FGFR1) war für die Weiterleitung der beschriebenen FGF-Effekte entscheidend, wobei die adipogene Konversion eine erniedrigte Beteiligung dieses Rezeptors zeigte. Bei der adipogenen Differenzierung und der osteogenen Differenzierung und Konversion waren die nachgeschalteten Signalwege ERK1/2 (Extracellular signal-regulated kinases 1 and 2) bzw. MEK1/2 (Mitogenactivated protein kinase (MAPK)/ ERK kinases 1 and 2) involviert, vermutlich über eine Phosphorylierung des FGFR Substrats FRS2a (FGFR substrate 2a) und der Ras/MAP Kinase. Im Gegensatz dazu waren die c-Jun N-terminale Kinase (JNK), die p38-MAP Kinase und die Proteinkinase C (PKC) nicht an der Weiterleitung des FGF-Signals beteiligt. Sie zeigten sich jedoch, in Übereinstimmung mit der aktuellen Literatur, verantwortlich für das Ausmaß der adipogenen bzw. osteogenen Differenzierung selbst. Zusammenfassend war die vorliegende Studie nach unserem besten Wissen die erste, die den starken Einfluss von FGF1 und FGF2 parallel sowohl auf die adipogene als auch die osteogene Differenzierung und Konversion von primären hBMSCs untersucht hat. Sie zeigte deutlich, dass, obwohl beide FGFs nicht die Differenzierung und Konversion zum osteogenen Zellschicksal hin unterstützen konnten, sie dennoch wirkungsvoll die adipogene Differenzierung und Konversion verhinderten, die während der Osteoporose erhöht zu sein scheinen. Unsere Ergebnisse lassen den Schluss zu, dass hBMSCs durch FGF1 und FGF2 in einem Stadium vor dem Schicksals-Commitment festgehalten werden. Folglich könnten diese Proteine verwendet werden, um eine ungewollte Adipogenese in vitro zu verhindern. Außerdem könnten unsere Ergebnisse helfen, einen pharmakologischen Kontrollpunkt zur Eliminierung der gesteigerten adipogenen Differenzierung und Konversion aufzudecken, welche potentielle Gründe für die Fettakkumulation und die reduzierte Osteoblastogenese im Knochenmark während des Alterns und besonders in der Osteoporose sind. KW - Mesenchymzelle KW - Genexpression KW - Fibroblastenwachstumsfaktor KW - Osteoporose KW - Fettzelle KW - Bone marrow stromal cell (BMSC) KW - Osteogenesis KW - Adipogenesis KW - Differentiation KW - adipocytes KW - Mesenchymale Stammzelle Y1 - 2015 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-119322 ER - TY - THES A1 - Gan, Qiang T1 - Investigation on Distinct Roles of Smad Proteins in Mediating Bone Morphogenetic Proteins Signals T1 - Untersuchung auf Unterschiedliche Rollen von Smad Proteinen in der Signalübertragung der Knochenmorphogenetischen Proteine N2 - Knochenmorphogenetische Proteine (engl. Bone morphogenetic Proteins, BMPs) sind eine Bestandteil von transforming growth factor-β (TGF-β)-Superfamilie und spielen wichtige Rollen in zahlreichen biologischen Ereignissen in der Entwicklung fast aller mehrzelligen Organismen. Fehlregulierte BMP-Signalweg ist die zugrunde liegenden Ursachen von zahlreichen erblichen und nicht erblichen Krankheiten wie Krebs. Die von BMP induziete breite Palette von biologischen Reaktionen konvergiert auf drei eng verwandten Smad Proteine. Sie vermitteln intrazelluläre Signale von BMP-Rezeptoren in den Zellkern. Die Spezifität des BMP-Signalwegs wurde intensiv auf der Ebene der Ligand-Rezeptor-Wechselwirkungen erforscht, aber, wie die verschiedenen Smad Proteine die durch BMPs hervorgerufen differenziellen Signale beitragen, bleibt unklar. In dieser Arbeit haben wir die BMP / Smad Signalweg in verschiedenen Aspektenuntersucht. Auf der Suche nach einem geeigneten Fluoreszenz-Reporter im Zebrafisch, verglichen wir verschiedene photo-schaltbaren Proteine und fand EosFP der beste Kandidat für diesen Modellorganismus im Bezug auf seine schnelle Reifung und Fluoreszenz-Intensität. Wir haben durch molekulare Modifizierung geeignete Vektoren erstellt, die Tol2-Transposon basieren trangenesis im Zebrafisch zu ermöglichen. Damit wurden schließlich transgenzebrafisch-Linien erzeugt. Wir kombinierten Fluoreszenz-Protein-Tagging mit hochauflösender Mikroskopie und untersuchten die Dynamik der Smad-Proteine in Modellsystem Zebrafisch. Es wurde beobachteten, dass Smad5 Kern-Translokation erfährt, als BMP Signalgeber bei Zebrafisch Gastrulation. Wir erkundeten die Beteiligung der Smad Proteine während der Myogenese-zu-Osteogenese Umwandlung von C2C12 Zelllinie, die durch BMP4 induziert wurde. Mit siRNA versuchten wir die endogene Smad Proteine niederzuschlagen, wobei die Auswirkungen auf diesen gekoppelten noch unterschiedlichen Verfahren durch quantitative real-time PCR und Terminal-Marker Färbung ausgewertet. Wir spekulieren, dass verschiedene Smad-Komplex Stöchiometrie für unterschiedliche durch BMPs hervorgerufe zelluläre Signale verantwortlich sein könnte. N2 - Bone morphogenetic proteins (BMPs) belong to the transforming growth factor-β (TGF-β) superfamily and play important roles in numerous biological events in the development of almost all multi-cellular organisms. Dysregulated BMP signaling is the underlying causes of numerous heritable and non-heritable human diseases including cancer. The vast range of biological responses induced by BMPs converges on three closely related Smad proteins that convey intracellular signals from BMP receptors to the nucleus. The specificity of BMP signaling has been intensively investigated at the level of ligand-receptor interactions, but how the different Smad proteins contribute to differential signals elicited by BMPs remains unclear. In this work, we investigated the BMP/Smad signaling in different aspects. In search for an appropriate fluorescence reporter in zebrafish, we compared different photo-switchable proteins and found EosFP the best candidate this model system for its fast maturation and fluorescence intensity. We modified and created appropriate vectors enabling Tol2-transposon based trangenesis in zebrafish, with which transgenic zebrafish lines were generated. We combined fluorescence protein tagging with high resolution microscopy and investigate the dynamics of Smad proteins in model system zebrafish. We observed that Smad5 undergoes nucleo-translocation as BMP signal transmitter during zebrafish gastrulation. We explored the Smad involvement during myogenic-to-osteogenic conversion of C2C12 cell line induced by BMP4. We created transient loss-of-function of Smads by siRNA-mediated knockdowns and analyzed the effects on these coupled yet distinct procedures by quantitative real-time PCR and terminal marker staining. We found that different Smad-complex stoichiometry might be responsible for distinct cellular signals elicited by BMPs. KW - Knochen-Morphogenese-Proteine KW - Zebrabärbling KW - Signaltransduktion KW - Bone morphogenetic proteins KW - Smad KW - Signaling KW - Zebrafish KW - Cell line KW - Differentiation KW - Differenzierung KW - Zelllinie KW - Zebrafisch Y1 - 2011 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-71127 ER - TY - THES A1 - Steinack, Carolin T1 - Untersuchungen zum Differenzierungspotential humaner Monozyten in vitro: Nachweis Insulin- und C-Peptid-positiver Zellen T1 - Investigation of in vitro modified human blood monocytes: Characterisation by immunohistochemistry and functional proof of their insulin N2 - Monozyten lassen sich in vitro nicht nur zu Makrophagen und Dendritischen Zellen differenzieren, sondern auch in eine Vielzahl nicht-phagozytierender Zellen. Monozyten scheinen somit über pluripotente Eigenschaften zu verfügen. In dieser Arbeit wurde untersucht, ob sich kultivierte Monozyten tatsächlich in Insulin-exprimierende Zellen differenzieren lassen. Monozyten von gesunden Spendern im Alter zwischen 20 und 26 Jahren wurden untersucht. Die über eine Leukozytenapherese gewonnenen Mono- zyten wurden über Adhärenz angereichert und für sechs Tage in X-Medium mit den Cytokinen M-CSF und IL-3 und für weitere 15 Tage in Y-Medium mit den Cytokinen HGF und EGF inkubiert. Die Zellen wurden immunhistochemisch und funktionell untersucht. Frisch isolierte Blutmonozyten waren vor ihrer Kultivierung negativ für Insulin, C-Peptid und Glukagon. Am 4. Kulturtag wurden Insulin und C-Peptid in den kultivierten Monozyten nachgewiesen. Die Expression von Insulin war jedoch nicht stabil: während am Tag 11 der Anteil Insulin-positiver Zellen bei ca. 80% lag, waren am Tag 14 nur noch ca. 30% der kultivierten Zellen Insulin-positiv. Dies wurde ebenfalls für den Nachweis von C-Peptid beobachtet. Auch die Expression von Glukagon war nicht stabil. Diese Beobachtung wird darauf zurückgeführt, dass sich die Monozyten zu Makrophagen differenzierten und diese eindeutig kein Insulin produzieren. Da Zellen Insulin aufnehmen und speichern können, sollte in dieser Arbeit die Frage geklärt werden, ob immunhistochemisch zu unterscheiden ist, ob Zellen Insulin gebildet (de novo Insulin) oder unspezifisch aufgenommen haben. In dieser Arbeit wurde gezeigt, dass zum eindeutigen Nachweis von de novo Insulin der Nachweis von C-Peptid unbedingt zu fordern ist. Die in dieser Arbeit durchgeführten Experimente mit aufgereinigtem Insulin belegen, dass für aufgenommenes Insulin – im Gegensatz zu de novo Insulin – C-Peptid immun- histochemisch nicht nachzuweisen ist. Das aus in vitro kultivierten Monozyten isolierte Insulin war in diabetischen Mäusen biologisch aktiv, d.h. es senkte den Blutzuckerspiegel kurzfristig. Hierzu wurden geerntete Monozyten der Kulturtage 6-12 im Ultraschallbad aufgeschlossen und der zellfreie Überstand diabetischen Mäusen injiziert. Insgesamt senkten 11 der 31 (35,5%) in dieser Arbeit getesteten Überstände den Blutzuckerspiegel dieser Tiere um mehr als 15%. Bezogen auf die 18 Proben, die einen Effekt zeigten, sind dies sogar 61%. In dieser Arbeit wurde somit erfolgreich gezeigt, dass in vitro modifizierte Monozyten Insulin exprimieren, das den Blutzuckerspiegel diabetischer Mäuse senkt. N2 - Monocytes differentiate not only in macrophages and dendritic cells but also in a variety of non-phagocytic cells. Monocytes or a subpopulation of monocytes seem to exhibit pluripotent diversity. In the present study the potential of in vitro cultured monocytes to differentiate into insulin-expressing cells was analysed. Monocytes of healthy human donors between 20 and 26 years old were analysed. They were obtained by leukocyte aphaeresis, enriched by adherence and cultured six days in X-Medium containing MCS-F und IL-3 and a further 15 days in Y-Medium containing HGF and EGF. The cells were characterized by immunohistochemistry and functional assays. Freshly isolated blood monocytes were negative for insulin, C-peptide and glucagon. In contrast, cultured monocytes were positive for insulin and C-peptide, detectable after 4 days in culture. However, the insulin expression was unstable. On day 11 of culture the amount of insulin-positive cells reached a maximum of 80 percent positive, by day 14 of culture the amount of insulin-positive cells had decreased to 30 percent. Similar results were obtained for C-peptide and glucagon. It seems that monocytes lost the ability to express insulin during their differentiation into macrophages. It is well known, that cells are able to take up and accumulate exogenous insulin. One aim of this study was to differentiate by immunohistochemistry between de novo insulin and exogenous insulin taken up by the cells from the environment. We showed that the presence of C-peptide must be proven to clearly identify de novo insulin. Experiments with purified insulin demonstrated that cells that took up purified insulin were negative for C-peptide. Insulin isolated from in vitro cultured monocytes demonstrated biological activity and reduced blood glucose levels in diabetic mice. Eleven of 31 in vivo tested cell-free supernatants (35.5 percent) lowered blood glucose levels in diabetic mice by more than 15 percent. The results of the study show that in vitro modified monocytes are able to produce insulin that reduces blood glucose levels in diabetic mice. KW - Insulin KW - Insulinstoffwechsel KW - Monozyten KW - Differenzierung KW - C-Peptid KW - Monocytes KW - Differentiation KW - C-Peptid Y1 - 2010 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-55518 ER -