TY  - THES
A1  - Widmaier, Louis
T1  - Die Regulation des Chemokinrezeptors CXCR4 durch Chemotherapeutika in Myelomzelllinien
T1  - The regulation of chemokinreceptor CXCR4 by chemotherapeutics in myeloma cell lines
N2  - Untersucht wurde der Einfluss mehrerer Chemotherapeutika auf den Chemokinrezeptor CXCR4 in 
Myelomzelllinien auf Ebene des Promotors, der mRNA und der Rezeptorverteilung, wobei drei 
Substanzen (Etoposid, Bortezomib und Dexamethason) als potenzielle Suppressoren des Promotors ausgemacht werden konnten. Abhängig vom Myelom-Zelltyp und der Dosierung können so evtl. 
Rückschlüsse auf die beobachtete Suppression von CXCR4 bei erkrankten Patienten mit hoher CXCR4-Aktivität (hier: Malignes Myelom) durch die begleitende Chemotherapie gezogen werden, welche eine Diagnostik und Therapie bei diesen Patienten erschwert.
Hintergrund: Hintergrund für diese Arbeit waren Beobachtungen in klinischen Fallstudien von Lapa et al. am Universitätsklinikum Würzburg, die sich auf CXCR4 bezogen, welches u.a. bei Patienten mit 
Multiplem Myelom überexprimiert wird und dadurch bereits als Target für Diagnostik und Therapie in der Klinik Anwendung findet. Dabei konnte bei PET-CT Untersuchungen in der Nuklearmedizin beobachtet werden, dass es durch die begleitende Chemotherapie der Patienten zu einer Suppression des markierten CXCR4-Signals kam, so dass es nicht mehr zur Verlaufsbeobachtung und 
vor allem nicht mehr zur Radiotherapie und Therapiekontrolle verwendet werden konnte. 
Um den Einfluss und mögliche Interaktionen der Chemotherapeutika auf CXCR4 zu untersuchen, war es Ziel dieser Arbeit, ein vergleichbares Szenario in-vitro nachzustellen und Einflüsse messbar zu 
machen, um so mögliche Ansätze und Verbesserungsvorschläge für die klinische Anwendung zu 
liefern. 
Methoden/Ergebnisse: Hierfür wurden im ersten Teil INA-6 (Myelomzellen) und Mesenchymale 
Stammzellen (MSC) kultiviert, in Ko-Kultur gebracht und nach einer bestimmten Zeit wieder getrennt, um anschließend den gegenseitigen Einfluss in Bezug auf CXCR4 zu messen. Zudem wurde der Einfluss von Dexamethason untersucht. Es zeigte sich eine enge Bindung zwischen INA-6 und MSC 
sowie eine hohe CXCR4-Aktivität bei INA-6, jedoch konnte keine Induktion der CXCR4-Aktivität in MSC durch INA-6-Kontakt oder Dexamethason quantifiziert werden. Die Immunzytologie erwies sich aufgrund einer schweren Anfärbbarkeit von CXCR4 – auch mit verschiedensten Antikörpern und sogar Liganden-gekoppeltem Farbstoff– als kaum auswertbar, wobei eine Darstellung von CXCR4 
generell aber gelang.
Der CXCR4-Promotor wurde mittels Software genauer analysiert, wobei einige relevante Bindestellen, u.a. für Glukokortikoide und NFkB gefunden wurden. Die Herstellung eines CXCR4-
pGl4.14-Promotor-Konstrukts war erfolgreich, ebenso dessen Einschleusung in Myelomzellen. Auch gelang die Herstellung stabiler transfizierter INA-6, sodass mit diesen anschließend konstantere Ergebnisse erzielt werden konnten.
Im größten Teil der Arbeit wurden geeignete Chemotherapeutika-Konzentrationen ermittelt und in Viabilitäts- und Apoptose-Versuchen überprüft. Die Stimulationsversuche mit diesen zeigten variable 
Effekte abhängig vom Zelltyp (INA-6, MM1S), jedoch konnten Bortezomib, Etoposid und 
Dexamethason konzentrationsabhängig als starke Suppressoren der CXCR4-Aktivität ausgemacht 
werden, was sich v.a. auf Ebene der Promotoraktivität – gemessen mittels Luciferase - zeigte. Interpretation: In-vitro konnten somit drei potenzielle Suppressoren der CXCR4-Aktivität ausgemacht 
werden: Etoposid, Bortezomib und Dexamethason. Zumindest beim INA-6-Zelltyp fiel dieser Effekt deutlich aus, wobei in der Klinik der entsprechende Zelltyp sowie die Dosierung der Medikamente berücksichtigt werden müssen. Hinzu kommen weitere Einflussfaktoren des menschlichen Körpers, 
die nicht berücksichtig werden konnten. Die genauen Mechanismen der Suppression könnten sich aus den Bindestellen des Promotors erklären, die von uns analysiert wurden, aber auf die in weiteren Arbeiten noch näher eingegangen werden muss.
N2  - The influence of several chemotherapeutic agents on the chemokine receptor CXCR4 in myeloma cell lines at the level of the promoter, the mRNA and the receptor distribution was examined, whereby three substances (etoposide, bortezomib and dexamethasone) could be identified as potential suppressors of the promoter. Depending on the cell type and the dosage, conclusions can be drawn about the observed suppression of CXCR4 in patients with diseases with high CXCR4 activity (here: multiple myeloma) due to the accompanying chemotherapy, which impairs theranostic applications like diagnostic imaging using PET/CT and may in particular abolish the chances of radiotherapeutic intervention in these patients.
Background: The background for this work were observations in clinical case studies by Lapa et al. at the University Hospital Würzburg, which referred to CXCR4, which is overexpressed in patients with multiple myeloma and is therefore already used as a target for diagnostics and therapy in the clinic. During PET-CT examinations in nuclear medicine, it could be observed that the accompanying chemotherapy of the patients led to a suppression of the marked CXCR4 signal, which is why it could no longer be used for monitoring the follow-up, but also was lost as a radiotherapeutic target.
In order to investigate the influence and possible interactions of chemotherapeutic agents on CXCR4, the aim of this work was to simulate a comparable scenario in vitro and to make influences measurable in order to provide possible approaches and suggestions for improvement for clinical application.
Methods/Conclusions: For this purpose, INA-6 (myeloma cells) and mesenchymal stem cells (MSC) were cultivated in the first part, brought into co-culture and separated again after a certain time in order to then measure the mutual influence with regard to CXCR4 expression. The influence of dexamethasone was also examined. There were intensive contacts between INA-6 and MSC and high CXCR4 activity in INA-6, but no induction of CXCR4 activity in MSC by INA-6 or dexamethasone could be quantified. The immunocytology turned out to be difficult due to the difficulty of staining CXCR4 - even with a wide variety of antibodies and ligand-coupled dyes - although CXCR4 was generally able to be represented.
The CXCR4 promoter was analyzed in more detail using the Genomatix software, and some relevant binding sites, including response elements for glucocorticoids and NFkB, were found. The production of a CXCR4-pGl4.14 luciferase-reporter construct was successful, as was its introduction into myeloma cells. The production of stably transfected INA-6 was also successful, so that more constant results could then be achieved.
In a large part of the work, suitable chemotherapeutic concentrations were determined and checked in viability and apoptosis tests. The stimulation experiments with these showed variable effects depending on the cell type (INA-6, MM1S). However, depending on the concentration, bortezomib, etoposide and dexamethasone could be identified as strong suppressors of CXCR4 activity, which was particularly evident at the level of activity of our luciferase-reporter construct.
Interpretation: Overall, three potential suppressors of CXCR4 activity could be identified in-vitro: etoposide, bortezomib and dexamethasone. At least with the INA-6 cell type, this effect was clear, although the corresponding cell type and the dosage of the medication must be taken into account in the clinic. In addition, there may be other influencing factors of the human organism in vivo that could not be considered. The exact mechanisms of suppression could be explained by the binding sites of the promoter, which we analyzed, but which will have to be discussed in more detail in further work.
KW  - Bortezomib
KW  - Plasmozytom
KW  - Chemokin CXCL12
KW  - Multiples Myelom
KW  - Chemotherapie
KW  - Promotor
KW  - CXCR4
KW  - Stimulationsversuche
Y1  - 2023
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-345682
ER  - 
TY  - THES
A1  - Fink, Severin Lion Julian
T1  - Entwicklung eines Sleeping Beauty Transposon Systems zum simultanen und induzierbaren shRNA-Knock-down verschiedener Zielstrukturen in Zelllinien des Multiplen Myeloms
T1  - Development of a system for multi-targeted inducible shRNA-knock-downs with the Sleeping Beauty transposon system and establishment in Multiple Myeloma cell lines
N2  - Das Multiple Myelom (MM) ist ungeachtet neuer medikamentöser Therapien weiterhin eine für die allermeisten Patienten unheilbare Erkrankung. Aktuelle Whole-Genome-Sequenzierungen konnten die Annahme, dass hierfür die genetische Heterogenität des MM verantwortlich ist, bestätigen. Um dieses onkogene Signalnetzwerk auf effiziente Weise zu untersuchen, wurde ein induzierbares Knock-down-System basierend auf der weitverbreiteten RNA-Interferenz und dem neuen, innovativen Sleeping Beauty Transposon System (SBTS) entwickelt. Die Etablierung des SBTS im MM zeigte, dass die CMV-Promotor-vermittelte EGFP-Expression über 231 Tage stabil ist. Die Verwendung des SBTS ermöglicht es, Zellen bei niedrigster biologischer Schutzstufe (S1) stabil zu transfizieren. Am Beispiel des MAPK-Signalweges konnten stabile shRNA-vermittelte Knock-downs in verschiedenen MM-Zelllinien erfolgreich durchgeführt werden. Um ein induzierbares Tet-On-System zur shRNA-Expression zu erstellen, wurden zum einen dem verwendeten H1-Promotor zwei TetO-Sequenzen hinzugefügt. Zum anderen wurde durch die Verwendung eines zweiten, neu konstruierten SBTS Vektors mit anderer Selektionsresistenz in den verwendeten Zellen das Tet-Repressor-Protein (TetR) stabil exprimiert. Die notwendige Expression von TetR konnte nur mittels CAG-Promotors erreicht werden. Am Beispiel von ERK2 konnte gezeigt werden, dass es durch die stabile Transfektion und die Induktion des Knock-downs mit Doxycyclin möglich ist, den Knock-down Effekt zu erzielen. Das etablierte Plasmid-basierte System stellt somit ein versatiles, einfach anwendbares, kostengünstiges und zeitsparendes Werkzeug dar, induzierbare Knock-downs durch RNA-Interferenz für einzelne oder mehrere Proteine gleichzeitig zu erzielen. Es ist davon auszugehen, dass die Anwendung aufgrund der Verwendung etablierter Techniken und der leichten Modifizierbarkeit nicht nur auf das MM begrenzt sein wird.
N2  - Multiple Myeloma (MM) is regardless of new drug therapies still an incurable disease for the majority of patients. Large-scale whole-genome-sequencing studies strongly support the assumption that the reason for this is the large genetic heterogeneity of MM. 
To gain knowledge about the complex oncogenetic signalling efficiently, in this work, a system for inducible knock-downs based on the wide-spread RNA-interference and the new innovative Sleeping Beauty Transposon System (SBTS) was developed. The successful establishment of the SBTS in MM revealed that EGFP-expression by a CMV-promotor is stable for at least 231 days without any further selection by antibiotics. The use of SBTS makes it possible to transfect cells stably at the lowest biological safety level (S1). Utilizing the MAPK-signal path as an example it was possible to successfully demonstrate shRNA-provided knock-downs for up to four targets at once in several different MM-cell lines. To create an inducible Tet-on-system for shRNA-Expression, two TetO-sequences were added to the used H1-Promotor. Furthermore, the required Tet-repressor-protein (TetR) was expressed by another newly constructed SBTS vector, which contains another selection resistance. After trying different approaches, it was possible to express the necessary amount of TetR by using the CAG-Promotor, which was verified by Western Blot. Using ERK2 as a sample target, it was possible to show that with stable transfection and induction of the knock-down with doxycycline it is possible to measure knock-down results without the toxic side effects of the electroporation necessary for transfection. The established plasmid-based system serves as an easily applicable, cost-efficient and time-saving tool for inducible knock-downs by RNAi for single or multiple proteins. Due to the fact that yet established techniques were used and thanks to the simplicity of the customization it is assumed that the application is not only limited to MM.
KW  - RNS-Interferenz
KW  - Plasmozytom
KW  - Transposon
KW  - Multiples Myelom
KW  - shRNA
KW  - Sleeping Beauty Transposon System
Y1  - 2021
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-249796
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TY  - THES
A1  - Demler, Theresa
T1  - Funktionelle Analyse von patientenspezifischen Mutationen in IKZF1/3 als mögliche Resistenzmechanismen in der Therapie des refraktären und rezidivierten multiplen Myeloms
T1  - Functional analysis of patient-specific mutations in IKZF1/3 as possible resistance mechanisms in the therapy of refractory and relapsed multiple myeloma
N2  - Trotz einer Vielzahl neuer Therapieansätze in den letzten Jahren, die ein längeres Überleben der Patienten ermöglichen, stellt das multiple Myelom weiterhin eine unheilbare Krankheit dar. Der Großteil der Patienten entwickelt letztlich ein rezidiviertes oder refraktäres multiples Myelom (RRMM). Bei Erstdiagnose und bei RRMM sind immunmodulierende Medikamente (IMiDs), wie Lenalidomid, eine bedeutende Therapieoption. Durch die Bindung von Lenalidomid an den CRL4CRBN Ligase Komplex entwickelt dieser eine modifizierte Substratspezifität: die Transkriptionsfaktoren IKZF1 (Ikaros) und IKZF3 (Aiolos) werden ubiquitinyliert und proteasomal abgebaut. Von Krönke et al. (2014) wurde eine 30 Aminosäuren lange Sequenz (Degron) am N-Terminus von IKZF1/3 definiert, die essenziell für die Lenalidomid-Sensitivität ist. Durch Next Generation Sequencing (NGS)-Technologien wurde ein signifikanter Anstieg der Mutationsfrequenz unter Therapie verzeichnet und vier Missense-Mutationen in IKZF1 und eine in IKZF3 bei Patienten mit RRMM identifiziert. Die Mutationen IKZF1-A152T und IKZF3-G159R sind innerhalb der Degron-Sequenz lokalisiert, IKZF1-E170D liegt unmittelbar daneben und IKZF1-Y413C bzw. IKZF1-R439H befinden sich am C-Terminus des Proteins. Für diese mutierten IKZF-Proteine wurden im Rahmen dieser Arbeit Expressionsvektoren kloniert und stabil in humane Myelomzelllinien transfiziert. Durch Western Analysen und funktionelle Assays der Zellviabilität (alamarBlue) bzw. des Zelltods (Annexin V-PI) wurden diese polyklonalen Sublinien bezüglich ihrer Implikationen für die Lenalidomid-Sensibilität untersucht. Nur die IKZF1-Mutationen A152T und E170D führten zu einer verminderten, bei A152T geradezu aufgehobenen, Degradierung von Ikaros nach Lenalidomid-Behandlung. In den funktionellen Analysen führte A152T ebenfalls zu stark verminderter Lenalidomid-Aktivität und zu deutlich höherem Überleben. Obwohl Sleeping Beauty Vektoren mit unterschiedlichen Expressionskassetten für Aiolos eingesetzt wurden, war keine eindeutige Überexpression von IKZF3 feststellbar, daher sind diese Ergebnisse nur eingeschränkt zu verwerten. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass in vivo bei Patienten aufgetretene und in vitro analysierte Mutationen, gezeigt an der in der Degron-Sequenz lokalisierten Mutation IKZF1-A152T, im Zellmodell eine Resistenz vermitteln und damit Einfluss auf mögliche Therapieresistenzen haben können.
N2  - Numerous therapeutic approaches were developed in recent years and have made a longer survival of patients possible. Nevertheless, multiple myeloma still is an incurable disease, and most patients progress to relapsed and refractory multiple myeloma (RRMM). Immunomodulatory drugs (IMiDs) such as lenalidomide are an important therapeutic option in the treatment of RRMM and newly diagnosed multiple myeloma. Lenalidomide binds to the CRL4CRBN ubiquitin ligase complex and modifies its substrate specificity. As a result, ubiquitination and degradation of the neo-substrates IKZF1 (Ikaros) and IKZF3 (Aiolos), both transcription factors, is induced. Krönke et al. (2014) defined a 30 amino acid sequence (termed degron) at the N-terminal end of IKZF1/3 that is essential for lenalidomide sensitivity. A significant increase in the mutation frequency during therapy was shown through next-generation sequencing (NGS) diagnostics and four missense mutations in IKZF1 and one in IKZF3 in patients with RRMM were identified. The mutations IKZF1-A152T and IKZF3-G159R are located within the degron sequence described by Krönke, IKZF1-E170D lies close to the border of this region and the position of IKZF1-Y413C and IKZF1-R439H is C-terminal. In this thesis, expression vectors were cloned for these mutated IKZF proteins and then stably transfected in human myeloma cell lines. The implications of these identified mutations for their sensitivity to lenalidomide were examined using Western blotting and functional assays: alamarBlue (cell viability assay) and Annexin V-PI (cell death assay). Only the IKZF1 mutations A152T and E170D led to a reduced, for A152T even abrogated, degradation of Ikaros following lenalidomide-incubation. In the functional analyses A152T also strongly diminished lenalidomide activity and caused a considerably higher survival in this subline. Although Sleeping Beauty vectors with different expression cassettes for IKZF3 were used, no distinct overexpression of Aiolos was achieved, and the results obtained for IKZF3 are therefore of limited interpretability. In summary, it was shown that mutations that occurred in patients, namely IKZF1-A152T located within the degron sequence, can confer resistance to lenalidomide-treatment in cell models and implications for therapy resistances are possible.
KW  - Plasmozytom
KW  - Punktmutation
KW  - Resistenz
KW  - Lenalidomid
KW  - Multiples Myelom
KW  - IKZF1
KW  - Ikaros
KW  - IKZF3
KW  - Aiolos
Y1  - 2021
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-248730
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TY  - THES
A1  - Zugelder, Laurens
T1  - Etablierung eines stabilen induzierbaren Multikassetten-Systems für shRNA-Knockdown-Konstrukte in Myelom Zelllinien und Anwendung zur Analyse des NFκB-Signalwegs
T1  - Establishment of a stable and inducible Multicassette-shRNA-Knockdown System in Myeloma Cell Lines and Adaption to the Evaluation of the NFκB-Pathway in Multiple Myeloms
N2  - Das Multiple Myelom muss trotz stetiger Fortschritte im Hinblick auf die verfügbaren Therapieoptionen und die Krankheitsprognose weiterhin im Wesentlichen als eine unheilbare Erkrankung angesehen werden. Dies kann vor allem auf die große inter- und intraindividuelle Heterogenität des MM zurückgeführt werden, welche die Entwicklung gezielter molekularer Therapiestrategien erheblich erschwert. Hierbei stellen loss-of-function- Experimente, welche die Identifikation einzelner oder mehrerer potenziell therapeutisch relevanter Zielstrukturen durch die (kombinierte) Depletion von Proteinen ermöglichen, eine wichtige Säule dar, für deren Durchführung verschiedene Systeme mit jeweils eigenen Vor- und Nachteilen zur Verfügung stehen. Im Rahmen dieser Arbeit konnte die Etablierung eines auf RNA-Interferenz basierenden stabilen und induzierbaren Knockdownsystems durch Elektroporation von MM Zelllinien mit Einzel- und Mehrfach-shRNA-Vektoren abgeschlossen werden. Die Transfektion von tet-Repressor-exprimierenden Zellinien mit einer oder mehreren shRNAExpressionskassetten innerhalb eines Plasmidvektors ermöglicht durch die vollständige Repression der shRNA-Transkription im nicht-induzierten Zustand die Selektion erfolgreich transponierter Zellen ohne Effekt-vermittelte Bias und die Generierung großer Zellmengen für Versuchsreihen in vergleichsweise kurzer Zeit. Die Induktion der verschiedenen in dieser Arbeit evaluierten Einzel- und Mehrfach-shRNA-Konstrukte gegen (Kombinationen von) Zielstrukturen im Ras/MAPK- sowie im NFκB-Signalsystem mittels Doxyzyklin als Induktionsagens zeigte durchweg deutliche und den Erwartungen aus transienten Experimenten entsprechende Knockdownergebnisse. Auch die Resultate hinsichtlich funktioneller Readouts und zellphysiologischer Effekte der induzierten Knockouts stehen im Einklang mit vorangegangenen Experimenten und bestätigen somit die Äquivalenz des stabilen induzierbaren Systems zu transienten Ansätzen auf RNAi-Basis oder zu pharmakologischen Inhibitoren. Der hierbei erzielte hypomorphe Phänotyp innerhalb einer polyklonalen Zellpopulation bildet die Realität einer medikamentösen Blockade einer oder weniger Zielstrukturen einer heterogenen MM Tumorpopulation näherungsweise ab, weshalb das vorgestellte System ein hilfreiches, kosteneffizientes und leicht zu handhabendes Werkzeug für die Identifikation potenziell relevanter Zielstrukturen für molekulare Therapieansätze im Multiplen Myelom darstellt
N2  - Despite steady progress concerning the therapeutic arsenal available to and the improved prognosis for newly diagnosed patients, multiple myeloma still has to be regarded as an incurable malignancy in the overwhelming majority of cases. This is mainly due to the disease’s high grade of inter- and intraindividual heterogeneity, which greatly complicates the development of molecular therapies. Loss-of-function studies, which enable researchers to identify individual or combinations of drug targets with a potential for clinical relevance by correlating the (combined) depletion of proteins with the resulting phenotype, represent an important cornerstone in the process of developing new molecular therapies, for the execution of which a broad variety of systems with their individual advantages and disadvantages is available.
During this thesis project, the establishment of a stable and inducible knockdown system by way of electroporation of myeloma cell lines with single- and multiple-shRNA- expression vectors was successfully completed. Transfecting cell lines which constitutively express the tet-repressor protein with a single plasmid vector carrying one or multiple shRNA expression cassettes allows for the selection of successfully transposed cells without any effect mediated bias and the creation of large amounts of cells for experiments in a comparatively short time, thanks to the full repression of the transcription of the transfected shRNA genes in an un-induced state. Inducing their transcription by adding doxycycline to the cell suspension resulted in strong and specific knockdowns for all single and multiple constructs against different (combinations of) targets in the Ras/MAPK- and the NFκB-pathway which were tested in the experiments shown in this thesis. Results regarding knockdowns, functional readouts and alterations in cellular metabolism mirrored with experiments conducted previously with both transiently expressed shRNAs and pharmacological inhibitors and therefore attest to the universal applicability of the system.
The resulting polyclonal cell population with a hypomorphic phenotype depicts the reality conveyed by a pharmacological inhibition of one or more targets within a heterogenic myeloma tumour rather well and therefore this stable and inducible system represents a useful, economical and easily applicable tool for the identification of potentially relevant targets for the development of new molecular therapies in multiple myeloma.
KW  - Plasmozytom
KW  - Multiples Myelom
KW  - shRNA
KW  - reverse genetics
Y1  - 2019
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-188377
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TY  - THES
A1  - Lagler, Charlotte
T1  - Analyse von BMP2 und BMP2-Derivaten der TGF-β-Familie als potentielles Therapeutikum im Multiplen Myelom
T1  - Analysis of BMP2 and BMP2 derivatives of the TGF-β-family as a potential therapeutic agent in multiple myeloma
N2  - Diese Dissertation analysiert BMP2 und BMP2-Derivate als neue therapeutische Strategien für die Behandlung des Multiplen Myeloms (MM). Das MM ist eine maligne neoplastische Erkrankung des Knochenmarks mit Plasmazellvermehrung und erhöhten Leveln an Aktivin A im Blutserum, wobei eines der Hauptsymptome das Auftreten von schmerzvollen Osteolysen ist. In den letzten Jahren rückte Aktivin-A als interessantes Target zur Behandlung des Multiplen Myeloms in den Vordergrund. Die Reduzierung der Aktivin-A Level durch decoy-Rezeptoren führte zu einer signifikanten Verbesserung der Osteolysen und einem reduzierten Proliferationsverhalten der neoplastischen B-Zellen, sowohl im Tierexperiment als auch in Studien der klinischen Phase II. Die Aktivin-A-Antagonisierung ist somit ein neuer und vielversprechender Ansatz in der Therapie des Multiplen Myeloms. 
Das Bone Morphogenetic Protein 2 ist aufgrund seiner molekularen und biologischen Eigenschaften ein interessantes Target für die Therapie des Multiplen Myeloms. Es ist auf molekularer Ebene ein Aktivin-A-Antagonist, besitzt aber auch osteoinduktives Potential und  apoptotische bzw. anti-proliferative Eigenschaften auf neoplastische B-Zellen.  Da die in der Literatur bereits beschriebenen, durch Mitglieder der TGF-β-Familie induzierten Apoptosemechanismen, noch nicht genauer untersucht waren, wurde in dieser Arbeit die BMP2-induzierte Apoptose in 10 unterschiedlichen humanen MM-Zellen analysiert. Erstens konnte dabei nachgewiesen werden, dass 7 von 10 Zelllinien nicht BMP2-responsiv waren. Eine genauere Untersuchung ergab, dass neben der Expression spezifischer BMP-Rezeptoren auch die Expression von inhibitorischen Smad-Proteinen über die BMP2-Responsivität entscheidet. Zweitens zeigte die genauere Analyse der Apoptosemechanismen, dass entgegen der in der Literatur publizierten Ergebnisse, BMP2 keine apoptotische Wirkung auf die von uns untersuchten Zelllinien hat. Mehrere verschieden durchgeführte Experimente, u.a. die Verwendung von spezifischen Inhibitoren des programmierten Zelltodes, unterstützen dieses Ergebnis und klassifizieren BMP2 als einen rein anti-proliferativen Faktor.
Der letzte Teil der Arbeit befasst sich mit der Analyse von potentiellen Aktivin-A-Antagonisten in Form verschiedener BMP2- und GDF5-Derivate und inwiefern sie sich zum Einsatz in der Therapie des Multiplen Myeloms eignen. Die unterschiedlichen Eigenschaften der einzelnen Mutanten wurden in verschiedenen Zellsystemen getestet. So konnte aufgezeigt werden, dass neben einer erhöhten biologischen Aktivität in Form eines gesteigerten osteoinduktiven und anti-proliferativen Potentials auf neoplastische B-Zellen (Superagonisten), sich die verschiedenen Derivate als Super-Antagonisten zu Aktivin A eignen und damit unterschiedlichen Ansprüchen der adjuvanten Therapie im Multiplen Myelom gerecht werden.
N2  - This dissertation analyses BMP2 and BMP2 derivatives as new therapeutic agents in multiple myeloma (MM). MM is a malignant neoplastic disease of bone marrow with plasmatic cell proliferation and increased Activin-A-level in blood serum. A particular symptom of this disease is the occurrence of painful osteolysis. In the last few years Activin A has become an important target for the treatment of multiple myeloma. Reducing Activin A levels by decoy receptors led to a significant improvement in osteolysis and reduced proliferation behavior of neoplastic B cells, both in animal experiments and clinical phase II trials. Activin A antagonization is thus a new and promising approach in the treatment of multiple myeloma.
Bone Morphogenetic Protein 2 is a promising prospect for the treatment of multiple myeloma due to its molecular and biological properties. It is an Activin-A-antagonist at the molecular level, but also has osteoinductive potential and apoptotic or anti-proliferative properties on neoplastic B cells as already described in literature. Since the apoptotic mechanisms, which members of the TGF-β family induced in MM-cells, have not yet been investigated in detail, the BMP2-induced apoptosis was analyzed in 10 different human MM cells. Firstly it was shown that 7 out of 10 cell lines were not responsive to BMP2. A more detailed analysis revealed that, besides the expression of specific BMP receptors, the expression of inhibitory Smad proteins determines BMP responsiveness. Secondly the more precise analysis of the apoptotic mechanisms revealed that, contrary to the results published in the literature, BMP2 has no apoptotic effect on the cell lines we have examined. Several different experiments, e.g. the use of specific inhibitors of programmed cell death, support this result and classify BMP2 as a purely anti-proliferative factor.
The last part of this research deals with the analysis of potential Activin-A-antagonists in form of different BMP2 and GDF5 derivatives and how they are suitable for use in the therapy of multiple myeloma. The different properties of the individual mutants were tested in diverse cell systems. The results demonstrate that in addition to increased biological activity in form of increased osteoinductive and anti-proliferative potential on neoplastic B cells (superagonist), the various derivatives are suitable as super-antagonist to Activin A and cope with different requirements of adjuvant therapy in context of multiple myeloma.
KW  - BMP
KW  - Plasmozytom
KW  - BMP2
KW  - Multiples Myelom
Y1  - 2017
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-155553
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TY  - THES
A1  - Heimberger, Tanja
T1  - Der Hitzeschock-Transkriptionsfaktor 1 (HSF1) als neues potenzielles Ziel im Multiplen Myelom
T1  - The heat shock transcription factor 1 (HSF1) as a new potential therapeutic target in multiple myeloma
N2  - Die evolutionär hoch konservierte Hitzeschock-Antwort (heat shock stress response, HSR) ermöglicht Zellen sich an Stresssituationen anzupassen und so dem programmierten Zelltod zu entgehen. Die Regulation der HSR unterliegt dem Hitzeschock-Transkriptionsfaktor 1 (HSF1), der nach einem Stress-Impuls umgehend die Synthese der Hitzeschock-Proteine (HSP) initiiert. Als molekulare Chaperone assistieren die HSP bei der Faltung und den intrazellulären Transport ihrer Klientenproteine und erhalten so die lebensnotwendigen zellulären Funktionen aufrecht. Während das HSF1/HSP-System vorteilhaft für normale Zellen ist, kann es aber auch den Prozess der malignen Transformation unterstützen. In verschiedenen Tumorentitäten wurde eine Abhängigkeit der malignen Zellen von HSP, vereinzelt auch von HSF1, beschrieben. Im multiplen Myelom (MM) stabilisieren HSP u.a. Klientenproteine in einem komplexen onkogenen Signalnetzwerk und erhalten so eine aberrante Signalweiterleitung aufrecht. Wegen dieser wichtigen Funktion ist die Inhibition der HSP (insbesondere HSP90) bereits ein therapeutischer Ansatzpunkt, der jedoch im MM noch nicht zu dem erhofften Erfolg führte. Darüber hinaus wurde beobachtet, dass es zu einer Induktion der HSP nach einer Behandlung mit neuen, antitumoralen Medikamenten (Proteasom-, HDAC- und HSP90-Inhibitoren) kommt. Diese kompensatorische Hochregulation der HSP ist assoziiert mit einem Resistenzverhalten gegenüber der Therapie und ist somit unerwünscht. Die bisherigen Untersuchungen legen aber auch nahe, dass HSF1 selbst eine wichtige Funktion bei der malignen Transformation einnimmt. So wurde gezeigt, dass der funktionelle Verlust von HSF1 vor der onkogenen Ras oder mutierten Trp53 getriebenen Tumorigenese schützt. In der vorliegenden Arbeit wurden daher die Expression von HSF1, seine Rolle in der HSP-Regulierung und den Beitrag zum Überleben und Resistenzen in MM-Zellen analysiert. Untersuchungen der HSF1-Expression in Knochenmarkbiopsien von Myelompatienten und in Myelomzelllinien zeigten, dass in ca. 50 % der untersuchten Biopsien und Zelllinien eine hohe HSF1-Expression vorhanden ist. Sowohl der shRNA-vermitteltem Knockdown von HSF1 als auch die pharmakologische Inhibition mit Triptolid induzierten Apoptose in MM-Zellen. Durch Microarrayanalysen nach shRNA-vermitteltem Knockdown und der anschließenden Verifikation über Western Blot konnte gezeigt werden, dass nach der HSF1-Depletion zahlreiche HSP (HSP90, HSP70, HSP40 and HSP27) vermindert exprimiert wurden. Einzelne Knockdown Experimente der HSP40 und HSP27 führten zu moderaten Zellsterben, so dass geschlussfolgert werden kann, dass die gleichzeitige Minderung multipler HSP, durch die Depletion von HSF1, zu einem summierten starken apoptotischen Effekt führt. In weiteren Studien stellte sich heraus, dass in MM-Zellen, trotz des deregulierten Systems und der aberrant hohen Expression der HSP, eine Stressantwort ausgelöst werden kann. Dies konnte durch den „klassischen“ Hitzschock und durch die Behandlung mit pharmakologischen Inhibitoren von HSP90 und des Proteasoms erreicht werden. Diese unerwünschte Reaktion auf Therapeutika wird vermutlich durch einen kompensatorischen Zellrettungsmechanismus ausgelöst, der zu Resistenzen gegenüber der Behandlung führen kann. Durch die Inhibition von HSF1 mit Triptolid und durch shRNA-vermitteltem Knockdown, konnte diese zelluläre Antwort unterbunden werden. Darüber hinaus führte die pharmakologische Inhibition von HSF1 in Kombination mit HSP90 (mit NVP-AUY922) oder Proteasom-Inhibition (mit Bortezomib) zu einem verstärkten apoptotischen Effekt in MM-Zellen. Zusammenfassend deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass HSF1 essenziell für die Regulation der HSP im MM ist. Darüber hinaus kann die Inhibition von HSF1, besonders in Kombination mit HSP90- oder Proteasom-Inhibition, eine neue hoffnungsvolle Therapieoption für Myelompatienten darstellen.
N2  - The heat shock stress response (HSR) represents an evolutionarily highly conserved salvage mechanism, which helps cells to cope with situations of stress and thus mediates protection from cell death. This stress response program is regulated by the heat shock transcription factor 1 (HSF1), which regulates expression and activity of heat shock proteins (HSPs). HSPs act as molecular chaperones to restore and maintain normal folding and intracellular trafficking of their cognate client proteins. The HSF1/HSP-controlled stress response can be beneficial in normal cells. However, its activation may also protect malignant cells from cell death induced by oncogene activation during malignant transformation or by drug-induced stress under therapeutic intervention. Various HSPs, as well as HSF1, have already been implicated in the pathogenesis of human cancer. In multiple myeloma (MM) HSPs stabilize components of a complex oncogenic signaling network, sustaining an aberrant signaling. In addition, an up-regulation of HSPs was reported after treatment with some new anti-MM agents, e.g. proteasome-, HDAC- and HSP90-inhibitors, suggesting that HSPs may contribute to drug resistance. For this reason, inhibition of HSPs (especially HSP90) is used as therapeutic approach. However, a clinical Phase I/II trial study showed that treatment with an HSP90 inhibitor as single agent had only limited anti-MM effects. Consequently, research effort is shifted towards blocking the induction of the heat shock stress response. For this purpose, HSF1 is regarded to be a promising target. Recently, it has been demonstrated that HSF1 contributes to malignant transformation in mouse models of tumorigenesis driven by oncogenic Ras or by functional loss of the Trp53 tumor suppressor. In the present study we therefore investigated the expression of HSF1, analyzed its role in the regulation of HSPs and its contribution to the survival and drug resistance in MM cells. We found that HSF1 protein was overexpressed in about half of the analyzed MM patient samples as well as in a majority of MM cell lines, whereas normal and premalignant MGUS plasma cells exhibited no or only weak HSF1 expression in situ. Both shRNA-mediated knockdown and pharmacological inhibition of HSF1 led to induction of apoptosis in MM cell lines and in primary MM cells. These results were affirmed by microarray analysis after shRNA-mediated knockdown and further verified by western blots, which revealed a decrease in numerous HSP (HSP90, HSP70, HSP40 and HSP27) after HSF1 depletion. Furthermore, individual knockdown experiments of HSP40 and HSP27 resulted in moderate cell death, leading to the conclusion that the simultaneous reduction of multiple HSP, by the inhibition of HSF1, achieves an additive strong apoptotic effect in MM cells. To study the stress response system in MM cells, we performed heat shock experiments and applied pharmacological HSP90- and proteasome-inhibitors. Despite the aberrant high expression of HSP in MM cells, both treatments showed an induction of the HSR and a stimulation of the synthesis of HSP. This adverse response to therapeutic agents is probably due to an onset of a compensatory cell rescue mechanism that leads to drug resistance. However, we were able to suppress this cellular response by the inhibition of HSF1 with triptolide and shRNA-mediated knockdown. Moreover, the combination of pharmacological HSF1-inhibition and HSP90 (with NVP AUY922) or HSF1 and proteasome inhibition (with bortezomib) resulted in an increased apoptotic effect in MM cells. In summary, these results suggest an important role for HSF1 in the regulation of major HSPs. Furthermore, the inhibition of HSF1 represents a promising new treatment strategy for MM patients, particularly in combination with HSP90 or proteasome inhibitors.
KW  - Plasmozytom
KW  - Therapie
KW  - Multiples Myelom
KW  - Hitzeschock Proteine
KW  - HSF1
KW  - onkogenes Signalnetzwerk
KW  - therapeutisches Target
KW  - Multiple Myeloma
KW  - heat shock proteins
KW  - HST1
KW  - therapeutic strategy
KW  - oncogenic signalling network
KW  - Hitzeschocktranskriptionsfaktor
KW  - Myelom
Y1  - 2013
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-83390
ER  - 
TY  - THES
A1  - Riedel, Simone Stefanie
T1  - Characterization of the fluorescence protein FP635 for in vivo imaging and establishment of a murine multiple myeloma model for non-invasive imaging of disease progression and response to therapy
T1  - Charakterisierung des Fluoreszenzproteins FP635 für die in vivo Bildgebung und Etablierung eines Maus Modells für die nicht invasive Bildgebung des Krankheitsverlaufes und Ansprechen auf Therapien imMultiplen Myelom
N2  - Optical in vivo imaging methods have advanced the fields of stem cell transplantation, graft-versus–host disease and graft-versus-tumor responses. Two well known optical methods, based on the transmission of light through the test animal are bioluminescence imaging (BLI) and fluorescence imaging (FLI). Both methods allow whole body in vivo imaging of the same animal over an extended time span where the cell distribution and proliferation can be visualized. BLI has the advantages of producing almost no unspecific background signals and no necessity for external excitation light. Hence, BLI is a highly sensitive and reliable detection method. Yet, the BLI reporter luciferase is not applicable with common microscopy techniques, therefore abolishing this method for cellular resolution imaging. FLI in turn, presents the appealing possibility to use one fluorescent reporter for whole body imaging as well as cellular resolution applying microscopy techniques. The absorption of light occurs mainly due to melanin and hemoglobin in wavelengths up to 650 nm. Therefore, the wavelength range beyond 650 nm may allow sensitive optical imaging even in deep tissues. For this reason, significant efforts are undertaken to isolate or develop genetically enhanced fluorescent proteins (FP) in this spectral range. “Katushka” also called FP635 has an emission close to this favorable spectrum and is reported as one of the brightest far-red FPs. Our experiments also clearly showed the superiority of BLI for whole body imaging over FLI. Based on these results we applied the superior BLI technique for the establishment of a pre-clinical multiple myeloma (MM) mouse model. MM is a B-cell disease, where malignant plasma cells clonally expand in the bone marrow (BM) of older people, causing significant morbidity and mortality. Chromosomal abnormalities, considered a hallmark of MM, are present in nearly all patients and may accumulate or change during disease progression. The diagnosis of MM is based on clinical symptoms, including the CRAB criteria: increased serum calcium levels, renal insufficiency, anemia, and bone lesions (osteolytic lesions or osteoporosis with compression fractures). Other clinical symptoms include hyperviscosity, amyloidosis, and recurrent bacterial infections. Additionally, patients commonly exhibit more than 30% clonal BM plasma cells and the presence of monoclonal protein is detected in serum and/or urine. With current standard therapies, MM remains incurable and patients diagnosed with MM between 2001 and 2007 had a 5-year relative survival rate of only 41%. Therefore, the development of new drugs or immune cell-based therapies is desirable and necessary. To this end we developed the MOPC-315 cell line based syngeneic MM mouse model. MOPC-315 cells were labeled with luciferase for in vivo detection by BLI. We validated the non-invasively obtained BLI data with histopathology, measurement of idiotype IgA serum levels and flow cytometry. All methods affirmed the reliability of the in vivo BLI data for this model. We found that this orthotopic MM model reflects several key features of the human disease. MOPC-315 cells homed efficiently to the BM compartment including subsequent proliferation. Additionally, cells disseminated to distant skeletal parts, leading to the typical multifocal MM growth. Osteolytic lesions and bone remodeling was also detected. We found evidence that the cell line had retained plasticity seen by dynamic receptor expression regulation in different compartments such as the BM and the spleen.
N2  - Optische in vivo bildgebende Verfahren haben die Felder der Stammzelltransplantation, Graft-versus-Host Krankheit und Graft-versus-Tumor Reaktion vorangebracht. Zwei gut bekannte optische Methoden, die auf der transmission von Licht durch das Versuchtier basieren, sind die Biolumineszenz Bildgebung (BLI) und die Fluoreszenz Bildgebung (FLI). Beide Methoden erlauben die in vivo Ganzkörperbildgebung desselben Tieres über lange Zeit wärenddessen die Zellverteilung und Proliferation sichtbar gemacht werden kann. Vorteil der BLI ist, dass beinahe keine unspezifischen Hintergrundsignale erzeugt werden und keine Notwendigkeit für Anregungslicht besteht. Daher ist BLI eine hochsensitive und verlässliche Detektionsmethode. Jedoch erlaubt der BLI Reporter, die Luziferase, keine Anwendung mit gängigen Mikroskopieanwendungen und verhindert daher, dass diese Methode für die Bildgebung auf zellulärer Ebene genutzt werden kann. FLI wiederum bietet die attraktive Möglichkeit einen fluoreszenten Reporter sowohl für die Bildgebung des gesamten Körpers, als auch auf zellulärer Ebene durch die Anwendung von Mikroskopietechniken zu nutzen. Derzeit bestehen noch größere Einschränkungen bei der Arbeit mit fluoreszent markierten Zellen innerhalb eines Tieres. Die allgemeine Autofluoreszenz des umliegenden Gewebes führt zu hohen Hintergrundsignalen. Zusätzlich werden sowohl das Anregungslicht als auch die emittierte Fluoreszenz durch das umliegende Gewebe abgeschwächt. Die Absorption des Lichtes geschieht hauptsächlich durch Melanin und Hämoglobin in Wellenlängen bis zu 650 nm. Daher könnte der Wellenlängenbereich über 650 nm sensitive optische Bildgebung auch in tief liegendem Gewebe ermöglichen. Aus diesem Grund werden erhebliche Anstrenungen unternommen um Fluoreszenzproteine (FP) in diesem spektralen Bereich zu isolieren oder genetisch verbesserte zu entwickeln. „Katushka“ auch FP635 genannt hat eine Emission, die nahe an diesem günstigen Spektrum liegt und wurde als eines der hellsten dunkelroten FPs beschrieben. Wir untersuchten FP635 für die Anwendung als sensitiver Einzelreporter für die Detektion immunologischer Prozesse von der Ganzkörper- bis zur Einzelzellbildgebung. Unsere Experimente zeigten auch deutlich die Überlegenheit der BLI über die FLI für die Ganzkörperbildgebung. Basierend auf diesen Ergebnissen setzten wir die überlegene BLI für die Etablierung eines präklinischen Mausmodells des Multiplen Myeloms (MM) ein. MM ist eine B-Zell Erkrankung wobei maligne Plasmazellen klonal im Knochenmark (BM) älterer Menschen expandieren und erhebliche Morbidität und Sterblichkeit verursacht. Chromosomale Abnormitäten gelten als Kennzeichen des MM, sind bei beinahe allen Patienten vorhanden und können sich während des Krankheitsverlaufes anhäufen oder verändern. Die Diagnose des MM basiert auf klinischen Syptomen inklusive der folgenden Kriterien: erhöhte Serum Kalzium Konzentration, Niereninsuffizienz, Anämie und Knochenläsionen (osteolytische Läsionen oder Osteoporose mit Kompressionsfrakturen). Weitere klinische Symptome beinhalten Hyperviskosität, Amyloidose und wiederkehrende bakterielle Infektionen. Zusätzlich zeigen Patienten verbreitet mehr als 30% klonale BM Plasmazellen und monoklonales Protein ist in Serum und/oder Urin detektierbar. Mit derzeitigen Standardtherapien bleibt MM unheilbar und Patienten, die zwischen 2001 und 2007 mit MM diagnostiziert wurden hatten eine relative 5-jahres Überlebensrate von nur 41%. Daher ist die Entwicklung neuer Medikamente und immunzellbasierten Therapien wünschenswert und notwendig. Zu diesem Zweck entwickelten wir das auf der Zelllinie MOPC-315 basierende syngene MM Mausmodell. Die MOPC-315 Zellen wurden für die in vivo Detektion mittels BLI mit Luziferase markiert. Wir validierten die nichtinvasiv gewonnenen BLI Daten mit Histopathologie, der Messung des idiotypen IgA Spiegels im Serum und Durchflusszytometrie. Alle Methoden bekräftigten die Zuverlässigkeit in vivo BLI Daten für dieses Modell. Wir stellten fest, dass dieses orthotope MM Modell einige Hauptmerkmale der menschlichen Erkrankung widerspiegelt. Die MOPC-315 Zellen wanderten effizient in das BM Kompartiment inklusive darauffolgender Proliferation. Ausserdem, streuten die Zellen in entfernte Teile des Skeletts aus was zum typischen multifokalen MM Wachstum führte. Wir stellten auch osteolytische Läsionen und Knochenumbau fest. Wir fanden Hinweise darauf, dass sich die Zelllinie Plastizität bewahrte was durch die dynamische Regulation der Rezeptorexpression in verschiedenen Kompartimenten, wie dem BM und der Milz, sichtbar wurde.
KW  - Fluoreszenzproteine
KW  - Plasmozytom
KW  - Biolumineszenzmessung
KW  - Maus
KW  - Multiple myeloma
KW  - bioluminescence imaging
KW  - fluorescence imaging
KW  - FP635
KW  - mouse model
KW  - nichtinvasive Bildgebung
KW  - Multiples Myelom
Y1  - 2013
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-77894
ER  - 
TY  - THES
A1  - Effenberger, Madlen
T1  - Funktionelle Charakterisierung von YB-1 im Zytoplasma des Multiplen Myeloms
T1  - Functional Characterization of YB-1 in the Cytoplasm of Multiple Myeloma
N2  - Das Y-Box-bindende Protein 1 (YB-1) ist ein Vertreter der hochkonservierten Familie eukaryotischer Kälteschockproteine und ein DNA/RNA-bindendes Protein. In Abhängigkeit von seiner Lokalisation übernimmt es Aufgaben bei der DNA-Transkription oder mRNA-Translation. YB-1 ist ein potentielles Onkogen beim Multiplen Myelom (MM), dass in primären MM-Zellen exprimiert ist. Für die funktionellen Untersuchungen von YB-1 in der vorliegenden Arbeit wurden humane Myelomzelllinien (HMZL) verwendet, die als in vitro Modell dieser malignen B Zell-Erkrankung dienen. Aufgrund der potentiellen Expression von YB-1 im Zellkern und/oder Zytoplasma von HMZL, wurde zunächst die Lokalisation des Proteins bestimmt. Es konnte gezeigt werden, dass YB 1 in den HMZL ausschließlich im Zytoplasma lokalisiert ist. Eine Translokation von YB-1 in den Nukleus kann durch die Serin-Phosphorylierung (Aminosäure 102) in der Kälteschockdomäne induziert werden. Die analysierten Myelomzelllinien zeigen jedoch kein nukleäres YB 1 und keine S102-Phosphorylierung. Diese Ergebnisse stützen die These, dass die Regulation der mRNA-Translation im Zytoplasma die vorherrschende Funktion von YB-1 beim MM ist. YB-1 könnte über diesen Mechanismus seine anti-apoptotische Wirkung vermitteln und die MM-Zellen vor genotoxischem Stress schützen. Um YB-1-regulierte mRNAs zu identifizieren wurden YB 1-Immunpräzipitationen mit zwei HMZL, einer Maus-Plasmozytomzelllinie und einem primären Maus-Plasmazelltumor durchgeführt. Zu den YB-1-gebundenen mRNAs gehören Translationsfaktoren und ribosomale Proteine, die eine starke Beteiligung von YB-1 beim RNA-Metabolismus bestätigen. In der vorliegenden Arbeit wurden spezifisch zwei mRNA-Kandidaten untersucht, die für den malignen Phänotyp von MM-Zellen wichtig sein können: das translationell kontrollierte Tumorprotein TCTP und MYC. Sowohl TCTP als auch MYC wurden bereits in Zusammenhang mit der Proliferation und Apoptose-Resistenz von malignen Zellen beschrieben. Die immunhistochemische Untersuchung der Knochenmarkbiopsien von MM-Patienten ergab eine gute Ko-Expression von YB-1 und TCTP in intramedullären MM-Zellen, während MYC erst in extramedullärem MM-Tumormaterial verstärkt mit der hohen YB 1-Expression korreliert. Die funktionellen Analysen der Arbeit haben gezeigt, dass YB 1 für die Translation der TCTP- und MYC-mRNA essentiell ist. Es kontrolliert die Verteilung dieser mRNAs zwischen translationell aktiven und inaktiven messenger Ribonukleoprotein-Partikeln. Die shRNA-vermittelte Reduktion von YB-1 führte zur Hemmung der TCTP- und MYC-Translation in der Phase der Initiation. Um den Einfluss der Kandidaten auf das Überleben der HMZL zu untersuchen, wurden proteinspezifische Knockdown-Experimente durchgeführt. Beim shRNA-vermittelten TCTP-Knockdown konnten keine Auswirkungen auf die Proliferation oder Viabilität von MM-Zellen beobachtet werden. Im Gegensatz dazu ist MYC für das Überleben und Wachstum der HMZL ausschlaggebend, denn der MYC-Knockdown induzierte Apoptose. Wie beim YB 1-Knockdown war ein Anstieg der Caspase-Aktivität und der Zusammenbruch des mitochondrialen Membranpotentials in den HMZL nachweisbar. Da es beim MYC-Knockdown gleichzeitig zur einer Reduktion der YB 1-Protein- und mRNA-Expression kam, wurde der Einfluss von MYC auf die Transkription des YB-1-Gens untersucht. Mit Hilfe von embryonalen Mausfibroblasten, die ein induzierbares MYC als Transgen besitzen, konnte gezeigt werden, dass die Aktivierung von MYC mit einer Zunahme der YB-1-mRNA einher geht. YB-1 ist somit ein direktes Zielgen des Transkriptionsfaktors MYC. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit haben zum ersten Mal ein gegenseitiges regulatorisches Netzwerk aufgezeigt, in dem YB 1 transkriptionell durch MYC reguliert wird und YB-1 für die Translation der MYC-mRNA essentiell ist. Die Ko-Expression beider Proteine trägt zum Wachstum und Überleben von malignen Plasmazellen bei.
N2  - The Y-box binding protein 1 (YB-1) is a member of the highly conserved coldshock-domain protein family and a DNA/RNA-binding protein. Therefore YB-1 can be involved in DNA transcription or mRNA translation depending on its localization in the cell. YB-1 is a potential oncogene in Multiple Myeloma (MM) and is expressed in primary MM cells. Human myeloma cell lines (HMCLs), which serve as the in vitro model for this B-cell malignancy, were used to functionally characterize YB-1 in MM. In this study it was shown that the YB-1 protein is expressed exclusively in the cytoplasm of HMCLs. Its translocation into the nucleus can be induced through the phosphorylation of a serine residue (amino acid 102) in the coldshock-domain of the protein. The analyzed myeloma cell lines are negative for nuclear YB-1 and the S102-phosphorylation. These results support the hypothesis that the regulation of mRNA translation in the cytoplasm is the primary function of YB-1 in MM. Through this mechanism YB-1 could mediate its anti-apoptotic effects and protect MM cells against genotoxic stress. To identify YB-1 regulated mRNAs in the cytoplasm immunoprecipitations of two HMCLs, one mouse plasmacytoma cell line and one primary mouse plasma cell tumor were performed. YB-1 bound mRNAs include translation factors and ribosomal proteins, which confirms the strong participation of YB-1 in the metabolism of RNAs. In the present study two mRNA candidates were specifically investigated which might be important for the malignant phenotype of MM cells: the translationally controlled tumor protein (TCTP) and MYC. Both, TCTP and MYC have been described in conjunction with proliferation and apoptosis-resistance of malignant cells. The immunohistochemical staining of bone marrow biopsies from MM patients revealed a good co-expression of YB-1 and TCTP in intramedullary MM cells, whereas MYC and YB-1 correlate strongly with each other in extramedullary MM tumors. The functional analysis of this study showed, that YB-1 is essential for the translation of TCTP and MYC mRNA. It controls the distribution of these mRNAs between translationally active and inactive messenger ribonucleoprotein particles. The shRNA-mediated reduction of YB-1 expression inhibits TCTP and MYC translation in the initiation phase. To investigate the influence of the candidates for HMCL survival protein-specific knockdown experiments were performed. The TCTP knockdown showed no effect on proliferation or viability of the analyzed MM cells. In contrast, MYC is crucial for MM cell survival and growth, as the knockdown induced apoptosis. Comparable with the performed YB-1 knockdown experiments apoptosis induction was verified here by an increase of activated caspases and disruption of the mitochondrial membrane potential in HMCLs. Interestingly, the knockdown of MYC also reduced YB-1 protein and mRNA expression. To investigate the influence of MYC on YB-1 gene transcription mouse embryonic fibroblasts (MEFs) from MYC transgenic animals were used. The activation of MYC protein in these cells induced YB-1 mRNA expression, showing that YB-1 is a direct target of the transcription factor MYC. The work presented here revealed for the first time a feed-forward loop of YB-1 and MYC expression in MM cells. In this loop YB-1 is transcribed by MYC and YB-1 is essential for MYC mRNA translation. Consequently, both proteins mutually up-regulate each other via combined transcriptional/translational activity to support cell growth and survival of malignant plasma cells.
KW  - Plasmozytom
KW  - Apoptosis
KW  - RNS-Bindungsproteine
KW  - Myc
KW  - Cytoplasma
KW  - YB-1
KW  - mRNA-Translation
KW  - TCTP
KW  - Multiples Myelom
KW  - Transkription
KW  - YB-1
KW  - mRNA translation
KW  - TCTP
KW  - multiple myeloma
KW  - transcription
Y1  - 2012
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-76816
ER  - 
TY  - THES
A1  - Rauert-Wunderlich, Hilka
T1  - Apoptoseregulation durch TNF im Multiplen Myelom
T1  - Regulation of apoptosis via TNF in multiple myeloma
N2  - Der Tumornekrosefaktor (TNF) entfaltet seine vielfältigen biologischen Aktivitäten durch die Stimulation der beiden TNF-Rezeptoren TNFR1 und TNFR2. Die TNFR1-vermittelte Signaltransduktion ist in vielen Details gut verstanden, wohingegen die TNFR2-vermittelte Signaltransduktion bis heute kaum untersucht ist. Mit Hilfe einer in unserer Gruppe entwickelten hochaktiven TNFR2-spezifischen TNF-Variante sowie einer bereits länger bekannten TNFR1-spezifischen TNF-Variante wurde in dieser Arbeit die TNF-Signaltransduktion insbesondere im Mutiplen Myelom untersucht. Mit Hilfe der beiden TNF-Varianten konnte gezeigt werden, dass die alleinige Stimulation des TNFR2 die Aktivierung des alternativen NFkappaB-Signalweges vermittelt, wohingegen TNFR1 nicht dazu in der Lage ist. So zeigte sich im Einklang mit der inhibitorischen Funktion des Adapterproteins TRAF2 in der Signaltransduktion des alternativen NFkappaB-Signalweges, dass die TNFR2-Stimulation in einer TRAF2-Depletion resultiert. Dies führt weiterhin zur Akkumulation von NIK und der Prozessierung von p100 zu seiner aktiven Form p52, den klassischen biochemisch nachweisbaren Ereignissen der Aktivierung des alternativen NFkappaB-Signalweges. Aufgrund der Rolle des NFkappaB-Systems im Multiplen Myelom (MM) und der stimulierenden Wirkung des TNFR1 und TNFR2 auf das NFkappaB-System wurde die Expression und Funktion dieser beiden Rezeptoren auf Myelomzelllinien untersucht. Insbesondere wurde analysiert, welchen Effekt eine spezifische Stimulation der beiden TNF-Rezeptoren auf die apoptotische Sensitivität von Myelomzellen hat. Mit einer Ausnahme wiesen alle untersuchten Myelomzelllinien eine eindeutige TNFR2-Oberflächenexpression auf, die TNFR1-Expression hingegen war heterogen. Die TNFR1-Stimulation in den TNFR1-positiven Zelllinien zeigte keinen wesentlichen Einfluss auf die Zellviabilität. Allerdings resultierte eine Vorstimulation mit TNF in einer gesteigerten Sensitivität für den CD95L-induzierten Zelltod, schützte aber gleichzeitig vor der TRAIL-vermittelten Induktion der Apoptose. Der gegenläufige Effekt der TNF-Vorstimulation auf den CD95L- und TRAIL-induzierten Zelltod konnte auf die Hochregulation der CD95-Oberflächenexpression und der gesteigerten Expression des antiapoptotischen cFLIPLong-Proteins zurückgeführt werden. Beide Effekte basieren auf der TNF-induzierten Aktivierung des klassischen NFkappaB-Signalweges. Im CD95L-induzierten Zelltod überkompensierte die Induktion der CD95-Expression offensichtlich die Hochregulation von cFLIPLong und resultierte in gesteigertem Zelltod. Der TRAIL-induzierte Zelltod hingegen wurde durch die TNF-Vorstimulation abgeschwächt, da hier lediglich die durch den klassischen NFkappaB-Signalweg vermittelte gesteigerte Expression des antiapoptotischen cFLIPLong eine Rolle spielte. Desweiteren zeigten die Analysen in dieser Arbeit, dass die TNFR2-Stimulation zu einer Depletion von TRAF2 und z. B. in JJN3-Zellen zu einer Sensitivierung für den TNFR1-induzierten Zelltod führte. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigten in der Summe somit, dass das TNF-TNFR-Signaling durch verschiedene Mechanismen Einfluss auf den Ausgang der extrinsischen Apoptoseinduktion hat, und dass der Effekt von TNF auf das Überleben von MM-Zellen kontextabhängig ist.
N2  - TNF mediates its biological functions by stimulation of the two TNF receptors TNFR1 and TNFR2. TNFR1-mediated signaling has already been studied in detail, whereas TNFR2-mediated signal transduction is poorly understood. In this work a newly developed TNFR2-specific variant and an established TNFR1-specific variant was used to study TNF signaling especially in myeloma cells. With the help of these TNF-variants it is shown here that TNFR2, but not TNFR1, induces activation of the alternative NFkappaB-pathway. Thus in consent with the inhibitory function of TRAF2 in alternative NFkappaB signal transduction, stimulation of TNFR2 resulted in depletion of TRAF2, accumulation of NIK and p100 processing to p52, the biochemical hallmarks of this pathway. Due to the relevance of the NFkappaB-system for multiple myeloma (MM) and the NFkappaB stimulatory activities of TNFR1 and TNFR2, the expression of these two receptors and their effect on apoptotic sensitivity was analyzed in myeloma cell lines. A huge majority of myeloma cell lines express TNFR2 whereas TNFR1 expression is rather restricted. Stimulation of TNFR1 in the TNFR1-positive subset of MM cell lines showed nearly no impact on cellular viability. However, TNF stimulation enhanced CD95L-induced cell death and in parallel reduced the TRAIL-mediated induction of apoptosis. This opposed regulation of TRAIL- and CD95L-induced cell death by TNF based on upregulation of the death receptor CD95 via the classical NFkappaB-pathway and by upregulation of the antiapoptotic protein cFLIPLong via the same pathway. The induction of CD95 expression appeared to overcompensate the upregulation of cFLIPLong and consequently TNF-induced NFkappaB activation resulted, in context of CD95 signaling, in apoptosis enhancement. TRAIL-mediated cell death induction, however, was reduced after TNF prestimulation, due to the fact that here only upregulation of cFLIPLong was relevant. Furthermore the experiments in this study showed that TNFR2-mediated depletion of TRAF2 resulted in a sensitization for TNFR1-induced cell death, for example in JJN3-cells. Taken together, this study revealed that the TNF-TNFR system influenced the outcome of activation of the extrinsic apoptotic pathway in myeloma cells by various mechanisms and the effect of TNF on MM cell survival is thus context dependent.
KW  - Apoptosis
KW  - Tumor-Nekrose-Faktor
KW  - Plasmozytom
KW  - apoptosis
KW  - TNF
KW  - multiple myeloma
Y1  - 2012
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-73998
ER  -